專利名稱：用于果蔬采后病害生物防治的海洋酵母及其制備方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物防治領(lǐng)域，尤其涉及一種用于果蔬采后病害生物防治的海洋 酵母及其制備方法和用途。
背景技術(shù)：
近20年來，中國果蔬行業(yè)得到飛速發(fā)展，取得巨大成就，已成為世界上最 大的果蔬原料生產(chǎn)國。2004年，我國果品總產(chǎn)量(含果用瓜類)達(dá)15000萬噸， 蔬菜總產(chǎn)量突破54900萬噸，果蔬總產(chǎn)值超過4000億元，已經(jīng)成為廣大農(nóng)民的 主要經(jīng)濟(jì)來源之一[']。我國果蔬品種繁多，而且許多果蔬品質(zhì)優(yōu)良，風(fēng)味獨(dú)特， 極具市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力。但是很多優(yōu)質(zhì)果蔬受到產(chǎn)地的限制，無法進(jìn)入高級(jí)市場(chǎng)，出 口售價(jià)也很低。主要原因是貯藏技術(shù)不夠發(fā)達(dá)，致使果蔬產(chǎn)品的采后品質(zhì)下降、 腐爛嚴(yán)重，平均年損朱率達(dá)35%,個(gè)別地區(qū)和品種更是高達(dá)50%。
果蔬采后腐爛大多由真菌引起[2]，目前常規(guī)的方法是冷鏈技術(shù)結(jié)合化學(xué)殺菌 劑，但是冷鏈技術(shù)不僅成本高，而且低溫只能抑制病原菌，不能根除，還會(huì)導(dǎo) 致熱帶和亞熱帶果蔬的冷害；冷害以上的溫度則不能有效地控制微生物的活動(dòng)， 腐爛相當(dāng)嚴(yán)重?；瘜W(xué)殺菌劑雖然可以有效的抑制病原菌的生長(zhǎng)，但是長(zhǎng)期高濃 度的頻繁使用化學(xué)殺菌劑會(huì)使病原菌產(chǎn)生抗性，并且造成果蔬上農(nóng)藥殘留的增 加。隨著人們對(duì)居住環(huán)境和生活健康等要求的日益提高，利用微生物代替化學(xué) 殺菌劑防治果蔬腐爛，安全性高、污染少，近年來迅速得到發(fā)展。
細(xì)菌、霉菌、酵母菌均可作為桔抗微生物來防治果蔬采后病害。國內(nèi)外的 研究者已經(jīng)利用微生物在對(duì)柑橘、蘋果、梨、桃子、草莓和櫻桃等多種水果的 采后病害生物防治中取得了多方面的進(jìn)展["7]。其中，酵母菌株由于具有拮抗效 果好、不產(chǎn)生毒素、可以和化學(xué)殺菌劑共同使用等優(yōu)點(diǎn)而成為果蔬采后生物防 治研究的熱點(diǎn)。但是由于水果表面菌種資源有限，目前90%以上關(guān)于酵母菌株的 研究集中在羅倫隱球酵母和季也蒙畢赤酵母等極少數(shù)從果實(shí)表面分離的酵母菌 株上，這類酵母菌株與化學(xué)殺菌劑相比效果不穩(wěn)定，生產(chǎn)成本高，這使得微生 物殺菌劑的發(fā)展遭遇到了瓶頸。
海洋酵母是生活在海水中酵母的通稱，是酵母家族的一個(gè)生態(tài)類群，廣泛 分布于各種自然海域中。海洋酵母除耐鹽性外，其生物學(xué)性質(zhì)和細(xì)胞的組成成 分與陸生酵母基本相同。海洋酵母非常適合于工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)，技術(shù)成熟，生產(chǎn)穩(wěn)定.產(chǎn)量高，周期短。尤其是海洋酵母的活細(xì)胞可以低溫下長(zhǎng)期貯存，
非常適合向市場(chǎng)推廣。
參考文獻(xiàn)王文生.新型保鮮劑在果蔬貯運(yùn)中的應(yīng)用.加工技術(shù)，2006， 3: 24-25張紅印，蔣益虹，鄭曉冬，席嶼芳，孫萍.酵母菌對(duì)果蔬采后病害防治的研
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發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種用于果蔬采后病害生物防治的海洋酵母及其制備 方法和用途。
用于果蔬采后病害生物防治的海洋酵母(i^odos/w^ww ;^/w^^"m/w Fell & Tallman)，在英國國際真菌研究所國際農(nóng)業(yè)與生物中心基因資源保藏中心保 藏，保藏號(hào)為SD225，菌落為粉紅色，表面光滑，在添加有l(wèi) 2%NaCl的NYDB 培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，當(dāng)NaCl濃度達(dá)到1696時(shí)，酵母停止生長(zhǎng)。
用于果蔬采后病害生物防治的海洋酵母的制備方法步驟如下
1) 從中國舟山，青島海區(qū)的近海海域采取海水樣品，稀釋，吸取O. 1 0.2mL 稀釋的海水樣品均勻涂布在含有l(wèi) 2%NaCl的NYDA培養(yǎng)基的平板上，倒置于 培養(yǎng)箱內(nèi)，恒溫26 28。C培養(yǎng)3 4天，用接種環(huán)挑出培養(yǎng)特征相異的單菌落進(jìn) 行平皿劃線純化，鏡檢確認(rèn)為酵母后，接入NYDA培養(yǎng)基斜面中進(jìn)行培養(yǎng)保存;
2) 把斜面保存的酵母菌接種到裝有已經(jīng)滅菌的35 70mLNYDB培養(yǎng)基的 250mL的三角瓶中，恒溫26 28'C下150 200轉(zhuǎn)/分鐘培養(yǎng)18 30小時(shí)，發(fā)酵液2000 3000轉(zhuǎn)/分鐘下離心5 10分鐘收集菌體，并用無菌水洗滌酵母菌 體兩次，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)并調(diào)整成濃度為10B 109CFU/mL的酵母菌細(xì)胞懸浮 液；將鏈格孢、擴(kuò)展青霉、指狀青籜、灰葡萄孢、多毛孢在26 28*€下培養(yǎng)7 14天，刮取適量孢子，轉(zhuǎn)移到含有0.05%Tween80的無菌水中，用血球計(jì)數(shù)板 計(jì)數(shù)并調(diào)整濃度至5Xl(T個(gè)/mL，待用；
3) 挑選成熟果實(shí)浸入含有0. 05%的次氯酸鈉溶液的自來水中消毒15秒 45 秒，再?zèng)_洗，晾干；用滅菌的打孔器在每個(gè)果實(shí)的腰部制造5mmX2mm的傷口， 先接種20 40 ii 1拮抗菌菌懸液，2 4小時(shí)后，再接種10 20 u 1病原菌孢子懸 浮液將果實(shí)至于塑料盒中，外套塑料袋以保持濕度；處理果實(shí)貯于20 25C 下4 6天后觀察酵母菌對(duì)果實(shí)釆后病原菌的抑制率；
4) 根據(jù)分離的酵母菌對(duì)各種病原菌的抑制率，篩選出一株對(duì)鏈格孢，擴(kuò)展 青霉、指狀青霉、灰葡萄孢、多毛孢均有顯著抑制效果的海洋酵母，經(jīng)英國國 際微生物研究所(CABI Bioscience Identification Services)鑒定為/ /wflfcMpo"Vft'"附
Fell & Taliman。
所述的菌株發(fā)酵培養(yǎng)基NYDB組成如下:牛肉膏6 8g/L、酵母粉4 5 g/L、 葡萄糖8 10g/L、氯化鈉10 20g/L;
菌株保存培養(yǎng)基NYDA組成如下牛肉膏6 8g/L、酵母粉4 5g/L、葡 萄糖8 10g/L、氯化鈉10 20g/L，瓊脂10 20g/L。
用于果蔬采后病害生物防治的海洋酵母用于防治果蔬采后由鏈格孢，擴(kuò)展 青霉、指狀青霉、灰葡萄孢、多毛孢等真菌造成的腐爛。
海洋酵母/ /Kwfoj/ oW^"加pa/w^ge"M7w Fell & Tallman在國內(nèi)外均是首次用 于微生物防治。該菌株從海水中分離，通過觀察果實(shí)腐爛抑制效果篩選得到。 / /kw/o印o/"W/ww pa/u^gCTw加Fell & Tallman在含有l(wèi) 2%NaCl的NYDB培養(yǎng)基 中生長(zhǎng)良好，單獨(dú)使用一定濃度的該酵母細(xì)胞懸浮液能有效降低多種果蔬釆后 真菌病害的發(fā)生率。此法成本低，不污染環(huán)境，市場(chǎng)前景廣闊。同時(shí)，也有利 于我國優(yōu)質(zhì)果蔬產(chǎn)品的出口創(chuàng)匯，經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益十分顯著。


圖1室溫下本發(fā)明的海洋酵母菌株及./w/"rf扭""加Fell & Tallman對(duì)櫻桃番 茄果實(shí)采后鏈格孢和灰葡萄孢病害的防治效果柱狀圖2是室溫下本發(fā)明的海洋酵母菌株及./w/urf(g幼鵬Fell & Tallman對(duì)碰柑 果實(shí)采后青霉病害的防治效果柱狀圖3是室溫下本發(fā)明的海洋酵母菌株及./7aZw%e"wm Fell & Tallman對(duì)柿子果實(shí)采后多毛孢病害的防治效果柱狀圖
圖4是室溫下本發(fā)明的海洋酵母菌株及.pa/wftge""加Fell & Tallman對(duì)櫻桃
番茄果實(shí)腐爛的防治效果柱狀圖5是室溫下本發(fā)明的海洋酵母菌株及.Fell & Tallman對(duì)櫻桃 番茄貯藏外觀的效果折線圖6是室溫下本發(fā)明的海洋酵母菌株及./ fl/Mrffgem<m Fell & Tallman對(duì)櫻桃
番茄貯藏口感的效果折線圖。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1
1) 從中國舟山，青島海區(qū)的近海海域采取幾十種海水樣品，稀釋不同倍數(shù)， 從各稀釋濃度的海水樣品中分別吸取O.lmL均勻涂布在NaCL濃度為2%的 NYDA培養(yǎng)基平板上，倒置于培養(yǎng)箱內(nèi)，恒溫281C培養(yǎng)3天，用接種環(huán)挑出培 養(yǎng)特征相異的單菌落進(jìn)行平皿劃線純化，鏡檢確認(rèn)為酵母后，接入NYDA培養(yǎng) 基斜面中進(jìn)行培養(yǎng)保存。
2) 把斜面保存的酵母菌接種到裝有已經(jīng)滅菌的70mLNYDB培養(yǎng)基的 250mL的三角瓶中，恒溫28'C下150轉(zhuǎn)/分鐘培養(yǎng)18小時(shí)，2000轉(zhuǎn)/分鐘下離 心10分鐘收集菌體，并用無菌水洗滌酵母菌體兩次，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)并調(diào)制 成濃度為10fiCFU/mL的酵母菌懸液。將擴(kuò)展青霉CP幼cz7/z'"加exptwwww)、指狀 胄霉(/>e"/c///z'w/w c^z'to加加)在28'C下培養(yǎng)7天，刮取適量孢子，轉(zhuǎn)移到含有 0.059&Tween80的無菌水中，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)并調(diào)整濃度至5Xl(^個(gè)/mL，待 用。
3) 本實(shí)施例以碰柑為試驗(yàn)材料。果實(shí)來源于浙江黃巖果園。挑選出成熟果 實(shí)浸入含有0.05%的次氯酸鈉溶液的自來水中消毒30秒，再?zèng)_洗，晾干。用滅 菌的打孔器在每個(gè)果實(shí)的腰部制造5mmX2mm的傷口，先接種40 y 1酵母細(xì)胞 懸浮液，2小時(shí)后，再接種20iU病原菌孢子懸浮液。將果實(shí)至于塑料盒中，外 套塑料袋以保持濕度。處理果實(shí)貯于20'C下4天后觀察酵母對(duì)果實(shí)腐爛的抑制 率。
4) 篩選出一株對(duì)碰柑指狀青霉，擴(kuò)展青霉均有顯著抑制效果的酵母，經(jīng)英
國國際微生物研究所(CABI Microbial Identification Service)鑒定為 及/ioc&75/707"zViz'"m / a/uc/(genu加Fell & Tallman 。
實(shí)施例2
1)從中國舟山，青島海區(qū)的近海海域采取海水樣品，稀釋，吸取0.2mL稀釋的海水樣品均勻涂布在含有2%NaCl的NYDA培養(yǎng)基的平板上，倒置 于培養(yǎng)箱內(nèi)，恒溫26'C培養(yǎng)4天，用接種環(huán)挑出培養(yǎng)特征相異的單菌落進(jìn)行平 皿劃線純化，鏡檢確認(rèn)為酵母后，接入NYDA培養(yǎng)基斜面中進(jìn)行培養(yǎng)保存；
2) 把斜面保存的酵母菌接種到裝有己經(jīng)滅菌的35mLNYDB培養(yǎng)基的 250mL的三角瓶中，恒溫26。C下200轉(zhuǎn)/分鐘培養(yǎng)30小時(shí)，發(fā)酵液3000轉(zhuǎn)/分 鐘下離心5分鐘收集菌體，并用無菌水洗滌酵母菌體兩次，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù) 并調(diào)制成濃度為109CFU/mL的酵母細(xì)胞懸浮液；將鏈格孢U/fer"an'a a/tem^")、 灰葡萄孢(Bo吵fe d"we")在26'C下培養(yǎng)14天，刮取適量孢子，轉(zhuǎn)移到含有 0.059&Tween80的無菌水中，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)并調(diào)整濃度至5X 1(T個(gè)/mL，待 用；
3) 本實(shí)施例以櫻桃番茄為試驗(yàn)材料。果實(shí)來源于杭州郊區(qū)果園。挑選成熟 果實(shí)浸入含有0.05%次氯酸鈉溶液的自來水中消毒15秒，再?zèng)_洗，晾干；用滅 菌的打孔器在每個(gè)果實(shí)的腰部制造5mmX2mm的傷口 ，先接種20 yl拮抗菌菌 懸液，4小時(shí)后，再接種lOul病原菌孢子懸浮液；將果實(shí)至于塑料盒中，外 套塑料袋以保持濕度；處理果實(shí)貯于25'C下4天后觀察酵母對(duì)果實(shí)采后病原菌 的抑制率，；
4) 根據(jù)分離的酵母對(duì)不同果實(shí)采后病原菌的抑制率,篩選出一株對(duì)鏈格孢、 灰葡萄孢均有顯著抑制效果的海洋酵母，經(jīng)英國國際微生物研究所(CABI Bioscience Identification Services)鑒定為^/zoc/os/wnVZ/wm pa/Md(gewM/w Fell & Tallman。
本發(fā)明制備的海洋酵母有如下特征
1) 形態(tài)特征
紅冬孢酵母菌株，分類命名為朋ocfewj; o"W譜/ a/w侮e"腦Fell & Tallman， 已于2006年4月19日保藏在英國國際真菌研究所國際農(nóng)業(yè)與生物中心基因資 源保藏中心，地址英國TW20 9TY薩里郡艾格鎮(zhèn)貝克漢姆路國際農(nóng)業(yè)與 生物中心英國中心。保藏編號(hào)為SD 225。
2) 培養(yǎng)特性
對(duì)兄pa/wc^gewwm Fell & Tallman進(jìn)行耐鹽性試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，該菌株在NYDB培 養(yǎng)基NaCl濃度達(dá)到2%時(shí)生長(zhǎng)最好，與從果實(shí)表面分離的拮抗酵母羅倫隱球酵 母和粘紅酵母相比，該菌株具有更高的耐鹽性。當(dāng)NaCl濃度達(dá)到16%時(shí)，該菌 株菌體生長(zhǎng)才完全受到抑制。這也證實(shí)了 i . /^/Mdge"Mw Fell & Tallman是一株 來自于海洋的酵母。實(shí)施例3
室溫下本發(fā)明的海洋酵母菌株及./w/M￡%em/m Fell & Tallman對(duì)樓桃番茄果 實(shí)采后鏈格孢和灰葡萄孢病害的防治效果
1) 酵母細(xì)胞懸浮液的配置
將保藏培養(yǎng)基菌種活化后接種到裝有已經(jīng)滅菌的35ml培養(yǎng)基的250ml的三 角瓶中，在26。C下150轉(zhuǎn)/分鐘培養(yǎng)30小時(shí)左右，2000轉(zhuǎn)/分鐘下離心10分鐘 收集菌體，并用無菌水洗滌酵母菌體，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，調(diào)節(jié)細(xì)胞懸浮液濃 度為108CFU/mL的酵母細(xì)胞懸浮液。
2) 本實(shí)施例以櫻桃番茄為試驗(yàn)材料。果實(shí)來源于杭州郊區(qū)果園。 病原菌鏈格孢(爿/teA7ww7aa/ter"ato)、灰葡萄孢(5ofryfts cz'形wa) 櫻桃番茄果實(shí)刺傷后接種酵母細(xì)胞懸浮液。接種量20nl為。2小時(shí)后，接
種10 P 1濃度為5X 1(T個(gè)/mL的病原菌孢子懸浮液。果實(shí)處理后20"下入庫jJC 藏6天，觀察其發(fā)病率。
/ . pfl/wflf扭""m Fell & Tallman菌株對(duì)櫻桃番茄果實(shí)采后鏈格孢病害和灰葡 萄孢病害的防治效果如圖1所示，酵母細(xì)胞懸浮液濃度為108CFU/mL時(shí)可以顯 著抑制櫻桃番茄采后鏈格孢病害和灰葡萄孢病害的發(fā)生。 實(shí)施例4
室溫下本發(fā)明的海洋酵母菌株及./7fl/W扭"M加Fell & Tallman對(duì)碰柑果實(shí)采 后青霉病害的防治效果
1) 酵母細(xì)胞懸浮液的配置
將保藏培養(yǎng)基菌種活化后接種到裝有已經(jīng)滅菌的70ml的NYDB培養(yǎng)基的 250ml的三角瓶中，在28'C下200轉(zhuǎn)/分鐘培養(yǎng)18小時(shí)，3000轉(zhuǎn)/分鐘下離心5 分鐘收集菌體，并用無菌水洗滌酵母菌體，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，調(diào)節(jié)細(xì)胞懸浮 液濃度為1(f-l(yCFU/mL的酵母細(xì)胞懸浮液。
2) 本實(shí)施例以碰坩為試驗(yàn)材料。果實(shí)來源于浙江黃巖果園。 病原菌指狀青霉(尸ew&z7"w加i/(gi'toft/m)
櫻桃番茄果實(shí)刺傷后分別接種不同濃度的酵母細(xì)胞懸浮液。接種量40ul 為。4小時(shí)后，接種20n 1濃度為5X104個(gè)/mL的指狀青每孢子懸浮液。果實(shí)處 理后25'C下入庫貯藏4天，觀察其發(fā)病率。
兄/w/i^(ge""iw Fell & Tallman菌株對(duì)碰柑果實(shí)采后靑霉病害的防治效果如 圖2所示，各個(gè)濃度的酵母細(xì)胞懸浮液對(duì)櫻桃番茄采后鏈格孢病害均有顯著的 防治效果，濃度越高效果越好。實(shí)施例5
室溫下本發(fā)明的海洋酵母菌株凡/w/m^伊""w Fell & Tallman對(duì)柿子果實(shí)釆 后多毛孢病害的防治效果
1) 海洋酵母細(xì)胞懸浮液的配置
將保藏培養(yǎng)基菌種活化后接種到裝有己經(jīng)滅菌的50ml培養(yǎng)基的250ml的三 角瓶中，在27'C下180轉(zhuǎn)/分鐘培養(yǎng)24小時(shí)左右，2500轉(zhuǎn)/分鐘下離心7分鐘 收集菌體，并用無菌水洗滌酵母菌體，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，調(diào)節(jié)細(xì)胞懸浮液濃 度為10MCFU/mL的酵母細(xì)胞懸浮液。
2) 本實(shí)施例以柿子為試驗(yàn)材料。果實(shí)來源于浙江淳安果園。 病原菌多毛孢(戶幼to/oriaflf/os/3DT)
柿子果實(shí)刺傷后接種酵母細(xì)胞懸浮液。接種量30iU為。3小時(shí)后，接種15 u 1濃度為的鏈格孢孢子懸浮液。果實(shí)處理后22'C下入庫jie藏5天，觀察其發(fā)病率。
/ . /w/"^ge"z湖Fell & Tallman菌株對(duì)柿子果實(shí)采后多毛孢病害的防治效果 如圖3所示，酵母細(xì)胞懸浮液濃度為108CFU/mL時(shí)可以顯著抑制柿子多毛孢病
害的發(fā)生。 實(shí)施例6
室溫下本發(fā)明的海洋酵母菌株及.；wZu^g幼w附Fell & Tallman對(duì)樓桃番茄果
實(shí)腐爛的防治效果
1) 酵母細(xì)胞懸浮液的配置
將保藏培養(yǎng)基菌種活化后接種到裝有已經(jīng)滅菌的50mlNYDB培養(yǎng)基的 250ml的三角瓶中，在28'C下200轉(zhuǎn)/分鐘培養(yǎng)20小時(shí)，2800轉(zhuǎn)/分鐘下離心6 分鐘收集菌體，并用無菌水洗滌酵母菌體，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，調(diào)節(jié)細(xì)胞懸浮 液濃度為108CFU/mL的酵母細(xì)胞懸浮液。
2) 本實(shí)施例以櫻桃番茄為試驗(yàn)材料。果實(shí)來源于杭州郊區(qū)果園。 將完整無損的果實(shí)置于酵母細(xì)胞懸浮液中，浸泡30秒，撈出晾干，在20
r下入庫貯藏25天，觀察其發(fā)病率并測(cè)定其品質(zhì)指標(biāo)。
及.戶/W扭m/附Fell & Tallman菌株對(duì)櫻桃番茄果實(shí)腐爛率的防治效果如圖 4所示，好果率達(dá)到75%以上，沒有采用酵母細(xì)胞懸浮液處理的樓桃番茄好果率 僅為30%。如圖5、 6所示，經(jīng)/ . Fell & Tallman處理的果實(shí)仍基本
保持新鮮果實(shí)的艷麗色澤，果實(shí)的硬度和風(fēng)味基本不變，
因此，本發(fā)明的酵母拮抗菌具有防止腐爛、控制氧化變色和軟化變味的多 種功能，配制和使用方便，安全無毒，對(duì)多種果蔬均有明顯的保鮮效果，是一 株及具潛力的新的生物防治菌株。
權(quán)利要求
1. 一種用于果蔬采后病害生物防治的海洋酵母(Rhodosporidiumpaludigenum Fell & Tallman)，其特征在于在英國國際真菌研究所國際農(nóng)業(yè)與生物中心基因資源保藏中心保藏，保藏號(hào)為SD 225，菌落為粉紅色，表面光滑，在添加有1～2％NaCl的NYDB培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，當(dāng)NaCl濃度達(dá)到16％時(shí)，酵母停止生長(zhǎng)。
2. —種如權(quán)利要求1所述用于果蔬采后病害生物防治的海洋酵母的制備方 法，其特征在于它包括如下步驟1) 從中國舟山，青島海區(qū)的近海海域采取海水樣品，稀釋，吸取0. 1 0. 2mL 稀釋的海水樣品均勻涂布在含有l(wèi) 2%NaCl的NYDA培養(yǎng)基的平板上，倒置于 培養(yǎng)箱內(nèi)，恒溫26 28t:培養(yǎng)3 4天，用接種環(huán)挑出培養(yǎng)特征相異的單菌落進(jìn) 行平皿劃線純化，鏡檢確認(rèn)為酵母后，接入NYDA培養(yǎng)基斜面中進(jìn)行培養(yǎng)保存；2) 把斜面保存的酵母菌接種到裝有已經(jīng)滅菌的35 70mLNYDB培養(yǎng)基的 250mL的三角瓶中，恒溫26 28。C下150 200轉(zhuǎn)/分鐘培養(yǎng)18 30小時(shí)，發(fā) 酵液2000 3000轉(zhuǎn)/分鐘下離心5 10分鐘收集菌體，并用無菌水洗滌酵母菌 體兩次，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)并調(diào)整成濃度為106 109CFU/mL的酵母菌細(xì)胞懸浮 液；將鏈格孢、擴(kuò)展青霉、指狀青霉、灰葡萄孢、多毛孢在26 28'C下培養(yǎng)7 14天，刮取適量孢子，轉(zhuǎn)移到含有0. 05%Tween80的無菌水中，用血球計(jì)數(shù)板 計(jì)數(shù)并調(diào)整濃度至5X104個(gè)/mL，待用；3) 挑選成熟果實(shí)浸入含有0. 05%的次氯酸鈉溶液的自來水中消毒15秒 45 秒，再?zèng)_洗，晾干；用滅菌的打孔器在每個(gè)果實(shí)的腰部制造5mmX2mm的傷口， 先接種20 40n 1拮抗菌菌懸液，2 4小時(shí)后，再接種10 20u 1病原菌孢子懸 浮液；將果實(shí)至于塑料盒中，外套塑料袋以保持濕度；處理果實(shí)貯于20 25°C 下4 6天后觀察酵母菌對(duì)果實(shí)采后病原菌的抑制率；4) 根據(jù)分離的酵母菌對(duì)各種病原菌的抑制率，篩選出一株對(duì)鏈格孢，擴(kuò)展 青霉、指狀青霉、灰葡萄孢、多毛孢均有顯著抑制效果的海洋酵母，經(jīng)英國國 際微生物研究所(CABI Bioscience Identification Services )鑒定為及/zoctos/ orWMm p"Wz'ge"訓(xùn)Fell & Talhnan。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述一種用于果蔬采^病害生物防治的海洋酵母的制備 方法，其特征在于所述的菌株發(fā)酵培養(yǎng)基1^B組成如下牛肉膏6 8g/L、 酵母粉4 5g/L、葡萄糖8 10g/L、氯化鈉10 20g/L;
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述一種用于果蔬采后病害生物防治的海洋酵母的制備 方法，其特征在于所述的菌株保存培養(yǎng)基NYDA組成如下牛肉膏6 8g/L、 酵母粉4 5g/L、葡萄糖8 10g/L、氯化鈉10 20g/L，瓊脂10 20g/L。
5. —種如權(quán)利要求1所述用于果蔬采后病害生物防治的海洋酵母的用途， 其特征在于它用于防治果蔬采后由鏈格孢，擴(kuò)展青霉、指狀青霉、灰葡萄孢、 多毛孢等真菌造成的腐爛。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種用于果蔬采后病害生物防治的海洋酵母及其制備方法和用途。從中國東海近海海域的海水中篩選出海洋酵母菌株Rhodosporidium paludigenum Fell & Tallman。該海洋酵母的菌落為粉紅色，表面光滑，在添加有1～2％NaCl的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。利用一定濃度的該酵母細(xì)胞懸浮液可以有效抑制鏈格孢、灰葡萄孢、擴(kuò)展青霉、指狀青霉、多毛孢等多種果蔬采后主要真菌病害的發(fā)生。海洋酵母菌株Rhodosporidium paludigenum Fell & Tallman在國內(nèi)外均是首次用于微生物防治果蔬采后病害。該菌株具有防止腐爛、控制氧化變色和軟化變味的多種功能，配制和使用方便，不產(chǎn)生抗生素，不污染環(huán)境，安全無毒，市場(chǎng)前景廣闊。同時(shí)，也有利于我國優(yōu)質(zhì)果蔬產(chǎn)品的出口創(chuàng)匯，經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益十分顯著。
文檔編號(hào)A01P3/00GK101412972SQ20061015506
公開日2009年4月22日 申請(qǐng)日期2006年12月7日 優(yōu)先權(quán)日2006年12月7日
發(fā)明者炫 朱, 湯海青, 王一非, 鄭曉冬 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)