專利名稱：：用于檢測和/或鑒定微生物的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明一般涉及鑒定樣品中微生物的方法，特別地涉及鑒定原核微生物的方法。本發(fā)明的方法特別地用于預(yù)測、診斷、預(yù)防和治療與病原體(包括人類病原體)相關(guān)的疾病，特別是諸如呼吸道感染、胃腸道感染、皮膚感染、生殖道感染和醫(yī)院內(nèi)感染的疾病。本發(fā)明也涉及用于鑒定微生物，特別是原核微生物的試劑盒。
背景技術(shù)：
：目前，診斷細(xì)菌感染所用的標(biāo)準(zhǔn)方法是從患者得到的臨床樣品的培養(yǎng)物。培養(yǎng)技術(shù)已用于臨床診斷許多年。除了慢、耗時和費力之外，培養(yǎng)技術(shù)得到的結(jié)果的可靠性非常低。因此，這已妨礙了開出用于治療細(xì)菌感染的有效藥物的處方，導(dǎo)致更多患者患病和/或死亡。該微生物鑒定方法的其它缺點包括需要專門的生長培養(yǎng)基、不能區(qū)別密切相關(guān)的種和株并需要大量樣品。重要地，已發(fā)現(xiàn)微生物檢測的上述方法難于同時檢測樣品中多于一種的微生物。因此，需要研制鑒定樣品中微生物的快速、靈敏和準(zhǔn)確的方法。
發(fā)明內(nèi)容因此，在第一個方面，本發(fā)明提供用于檢測和/或鑒定試樣中至少一種微生物或用于同時檢測和/或鑒定試樣中幾種微生物的方法，其包括(a)提供疑為包含一種或多種目標(biāo)微生物的試樣；(b)任選地從所述試樣中釋放、分離和/或濃縮來自所述至少一種微生物的聚核酸(polynucleicacids)，如果其存在于該試樣中，所述的或每種所述的聚核酸包括至少部分f"/基因可變區(qū)；(c)在足以發(fā)生雜交的條件下，使所述試樣或來自所述試樣的所述聚核酸與一個或多個源自所述^/基因可變區(qū)的探針接觸一段時間；和(d)檢測在歩驟(C)中發(fā)生的任何雜交；其中存在或不存在雜交表示在所述試樣中存在或不存在所述一種或多種微生物。優(yōu)選的是使用諸如聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)的擴增技術(shù)擴增所述試樣中的聚核酸。因此，在第二個方面，本發(fā)明提供用于檢測和/或鑒定試樣中至少一種微生物或用于同時檢測和/或鑒定試樣中幾種微生物的方法，其包括(a)任選地，從所述至少一種要檢測的微生物中釋放、分離和/或濃縮聚核酸；(b)任選地，用至少一個引物對擴增來自所述微生物的至少部分基因可變區(qū)；(c)在足以發(fā)生雜交的條件下，使所述試樣或來自所述試樣的的所述聚核酸與一個或多個源自所述^/基因可變區(qū)的探針接觸一段時間；和(d)檢測在步驟(C)中發(fā)生的任何雜交；其中存在或不存在雜交表示在所述試樣中存在或不存在所述一種或多種微生物。在某些實施方案中，所述聚核酸源自如在SEQIDNOs.:l至ll中所示的m/基因可變區(qū)。優(yōu)選地，所述聚核酸基本上由SEQIDNOs.:1至11的核苷酸108-220、393-591、708-774、792-816禾口/或885-945組成。在其它實施方案中，所述聚核酸具有對如在SEQIDNOs.:l至ll中所示的^/基因可變區(qū)反義的序列。優(yōu)選地，所述聚核酸基本上由對SEQIDNOs.:1至11的核苷酸108-220、393-591、708-774、792-816和/或885-945反義的核苷酸組成。在某些實施方案中，接觸所述試樣的步驟包括至少部分^//基因可變區(qū)與包括至少一種選自包括SEQIDN0s:12至84、208至251、254-315和330至393的組的探針的雜交。因此，在第三方面，本發(fā)明提供用于檢測和/或鑒定試樣中至少一種微生物或用于同時檢測和/或鑒定試樣中幾種微生物的方法，其包括(a)任選地，從所述至少一種要檢測的微生物中釋放、分離和/或濃縮聚核酸；(b)任選地，用至少一個引物對擴增來自所述微生物的至少部分<基因可變區(qū)；(c)雜交至少部分來自所述微生物的基因可變區(qū)與一組包括至少一個選自下述探針的探針SEQIDNOs:12至84、208至251、254-315和330至393;(d)檢測在步驟(C)中形成的雜交物；禾口(e)鑒定來自步驟(d)的所述檢測物中的所述至少一種微生物。在其它實施方案中，至少一個探針選自SEQIDNOs:12至84、208至315或330至393。在其它實施方案中，至少一個探針選自SEQIDNOs:12至392或393。在第四個方面，本發(fā)明提供診斷和/預(yù)測與目標(biāo)微生物相關(guān)的疾病的方法，其包括(a)任選地，從所述至少一種要檢測的微生物中釋放、分離和/或濃縮聚核酸；(b)任選地，用至少一個引物對擴增來自所述微生物的至少部分基因可變區(qū)；(c)在足以發(fā)生雜交的條件下，使所述試樣或來自所述試樣的所述聚核酸與一個或多個源自所述m/基因可變區(qū)的探針接觸一段時間；和(d)檢測在歩驟(C)中發(fā)生的任何雜交；其中存在或不存在雜交表示在所述試樣中存在或不存在目標(biāo)微生物，(e)聯(lián)系存在的所述一種或多種所述目標(biāo)微生物與疾?。缓?f)確定所述疾病的診斷和/或預(yù)測。在第五個方面，本發(fā)明提供用于預(yù)防或治療與目標(biāo)微生物相關(guān)的疾病的方法，其包括(a)任選地，從所述至少一種要檢測的微生物中釋放、分離和/或濃縮聚核酸；(b)任選地，用至少一個引物對擴增來自所述微生物的至少部分化/基因可變區(qū)；(c)在足以發(fā)生雜交的條件下，使所述試樣或來自所述試樣的所述聚核酸與一個或多個源自所述似/基因可變區(qū)的探針接觸一段時間；和(d)檢測在步驟(C)中發(fā)生的任何雜交；其中存在或不存在雜交表示在所述試樣中存在或不存在目標(biāo)微生物，(e)聯(lián)系存在的所述一種或多種所述目標(biāo)微生物與疾?。缓?f)開具預(yù)防或治療所述疾病的處方。在某些實施方案中，聯(lián)系存在的一種或多種目標(biāo)微生物與疾病的步驟或開具治療該疾病處方的步驟包括使用計算機程序的歩驟。在某些實施方案中，所述疾病可以是細(xì)菌感染、呼吸道感染、胃腸道感染、皮膚感染、血流感染、腦膜炎或中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染、尿路感染、生殖道感染、創(chuàng)傷感染或醫(yī)院內(nèi)感染。在某些實施方案中，所述檢測的和/或鑒定的微生物選自博德特氏菌禾中(Bwrfete〃a5"/e"'esO、嗜衣原體菌禾中(CTz/cw^dop/n'/as/ec^s)耆血桿菌禾中(//ae附op/w7us15pec/as0、軍團(tuán)桿菌禾中(丄eg/o"e〃as/ecz'es)、支原體禾中(Afyco//asmas/ec/es:)、分支桿菌禾中(_A^yco6acfer/MWs/ec/eO、葡萄球菌禾中(Stop/;^/ococc船s/ec/es)、鏈球菌禾中(5^eptococcwsspec/es)、假單胞菌禾中(i^e"(io附owass/ec/as)、莫拉氏菌禾中(Moraxellaspecies)和梭桿菌種(FwTO6acten'wws/e"'es)、窄食假單胞菌種(5Vewc^ra//zomcwas/ec/^)、伯克霍爾德菌禾中(SwrA:/zo/6fehs/ec/e)、腸球菌禾中(Enterococcusspecies)、棒狀桿菌禾中(Cb/3^e6actehMw5pec/^s0或奈瑟氏菌禾中(7Ve&化r/aJ7ec/es1)。在某些實施方案中，擴增來自微生物的至少部分^/基因可變區(qū)的步驟使用至少一個引物對，其中至少一個引物選自SEQIDNOs:394-396或其等效物，只要所述等效物特異地同時擴增了不同種類微生物的m/可變區(qū)或其部分。在第六個方面，本發(fā)明提供一種組合物，其包括至少一個選自下述序列的探針SEQIDNOs:12-393或其等效物，只要所述等效物特異地結(jié)合要檢測的微生物的^//基因可變區(qū)。在第七個方面，本發(fā)明提供一種組合物，其包括至少一個選自下述序列的引物SEQIDNOs:394-396或其等效物，只要所述等效物特異地擴增要檢測的微生物的^/"基因可變區(qū)或其部分。在第八個方面，本發(fā)明提供用于檢測和/或鑒定試樣中發(fā)現(xiàn)的至少一種微生物的寡核苷酸探針，所述微生物選自博德特氏菌種、嗜衣原體菌種、嗜血桿菌種、軍團(tuán)桿菌種、支原體種、分支桿菌種、葡萄球菌種、鏈球菌種、假單胞菌種、莫拉氏菌種和梭桿菌種、窄食假單胞菌種、伯克霍爾德菌種、腸球菌種、棒狀桿菌種或奈瑟氏菌種，其中所述探針選自對于流感嗜血桿菌12);:13);CATCGGTGCATTATTACGTGGTAC(SEQIDNO.:14);15);16);CCGTAAATTACTTGACGAAGGTCG(SEQIDNO.:17);ACTTCGAATCAGAAGTGTAC(SEQIDNO.:64);CAAACGTGAAGAAATCGAAC(SEQIDNO.:65);CGATAACATCAAGATGACAGT(SEQIDNO.:66);對于粘膜炎莫拉菌TGAGCGTGACATCGATAAGTCA(SEQIDNO.:18);19);20);CGTAAGCTGCTAGACGAAGGT(SEQIDNO.:21);TACCCCATTCCTAAATGGCTATCG(SEQIDNO.:22);TAACTGGTGCCATCACCCTAC(SEQIDNO.:23);<formula>formulaseeoriginaldocumentpage17</formula>CTGGTGTTGTAAACTTACCAGAAGG(SEQIDNO.:45);GAAATGGTTATGCCTGGCGAC(SEQIDNO.:46);CGTATTATCTAAAGATGAAGGTGGACG(SEQIDNO:50);對于綠膿假單胞菌AAGTTCGAGTGCGAAGT(SEQIDNO.:51);AAGGCGTAGAGATGGTAAT(SEQIDNO.:52);TTCTTCAAGGGCTACCG(SEQIDNO.:53);ATCATCAAGGTCCAGGAAGAAGT(SEQIDNO.:54);ACCAAGACTACCTGCACCG(SEQIDNO.:55);TGTACGTGCTGTCCAAGGAA(SEQIDNO.:56);CCGGTAACTGCGAACTGC(SEQIDNO.:57);CACGTTGACTGCCCCGGTCACGC(SEQIDNO.:85);ACGCCTTCCGGCAGTTCGCAGTTAC(SEQIDNO.:86);ATCGGTCACGTTGACCATGGCA(SEQIDNO.:87);GCCGCCTTCGCGGATCGCGAA(SEQIDNO.:88);對于百日咳桿菌GTACATTCTGTCCAAGGAAG(SEQIDNO.:58);GACAACGTGGGTATCTTG(SEQIDNO.:59);GACAAGGAAATGGTGCT(SEQIDNO..-60);對于肺炎嗜衣原體AATTTAAGTCAGCTGTTTACG(SEQIDNO.:61);GAGGTATTGGAAAGAACGAT(SEQIDNO.:62);ATAACGTTGAGCTTGATGTT(SEQIDNO.:63);對于嗜肺性軍團(tuán)病桿菌AGTTTGAAGCAGAAGTGTAT(SEQIDNO.:67);TGTTATTACGAGGTACGAAG(SEQIDNO.:68);AGATAATGTGCAATTAGTTGTTA(SEQIDNO.:69);對于肺炎支原體GAACGTGGTCAAGTGTTAG(SEQIDNO.:71);GACAATACCTCGATTACAGT(SEQIDNO.:72);對于結(jié)核分枝桿菌AACATCTCGGTGAAGTTGAT(SEQIDNO.:73);TGACAACACCAACATCTC(SEQIDNO.:74);ACGAAGGTCTGCGTTT(SEQIDNO.:75);對于肺炎鏈球菌AATTCAAAGGTGAAGTCTACA(SEQIDNO.:79);CAACGTGATGAAATCGAAC(SEQIDNO.:80);GACAATCGACGTTGAGTT(SEQIDNO.:81);對于化膿性鏈球菌CAACGTGACGAAATCGAA(SEQIDNO.:83);CGTGACAATCAACGTTGA(SEQIDNO.:84);及其組合。在第九個方面，本發(fā)明提供一種雜交方法，其包括使疑為包含聚核酸的試樣與固體載體接觸，所述固體載體具有固定在其上的一個或多個選自SEQIDNOs:12-392或393的探針。在某些實施方案中，提供的本發(fā)明的某些方面為試劑盒。因此，在第十方面，本發(fā)明提供用于檢測和/或鑒定試樣中至少一種微生物或用于同時檢測和/或鑒定試樣中幾種微生物的試劑盒，其包括(a)任選地，至少一個使至少部分加/基因可變區(qū)擴增的引物對；(b)根據(jù)第六個方面的組合物；(c)緩沖液或產(chǎn)生緩沖液所需的組分，其能使包含在所述組合物中的探針和存在于樣品中的聚核酸或其擴增產(chǎn)物進(jìn)行雜交反應(yīng)；(d)溶液或產(chǎn)生所述溶液所需的組分，其能在適當(dāng)?shù)南礈鞐l件下洗滌形成的雜交物；(e)任選的一種用于檢測由前述雜交得到的雜交物的工具。在第十一個方面，本發(fā)明提供用于檢測和/或鑒定痰樣中至少一種微生物或用于同時檢測和/或鑒定痰樣中幾種微生物的方法，其包括步驟(a)任選地，從所述至少一種要檢測的微生物中釋放、分離和/或濃縮聚核酸；(b)任選地，用至少一個引物對擴增來自所述微生物的至少部分基因可變區(qū)；(c)雜交至少部分來自所述微生物的基因可變區(qū)與一組包括至少一個選自下述探針的探針SEQIDNOs:12至84、208至251、254-315和330至393;(d)檢測在歩驟(C)中形成的雜交物；(e)鑒定來自步驟(d)的所述檢測物中的所述至少一種微生物。在第十二個方面，本發(fā)明提供微點陣(microarray，或生物芯片)，其包括至少一個選自下述序列的探針SEQIDNOs:12-393或其等效物，只要所述等效物特異地結(jié)合微生物的^/基因可變區(qū)。圖1:為^/"基因片段的PCR擴增。泳道l、DNA標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)記物；泳道2、肺炎鏈球菌；泳道3、粘膜炎莫拉菌；泳道4、嗜肺性軍團(tuán)病桿菌；泳道5、金黃色葡萄球菌；泳道6、流感嗜血桿菌。圖2:顯示了肺炎鏈球菌的檢測。一式兩份的試驗l、2和3-陽性試驗結(jié)果表明存在肺炎鏈球菌，一種細(xì)菌性肺炎的病原體。試驗l-SEQIDN0.:79試驗2-SEQIDNO.:80試驗3-SEQIDNO.:81圖3:顯示了粘膜炎莫拉菌的檢測。一式兩份的試驗l、2和3-陽性試驗結(jié)果表明存在粘膜炎莫拉菌，一種慢性阻塞性肺病的病原體。試驗l-SEQIDNO.:208試驗2-SEQIDNO.:209試驗3-SEQIDNO.:210圖4:顯示了嗜肺性軍團(tuán)病桿菌的檢測。一式兩份的試驗l、2和3-陽性試驗產(chǎn)生表明存在嗜肺性軍團(tuán)病桿菌，軍團(tuán)病的主要病原體。試驗l-SEQIDNO.:67試驗2-SEQIDNO:68試驗3-SEQIDNO:69圖5:顯示了金黃色葡萄球菌的檢S陽性試驗結(jié)果表明存在金黃色葡萄球菌肺炎的病原體。試驗1-SEQIDN0.:76試驗2-SEQIDNO.:77試驗3-SEQIDNO.:78圖6:顯示了流感嗜血桿菌的檢性試驗結(jié)果表明存在流感嗜血桿菌，試驗l-SEQIDN0.:64試驗2-SEQIDNO.:65試驗3-SEQIDNO.:6具體實施方式在詳細(xì)描述優(yōu)選的實施方案之前，應(yīng)當(dāng)理解本文所用的術(shù)語僅僅是用于描述本發(fā)明的具體實施方案的目的，而不意味著限制本發(fā)明。所有本文引用的出版物、專利和專利申請，無論其在上文或在下文，在此將其全部引入作為參考。然而，本文提及的出版物被引用用于描述和公開試驗設(shè)計和試劑的目的，所述試驗設(shè)計和試劑在所述出版物中有報道，并且可用于本發(fā)明的方面。在本文中沒有內(nèi)容被看作是由于現(xiàn)有發(fā)明而使本發(fā)明沒有先于這樣公開的內(nèi)容的許可。-式兩份的試驗1、2和3-種老年人中軟組織感染和測。一式兩份的試驗l、2和3-陽一種細(xì)菌性肺炎的病原體。除非另有說明，本發(fā)明的實施將使用本領(lǐng)域技術(shù)內(nèi)的微生物學(xué)和分子生物學(xué)的常規(guī)技術(shù)。這樣的技術(shù)描述在文獻(xiàn)中。參見，例如，ImmunochemicalMethodsinCellandMolecularBiology(MayerandWalker,eds.,AcademicPress,London,1987);"MolecularCloning:ALaboratoryManual",2edEd(由Sambrook、Fritsch禾口Maniatis編著)(ColdSpringHarborLaboratoryPress:1989);"NucleicAcidHybridization",(Hames&Higginseds.1984);"OligonucleotideSynthesis"(Gaited.,1984);Remington'sPharmaceuticalSciences，17thEdition，MackPublishingCompany,Easton,Pennsylvania,USA.;"TheMerckIndex",12thEdition(1996)，TherapeuticCategoryandBiologicalActivityIndex;禾口"Transcription&Translation",(Hames&Higginseds.1984)。必須指出，除非上下文另有清楚地規(guī)定，如本文和附加的權(quán)利要求使用的單數(shù)形式的"一"或"所述"包括復(fù)數(shù)參考。因此，例如，參考"微生物"包括復(fù)數(shù)的微生物和"核酸分子"指復(fù)數(shù)核酸分子，除非另有定義，所有本文使用的技術(shù)術(shù)語和科學(xué)術(shù)語具有與如本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常理解的含義相同的含義。在隨后的說明書中，如果沒有說明，應(yīng)當(dāng)理解細(xì)胞培養(yǎng)物技術(shù)是本領(lǐng)域眾所周知的，并且可以采用任何這樣的技術(shù)。盡管同那些本文描述的材料和方法類似或同等的材料和方法可用于實施或試驗本發(fā)明，優(yōu)選的材料和方法為本文目前描述的。"包括"指包括，但不限于，無論在術(shù)語"包括"后跟隨什么。因此，術(shù)語"包括"的使用指列出的要素是所需的或必須的，但是其他的要素是任選的并且可存在或不存在。"由……組成"指包括，并且限于短語"由……組成"之后的要素。因此，短語"由……組成"指所列出的元素是所需的或必須的，并且不可能存在其它要素。"基本上由....組成"指包括該短語后的任何要素，并且限于不妨礙或有助于在公開的內(nèi)容中對所列要素規(guī)定的活性或作用的其它要素。因此，短語"基本上由……組成"指列出的要素是所需的或必須的，但是其他的要素是任選的，可存在或不存在，這取決于它們是否影響所列要素的活性或作用。在導(dǎo)致本發(fā)明的研究中，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，/"/基因包含在不同的微生物之間不同的可變區(qū)，因此，其可用于鑒定不同的微生物。在試樣中的不同微生物可通過檢測可變區(qū)和對該可變區(qū)特異的探針之間的雜交來鑒定。因此，本發(fā)明涉及來源于/"/基因可變區(qū)的聚核酸。如本文所用，"基因"為包含用于特定功能信息的聚核酸分子，比如編碼特定蛋白質(zhì)的序列?；蛞部砂ǚ蔷幋a信息，比如一種或多種信號序列、復(fù)制起點、增強子元件、啟動子和/或轉(zhuǎn)錄終止序列。如本文所用，術(shù)語"聚核酸"指mRNA、RNA、cRNA、cDNA或DNA。^/基因普遍存在于所有的細(xì)菌中并通常包含同樣的序列，即，所有的種之間共有的序列。其它常見細(xì)菌基因的實例包括16s核糖體RNA、23s核糖體RNA和r/wB。不同微生物的/w/序列的實例在SEQIDNos.:l至11中列出。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，本文公開的序列可以與在SEQIDNOs.:l至ll的任一項中提供的序列不同，而沒有背離本發(fā)明。特別地，所述^/基因序列可改變多達(dá)30%，只要變異體的生物活性保留了。特別地，所述變異體必須具有可用于鑒定靶向微生物的可變區(qū)。"m/基因可變區(qū)"為在微生物的種、亞種和次代株之間的m/基因中可改變的那些核苷酸序列。在某些實施方案中，所述^/基因可變區(qū)基本上由SEQIDNOs.:1到11的核苷酸108-220、393-591、708-774、792-816和/或885-945組成。在某些實施方案中，所述/w/基因可變區(qū)來自于洋蔥伯克霍爾德氏菌，其可用于特別地鑒定在患有囊性纖維化的患者的痰樣中的這一菌種。在某些實施方案中，可以使用一個或多個SEQIDNos.:269至275，其相當(dāng)于洋蔥伯克霍爾德氏菌的m/基因可變區(qū)。在其它的實施方案，所述^/基因可變區(qū)來自于嗜麥芽窄食假單胞菌的fw/基因，其可用于特別地鑒定患有綠膿假單胞菌感染之后的肺炎患者的痰樣中的這一菌種。在某些實施方案中，可以使用一個或多個SEQIDNo.:264至268，其相當(dāng)于嗜麥芽窄食假單胞菌的f"/基因可變區(qū)。如本文所用，聚核酸包括m/基因的至少某些部分，其包括^/基因可變區(qū)或源自&/基因。所述聚核酸序列可具有全部的"z/基因本身的核苷酸序列或其部分，只要其包含至少---'個^/基因可變區(qū)或其部分。所述聚核酸也可以對^/基因反義。在本發(fā)明中，術(shù)語"反義"用來表示核酸分子，其為具有對所述基因的^/基因可變區(qū)互補的序列的DNA或RNA。根據(jù)本發(fā)明，所述^/基因可變區(qū)用于鑒定試驗中目標(biāo)微生物。試樣可以是疑為包含目標(biāo)微生物的任何種類的樣品。因此，通過本發(fā)明的方法分析的試樣可以從多種來源獲得。這樣的來源包括，但不限于來源于動物受試者，比如人類、花、種子、植物、食品及來自環(huán)境的樣品。在某些實施方案中，所述試樣為"生物試樣"。術(shù)語"生物試樣"應(yīng)當(dāng)理解為來源于動物的比如，但不限于血液、唾液、尿、淚、汗、腦脊液、淋巴液、血清、血漿、粘液、痰、糞便和活檢標(biāo)本的生物物質(zhì)的任何樣品。根據(jù)本發(fā)明方法試驗的生物試樣可以直接試驗或可能在試驗前需要某種形式的處理。例如，活組織檢査樣品可能需要在試驗前勻漿化。進(jìn)一步地，對于生物試樣不是液態(tài)的情況，(例如，其可能是固體、半固體或脫水的液體樣品)，其可能需要加入試劑，比如賦予樣品可動性的緩沖液。在試驗前，試樣也可能需要加工以釋放任何聚核酸。例如，使用裂解緩沖液，比如商業(yè)可得的裂解溶液可釋放聚核酸。適宜的用于細(xì)菌的商業(yè)可得的裂解溶液為Lyse-N-Go(PierceBiotechnologyInc,RockfordIL，USA)PCR試劑。一旦被釋放，聚核酸可獲得以用于本發(fā)明的方法的試驗。可選地或另外地，可以對所述試樣進(jìn)行純化步驟，以便分離、濃縮或分開試樣中的聚核酸。"分離的"聚核酸為已經(jīng)從其自然環(huán)境中釋放的和/或分開的和/或回收的一種聚核酸。其自然環(huán)境的雜質(zhì)組分為將典型地妨礙鑒定目標(biāo)微生物的物質(zhì)，其可能包括酶、激素和其它蛋白性或非蛋白性溶質(zhì)。在某些實施方案中，聚核酸將被純化和/或濃縮(l)至足夠獲得至少30至45個核苷酸序列信息的堿基對的程度，和/或(2)至通過凝膠電泳可測的均勻性。在分離聚核酸中，可以對試樣進(jìn)行多個不同的加工歩驟，比如組織勻槳、細(xì)胞分離和胞質(zhì)抽提、核酸抽提等。從細(xì)胞、組織、器官或整個生物中分離核酸的方法是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員己知的，并描述在，例如Maniatis等人(MolecularCloning:ALaboratoryManual,ColdSpringHarbourLaboratoryPress,1989)禾口Ausubel等人(CurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWiley&Sons,Inc1998)中，將每篇中的內(nèi)容引入本文作為參考。在本發(fā)明的某些實施方案中，來自試樣的細(xì)胞可用作用于分析的聚核酸的來源，從而避免了純化培養(yǎng)物的需要。聚核酸分子可以是DNA、RNA或二者的組合。在某些實施方案中，聚核酸為DNA。優(yōu)選地，有至少IOO微克可獲得的DNA用于分析；然而，非常較少量的DNA可用于本發(fā)明的方法。當(dāng)僅僅可獲得低水平的聚核酸用于分析時，可使用核酸擴增技術(shù)，比如PCR來補償?；谀繕?biāo)聚核酸的序列分析，可以通過使用幾個引物進(jìn)行多重PCR反應(yīng)。多重PCR為當(dāng)在聚合酶鏈反應(yīng)中使用多于一對引物時使用的術(shù)語。多重PCR的目標(biāo)是同時擴增目標(biāo)聚核酸的幾段，從而節(jié)省模板聚核酸、時間和費用。對于多重PCR的詳細(xì)試驗設(shè)計可以在MolecularCloning,ALaboratoryManualSambrookandRussellVolume2，thirdedition,ColdspringHarbourLaboratoryPress中找至廿。因為臨床樣品經(jīng)常包含將妨礙PCR的材料，可以研究獨特的預(yù)處理方法以獲得最佳擴增。同時擴增所有目標(biāo)聚核酸區(qū)域的反應(yīng)條件將是最佳的。其它的聚核酸擴增技術(shù)包括自持續(xù)的序列復(fù)制、QP復(fù)制酶、基于連接的熱循環(huán)方法、實時PCR、實時鏈置換擴增(SDA)、滾環(huán)擴增(RCA)和多重置換擴增(MDA)。在其它地方中，用于擴增聚核酸的詳細(xì)試驗設(shè)計可以在Ausubel等人(ShortProtocolsinMolecularBiology,JohnWiley&Sons(1995)volume2，5theditionChapter15)中禾口在Sambrook禾口Russell(MolecularCloning,ALaboratoryManual,volume2,thirdedition,ColdspringHarbourLaboratoryPress)中找到。這些出版物也提供了如何設(shè)計核酸擴增引物的詳細(xì)指導(dǎo)。在本發(fā)明的某些實施方案中，分離聚核酸，然后使用PCR擴增。任何擴增引物都可用于擴增來自目標(biāo)微生物的/"/基因，只要所述引物特異地擴增^f基因可變區(qū)或其部分。設(shè)計能擴增大量來自不同種類微生物的W/基因的引物是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。例如，用于細(xì)菌種的^//基因序列自由地從諸如GenBankTM的公眾數(shù)據(jù)庫中獲得。存在許多能使用獲得的/"/基因序列進(jìn)行多重序列比對的數(shù)據(jù)庫。一旦被比對，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以通過分析多重序列比對數(shù)據(jù)確定多種微生物內(nèi)的保守區(qū)。表1顯示了來自多種微生物的大量^/基因的多重序列比對。在某些實施方案中，用于擴增來自大量微生物的f"/基因的引物選自SEQIDNOs:394-396或其等效物，只要所述等效物特異地同時擴增不同種類微生物的^/可變區(qū)或其部分。設(shè)計SEQIDNOs:394-395的同等物的能力是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。例如，人們很好地認(rèn)識到，任何擴增引物的3'端是任何引物最重要的末端，因為這需要對DNA模板適當(dāng)?shù)赝嘶?，例如，為了引物延長發(fā)生。因此，需要保持SEQIDNOs:394-395的3'末端。然而，人們進(jìn)一步認(rèn)識到，大多數(shù)引物的5'端可以被改變、延長和/或縮短，而不會相反地影響引物擴增產(chǎn)物的能力。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠通過常規(guī)實驗確定在引物中產(chǎn)生的變化。如上所述，包括&/基因或f"/基因可變區(qū)的聚核酸可用于鑒定試樣中的目標(biāo)微生物。術(shù)語"微生物"包括只能借助于顯微鏡觀察到的任何生物，其包括細(xì)菌、腸內(nèi)菌群、無核原生物(monerans)、無核原生質(zhì)團(tuán)、微生物、病原體、菌毛、原生生物、單細(xì)胞動物、原生生物、病毒、立克次體、原生動物、藻螺旋菌和真菌。在某些實施方案中，所述目標(biāo)微生物為原核微生物。原核微生物的實例包括百日咳桿菌、流感嗜血桿菌、嗜肺性軍團(tuán)病桿菌、肺炎支原體、金黃色葡萄球菌、結(jié)核分支桿菌、大腸桿菌、化膿性鏈球菌、洋蔥伯克霍爾德氏菌、棒狀桿菌屬、肺炎嗜衣原體、糞腸球菌、具核梭桿菌、肺炎桿菌、長灘軍團(tuán)菌、粘膜炎莫拉菌、腦膜炎奈瑟氏球菌、綠膿假單胞菌、表皮葡萄球菌、嗜麥芽窄食假單胞菌、肺炎鏈球菌、變形鏈球菌、血鏈球菌和粘質(zhì)沙雷氏桿菌。如表2所示，上述細(xì)菌顯示大量特征。表1MPNE-HF2-------------ATGGCAAAACAAAAGTTTGATAGATCAAAAGCTCACGTTAATATTGG47MPNE--------------ATGGCAAGAGAGAAATTTGACCGATCTAAACCCCACGTTAATGTAGG47LiPNE-ParisGGGAGACTTTCCGATGGCGAAGGAAAAATTTGAACGTAAGAAGCCGCACGTAAACGTGGG60LPNE2-DAS------------------------------------------......------------LPNE-Philadelphial----.....----ATGGCGAAGGAAAAATTTGAACGTAAGAAGCCGCACGTAAACGTGGG47IjPNE-Lens-------------ATGGCGAAGGAAAAATTTGAACGTAAGAAGCCGCACGTAAACGTGGG47LLOW-DAS----......----------.........----------..........-..........PNUODAS------------------------------------------------------------CPNE-CWIj02S-------------ATGTCAAAAGAAACTTTTCAACGTAATAAGCCCCATATCAATATTGG47EFAE—DAS------------------------------------------------------------EFAE-V583——.....-----ATGGCAAAAGAAAAATTTGACCGTTCTAAATCCCATGTTAACATTGG47SAUH-Mu50----.......--ATGGCAAAAGAAAAATTCGATCGTTCTAAAGAACATGCCAATATCGG47SAUR-N315-------------ATGGCAAAAGAAAAATTCGATCGTTCTAAAGAACATGCCAATATCGG47SAUR-MW2---......----ATGGCAAAAGAAAAATTCGATCGTTCTAAAGAACATGCCAATATCGG47SAUR-MSSA47S-------------ATGGCAAAAGAAAAATTCGATCGTTCTAAAGAACATGCCAATATCGG47SAUR-MRSA252-------------ATGGCAAAAGAAAAATTTGATCGTTCTAAAGAACATGCCAATATCGG47SEP工-12228-------------ATGGCAAAAGAAAAATTTGATCGCTCAAAAGAACATGCCAATATTGG47SEP工-RPG2A-------------ATGGCAAAAGAAAAATTTGATCGCTCAAAAGAACATGCCAATATTGG47SM工T醫(yī)DAS——......一—^-----------------.....---------------------------SSAN-DAS——.........一—......------.......---------------------------SM工T-NCTC12261-------------ATGGCAAAAGAAAAATACGATCGTAGTAAACCACACGTTAACATTGG47SPNE-RS-------------ATGGCAAAAGAAAAATACGATCGTAGTAAACCACACGTTAACATTGG47SPYO-M1GAS-------------ATGGCAAAAGAAAAATACGATCGTAGTAAACCCCACGTTAACATTGG47SMUT-DAS------------------------.....----------.........------------SMUT-UA159-------------ATGGCAAAAGAAAAATACGATCGTAGTAAACCACACGTTAACATTGG47H工NF-RdKW20-------------ATGTCTAAAGAAAAATTTGAACGTACAAAACCGCACGTAAACGTGGG47MCAT-DAS----------.......----------------------------.....----------BPER-Tohamal-------------ATGGCAAAAGGCAAGTTTGAACGTACCAAGCCGCACGTGAACGTGGG47BPAR-12822-------------ATGGCAAAAGGCAAGTTTGAACGTACCAAGCCGCACGTGAACGTGGG47BCEP2-DAS---------------------------------------------.....—.......—BPSE-1710b-------------ATGGCAAAAGAGAAGTTTGAGCGGACCAAGCCGCACGTGAACGTTGG47SMAL-DAS------------------------------------------------------------PAER-PA01-------------GTGGCTAAGGAAAAATTCGAACGTAACAAACCGCACGTCAACGTCGG47ICPUE-DAS-------.....------------------------------------------------MAVI-K10-.....-------GTGGCGAAGGCGAAGTTCGAGCGGACGAAGCCGCACGTCAACATCGG47MAV工-paratub-------------GTGGCGAAGGCGAAGTTCGAGCGGACGAAGCCGCACGTCAACATCGG47MAISpig-DAS-----------------------......-------------------------------MKAN-DAS-------------------......-.....---------------------......——MTUB-H37Rv-------------GTGGCGAA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TACCGTGGGTGCC1158TCGCTATGGAAGAAGGTTTGCGCTTTGCGATTCG-CGAAGGCGGCCGTACCGTGGGTGCC1158TCGCTATGGAAGAG——CTGCGCTT-GCGTCGTGTCGCGCGTGTCCAT------------983GGTACAGTAACTAAAGTTATTAAGTAA1185GGTTCAGTCACGGAAGTGCTTGAATAG1185GGTGTAGTCGCTAAAATAATCGAGTAA1204GGTGTAGTCGCTAAAATAATCGAGTAA1131GGTGTAGTCGCTAAAATAATCGAGTAA1191GGAACGATTTCAAAGATCAATGCTTAA118SGGCGTTGTTACTGAAATCGTTAAATAA1188GGCGTTGTTACTGAAATCATTAAATAA1185GGCGTTGTTACTGAAATCATTAAATAAGGCGTTGTTACTGAAATCATTAAATAA1185GGCGTTGTTACTGAAATCATTAAATAA1185GGCGTTGTTACTGAAATCATTAAATAA1185GGCGTTGTAACTGAAATCTTTGAATAA1185GGCGTTGTAACTGAAATCTTTGAATAA1185GGTATGGTTACAGAAATCGAAGCTTAA1137GGTATGGTTACAGAAATCGAAGCTTAA1197GGTATCGTTTCAGAAATCGAAGCTTAA1197SMUT-UA159H工NF-RdKW20MCAT-DASBPER-Tohama工BPAR-12822BCEP2-DASBPSE-1710bSMAIj-DASPAER-PA01KPNE-DASMAV工-KIOMAV工-pa:ratubMA工Spig-DASMKAN-DASMTUB-H37RvMTUB-CDC1551MAVI-DASNCTC13129NMEN-MC58NMEN-Z2491NMEN-DAS表l中使用的縮寫mpnelpne:l:lonfnuccpneefaesaursepism工tssanspnespyosmuth工nfmcatbperbparbcepbpsesmalpaerkpnemavima工smkanmtubcd工p■kmGGTATCGTTTCAGAAATCGAAGCTTAA1137GGCGTTGTTGCGAAAATCATCAAATAA1185GGCGTCGTCGCCAAGATCATCAAGTAA1191GGCGTCGTCGCTAAGATCATCAAGTAA1191GGCGTCGTCGCCAAGATCATCGAGTAAllSlGGCGTGGTTGCCAAGATCATCGAGTAA1194GGCCGGOTCGTCAAGATCATCAAGTAG1131GGCCGGGTCGTCAAGATCATCAAGTAG1191GGCCGGGTCACCAAGATCATCAAGTAG1131GGCCGGGTCACCAAGATCATCAAGTAG1191GGTCGCGTTACCAAGATCATCAAGTAA1191GGCGTGGTTTCTTCTGTTATCGCTTAA1185GGCGTGGTTTCTTCTGTTATCGCTTAA1185肺炎支原體嗜肺性軍團(tuán)病桿菌具核梭桿菌肺炎嗜衣原體糞腸球菌金黃色葡萄球菌表皮葡萄球菌輕型鏈球菌血鏈球菌肺炎鏈球菌化膿性鏈球菌變形鏈球菌流感嗜血桿菌粘膜炎莫拉菌百曰咳桿菌副百日咳博代桿菌洋蔥伯克霍爾德菌類鼻疽伯克霍爾德菌嗜麥芽窄食假單胞菌綠膿假單胞菌肺炎桿菌鳥分枝桿菌胞內(nèi)分枝桿菌堪薩斯分枝桿菌結(jié)核分枝桿菌白喉棒桿菌腦膜炎奈瑟氏球菌表2革蘭氏陽性細(xì)菌革蘭氏陰性細(xì)菌有氧桿菌白喉棒桿菌菌種有氧桿菌百閂咳桿菌肺炎嗜衣原體流感嗜血桿菌粘質(zhì)沙雷氏桿菌粘膜炎莫拉菌嗜肺性軍團(tuán)病桿菌肺炎支原體肺炎桿菌洋蔥伯克霍爾德菌嗜麥芽窄食假單胞菌.綠膿假單胞菌有氧球菌有氧球菌金黃色葡萄球菌腦膜炎奈瑟氏球菌表皮葡萄球菌肺炎鏈球菌化膿性鏈球菌變形鏈球菌血鏈球菌糞腸球菌厭氧桿菌具核梭桿菌結(jié)核分枝桿菌本發(fā)明用于鑒定微生物的方法可用于多種領(lǐng)域，包括，但不限于人類醫(yī)學(xué)、流行病學(xué)、藥物研發(fā)、獸醫(yī)學(xué)、農(nóng)業(yè)、環(huán)境、食品科學(xué)和工業(yè)微生物學(xué)。例如，微生物鑒定可用于確定在患有傳染病的患者中發(fā)現(xiàn)的微生物的同一性。微生物鑒定也可通過檢測病原體來監(jiān)測食品安全。類似地，可以檢驗植物以確定它們是否寄生致植物病的細(xì)菌。進(jìn)一步,本發(fā)明的方法可用于鑒定抗藥細(xì)菌,包括細(xì)菌的抗生素抵抗株。本發(fā)明的一種用于鑒定試驗中目標(biāo)微生物的方法包括在足以發(fā)生雜交的條件下,使該試樣或上述描述的擴增加工的產(chǎn)物與源自~/基因可變區(qū)的探針接觸一段時間。如本文所用，術(shù)語"探針"可以與術(shù)語"寡核苷酸探針"或"雜交探針"互換使用，并指短鏈(shortspan)的連續(xù)核苷酸，優(yōu)選在IO至50個核苷酸之間，其與來自目標(biāo)微生物的^/基因可變區(qū)的至少部分互補，以使其能特異地結(jié)合來自目標(biāo)微生物的如本文定義的聚核酸。探針的設(shè)計、使用和標(biāo)記在Kelleretal.，DNAProbes,pp.149-213(StocktonPress,1989)中描述。術(shù)語"特異的結(jié)合"或"特異地結(jié)合"指本發(fā)明的探針和來自目標(biāo)微生物的相應(yīng)聚核酸之間的相互作用。如本文所用，術(shù)語"接觸"指使試樣或擴增產(chǎn)物與來源于m/基因可變區(qū)的探針物理接近，因此，如果其它的條件適宜，可以發(fā)生雜交。所述接觸可以是直接的或間接的。例如，所述試樣可以直接接觸探針以使雜交可以發(fā)生。可選地，樣品可以與另一個分子(例如另一個核酸分子)雜交，該分子依次與來源于^/基因可變區(qū)的探針雜交。本文使用的"雜交"表示產(chǎn)生DNA-DNA雜交物或DNA-RNA雜交物的互補核苷酸序列配對?；パa堿基序列為與堿基配對規(guī)則相關(guān)的那些序列。在DNA中，A與T配對，C與G配對。在RNA中，U與A配對，C與G配對。在這點上，如本文所用，術(shù)語"匹配"和"不匹配"指在互補核酸鏈中配對核苷酸的雜交可能性。匹配的核苷酸有效地雜交，比如上述典型的A-T和G-C對。不匹配為不能有效雜交的核苷酸的組合。定義的適當(dāng)?shù)碾s交條件在本領(lǐng)域技術(shù)的范圍內(nèi)。參見，例如上述Sambrook等人。然而，通常，用于探針雜交或退火的"嚴(yán)格的條件"(1)使用用于洗滌的低離子強度和高溫，例如，在50°C、0.015MNaCl/0.0015M檸檬酸鈉/0，/0十二垸基磺酸鈉(SDS)，或(2)在雜交期間使用諸如甲酰胺的變性劑，例如，在42。C、含0.1%牛血清白蛋白/0.1。/。Ficoll/0.1。/。聚乙烯吡咯垸酮/50mM的pH6.5的磷酸鈉緩沖液含750mM的NaCl、75mM的檸檬酸鈉的50%(體積/體積)甲酰胺。中等嚴(yán)格的雜交條件的實例為在42。C使用50%甲酰胺、5XSSC(0.75M的NaCl、0.075M的檸檬酸鈉)、50mM磷酸鈉(pH6.8)、0.1%焦磷酸鈉、5XDenhardt's溶液，超聲處理的鮭魚精液DNA(50yg/mL)、0.1%的SDS和10%的葡聚糖硫酸酯，并在42°C、0.2XSSC和0.1%的SDS中洗滌。適宜的雜交和洗滌條件取決于特定的應(yīng)用。需要區(qū)別的兩種微生物之間的相似度越高，雜交和洗滌條件的嚴(yán)格性就越高。例如，當(dāng)施用需要在屬的水平上區(qū)分微生物時，相對低嚴(yán)格的雜交和洗滌條件可能是所有必需的條件。然而，當(dāng)在種水平上區(qū)別微生物時，其中所述微生物具有更高的相似度，需要更高嚴(yán)格的雜交和洗滌條件。進(jìn)一步地，當(dāng)在株水平上區(qū)別微生物時，其中所述微生物具有甚至更高的相似度，需要甚至更高嚴(yán)格的雜交和洗滌條件。在某些實施方案中，接觸所述試樣的步驟包括至少部分m/基因可變區(qū)與一組探針的雜交，所述探針包括至少一個選自下述探針的探針SEQIDNOs:12至57、208至209或210。在其它實施方案中，至少一個探針選自SEQIDNOs:12至79、208至209和210。在其它實施方案中，至少一個探針選自SEQIDNOs:12至392或393。在某些實施方案中，所述目標(biāo)微生物選自博德特氏菌種、嗜衣原體菌種、嗜血桿菌種、軍團(tuán)桿菌種、支原體種、分支桿菌種、葡萄球菌種、鏈球菌種、假單胞菌種、莫拉氏菌種和梭桿菌種、窄食假單胞菌種、伯克霍爾德菌種、腸球菌種、棒狀桿菌種或奈瑟氏菌種，其中所述探針選自<formula>formulaseeoriginaldocumentpage44</formula>ATCATCGGTTTACATGACACATCTAAAA(SEQIDNO.:32);CATTCTTCTCAAACTATCGTCCACAA(SEQIDNO.:34);CCAATCGCGATTGAAGACGG(SEQIDNO.:37);CTGGTTCAGCATTAAAAGCTTTAGAAG(SEQIDNO.:38);GTATTATCAAAAGACGAAGGTGGACG(SEQIDNO.:41);GCGATGCTCAATACGAAGAAAAAATC(SEQIDNO.:42);TGAATTCAAAGCAGAAGTATAC(SEQIDNO.:76);ATTATTACGTGGTGTTGCTC(SEQIDNO.:77);GTGATAACGTTGAAATGACAG(SEQIDNO.:78);對于表皮葡萄球菌GAAATGGTTATGCCTGGCGAC(SEQIDNO.:46);TGACAACATCGGTGCTTTATTACG(SEQIDNO.:48);對于綠膿假單胞菌AAGTTCGAGTGCGAAGT(SEQIDNO.:51);AAGGCGTAGAGATGGTAAT(SEQIDNO.:52);TTCTTCAAGGGCTACCG(SEQIDNO.:53);ATCATCAAGGTCCAGGAAGAAGT(SEQIDNO.:54);ACCAAGACTACCTGCACCG(SEQIDNO.:55);TGTACGTGCTGTCCAAGGAA(SEQIDNO.:56);CCGGTAACTGCGAACTGC(SEQIDNO.:57);.:85);乂O.:86);ATCGGTCACGTTGACCATGGCA(SEQIDNO.:87);GCCGCCTTCGCGGATCGCGAA(SEQIDNO.:88);對于百日咳桿菌GTACATTCTGTCCAAGGAAG(SEQIDNO.:58);GACAACGTGGGTATCTTG(SEQIDNO.:59);GACAAGGAAATGGTGCT(SEQIDNO.:60);對于肺炎嗜衣原體AATTTAAGTCAGCTGTTTACG(SEQIDNO.:61);GAGGTATTGGAAAGAACGAT(SEQIDNO.:62);ATAACGTTGAGCTTGATGTT(SEQIDNO.:63);對于嗜肺性軍團(tuán)病桿菌；AGTTTGAAGCAGAAGTGTAT(SEQIDNO.:67);TGTTATTACGAGGTACGAAG(SEQIDNO.:68);AGATAATGTGCAATTAGTTGTTA(SEQIDNO.:69);對于肺炎支原體GAACGTGGTCAAGTGTTAG(SEQIDNO.:71);GACAATACCTCGATTACAGT(SEQIDNO.:72);對于結(jié)核分枝桿菌AACATCTCGGTGAAGTTGAT(SEQIDNO.:73);TGACAACACCAACATCTC(SEQIDNO.:74);ACGAAGGTCTGCGTTT(SEQIDNO.:75);對于肺炎鏈球菌AATTCAAAGGTGAAGTCTACA(SEQIDNO.:79);CAACGTGATGAAATCGAAC(SEQIDNO.:80);GACAATCGACGTTGAGTT(SEQIDNO.:81);對于化膿性鏈球菌CAAAGGTGAAGTATATATCCTTTC(SEQIDNO.:82);CAACGTGACGAAATCGAA(SEQIDNO.:83);CGTGACAATCAACGTTGA(SEQIDNO.:84);及其組合。一旦認(rèn)為已經(jīng)發(fā)生了雜交，那么檢測形成的任一種雜交物。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)能容易地檢測到本發(fā)明的探針和本發(fā)明的聚核酸之間的雜交。例如，其中聚核酸或探針都沒有標(biāo)記時，使用DNA插入染料，比如溴化乙錠、SYBRGreen(AppliedBiosystems,ScoresbyVIC,澳大利亞)或SYTOXOrange(Invitrogen,MountWaverleyVIC,澳大利亞)可以檢測到雜交。這些染料有效地結(jié)合雙鏈DNA。因此，當(dāng)目標(biāo)聚核酸和探針核苷酸序列之間形成雜交物吋，用上述染料的染色將便于檢測得到的雜交物。在本發(fā)明的某些優(yōu)選的實施方案中，標(biāo)記源自試樣的聚核酸或探針以便于雜交檢測。可用于標(biāo)記DNA或RNA分子的方法和材料是本領(lǐng)域已知的。在下述實施例中，描述了用Cy3或Cy5標(biāo)記DNA的方法。然而，還可使用其它已知的標(biāo)記材料和方法。例如，其他的Cy染料，比如Cy3.5和Cy5.5、Alexa熒光染料和放射性同位素，比如32P和35S等也可以用于標(biāo)記整個基因組DNA以便于雜交的檢測。而且，在本發(fā)明中可以使用雙色熒光標(biāo)記策略。該策略描述在Ramsay,1998，TVaf.S/ofec/2.，16:40-44)禾口Shalone/a/.，1996，，6:639-645中，將這兩者都以其全部引入作為參考。這樣的多色雜交檢測策略減少了不一致的實驗條件產(chǎn)生的變化，并允許直接和定量地比較不同樣品之間的目標(biāo)豐度(參見，上述Ramsay,1998和上述Shalon等人，1996).所述標(biāo)記為優(yōu)選地在給定時間內(nèi)不提供可變信號，但代之以提供恒定和可重現(xiàn)的信號。在某些實施方案中，接觸探針和試樣及檢測微生物的優(yōu)選的方法是使用微點陣。"微點陣"典型地為其上已經(jīng)放置了本發(fā)明的兩個或多個探針的2-維點陣。在某些實施方案中，在微點陣上有至少3個位置，其包含本發(fā)明的不同序列的探針。這具有最小化假陽性的優(yōu)點。檢測目標(biāo)微生物中聚核酸存在的另一種方法為特定的核酸微點陣和微芯片技術(shù)。微點陣為用于檢測基因或核酸序列存在的工具，其典型地由許多探針樣品已經(jīng)按常規(guī)模式排列在其上的小的膜或載玻片組成。例如，本文公開的用于微生物聚核酸的寡核苷酸探針可以放置在載玻片上預(yù)定的位點。在允許探針和聚核酸(如果在試樣中存在)間雜交或結(jié)合的條件下，由此分離的試樣或聚核酸可以加入到探針中?？蛇x地，在加入本文公開的用于聚核酸的探針之前，可以將來自試樣的聚核酸施用到載玻片上。探針和聚核酸之間的結(jié)合可以通過本領(lǐng)域已知的任何方式檢測，并且聚核酸和探針之間的特定結(jié)合表明在所述試樣中存在聚核酸。聚核酸雜交方法和微點陣技術(shù)是本領(lǐng)域熟知的。例如，用于雜交的聚核酸和探針、載玻片和雜交條件的具體制備提供在PCT/US01/10482中，將其引入本文作為參考。微點陣技術(shù)允許同時測定數(shù)千基因或聚核酸，從而給出了鑒定微生物存在的強大的工具。兩種微點陣技術(shù)目前在廣泛使用。第一種是cDNA點陣，第二種是寡核苷酸點陣。盡管在這些芯片的構(gòu)建中存在差異，基本上所有的下游數(shù)據(jù)分析和輸出都是相同的。這些分析的產(chǎn)物典型地測量了接收自標(biāo)記的探針的信號強度，所述探針用于檢測來自試樣的聚核酸，所述試樣在微點陣上己知位點與聚核酸雜交。典型地，信號強度與聚核酸的量成比例。許多這樣的技術(shù)是可獲得且有用的。優(yōu)選的方法可以在Linsley等人的美國專利Nos.6,271,002、Friend等人的美國專利No.6,218,122、Peck等人的美國專利No.6,218,114和Wang等人的美國專利No.6,004,755中找到，本文將其中每個公開的內(nèi)容都引入作為參考。在優(yōu)選的方法中，通過比如在Hoffmann"a/.,2005,Mo/所o&c/wo/.,29:31-8中描述的方法制備生物素化的探針，并將其雜交至諸如AffymetrixHG-U133A寡核苷酸微點陣(Affymetrix,SantaClara,CA)的微點陣。使用例如MAS5.0軟件可以將陣列圖簡化為各個探針的強度值(C五丄文件)。使用加強的多陣列分析(RMA)，例如如IrizarryW2003，7Vwc/e/c爿c/Aias.，31:e15中禾口Dallasa/.，2005,S_MCGe"om/c&,6:59中所描述的，求出表達(dá)測定。一旦使用本文描述的本發(fā)明檢測微生物，可以完成適當(dāng)?shù)脑\斷、預(yù)測或治療。因此，本發(fā)明進(jìn)一歩提供用于預(yù)測、診斷、預(yù)防或治療患有疾病的受試者的方法，其包括檢測試樣中的聚核酸和源自^/基因可變區(qū)的探針之間的雜交。檢測樣品中核酸分子和基因的可變區(qū)之間的雜交能夠鑒定樣品中的微生物。該信息可用于確定所述疾病是否起因于病原微生物，并由此預(yù)測、診斷、預(yù)防或治療所述疾病。如本文所用，"預(yù)測"指預(yù)計疾病的過程和結(jié)果或受試者患病的可能。如本文所用，"診斷"指鑒定疾病的方法，例如通過其癥狀、實驗室試驗(包括基因型試驗)及身體發(fā)現(xiàn)。如本文所用，"預(yù)防"指任何預(yù)防受試者中的疾病并包括預(yù)防在可能易感染疾病但還沒有診斷為患有疾病的受試者屮出現(xiàn)疾病。效果可以是以完全地或部分地預(yù)防所述疾病或其病征或癥狀的形式的預(yù)防。如本文所用，"治療"指在檢測特定的微生物后，通過給予受試者藥物來治療任何受試者中的疾病。"治療"包括(a)抑制疾病，g卩，阻止其發(fā)展；或(b)減輕或改善疾病的癥狀，g卩，導(dǎo)致疾病的癥狀消退。效果可以是部分或完全治愈疾病形式的治療。本發(fā)明的方法可用于預(yù)測、診斷、預(yù)防或治療任何受試者，比如動物或植物、如被微生物感染并經(jīng)受微生物引起的疾病和障礙的所有動植物。如本文所用，"動物"指任何動物，比如人類或?qū)θ祟惖慕?jīng)濟性重要和/或社會性重要的哺乳動物，例如除人類之外的食肉動物(比如貓和狗)、豬(小豬、肥豬和野豬)、反芻動物(比如牛(cattle、oxen)、羊、長頸鹿、鹿、山羊、野牛和駱駝)和馬。也提供禽類的治療，包括治療那些瀕臨絕種的、養(yǎng)在動物園中的禽類和家禽，更特別地，馴養(yǎng)的家禽，例如家禽，比如火雞、小雞、鴨、鵝、珍珠雞等，因為它們也是對人類經(jīng)濟性重要的。因此，提供家畜的治療，包括，但不限于馴養(yǎng)的豬(小豬和肥豬)、反芻動物、馬、家禽等。該術(shù)語沒有表示特定的年齡。因此，意味著成年和新生受試者都被涵蓋。如本文所用，"植物"包括植物界的任一成員，包括，但不限于真核藻類、蘚類、石松、蕨類、被子植物、裸子植物和地衣(其包含藻)，包括其任何部分(例如，花粉、種子、細(xì)胞、塊莖、莖)，及其任意細(xì)胞組分(例如質(zhì)粒、核糖體等)。如本文所用，"疾病"為常用于指其中受試者經(jīng)受的任何偏離健康狀態(tài)的泛稱。在某些實施方案中，所述疾病為與病原體(包括動物病原體)相關(guān)的一種，特別是感染性疾病、呼吸道感染，包括肺炎(包括公眾獲得性肺炎(communityacquiredpneumonia))、百曰咳、腦膜炎、斑疹傷寒、結(jié)核病、白喉、傷寒和細(xì)菌性腹瀉；胃腸道感染，包括胃腸炎；皮膚感染；生殖道感染；尿路感染；醫(yī)院內(nèi)感染；傷寒；肉毒中毒；鏈球菌喉炎(Strepthmat);風(fēng)濕熱；梅毒、膀胱炎；腎感染；毛囊炎；癤病(布)；膿皰病(schoolsore);甲氧西林耐藥性金黃色葡萄球菌；葡萄球菌性燒傷樣皮膚綜合征；中毒性休克綜合征；蜂窩組織炎、丹毒；壞死性筋膜炎；猩紅熱；創(chuàng)傷感染即皮炎和疥瘡。醫(yī)學(xué)醫(yī)師或獸醫(yī)醫(yī)師，在被提供上述方法的結(jié)果后，可根據(jù)他或她的知識和技術(shù)開具適當(dāng)?shù)闹委熖幏?。然而，在另一個實施方案中，一旦已經(jīng)進(jìn)行了微生物鑒定，可以提供計算機軟件程序以對患者給出適當(dāng)?shù)闹委熃ㄗh。本發(fā)明的實施方案也可方便地提供在試劑盒中。本發(fā)明的試劑盒可包括試劑，比如探針或引物，參考聚核酸、緩沖液、酶等。本發(fā)明的試劑盒也可包括用于實施本發(fā)明的方法的說明。這樣的說明可以是包裝嵌入物、或標(biāo)簽、或其他諸如書、雜志、網(wǎng)站和光盤的介紹的形式。本發(fā)明現(xiàn)在將僅參照下述非限制性實施例來進(jìn)一步描述。然而，應(yīng)當(dāng)理解，隨后的實施例僅僅是說明性的，不應(yīng)當(dāng)以任何形式限制如上所述的本發(fā)明的普遍性。實施例1來自痰樣的微生物的鑒定痰樣從病理實驗室獲得，并用水稀釋。使用兩微升的這些樣品來通過聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴增在真菌種中發(fā)現(xiàn)的特定保守序列。然后，通過隨機啟動的聚合反應(yīng)(Do〃"a/.，2001(GenomeRes.11，1706-15))或通過PCR后標(biāo)記將所述PCR產(chǎn)物用作直接結(jié)合熒光類似物Cy5的模板。寡核苷酸探針被設(shè)計成包含唯一的標(biāo)記序列，該序列選自真菌種中的保守序列，并將其印跡在微點陣載玻片上。然后，將標(biāo)記的PCR產(chǎn)物雜交至微點陣載玻片。所述雜交在玻璃蓋玻片下在浸入53。C水浴槽中的濕潤的室中30分鐘后發(fā)生。該載玻片被洗滌、干燥并通過使用激光活化的共聚焦掃描儀掃描熒光。減去各個掃描陣列上點樣的背景，并用軟件分析來給出在臨床樣品中存在的菌種并給出適當(dāng)?shù)闹委熁颊叩慕ㄗh。材料和方法載玻片CodeLinkTM活化的載玻片(G￡//ea欣ca").寡核苷酸探針設(shè)計在5'端具有5'氨基修飾和10T連接的17至24個核苷酸的寡核苷酸。將寡核苷酸設(shè)計成包含在真菌種'&/基因中的唯一標(biāo)記序列。點樣溶液1M的磷酸鈉緩沖液。將寡核苷酸以100"M的濃度溶于Milli-Q水中。寡核苷酸在點樣溶液中最終濃度為25tiM，磷酸鈉緩沖液在點樣溶液中最終濃度為250mM。印跡使用_M/craGridIICompactMicroarrayer(所oic^o"c力進(jìn)行Epoxy載玻片的印跡。目標(biāo)DNA:使用引物對MAtuf-F4(正向引物，5，KYACIGGHGTBGARATGTTC3'，SEQIDNO.:396)和MAtuf-R5(反向引物，5，GTDCGDCCRCCYTCWCGRAT3',SEQIDNo.395)擴增Zw/基因片段。使用引物MAtuf-Fl(SEQIDNo.394)和MAtuf-R5(SEQIDNo.395)擴增^/基因的第二個片段。使用在^/基因中發(fā)現(xiàn)的保守區(qū)設(shè)計引物。PCR條件為1x94°C，1分鐘初始變性，35x94°C，30秒/5(TC，30秒/72。C，30秒/，lx72。C，7分鐘最終延伸。在標(biāo)記前，使用WizardPCRPrepsDNAPurification試劑盒(Promega)純化PCR產(chǎn)標(biāo)記使用標(biāo)記混合物2mM的dATP、dCTP、dGTP、1.5mM的dTTP和0.5mM的生物素-dUTP進(jìn)行標(biāo)記。在37°C，使用引物MAtuf-F4和MAtuf-R5對得到的產(chǎn)物進(jìn)行標(biāo)記過夜。在使用Cy5-dUTP(GEHealthcare)的PCR反應(yīng)期間，使用MAtuf-Fl和MAtuf-R5引物對擴增的似/片段進(jìn)行直接標(biāo)記。雜交在53。C，在雜交室中雜交30分鐘。隨后，進(jìn)行4個洗滌歩驟，每次5分鐘，如下洗滌l、2xSSC/0.1%SDS;洗滌2、0.5xSSC/0.1%SDS;洗滌3、2xSSC;洗滌4、4xSSC/0.2。/。的吐溫20。在雜交后，使用GenePix4000B掃描儀(Affymetrix)掃描所述陣列。結(jié)果Z"/基因片段的PCR擴增。使用引物MAtuf-F4和MAtuf-R5擴增的PCR產(chǎn)物的大小為約381個堿基對(圖1)。引物MAtuf-Fl和MAtuf-R5引物產(chǎn)生約1.1kb的PCR擴增產(chǎn)物。掃描儀輸出。微點陣成功地檢測和區(qū)分在該研究中試驗的生物；即(a)肺炎鏈球菌；(b)粘膜炎莫拉菌；(C)嗜肺性軍團(tuán)病桿菌；(d)金黃色葡萄球菌；(e)流感嗜血桿菌(圖2、3、4、5和6)討論DNA微點陣組合了高精度技術(shù)與高等分子生物學(xué)來獲得DNA片段的高通量篩選。在該研究中，研究了DNA微點陣技術(shù)用于鑒定和區(qū)分來自五種病原菌的PCR衍生的擴增子的潛能；所述病原菌即，肺炎鏈球菌、粘膜炎莫拉菌、嗜肺性軍團(tuán)病桿菌、金黃色葡萄球菌和流感嗜血桿菌。選擇來自W/基因的片段用于擴增。該基因普遍存在于所有的細(xì)菌種中。該基因的部分是高度保守的(保守區(qū))，而其余部分顯示出高度變化(可變區(qū))。使用從幾種不同細(xì)菌種中得到的^/DNA序列，經(jīng)由多重序列比對確定保守區(qū)和可變區(qū)。使用保守區(qū)設(shè)計引物，以便獲得包含可變區(qū)的擴增子。將這些擴增子用在DNA微點陣上以檢測和區(qū)分前述的細(xì)菌種。這表明所述微點陣技術(shù)可用作鑒定和區(qū)分細(xì)菌種的方法。該方法已被證實是高度靈敏的和特異性的。這項研究證實經(jīng)由PCR技術(shù)擴增的細(xì)菌fw/基因序列可以成功地和DNA微點陣聯(lián)合來為在臨床診斷裝置中的上述目的服務(wù)。如果可以滿足目前的需要，核酸微點陣技術(shù)將賦予高于基于其它分子的鑒定方法的競爭優(yōu)勢。該領(lǐng)域快速發(fā)展將同時改善技術(shù)和降低成本，使得微點陣方法更有吸引力和有競爭力。序列來自多種微生物的f"/基因的核苷酸序列提供在SEQIDNOs.:1至11中。SEQIDNOs.:12至393為來自多種微生物的標(biāo)記(探針)序列，其中-ABAU-鮑曼不動桿菌BCEP-洋蔥伯克霍爾德氏菌BPER-百日咳桿菌CABO-流產(chǎn)嗜衣原體(C7^/^cfop/n7afl6om^)CDIP-白喉棒桿菌CJEJ-空腸彎曲桿菌CPER-產(chǎn)氣莢膜梭桿菌CPNE-肺炎嗜衣原體CTET-破傷風(fēng)桿菌EFAE-糞腸球菌FNUC-具核梭桿菌HPYL-幽門螺旋桿菌HHEP-肝螺桿菌HINF-流感嗜血桿菌KPNE-肺炎桿菌LLON-長灘軍團(tuán)菌LMON-單核細(xì)胞增多性李氏菌LPNE-嗜肺性軍團(tuán)病桿菌MCAT-粘膜炎莫拉菌MTUB-結(jié)核分枝桿菌MPNE-肺炎支原體NGON-淋病奈瑟氏菌NMEN-腦膜炎奈瑟氏球菌PAER-綠膿假單胞菌SAUR-金黃色葡萄球菌SEPI-表皮葡萄球菌SSAP-腐生性葡萄球菌SMAL-嗜麥芽窄食假單胞菌SPNE-肺炎鏈球菌SPYO-化膿性鏈球菌SMUT-變形鏈球菌SSAN-血鏈球菌SMAR-粘質(zhì)沙雷氏桿菌VVUL-嗜鹽弧菌VPAR-副溶血弧菌VCHO-霍亂弧菌YPES-鼠疫耶爾森氏菌YPSE-假結(jié)核耶爾森氏菌序列394和395為所設(shè)計的抗多種微生物的加/基因保守區(qū)的寡核苷酸引物。序列還可包含另外的堿基。這些顯示如下R-A或GY-C或TM-A或CK-G或TS-G或CW醒A或TH-A或C或TB-G或C或TV-A或G或CD-A或G或TI-同A、G、C或T結(jié)合的A堿基權(quán)利要求1、用于檢測和/或鑒定試樣中至少一種微生物或用于同時檢測和/或鑒定試樣中幾種微生物的方法，其包括(a)提供疑為包含一種或多種目標(biāo)微生物的試樣；(b)任選地，從所述試樣中釋放、分離和/或濃縮來自所述至少一種微生物的聚核酸，如果其存在于該試樣中，所述的或每個所述的聚核酸包括至少部分tuf基因可變區(qū)；(c)在足以發(fā)生雜交的條件下，使所述試樣或來自所述試樣的所述聚核酸與一個或多個源自所述tuf基因可變區(qū)的探針接觸一段時間；和(d)檢測在步驟(c)中發(fā)生的任何雜交；其中存在或不存在雜交表示所述試樣中存在或不存在一種或多種所述微生物。2、根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中在所述試樣中的聚核酸是擴增的。3、用于檢測和/或鑒定試樣中至少一種微生物或用于同時檢測和/或鑒定試樣中幾種微生物的方法，其包括(a)任選地，從所述至少一種要檢測的微生物中釋放、分離和/或濃縮聚核酸；(b)任選地，用至少一個引物對擴增來自所述微生物的至少部分基因可變區(qū)；(c)在足以發(fā)生雜交的條件下，使所述試樣或來自所述試樣的所述聚核酸與一個或多個源自所述^/基因可變區(qū)的探針接觸一段時間；和(d)檢測在步驟(C)中發(fā)生的任何雜交；其中存在或不存在雜交表示在所述試樣中存在或不存在所述一種或多種微生物。4、根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中所述聚核酸源自如在SEQIDNOs.:1至11中所示的/w/基因可變區(qū)。5、根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中所述聚核酸基本上由SEQIDNOs.:1至11的核苷酸108-220、393-591、708-774、792-816禾口/或885-945組成。6、根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中所述聚核酸具有與如在SEQIDNOs.:1至11中所示的to/基因可變區(qū)反義的序列。7、根據(jù)權(quán)利要求1至6中任一項的方法，其中接觸所述試樣的步驟包括至少部分^/基因可變區(qū)與一組探針的雜交，所述探針包含至少一個選自下述序列的探針:SEQIDNOs:12至84、208至251、254-315或330至393。8、用于檢測和/或鑒定試樣中至少一種微生物或用于同時檢測和/或鑒定試樣中幾種微生物的方法，其包括(a)任選地，從所述至少一種要檢測的微生物中釋放、分離和/或濃縮聚核酸；(b)任選地，用至少一個引物對擴增來自所述微生物的至少部分~/基因可變區(qū)；(c)雜交至少部分來自所述微生物的基因可變區(qū)與一組包括至少一個選自下述序列的探針SEQIDNOs:12至84、208至251、254-315或330至393;(d)檢測在步驟(c)中形成的雜交物；禾口(e)鑒定來自步驟(d)的所述檢測物中的所述至少一種微生物。9、根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其中至少一個探針選自SEQIDNOs:12至84、208至315或330至393。10、根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其中至少一個探針選自SEQIDNOs:12至392或393。11、權(quán)利要求1至10中任一項的方法，其中被檢測和/或鑒定的微生物選自博德特氏菌種、嗜衣原體菌種、嗜血桿菌種、軍團(tuán)桿菌種、支原體種、分支桿菌種、葡萄球菌種、鏈球菌種、假單胞菌種、莫拉氏菌種和梭桿菌種、窄食假單胞菌種、伯克霍爾德菌種、腸球菌種、棒狀桿菌種或奈瑟氏菌種。12、用于l會斷和/預(yù)測與目標(biāo)微生物相關(guān)的疾病的方法，其包括(a)任選地，從所述至少一種要檢測的微生物中釋放、分離和/或濃縮聚核酸；(b)任選地，用至少一個引物對擴增來自所述微生物的至少部分基因可變區(qū)；(C)在足以發(fā)生雜交的條件下，使所述試樣或來自所述試樣的的所述聚核酸與一個或多個源自所述^/基因可變區(qū)的探針接觸一段時間；和(d)檢測在步驟(C)中發(fā)生的任何雜交；其中存在或不存在雜交表示在所述試樣中存在或不存在目標(biāo)微生(e)聯(lián)系存在的所述一種或多種所述目標(biāo)微生物與疾??；和(f)確定所述疾病的診斷和/或預(yù)測。13、根據(jù)權(quán)利要求12的方法，其中被檢測和/或鑒定的微生物選自博德特氏菌種、嗜衣原體菌種、嗜血桿菌種、軍團(tuán)桿菌種、支原體種、分支桿菌種、葡萄球菌種、鏈球菌種、假單胞菌種、莫拉氏菌種和梭桿菌種、窄食假單胞菌種、伯克霍爾德菌種、腸球菌種、棒狀桿菌種或奈瑟氏菌種。14、用于預(yù)防或治療與目標(biāo)微生物相關(guān)的疾病的方法，其包括(a)任選地，從所述至少一種要檢測的微生物中釋放、分離和/或濃縮聚核酸；(b)任選地，用至少一個引物對擴增來自所述微生物的至少部分似/基因可變區(qū)；(c)在足以發(fā)生雜交的條件下，使所述試樣或來自所述試樣的所述聚核酸與一個或多個源自所述^/基因可變區(qū)的探針接觸一段時間；和(d)檢測在步驟(C)中發(fā)生的任何雜交；其中存在或不存在雜交表示在所述試樣中存在或不存在目標(biāo)微生(e)聯(lián)系存在的所述一種或多種所述目標(biāo)微生物與疾??；和(f)開具預(yù)防或治療所述疾病的處方。15、根據(jù)權(quán)利要求3至14中任一項的方法，其中擴增來自微生物的至少部分^/基因可變區(qū)的歩驟使用至少一個引物對，其中至少一個引物選自SEQIDNOs:394-396或其等效物，只要所述等效物特異地同時擴增不同種類微生物的m/可變區(qū)或其部分。16、根據(jù)權(quán)利要求14的方法，其中聯(lián)系存在的一種或多種目標(biāo)微生物與疾病的歩驟或開具治療所述疾病的處方的步驟包括使用計算機程序的步驟。17、根據(jù)權(quán)利要求12至16中任一項的方法，其中所述疾病為細(xì)菌感染、呼吸道感染、胃腸道感染、皮膚感染、血流感染、腦膜炎或中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染、尿路感染、生殖道感染、創(chuàng)傷感染或醫(yī)院內(nèi)感染。18、根據(jù)權(quán)利要求1至17中任一項的方法，其中被檢測和/或鑒定的微生物選自博德特氏菌種、嗜衣原體菌種、嗜血桿菌種、軍團(tuán)桿菌種、支原體種、分支桿菌種、葡萄球菌種、鏈球菌種、假單胞菌種、莫拉氏菌種和梭桿菌種、窄食假單胞菌種、伯克霍爾德菌種、腸球菌種、棒狀桿菌種或奈瑟氏菌種。19、組合物，包括至少一個選自SEQIDNOs:12-293或其等效物的探針，只要所述等效物特異地結(jié)合被檢測的微生物的^/基因可變區(qū)。20、組合物，包括至少一個選自基本上由SEQIDNOs:12-393或其等效物組成的組的探針，只要所述等效物特異地結(jié)合被檢測的微生物的/w/基因可變區(qū)。21、組合物，包括至少一個選自基本上由SEQIDNOs:394-396或其等效物組成的組的引物，只要所述等效物特異地擴增被檢測的微生物的^/基因可變區(qū)或其部分。22、用于檢測和/或鑒定試樣中發(fā)現(xiàn)的至少一種微生物的寡核苷酸探針，所述微生物選自博德特氏菌種、嗜衣原體菌種、嗜血桿菌種、軍團(tuán)桿菌種、支原體種、分支桿菌種、葡萄球菌種、鏈球菌種、假單胞菌種、莫拉氏菌種和梭桿菌種、窄食假單胞菌種、伯克霍爾德菌種、腸球菌種、棒狀桿菌種或奈瑟氏菌種，其中所述探針選自對于流感嗜血桿菌CATCGGTGCATTATTACGTGGTAC(SEQIDNO.:14);TGACTGGTACAATCGAATTACCAGAA(SEQIDNO.:16);ACTTCGAATCAGAAGTGTAC(SEQIDNO.:64);CAAACGTGAAGAAATCGAAC(SEQIDNO.:65);CGATAACATCAAGATGACAGT(SEQIDNO.:66);對于粘膜炎莫拉菌TGAGCGTGACATCGATAAGTCA(SEQIDNO.:18);CGTAAGCTGCTAGACGAAGGT(SEQIDNO.:21);TACCCCATTCCTAAATGGCTATCG(SEQIDNO.:22);TAACTGGTGCCATCACCCTAC(SEQIDNO.:23);AGTTTGATGCAGAAGTATACG(SEQIDNO.:208)TATCCTACTACGTGGTACTAA(SEQIDNO.:209)ATAACGTTGAGATGAGCG(SEQIDNO.:210)對于糞腸球菌AAGGCGACGAGTCTTATGAAGA(SEQIDNO.:24);AATTAATGGCTGCAGTTGACGAAT(SEQIDNO.:25);GAAGTTCGCGTTGGTGACG(SEQIDNO.:26);TGGTGTTGTAGAATTGCCAGAAG(SEQIDNO.:28);TAAACCAGCTACAATCACTCCACA(SEQIDNO.:29);對于金黃色葡萄球菌CTTAGAATTAATGGAAGCTGTAGATACTTACA(SEQIDNO.:CATTCTTCTCAAACTATCGTCCACAA(SEQIDNO.:34);CTGGTGTTGTTCACTTACCAGAAG(SEQIDNO.:35);CCAATCGCGATTGAAGACGG(SEQIDNO.:37);TGACAACATTGGTGCATTATTACGT(SEQIDNO.:39);TGTTACAGGTGTTGAAATGTTCCG(SEQIDNO.:40);TGAATTCAAAGCAGAAGTATAC(SEQIDNO.:76);ATTATTACGTGGTGTTGCTC(SEQIDNO.:77);GTGATAACGTTGAAATGACAG(SEQIDNO.:78);對于表皮葡萄球菌TAGACTTAATGCAAGCAGTTGATGATTAC(SEQIDNO.:43);GAAATGGTTATGCCTGGCGAC(SEQIDNO.:46);CTGGTTCTGCATTAAAAGCATTAGAAG(SEQIDNO.:47);TGACAACATCGGTGCTTTATTACG(SEQIDNO.:48);對于綠膿假單胞菌AAGTTCGAGTGCGAAGT(SEQIDNO.:51);AAGGCGTAGAGATGGTAAT(SEQIDNO.:52);TTCTTCAAGGGCTACCG(SEQIDNO.:53);ACCAAGACTACCTGCACCG(SEQIDNO.:55);TGTACGTGCTGTCCAAGGAA(SEQIDNO.:56);CCGGTAACTGCGAACTGC(SEQIDNO.:57);CACGTTGACTGCCCCGGTCACGC(SEQIDNO.:85);ACGCCTTCCGGCAGTTCGCAGTTAC(SEQIDNO.86);ATCGGTCACGTTGACCATGGCA(SEQIDNO.:87);GCCGCCTTCGCGGATCGCGAA(SEQIDNO.:88);對于百日咳桿菌GTACATTCTGTCCAAGGAAG(SEQIDNO.:58);GACAACGTGGGTATCTTG(SEQIDNO.:59);GACAAGGAAATGGTGCT(SEQIDNO.:60);對于月市炎嗜衣原體(C7z/flm_y<iop/z//fl/rtg"mo"/ae):AATTTAAGTCAGCTGTTTACG(SEQIDNO.:61);GAGGTATTGGAAAGAACGAT(SEQIDNO.:62);ATAACGTTGAGCTTGATGTT(SEQIDNO.:63);對于嗜肺性軍團(tuán)病桿菌；AGTTTGAAGCAGAAGTGTAT(SEQIDNO.:67);TGTTATTACGAGGTACGAAG(SEQIDNO.:68);AGATAATGTGCAATTAGTTGTTA(SEQIDNO.:69);對于肺炎支原體GAAATTTAAAGCGGAAATCTATG(SEQIDNO.:70);GAACGTGGTCAAGTGTTAG(SEQIDNO.:71);GACAATACCTCGATTACAGT(SEQIDNO.:72);對于結(jié)核分枝桿菌AACATCTCGGTGAAGTTGAT(SEQIDNO.:73);TGACAACACCAACATCTC(SEQIDNO.:74);ACGAAGGTCTGCGTTT(SEQIDNO.:75);對于肺炎鏈球菌AATTCAAAGGTGAAGTCTACA(SEQIDNO.:79);CAACGTGATGAAATCGAAC(SEQIDNO.:80);GACAATCGACGTTGAGTT(SEQIDNO.:81);對于化膿性鏈球菌CAAAGGTGAAGTATATATCCTTTC(SEQIDNO.:82);CAACGTGACGAAATCGAA(SEQIDNO.:83);CGTGACAATCAACGTTGA(SEQIDNO.:84);及其組合。23、雜交方法，其包括使疑為包含聚核酸的試樣與固體載體接觸，所述固體載體具有固定在其上的一個或多個選自SEQIDNOs:12-392和393的探針。24、用于檢測和/或鑒定試樣中至少一種微生物或同時檢測和/或鑒定試樣中幾種微生物的試劑盒，其包括(a)任選地，至少一個使至少部分^//基因可變區(qū)擴增的引物對；Cb)根據(jù)權(quán)利要求21的組合物；(c)緩沖液或產(chǎn)生緩沖液所需的組分，其能使包含在所述組合物中的探針和存在于樣品中的聚核酸或其擴增產(chǎn)物發(fā)生雜交反應(yīng)；(d)溶液或產(chǎn)生所述溶液所需的組分，其能在適當(dāng)?shù)南礈鞐l件下洗滌形成的雜交物；(e)任選地，用于檢測由前述雜交得到的雜交物的工具。25、檢測和/或鑒定痰樣中至少一種微生物或用于同時檢測和/或鑒定痰樣中幾種微生物的方法，其包括步驟(a)任選地，從所述至少一種要檢測的微生物中釋放、分離和/或濃縮聚核酸；(b)任選地，用至少一個引物對擴增來自所述微生物的至少部分基因可變區(qū)；(C)雜交至少部分來自所述微生物的^V/基因可變區(qū)與一組包括至少一個選自下述序列的探針seQIDNOs:12至84、208至251、254-315或330至393;(d)檢測在步驟(C)中形成的雜交物；(e)鑒定來自步驟(d)的所述檢測物中的所述至少一種微生物。26、微點陣，其包括至少一個選自下述序列的探針SEQIDNOs:12-393或其等效物，只要所述等效物特異地結(jié)合微生物的^/基因可變區(qū)。27、檢測和/或鑒定試樣中至少一種流感嗜血桿菌微生物或同時檢測和/或鑒定試樣中幾種流感嗜血桿菌微生物的方法，其包括步驟(a)任選地，從所述至少一種要檢測的微生物中釋放、分離和/或濃縮聚核酸；(b)任選地，用至少一個引物對擴增來自所述微生物的至少部分基因可變區(qū)；(c)雜交至少部分來自所述微生物的基因可變區(qū)與一組包括至少一個選自下述序列的探針SEQIDNOs:12-17和64-66;(d)檢測在步驟(C)中形成的雜交物；和(e)鑒定來自步驟(d)的所述檢測物中的所述至少一種微生物。28、檢測和/或鑒定試樣中至少一種粘膜炎莫拉菌微生物或同時檢測和/或鑒定試樣中幾種粘膜炎莫拉菌微生物的方法，其包括步驟(a)任選地，從所述至少一種要檢測的微生物中釋放、分離和/或濃縮聚核酸；(b)任選地，用至少一個引物對擴增來自所述微生物的至少部分基因可變區(qū)；(c)雜交至少部分來自所述微生物的rt/基因可變區(qū)與一組包括至少一個選自下述序列的探針SEQIDNOs:18-23和208至210;(d)檢測在步驟(C)中形成的雜交物；禾口(e)鑒定來自步驟(d)的所述檢測物中的所述至少一種微生物。29、檢測和/或鑒定試樣屮至少一種假單胞菌屬微生物或同時檢測和/或鑒定試樣中幾種假單胞菌屬微生物的方法，其包括步驟(a)任選地，從所述至少一種要檢測的微生物中釋放、分離和/或濃縮聚核酸；(b)任選地，用至少一個引物對擴增來自所述微生物的至少部分基因可變區(qū)；(c)雜交至少部分來自所述微生物的化/基因可變區(qū)與一組包括至少一個選自下述序列的探針SEQIDNOs:51-57或85-88;(d)檢測在步驟(C)中形成的雜交物；禾口(e)鑒定來自步驟(d)的所述檢測物中的所述至少一種微生物。全文摘要本發(fā)明一般涉及鑒定樣品中微生物的方法，特別地涉及鑒定原核微生物的方法。在某些實施方案中，本發(fā)明涉及用于檢測和/或鑒定試樣中至少一種微生物或用于同時檢測和/或鑒定試樣中幾種微生物的方法，其中使所述試樣與一種或多種源自tuf基因可變區(qū)的探針接觸。文檔編號C12Q1/04GK101287844SQ200680035210公開日2008年10月15日申請日期2006年7月27日優(yōu)先權(quán)日2005年7月27日發(fā)明者B·N·弗里,V·N·佩雷拉申請人:診斷陣列系統(tǒng)私人有限公司