專利名稱：一種選育具有抗白斑綜合癥病毒特性的凡納濱對(duì)蝦親蝦的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種選育具有抗白斑綜合癥病毒特性的凡納濱對(duì)蝦親蝦的方法。
背景技術(shù)：
凡納濱對(duì)蝦是重要的海水經(jīng)濟(jì)蝦類，因其生長(zhǎng)速度快、抗病能力強(qiáng)、市場(chǎng)價(jià)值高等特點(diǎn)深受水產(chǎn)養(yǎng)殖者的重視，近年來(lái)的養(yǎng)殖規(guī)模越來(lái)越大。但是，隨著養(yǎng)殖規(guī)模的增加和水環(huán)境污染的加劇，凡納濱對(duì)蝦養(yǎng)殖過(guò)程中的病害也時(shí)有發(fā)生，其中對(duì)養(yǎng)殖造成危害最大的是凡納濱對(duì)蝦白斑綜合癥(white spotsyndrome，簡(jiǎn)稱WSS)。對(duì)蝦白斑綜合癥是由白斑綜合癥病毒(white spotsyndrome virus，簡(jiǎn)稱WSSV)引起的，目前還沒(méi)有有效的藥物來(lái)防治WSSV，因此控制WSS暴發(fā)的主要方法在于預(yù)防。在生產(chǎn)中人們發(fā)現(xiàn)，凡納濱對(duì)蝦種群中有部分對(duì)蝦具有抗WSSV的能力，這部分對(duì)蝦在感染W(wǎng)SSV后能夠健康存活，并且子代也具有抗病毒的特性，被稱為SPR(special pathogen resistance)種群。因此，在凡納濱對(duì)蝦親蝦中篩選具有抗WSSV能力的個(gè)體進(jìn)行繁殖，利用其種苗的抗病毒特性來(lái)防止對(duì)蝦白斑綜合癥的發(fā)生是保證凡納濱對(duì)蝦養(yǎng)殖業(yè)可持續(xù)發(fā)展的重要措施之一。而目前，具有抗WSSV能力的凡納濱對(duì)蝦親蝦的篩選方法還沒(méi)有見(jiàn)到。

發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種選育具有抗WSSV特性的凡納濱對(duì)蝦親蝦的方法。
本發(fā)明的具有抗WSSV特性的凡納濱對(duì)蝦親蝦選育方法的具體步驟如下
1)親蝦選擇與暫養(yǎng)按照雌雄比為1∶2的比例選擇健康親蝦。所述的健康親蝦體長(zhǎng)為14～18cm、體重為35～40g、體型大、體色正常、副肢完整、鰓部清潔。所述的親蝦暫養(yǎng)的優(yōu)選方法為按照30～50尾/箱的密度將親蝦放入室內(nèi)體積為1000L的PVC水族箱內(nèi)，水族箱內(nèi)的用水必須先經(jīng)過(guò)臭氧消毒、紫外線消毒和孔徑1～5μm精密過(guò)濾器的處理，按照1L/分鐘的速度進(jìn)行微流水換水，在整個(gè)親蝦選育期間保證水溫控制在26～30℃，鹽度為28～34，溶氧保證5毫克/升以上，PH7.8～8.6，水中總氨氮含量低于0.6毫克/升。每天按照對(duì)蝦體重的2％投喂親蝦飼料(購(gòu)于湛江恒興南方海洋科技有限公司)，每天投喂4次。
2)攻毒親蝦在1000L水族箱中暫養(yǎng)10天后，從水族箱中快速撈出對(duì)蝦，用一次性注射器在每尾親蝦背部第一附節(jié)肌肉注射WSSV病毒液50μL，然后放回到水族箱中。
所述的WSSV病毒液優(yōu)選的制備方法為在爆發(fā)白斑綜合癥的養(yǎng)殖池塘進(jìn)行取樣，該蝦池白斑綜合癥癥狀明顯，經(jīng)PCR檢測(cè)和投喂感染證明為WSSV陽(yáng)性。取0.1g爆發(fā)白斑綜合癥的對(duì)蝦附節(jié)肌肉放入勻漿器中，迅速加入1mLPBS緩沖液，冰浴研磨均勻，然后將病毒液置入1.5mL的EP管中3000r/min離心5min，取上清200μL加入到1800μL的PBS緩沖液中，用經(jīng)高壓消毒過(guò)的裝有0.22μL孔目的過(guò)濾器過(guò)濾除菌。取濾液500μL加入到49500μL(49.5mL)pH7.4的PBS緩沖液混勻，共計(jì)50mL，4℃保存?zhèn)溆米霾《咀⑸湟?。注射前用PBS緩沖溶液稀釋1000倍使用即可。
3)淘汰非抗性親蝦注射病毒液第2天后對(duì)蝦開(kāi)始出現(xiàn)感染癥狀，3天后開(kāi)始出現(xiàn)死亡。每天認(rèn)真觀察對(duì)蝦感染和發(fā)病情況，發(fā)現(xiàn)死蝦及時(shí)撈出進(jìn)行無(wú)害化處理然后丟棄掉；攻毒后養(yǎng)殖8天后大約80％的親蝦發(fā)病死亡，剩下的對(duì)蝦不發(fā)生感染和發(fā)病癥狀，說(shuō)明其具有抗白斑綜合癥病毒(WSSV)的能力。
4)親蝦培育將成活下來(lái)的親蝦再次進(jìn)行篩選，選擇體表無(wú)傷、攝食良好和活力好的親蝦移入室內(nèi)親蝦培育池進(jìn)行培育。親蝦培育池的規(guī)格一般為16～25平方米，水深1～1.2米，每個(gè)水泥池中放入親蝦80～200尾；培育池用水水質(zhì)條件要求與親蝦暫養(yǎng)階段相同，換水量每天換水40％～70％。光照周期按照12h12h控制，光線強(qiáng)度控制在500～1000lx。將親蝦配合飼料(購(gòu)于湛江恒興南方海洋科技有限公司)、沙蟲(chóng)、魷魚(yú)、牛肝等按照1∶3∶1∶1的比例飼喂親蝦。每天的投喂量按照親蝦體重的2％計(jì)算，每天投喂3～4次。養(yǎng)殖期2～3個(gè)月，待養(yǎng)殖親蝦大小達(dá)50～70g時(shí)，可促使其性腺發(fā)育成熟。即可進(jìn)行交配產(chǎn)卵等苗種生產(chǎn)程序。
2004年7月在國(guó)家863海洋種子工程南方基地(湛江恒興南方海洋科技有限公司)SPR種蝦繁育基地，經(jīng)過(guò)對(duì)5000尾親蝦進(jìn)行攻毒檢驗(yàn)，共篩選具備抗WSSV能力的凡納濱對(duì)蝦親蝦1531尾，經(jīng)過(guò)3個(gè)月養(yǎng)殖，存活率95％，交配率80％。采用人工培育的凡納濱對(duì)蝦親蝦，共生產(chǎn)凡納濱對(duì)蝦無(wú)節(jié)幼體2.3億多尾；凡納濱對(duì)蝦苗種6900萬(wàn)尾。子一代的抗WSSV凡納濱對(duì)蝦經(jīng)商業(yè)養(yǎng)殖場(chǎng)進(jìn)行養(yǎng)殖，90天可長(zhǎng)到10～12g，且都未有白斑綜合癥發(fā)生。在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)取部分子一代抗WSSV凡納濱對(duì)蝦進(jìn)行攻毒試驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其成活率可達(dá)79％。2005年，該基地又將部分子一代抗WSSV對(duì)蝦培育成為親蝦后與其他家系對(duì)蝦雜交，生產(chǎn)出的子二代具有更好的抗病毒能力和生長(zhǎng)潛能。
本發(fā)明利用現(xiàn)代生物學(xué)的原理，通過(guò)應(yīng)激試驗(yàn)篩選凡納濱對(duì)蝦親蝦中具有抗WSSV能力的個(gè)體。經(jīng)過(guò)該選育過(guò)程后的親蝦繁殖其子一代，二代皆具有較強(qiáng)的抗WSSV的能力，適合在各種條件下進(jìn)行養(yǎng)殖，對(duì)提高商業(yè)對(duì)蝦養(yǎng)殖的成功率有重要作用。
本發(fā)明提供了一種健康優(yōu)質(zhì)種苗繁育的新方法，其操作簡(jiǎn)單方便、適合于大規(guī)模選育具有抗WSSV特性的凡納濱對(duì)蝦親蝦。
具體實(shí)施方式實(shí)施例11)親蝦選擇與暫養(yǎng)按照雌雄比1∶2的比例選擇體長(zhǎng)為14cm、體重為35g的健康親蝦5000尾，親蝦體型大、體色正常、副肢完整、鰓部清潔。按照30尾/箱的密度將親蝦放入室內(nèi)1000L的PVC水族箱內(nèi)，水族箱內(nèi)的用水預(yù)先經(jīng)過(guò)臭氧消毒、紫外線消毒和孔徑為1μm精密過(guò)濾器處理，然后按照1L/分鐘的速度進(jìn)行微流水換水，在整個(gè)親蝦選育期間保證水溫控制在26℃，鹽度為28，溶氧保證5毫克/升以上，PH7.8，水中總氨氮含量0.6毫克/升。每天按照對(duì)蝦體重的2％投喂親蝦飼料(購(gòu)于湛江恒興南方海洋科技有限公司)，每天投喂4次。
2)攻毒親蝦在1000L水族箱中暫養(yǎng)10天后，從水族箱中快速撈出對(duì)蝦，用一次性注射器在每尾親蝦背部第一附節(jié)肌肉注射WSSV病毒液50μL，然后放回到水族箱中。
注射使用得WSSV病毒液按照如下方法制備在爆發(fā)白斑綜合癥的養(yǎng)殖池塘進(jìn)行取樣，該蝦池白斑綜合癥癥狀明顯，經(jīng)PCR檢測(cè)和投喂感染證明為WSSV陽(yáng)性。取0.1g爆發(fā)白斑綜合癥的對(duì)蝦附節(jié)肌肉放入勻漿器中，迅速加入1mLPBS緩沖液，冰浴研磨均勻，然后將病毒液置入1.5mL的EP管中3000r/min離心5min，取上清200μL加入到1800μL的PBS緩沖液中，用經(jīng)高壓消毒過(guò)的裝有0.22μL孔目的過(guò)濾器過(guò)濾除菌。取濾液500μL加入到49500μL(49.5mL)pH7.4的PBS緩沖液混勻，共計(jì)50mL，4℃保存?zhèn)溆米霾《咀⑸湟?。注射前用PBS緩沖溶液稀釋1000倍后即可使用。
3)淘汰非抗性親蝦注射病毒液第2天后對(duì)蝦開(kāi)始出現(xiàn)感染癥狀，3天后開(kāi)始出現(xiàn)死亡。每天認(rèn)真觀察對(duì)蝦感染和發(fā)病情況，發(fā)現(xiàn)死蝦及時(shí)撈出進(jìn)行無(wú)害化處理后丟棄掉；攻毒后養(yǎng)殖8天后大約80％的親蝦發(fā)病后死亡，剩下的對(duì)蝦不發(fā)生感染，未見(jiàn)發(fā)病癥狀，說(shuō)明其具有抗白斑綜合癥病毒(WSSV)的能力。
4)親蝦培育將成活下來(lái)的親蝦再次進(jìn)行篩選，選擇體表無(wú)傷、攝食良好和活力好的親蝦共1531尾移入室內(nèi)親蝦培育池進(jìn)行培育。親蝦培育池的規(guī)格為16平方米，水深1.0米，每個(gè)水泥池中放入親蝦80尾；培育池用水水質(zhì)條件要求與親蝦暫養(yǎng)階段相同，換水量每天換水40％。光照周期按照12h12h控制，光線強(qiáng)度控制在500x。將親蝦配合飼料(購(gòu)于湛江恒興南方海洋科技有限公司)、沙蟲(chóng)、魷魚(yú)、牛肝等按照1∶3∶1∶1的比例飼喂親蝦。每天的投喂量按照親蝦體重的2％計(jì)算，每天投喂4次。養(yǎng)殖2個(gè)月后，親蝦大小達(dá)60g，即可進(jìn)行交配產(chǎn)卵等苗種生產(chǎn)程序。
實(shí)施例21)親蝦選擇與暫養(yǎng)按照雌雄比1∶2的比例選擇體長(zhǎng)為16cm、體重為38g的健康親蝦2000尾，親蝦體型大、體色正常、副肢完整、鰓部清潔。按照40尾/箱的密度將親蝦放入室內(nèi)1000L的PVC水族箱內(nèi)，水族箱內(nèi)的用水預(yù)先經(jīng)過(guò)臭氧消毒、紫外線消毒和孔徑為5μm精密過(guò)濾器的處理，按照1L/分鐘的速度進(jìn)行微流水換水，在整個(gè)親蝦選育期間保證水溫控制在28℃，鹽度為30，溶氧保證6毫克/升，PH8.0，水中總氨氮含量0.5毫克/升。每天按照對(duì)蝦體重的2％投喂親蝦飼料(購(gòu)于湛江恒興南方海洋科技有限公司)，每天投喂4次。
2)攻毒親蝦在1000L水族箱中暫養(yǎng)10天后，從水族箱中快速撈出對(duì)蝦，用一次性注射器在每尾親蝦背部第一附節(jié)肌肉注射WSSV病毒液50μL，然后放回到水族箱中。
注射使用得WSSV病毒液按照如下方法制備在爆發(fā)白斑綜合癥的養(yǎng)殖池塘進(jìn)行取樣，該蝦池白斑綜合癥癥狀明顯，經(jīng)PCR檢測(cè)和投喂感染證明為WSSV陽(yáng)性。取0.1g爆發(fā)白斑綜合癥的對(duì)蝦附節(jié)肌肉放入勻漿器中，迅速加入1mLPBS緩沖液，冰浴研磨均勻，然后將病毒液置入1.5mL的EP管中3000r/min離心5min，取上清200μL加入到1800μLPBS緩沖液，用經(jīng)高壓消毒過(guò)的裝有0.22μL孔目的過(guò)濾器過(guò)濾除菌。取濾液500μL加入到49500μL(49.5mL)pH7.4的PBS緩沖液混勻，共計(jì)50mL，4℃保存?zhèn)溆米霾《咀⑸湟?。注射前用PBS緩沖溶液稀釋1000倍使用即可。
3)淘汰非抗性親蝦注射病毒液第2天后對(duì)蝦開(kāi)始出現(xiàn)感染癥狀，3天后開(kāi)始出現(xiàn)死亡。每天認(rèn)真觀察對(duì)蝦感染和發(fā)病情況，發(fā)現(xiàn)死蝦及時(shí)撈出進(jìn)行無(wú)害化處理然后丟棄掉；攻毒后養(yǎng)殖8天后大約80％的親蝦發(fā)病后死亡，剩下的對(duì)蝦不發(fā)生感染，未見(jiàn)發(fā)病癥狀，說(shuō)明其具有抗白斑綜合癥病毒(WSSV)的能力。
4)親蝦培育將成活下來(lái)的親蝦再次進(jìn)行篩選，選擇體表無(wú)傷、攝食良好和活力好的親蝦共600尾移入室內(nèi)親蝦培育池進(jìn)行培育。親蝦培育池的規(guī)格為25平方米，水深1.2米，每個(gè)水泥池中放入親蝦150尾；培育池用水水質(zhì)條件要求與親蝦暫養(yǎng)階段相同，換水量每天換水70％。光照周期按照12h12h控制，光線強(qiáng)度控制在800lx。將親蝦配合飼料(購(gòu)于湛江恒興南方海洋科技有限公司)、沙蟲(chóng)、魷魚(yú)、牛肝等按照1∶3∶1∶1的比例飼喂親蝦。每天的投喂量按照親蝦體重的2％計(jì)算，每天投喂3次。養(yǎng)殖3個(gè)月后，親蝦大小達(dá)50g，即可進(jìn)行交配產(chǎn)卵等苗種生產(chǎn)程序。
實(shí)施例31)親蝦選擇與暫養(yǎng)按照雌雄比1∶2的比例選擇體長(zhǎng)為18cm、體重為40g的健康親蝦4000尾，親蝦選擇要求體型大、體色正常、副肢完整、鰓部清潔。按照35尾/箱的密度將親蝦放入室內(nèi)1000L的PVC水族箱內(nèi)，水族箱內(nèi)的用水預(yù)先經(jīng)過(guò)臭氧消毒、紫外線消毒和孔徑為4μm精密過(guò)濾器的處理，按照1L/分鐘的速度進(jìn)行微流水換水，在整個(gè)親蝦選育期間保證水溫控制在30℃，鹽度為34，溶氧保證6毫克/升，PH8.6，水中總氨氮含量0.5毫克/升。每天按照對(duì)蝦體重的2％投喂親蝦飼料(購(gòu)于湛江恒興南方海洋科技有限公司)，每天投喂4次。
2)攻毒親蝦在1000L水族箱中暫養(yǎng)10天后，從水族箱中快速撈出對(duì)蝦，用一次性注射器在每尾親蝦背部第一附節(jié)肌肉注射WSSV病毒液50μL，然后放回到水族箱中。
注射使用得WSSV病毒液按照如下方法制備在爆發(fā)白斑綜合癥的養(yǎng)殖池塘進(jìn)行取樣，該蝦池白斑綜合癥癥狀明顯，經(jīng)PCR檢測(cè)和投喂感染證明為WSSV陽(yáng)性。取0.1g爆發(fā)白斑綜合癥的對(duì)蝦附節(jié)肌肉放入勻漿器中，迅速加入1mLPBS緩沖液，冰浴研磨均勻，然后將病毒液置入1.5mL的EP管中3000r/min離心5min，取上清200μL加入到1800μL的PBS緩沖液中，用經(jīng)高壓消毒過(guò)的裝有0.22μL孔目的過(guò)濾器過(guò)濾除菌。取濾液500μL加入到49500μL(49.5mL)pH7.4的PBS緩沖液混勻，共計(jì)50mL，4℃保存?zhèn)溆米霾《咀⑸湟骸Ｗ⑸淝坝肞BS緩沖溶液稀釋1000倍即可使用。
3)淘汰非抗性親蝦注射病毒液第2天后對(duì)蝦開(kāi)始出現(xiàn)感染癥狀，3天后開(kāi)始出現(xiàn)死亡。每天認(rèn)真觀察對(duì)蝦感染和發(fā)病情況，發(fā)現(xiàn)死蝦及時(shí)撈出進(jìn)行無(wú)害化處理后丟棄掉；攻毒后養(yǎng)殖8天后大約80％的親蝦發(fā)病后死亡，剩下的對(duì)蝦不發(fā)生感染，未見(jiàn)發(fā)病癥狀，說(shuō)明其具有抗白斑綜合癥病毒(WSSV)的能力。
4)親蝦培育將成活下來(lái)的親蝦再次進(jìn)行篩選，選擇體表無(wú)傷、攝食良好和活力好的親蝦共1182尾移入室內(nèi)親蝦培育池進(jìn)行培育。親蝦培育池的規(guī)格為25平方米，水深1.2米，每個(gè)水泥池中放入親蝦200尾；培育池用水水質(zhì)條件要求與親蝦暫養(yǎng)階段相同，換水量每天換水60％。光照周期按照12h12h控制，光線強(qiáng)度控制在1000lx。將親蝦配合飼料(購(gòu)于湛江恒興南方海洋科技有限公司)、沙蟲(chóng)、魷魚(yú)、牛肝等按照1∶3∶1∶1的比例飼喂親蝦。每天的投喂量按照親蝦體重的2％計(jì)算，每天投喂4次。養(yǎng)殖2個(gè)月后，親蝦大小達(dá)70g，即可進(jìn)行交配產(chǎn)卵等苗種生產(chǎn)程序。
權(quán)利要求
1.一種選育具有抗白斑綜合癥病毒特性的凡納濱對(duì)蝦親蝦的方法，其特征在于具體步驟如下1)親蝦選擇按照雌雄比1∶2的比例選擇健康親蝦進(jìn)行暫養(yǎng)；2)攻毒在親蝦背部第一附節(jié)肌肉注射白斑綜合癥病毒液；3)淘汰經(jīng)病毒注射后發(fā)病和死亡的親蝦，從中篩選出具有白斑綜合癥病毒抗性的凡納濱對(duì)蝦親蝦；4)親蝦培育將篩選出的親蝦進(jìn)行培育和營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的選育方法，其特征在于健康的親蝦體長(zhǎng)為14～18cm、體重為35～40g、體型大、體色正常、副肢完整、鰓部清潔。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的選育方法，其特征在于健康親蝦的暫養(yǎng)條件為按照30～50尾/1000L的密度養(yǎng)殖，用水須經(jīng)過(guò)臭氧消毒、紫外線消毒和1～5μm精密過(guò)濾器的處理，按照1L/分鐘的速度進(jìn)行微流水換水，水溫為26～30℃，鹽度為28～34，溶氧為5毫克/升以上，PH7.8～8.6，水中總氨氮含量為0～0.6毫克/升，每天投喂親蝦飼料4次，日投喂量為對(duì)蝦體重的2％。
4.如權(quán)利要求1所述的選育方法，其特征在于白斑綜合癥病毒液的制備方法為在爆發(fā)白斑綜合癥的養(yǎng)殖池塘進(jìn)行取樣，該蝦池白斑綜合癥癥狀必須明顯，經(jīng)PCR檢測(cè)和投喂感染證明為白斑綜合癥病毒陽(yáng)性；然后取0.1g爆發(fā)白斑綜合癥的對(duì)蝦附節(jié)肌肉放入勻漿器中，迅速加入1mL PBS緩沖液，冰浴研磨均勻，然后將病毒液置入1.5mL的EP管中3000r/min離心5min，取上清200μL加入到1800μL的PBS緩沖液中，用經(jīng)高壓消毒過(guò)的孔徑為0.22μL的過(guò)濾器過(guò)濾除菌；接著取濾液500μL加入到49500μL、pH7.4的PBS緩沖液混勻，4℃保存?zhèn)溆米霾《咀⑸湟?；注射前取病毒?mL，然后加入PBS緩沖溶液999mL后即可使用。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的選育方法，其特征在于培育經(jīng)篩選后的具有白斑綜合癥病毒抗性的凡納濱對(duì)蝦親蝦的方法為將成活下來(lái)的親蝦再次進(jìn)行篩選，選擇體表無(wú)傷、攝食良好和活力好的親蝦放入16～25平方米，水深1～1.2米的親蝦培育池，按照80～200尾/池的密度進(jìn)行培育，培育池用水須經(jīng)過(guò)臭氧消毒、紫外線消毒和1～5μm精密過(guò)濾器的處理，每天換水量為40％～70％，光照周期為12h∶12h，光線強(qiáng)度為500～1000lx；然后將親蝦配合飼料、沙蟲(chóng)、魷魚(yú)、牛肝等按照1∶3∶1∶1的比例飼喂親蝦，每天投喂3～4次，日投喂量為親蝦體重的2％，養(yǎng)殖期2～3個(gè)月，待養(yǎng)殖親蝦大小達(dá)50～70g時(shí)，即可進(jìn)行交配產(chǎn)卵等苗種生產(chǎn)程序。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種選育具有抗白斑綜合癥病毒特性的凡納濱對(duì)蝦親蝦的方法，其操作程序是1)親蝦選擇按照雌雄比1∶2的比例選擇健康親蝦進(jìn)行暫養(yǎng)；2)攻毒在親蝦背部第一附節(jié)肌肉注射白斑綜合癥病毒液；3)淘汰經(jīng)病毒注射后發(fā)病和死亡的親蝦，從而篩選出具有白斑綜合癥病毒抗性的凡納濱對(duì)蝦親蝦；4)親蝦培育將篩選出的親蝦進(jìn)行培育和營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化。本發(fā)明方法簡(jiǎn)單、操作方便、適合于大規(guī)模選育具有抗白斑綜合癥病毒特性的凡納濱對(duì)蝦親蝦。
文檔編號(hào)A01K61/00GK1926970SQ20061012242
公開(kāi)日2007年3月14日 申請(qǐng)日期2006年9月26日 優(yōu)先權(quán)日2006年9月26日
發(fā)明者劉興旺, 梁海鷗, 王華朗, 馮敏毅, 趙麗梅, 程成榮, 黃智成, 李治國(guó), 韓垂旺 申請(qǐng)人:廣東恒興集團(tuán)有限公司