專(zhuān)利名稱(chēng)：卡瓦胡椒離體組織培養(yǎng)技術(shù)與方法
專(zhuān)利說(shuō)明卡瓦胡椒離體組織培養(yǎng)技術(shù)與方法 本發(fā)明涉及卡瓦胡椒離體組織培養(yǎng)的技術(shù)與方法，包括通過(guò)芽繁芽、愈傷組織誘導(dǎo)出芽?jī)蓷l途徑成功實(shí)現(xiàn)了卡瓦胡椒無(wú)菌、無(wú)毒苗植株的再生和快繁?？ㄍ吆?Piper Methysticum Forst.f)，俗稱(chēng)卡瓦，多年生胡椒科(Piperaceae)胡椒屬(Piper)灌木類(lèi)植物，是一種著名的藥用植物，主要分布于瓦努阿圖、斐濟(jì)、湯加、巴布亞—新幾內(nèi)亞及所羅門(mén)群島等南平洋諸島國(guó)，近年引入我國(guó)試種。
卡瓦胡椒在南太平洋諸島國(guó)已有3000多年的藥用、栽培歷史。利用卡瓦胡椒根或根莖制備的飲料具有放松肌肉和情緒、恢復(fù)體力、促進(jìn)睡眠、減輕痛苦的作用。藥理成份分析表明，卡瓦胡椒根的主要藥理成份包括卡瓦因、二氫卡瓦因、醉椒苦素、二氫醉椒苦素、羊高寧及去甲氧基高羊?qū)幍圈?吡喃酮衍生物，統(tǒng)稱(chēng)為卡瓦內(nèi)酯。病理學(xué)實(shí)驗(yàn)和臨床實(shí)驗(yàn)證實(shí)，卡瓦胡椒根可用于治療精神抑郁癥、神經(jīng)衰弱、植物性神經(jīng)紊亂等。
卡瓦胡椒具有只開(kāi)花不結(jié)果的生物學(xué)特性，目前主要以扦插方式進(jìn)行繁殖。扦插繁殖需要消耗大量的健康莖段，影響植株正常生長(zhǎng)發(fā)育，長(zhǎng)期扦插繁殖也導(dǎo)致種苗帶菌、種苗內(nèi)生菌嚴(yán)重，致使種苗退化。發(fā)展卡瓦胡椒離體組織培養(yǎng)的技術(shù)與方法，將為大規(guī)模、商品化生產(chǎn)卡瓦胡椒無(wú)菌\無(wú)毒種苗、大規(guī)模人工栽培卡瓦胡椒打下基礎(chǔ)。
由于長(zhǎng)期依靠扦插繁殖，卡瓦胡椒植株表面帶菌、內(nèi)生菌較為嚴(yán)重。如何有效克服內(nèi)生菌污染問(wèn)題已經(jīng)成為發(fā)展卡瓦胡椒離體組織培養(yǎng)技術(shù)與方法的關(guān)鍵。Taylor and Taufa于1998年進(jìn)行了嘗試，但沒(méi)有成功。2001年Briskin等通過(guò)表面消毒、在培養(yǎng)基中添加抗生素等多種辦法，也僅獲得了卡瓦胡椒葉片、莖段的愈傷組織，至今未見(jiàn)有通過(guò)離體組織培養(yǎng)技術(shù)獲得完整再生卡瓦胡椒植株的報(bào)道。
本發(fā)明成功克服了卡瓦胡椒離體組織培養(yǎng)中的技術(shù)瓶頸——內(nèi)生菌污染問(wèn)題，打破了卡瓦胡椒只能依靠扦插進(jìn)行繁殖的單一繁殖方法，通過(guò)芽繁芽、愈傷組織誘導(dǎo)出芽?jī)蓷l途徑成功實(shí)現(xiàn)了卡瓦胡椒無(wú)菌、無(wú)毒苗植株的再生和快繁。本發(fā)明克服了卡瓦胡椒離體組織培養(yǎng)中的技術(shù)瓶頸——內(nèi)生菌污染，打破了卡瓦胡椒只能依靠扦插進(jìn)行繁殖的單一繁殖方法，通過(guò)芽繁芽、愈傷組織誘導(dǎo)出芽?jī)蓷l途徑成功實(shí)現(xiàn)了卡瓦胡椒無(wú)菌、無(wú)毒苗植株的再生和快繁。本發(fā)明技術(shù)方案通過(guò)2種組織培養(yǎng)技術(shù)路線實(shí)現(xiàn)卡瓦胡椒植株再生的技術(shù)和方法。其技術(shù)路線、步驟及特征如下技術(shù)路線、步驟及特征1.采用含有休眠芽莖段→接種于休眠芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上誘導(dǎo)休眠芽發(fā)芽→切取生長(zhǎng)一定時(shí)間和具有一定長(zhǎng)度的幼嫩芽接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基→誘導(dǎo)不定芽發(fā)生→切取不定芽轉(zhuǎn)入繼代培養(yǎng)基中增植培養(yǎng)→不定芽轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中誘導(dǎo)不定根發(fā)生→形成具有根、莖、葉的完整卡瓦胡椒苗→移植于營(yíng)養(yǎng)杯→組培苗大田種植的方法。
技術(shù)路線、步驟、步驟及特征2.采用含有休眠芽莖段→接種于休眠芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上誘導(dǎo)休眠芽發(fā)芽→切取生長(zhǎng)一定時(shí)間和具有一定長(zhǎng)度的幼嫩芽接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基→誘導(dǎo)不定芽發(fā)生→切取不定芽葉片誘導(dǎo)愈傷組織發(fā)生→將愈傷組織轉(zhuǎn)入不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)叢生芽→切取單個(gè)芽轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中誘導(dǎo)不定根發(fā)生→形成具有根、莖、葉的完整卡瓦胡椒苗→移植于營(yíng)養(yǎng)杯→組培苗大田種植的方法。
結(jié)果分析1、外植體消毒流線型自來(lái)水沖洗12小時(shí)后，將切割成1cm長(zhǎng)的莖段(帶有1個(gè)休眠芽)置于70％酒精中浸泡30秒，0.1％升汞中不斷攪動(dòng)處理10-15分鐘，在培養(yǎng)基上培養(yǎng)10天，可見(jiàn)的污染率僅有41％，這說(shuō)明這種表面消毒處理對(duì)卡瓦胡椒莖段表面泥砂、細(xì)菌及其真菌孢子去除均有一定的作用。由于內(nèi)生菌污染，培養(yǎng)30天時(shí)，污染率接近100％。
2、內(nèi)生菌的去除及無(wú)菌芽獲得由于長(zhǎng)期扦插繁殖，卡瓦胡椒內(nèi)生菌污染嚴(yán)重，是卡瓦胡椒離體組織培養(yǎng)的技術(shù)瓶頸。本研究通過(guò)選擇一定生長(zhǎng)時(shí)間、一定長(zhǎng)度的芽尖(來(lái)自休眠芽)為次級(jí)外植體，成功克服了這一困難，得到了完全無(wú)菌的芽。我們的研究表明，選擇生長(zhǎng)15天、0.5mm的芽尖用作次級(jí)外植體進(jìn)行芽繁芽，二次污染率可以降低到64％。
3、通過(guò)芽繁芽獲得較高的繁殖系數(shù)通過(guò)芽繁芽途徑，卡瓦胡椒每月增殖系數(shù)達(dá)7-8。
4、利用無(wú)菌苗葉片為外植體獲得胚性愈傷組織并誘導(dǎo)叢生芽以獲得的無(wú)菌苗葉片為外植體，通過(guò)誘導(dǎo)胚性愈傷組織，繼而誘導(dǎo)叢生芽途徑也獲得了較高的繁殖系數(shù)，最高達(dá)4.5。
5、高生根率將獲得的無(wú)菌芽切割，轉(zhuǎn)至催根培養(yǎng)基，獲得了最高的生根效率，可達(dá)100％。
6、較高的移栽成活率正常條件下生長(zhǎng)的小苗在移入大田前進(jìn)行10-15天左右的馴化培養(yǎng)是必需的。根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室對(duì)不同培養(yǎng)基質(zhì)的配比試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)在砂∶石灰?guī)r土∶椰糠＝1∶2∶1的基質(zhì)中生長(zhǎng)的小苗成活率高達(dá)87.2％。
本研究在國(guó)際上首次克服了卡瓦胡椒離體組織培養(yǎng)中的技術(shù)瓶頸——內(nèi)生菌污染，打破了卡瓦胡椒只能依靠扦插進(jìn)行繁殖的單一繁殖方法，通過(guò)芽繁芽、愈傷組織誘導(dǎo)叢生芽?jī)蓷l途徑成功實(shí)現(xiàn)了卡瓦胡椒無(wú)菌、無(wú)毒苗植株的再生和快繁。本方法培養(yǎng)的卡瓦胡椒幼苗為無(wú)菌、無(wú)毒苗，每月繁殖指數(shù)高達(dá)7-8，生根率100％，移栽成活率達(dá)到87％。通過(guò)此項(xiàng)研究，我們已掌握了從取樣到移栽等一整套的操作技術(shù)，這項(xiàng)技術(shù)打破了卡瓦胡椒只能依靠扦插進(jìn)行繁殖的單一繁殖方法，可以滿足商品化、工廠化大規(guī)?？焖偕a(chǎn)卡瓦胡椒無(wú)菌、無(wú)毒栽培苗植株的要求，具有較大的商業(yè)應(yīng)用前景。下面結(jié)合實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明1、材料來(lái)源以從庫(kù)克等南太平洋島國(guó)引種、種植于中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室溫室的卡瓦胡椒(Piper MethysticumForst.f)一年生莖作為初始外植體。
2、方法(1)材料預(yù)處理及外植體消毒 ①預(yù)處理取健康的一年生莖進(jìn)行經(jīng)預(yù)處理后，用流線型自來(lái)水沖洗過(guò)夜或不低于12小時(shí)；②外植體消毒將初始外植體切割成1cm長(zhǎng)的莖段外植體，每個(gè)外植體(莖段)帶有1個(gè)休眠芽，用70％酒精處理30-60秒，0.1％升汞消毒10-15分鐘，無(wú)菌水沖洗3-4次，每次5分鐘。
(2)誘導(dǎo)休眠芽出芽將消毒后的外植體接種于MS+BA 1.0mg/L+NAA 0.1mg/L+30g/L蔗糖+7g/L瓊脂培養(yǎng)基(pH＝5.8)上，置于26-28℃、12小時(shí)光照/12小時(shí)黑暗條件下培養(yǎng)，光照強(qiáng)度為1500lx。
(3)切取初生芽及誘導(dǎo)叢生芽切取生長(zhǎng)15天、萌發(fā)的休眠芽尖端0.5mm芽尖為次級(jí)外植體，接種于MS+BA1.0mg/L+NAA0.1mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂7g/L誘導(dǎo)培養(yǎng)基(PH＝5.8)上誘導(dǎo)出芽。在此基礎(chǔ)上，切取誘導(dǎo)出的芽接種于MS+BA1.0mg/L+NAA0.1mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂7g/L誘導(dǎo)培養(yǎng)基(PH＝5.8)培養(yǎng)基上，置于26-28℃、12小時(shí)光照/12小時(shí)黑暗、光照強(qiáng)度為1500lx條件下，以芽為基礎(chǔ)誘導(dǎo)叢生芽。
(4)誘導(dǎo)愈傷組織及叢生芽取芽繁芽途徑獲得的無(wú)菌苗葉片，接種于MS+BA1.0mg/L+NAA0.1mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂7g/L培養(yǎng)基(pH＝5.8)上誘導(dǎo)愈傷組織，然后將生長(zhǎng)良好的愈傷組織快接種于叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基MS+BA1.0mg/L+IAA0.5mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂7g/L培養(yǎng)基(pH＝5.8)上，置于26-28℃、12小時(shí)光照/12小時(shí)黑暗、光照強(qiáng)度為1500lx條件下誘導(dǎo)愈傷組織出芽(叢生芽)。
(5)誘導(dǎo)生根從叢生芽中切取生長(zhǎng)良好的單個(gè)芽，接種于1/2MS+IBA0.75mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂7g/L培養(yǎng)基(pH＝5.8)上，26-28℃、12小時(shí)光照/12小時(shí)黑暗、光照強(qiáng)度為1500lx條件下誘導(dǎo)生根。
(6)試管苗苗馴化及移栽將生根苗置于自然光下經(jīng)2-3天的煉苗后，洗去根上的瓊脂，移栽于滅菌的基質(zhì)(砂∶火山巖土∶椰糠＝1∶2∶1)中，26-28℃，每日光照培養(yǎng)12小時(shí)，強(qiáng)度為800lx，1-15天后移栽入大田。
附相關(guān)數(shù)據(jù)與表格表一休眠芽來(lái)源芽的生長(zhǎng)時(shí)間與污染率之間的關(guān)系(使用0.5-1.0mm長(zhǎng)芽尖為外植體)
表二激素對(duì)芽增殖誘導(dǎo)的影響
表三激素對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響(愈傷組織鮮重g)
表四4激素對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)出芽的影響(芽數(shù)/每塊愈傷組織)
表五不同濃度IBA對(duì)催根效果的影響.


卡瓦胡椒離體組織培養(yǎng)的技術(shù)與方法。A.誘導(dǎo)休眠芽出芽；B.誘導(dǎo)芽增殖；C.誘導(dǎo)愈傷組織；D.誘導(dǎo)叢生芽；E.催根；F.組培苗完整植株。
權(quán)利要求
1.卡瓦胡椒離體組織培養(yǎng)技術(shù)與方法，即通過(guò)2種組織培養(yǎng)技術(shù)路線實(shí)現(xiàn)卡瓦胡椒植株再生的技術(shù)和方法。其技術(shù)路線、步驟及特征如下技術(shù)路線、步驟及特征1.采用含有休眠芽莖段→接種于休眠芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上誘導(dǎo)休眠芽發(fā)芽→切取生長(zhǎng)一定時(shí)間和具有一定長(zhǎng)度的幼嫩芽接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基→誘導(dǎo)不定芽發(fā)生→切取不定芽轉(zhuǎn)入繼代培養(yǎng)基中增殖培養(yǎng)→不定芽轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中誘導(dǎo)不定根發(fā)生→形成具有根、莖、葉的完整卡瓦胡椒苗→移植于營(yíng)養(yǎng)杯→組培苗大田種植的方法。技術(shù)路線、步驟、步驟及特征2.采用含有休眠芽莖段→接種于休眠芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上誘導(dǎo)休眠芽發(fā)芽→切取生長(zhǎng)一定時(shí)間和具有一定長(zhǎng)度的幼嫩芽接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基→誘導(dǎo)不定芽發(fā)生→切取不定芽葉片誘導(dǎo)愈傷組織發(fā)生→將愈傷組織轉(zhuǎn)入不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)叢生芽→切取單個(gè)芽轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中誘導(dǎo)不定根發(fā)生→形成具有根、莖、葉的完整卡瓦胡椒苗→移植于營(yíng)養(yǎng)杯→組培苗大田種植的方法。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的卡瓦胡椒離體組織培養(yǎng)技術(shù)與方法，其特征在于利用一年生、帶有休眠芽的健康卡瓦胡椒莖為初始外植體。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的卡瓦胡椒離體組織培養(yǎng)技術(shù)與方法，其特征在于對(duì)初始外植體進(jìn)行預(yù)處理，方法為用流線型自來(lái)水常溫條件下沖洗12小時(shí)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的卡瓦胡椒離體組織培養(yǎng)技術(shù)與方法，其特征在于將預(yù)處理后的初始外植體即帶有休眠芽的莖，切割成帶有一個(gè)休眠芽、約1cm長(zhǎng)的莖段作為外植體。然后，將外植體接種于MS+BA 0.5mg/L+IAA 0.5mg/L+30g/L蔗糖+7g/L瓊脂培養(yǎng)基(pH＝5.8)上，置于26-28℃、12小時(shí)光照/12小時(shí)黑暗條件下培養(yǎng)，光照強(qiáng)度為1500lx。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的卡瓦胡椒離體組織培養(yǎng)技術(shù)與方法，其特征在于切取生長(zhǎng)15天、萌發(fā)的休眠芽尖端0.5-1mm芽尖為次級(jí)外植體，接種于MS+BA0.5mg/L+IAA0.5mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂7g/L誘導(dǎo)培養(yǎng)基(PH＝5.8)上誘導(dǎo)出芽。在此基礎(chǔ)上，切取誘導(dǎo)出的芽接種于MS+BA 0.5mg/L+NAA0.5mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂7g/L誘導(dǎo)培養(yǎng)基(PH＝5.8)培養(yǎng)基上，置于26-28C、12小時(shí)光照/12小時(shí)黑暗、光照強(qiáng)度為1500lx條件下，誘導(dǎo)芽繁芽。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的卡瓦胡椒離體組織培養(yǎng)技術(shù)與方法，其特征在于取芽繁芽途徑獲得的無(wú)菌苗葉片，接種于MS+BA1.0mg/L+IAA0.5mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂7g/L培養(yǎng)基(pH＝5.8)上誘導(dǎo)愈傷組織，然后將生長(zhǎng)良好的愈傷組織快接種于叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基MS+BA1.0mg/L+IAA0.5mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂7g/L培養(yǎng)基(pH＝5.8)上，置于26-28℃、12小時(shí)光照/12小時(shí)黑暗、光照強(qiáng)度為1500lx條件下誘導(dǎo)愈傷組織出芽(叢生芽)。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的卡瓦胡椒離體組織培養(yǎng)技術(shù)與方法，其特征在于將權(quán)利要求5和6獲得的芽，進(jìn)行催根培養(yǎng)，步驟為將繁殖芽接種于1/2MS+IBA0.75mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂7g/L培養(yǎng)基(pH＝5.8)上，26-28℃、12小時(shí)光照/12小時(shí)黑暗、光照強(qiáng)度為1500lx條件下誘導(dǎo)生根。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述，其特征在于所述的卡瓦胡椒離體組織培養(yǎng)技術(shù)與方法，試管苗馴化及移栽步驟為生根苗經(jīng)2-3天的自然光煉苗后，洗去根上的瓊脂，移栽于滅菌的基質(zhì)(砂∶火山巖土∶椰糠＝1∶2∶1)中，26-28℃，每日光照培養(yǎng)12小時(shí)，強(qiáng)度為800lx，20天后移栽入大田。
全文摘要
卡瓦胡椒離體組織培養(yǎng)技術(shù)與方法。本發(fā)明涉及通過(guò)兩種組織培養(yǎng)技術(shù)路線實(shí)現(xiàn)卡瓦胡椒植株再生的技術(shù)和方法，其主要特征在于克服了卡瓦胡椒無(wú)菌離體組織培養(yǎng)中的技術(shù)瓶頸——內(nèi)生菌污染，打破了卡瓦胡椒只能依靠扦插進(jìn)行繁殖的單一繁殖方法，通過(guò)芽繁芽、愈傷組織誘導(dǎo)叢生芽?jī)蓷l途徑成功實(shí)現(xiàn)了卡瓦胡椒無(wú)菌、無(wú)毒苗植株的再生和快繁。本方法培養(yǎng)的卡瓦胡椒幼苗為無(wú)菌、無(wú)毒苗，每月繁殖指數(shù)達(dá)7－8，生根率達(dá)100％，移栽成活率為87.2％。這項(xiàng)技術(shù)的發(fā)明和成功應(yīng)用具有十分重要的社會(huì)和經(jīng)濟(jì)效益，能夠?yàn)樯唐坊?、工廠化大規(guī)?？焖偕a(chǎn)卡瓦胡椒無(wú)菌、無(wú)毒栽培苗提供技術(shù)支撐。
文檔編號(hào)A01G1/00GK101040601SQ200610146949
公開(kāi)日2007年9月26日 申請(qǐng)日期2006年11月19日 優(yōu)先權(quán)日2006年11月19日
發(fā)明者張治禮, 陳雄庭, 鄭學(xué)勤 申請(qǐng)人:中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所, 中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室