專利名稱：提高鹵蟲滯育孢囊孵化百分率的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及通過在預先決定的孵育期內在允許至少一部分孢囊孵 化并釋放自由游動的無節(jié)幼體的條件下在孵化介質中孵育孢嚢，從一定量的一個或多個離蟲(Artemia)物種的孢嚢(cyst)(包括滯育孢 嚢)開始，孵化囟蟲無節(jié)幼體(Artemia nauplii)的方法，在該方法 中，使孢囊接觸化合物來破壞至少一定數量所述滯育孢囊的滯育，以 便使它們能夠在所述的預先決定的孵育期內產生自由游動的無節(jié)幼時的全部孢嚢總數的X %提高至它們接觸所述化合物時的高于X % 的孵化百分率。
背景技術：
卣蟲無節(jié)幼體通常用作水產養(yǎng)殖中的活食物生物，更特別用作海 洋魚和蝦早期幼體階段的活食物。作為活食物的卣蟲無節(jié)幼體不是按 原樣上市銷售，而是作為從其中可以孵化出無節(jié)幼蟲的卣蟲孢嚢上市 銷售。存在可以產孢囊的不同的鹵蟲物種，如^Wew/fl/fwic/sc"m ，在囟蟲的被囊胚胎或孢囊中，動物的胚胎發(fā)育在原腸胚階段中斷 (或進入滯育)。就這樣由雌性釋放至水生環(huán)境中，這些滯育或休眠幼體。只有在通過外部刺激去活化滯育控制機制時，才重新發(fā)育。在 自然環(huán)境中，已知冷休克(冬眠)和脫水能終止滯育。在孵育條件允 許時，因此激活的(或靜止的)胚胎可以重新發(fā)育。滯育的以及靜止的孢囊可以存活長期的脫水和缺氣、極端溫度和壓力。在自然環(huán)境中，這樣的抵抗力是物種的存活策略，因為孢囊通 常暫時是給定群落生境中動物的唯一生活階段。在它們的自然環(huán)境之 外，當被充分脫水并適當儲存時，即，在千燥的環(huán)境中，優(yōu)選在低溫 以及遠離光和氧氣時，孢囊保持生存力持續(xù)相當長的一段時間(幾年)。的全年現貨供應的可利用性，以及短的孵育時間使它們成為最方便的、最不勞動密集的用于水產養(yǎng)殖的活食物的來源(Van Stappen， 1996)。從自然環(huán)境收集用于后者水產養(yǎng)殖應用的卣蟲孢嚢。在這樣收集 的未加工產品中，存在著不同比例的靜止和滯育的孢嚢。在應用一系 列加工和調節(jié)程序后獲得干的、即可使用的商業(yè)產品。在加工中，將 未加工的產品純化(除去碎片)，洗滌(除去鹽)，并且最終干燥。 標準調節(jié)技術通常設法復制冬眠(儲存于冷的倉庫中)和/或干燥(用 熱空氣作為加工程序的一部分來干燥)的自然條件，并且通常導致實 際上全部單個孢嚢中滯育機制的去活化。然而，許多時候加工過的孢嚢的孵化率仍然是差的，因為胚胎不 能進入自由游動的無節(jié)幼體的階段。以H。/。， Heff或Houtput來測量孵化率，并考慮孵化方法的最后 結果，即，自由游動的無節(jié)幼體。孵化百分率(H% )是從100個完 整孢囊出現的自由游動的無節(jié)幼體的數量，孵化效率(Heff)是從一 克孢囊產品孵出的自由游動的無節(jié)幼體的數量，孵化產量(Houtput) 是從一克孢囊產品孵出的自由游動的無節(jié)幼體的重量。胚胎有時不能進入游動的無節(jié)幼體階段的原因通常與不適當的孵 育條件相關。然而，孢嚢固有的因素也可能引起這種問題(例如不 足量的儲存能量)。此外，在一些鹵蟲林系或相同林的一些批次中， 或多或少大量的胚胎，盡管是存活的，卻不能夠開始孵化程序。對于 這樣的林系或批次，直至所應用的加工或調節(jié)技術明顯不能去活化所 有單個孢囊中的滯育，以便獲得最大數量的自由游動的無節(jié)幼體時， 補充性的和更特異性的滯育去活化程序將是必需的(Van Stappen, 1996) 所述的程序包括干燥孢囊的a.o.延長冷儲存，重復的水合-脫水循 環(huán)，特定化學物質(例如，過氧化氫)溶液中的短時孵育。這些技術 是林系和批次特異性的，此外，孢囊常常以反復無常的方式應答。不 適當地進行時，甚至獲得不利的結果(例如，在不適當的時間-劑量組 合下在化學物質溶液中的孵育)。將這些技術另外應用，并在直至那 時已經應用加工技術之后，即，由孢囊的使用者來應用。它們需要后 者大量的工作、技巧和足夠的一般卣蟲背景知識以及關于待處理的特 定抹系或批次的特定信息。沒有這將是錯誤和/或不利結果的起源。這 些特定的、補充的滯育停止技術的使用者不相宜的性質消除了囟蟲孢 囊的主要優(yōu)勢之一水產養(yǎng)殖的易獲得新鮮食品的來源。EP1195088中^^開了能夠處理孢嚢來提高其孵化百分率而不需要 太多處理步驟的方法。在這個方法中，將0.5至30mg/l孵化介質范圍 內選定量的過氧化氫引入孵化介質中，其中以最大約每升5g孢囊千物 質的密度來孵化孢嚢，將孵化百分率從孢囊沒有接觸過氧化氫時的全 部孢囊總數的X %提高至它們接觸過氧化氫時的高于X %的值。該方法的缺點是該方法中的孵化依賴于過氧化物的量。更特別地， 在孵化介質中需要引入0.5至30 mg/1的量，以允許破壞至少一定數量 滯育囟蟲孢嚢的滯育，以便使這樣的滯育孢囊能夠在孵育期內產生自 由游動的無節(jié)幼體。在過氧化物濃度低于最佳過氧化物濃度范圍時， 孵化沒有達到其最大值，在過氧化物濃度高于最佳過氧化物濃度的范 圍時，過氧化物對無節(jié)幼體是毒性的，并且這反映在孵化低于最大值。 該最佳濃度的范圍非常小，并且由于其還依賴于鹵蟲的林系或批次， 因此在可以計算過氧化氬劑量之前必需通過標準化的測試來測定每個 批次或林系的最佳過氧化物濃度的范圍。這種最佳范圍的測定是費時 的工作，沒有小心謹慎地進行時，其能降低孵化百分率。發(fā)明內容因此，本發(fā)明的目的是提供一種提高鹵蟲孢囊孵化百分率的可替 換方法，而沒有限制允許最大孵化百分率的最佳濃度的狹窄范圍。為此，使孢囊接觸至少 一種包含至少 一個-(OH)C-C(OH)-結構的 化合物，來破壞至少一定數量滯育孢囊的滯育，以便使它們能夠產生 自由游動的無節(jié)幼體，從而將孵化百分率從孢囊沒有接觸所述化合物 時的全部孢囊總數的X %提高至它們接觸所述化合物時高于X %的 值。本發(fā)明人已經發(fā)現，使孢囊接觸所述化合物，更特別地，將所述 化合物引入孵化介質中，能夠破壞至少一定數量滯育孢嚢的滯育，并 因此提高孵化百分率。令人意外地，在這個新方法中，在所述化合物 的非常大濃度范圍內獲得最大孵化，與EP1195088中所述的方法相反， 其中最大孵化只可能在窄范圍的過氧化氫或產生過氣化氬的化合物 中。該特征的重要優(yōu)勢是測定最佳濃度范圍時，保持接近該最佳濃度 不是那么關鍵。對卣蟲的致死作用不常發(fā)生，即使在最佳結果的所述 化合物的最小劑量雙倍或三倍時。另 一個重要優(yōu)勢是與EP1195088中詳細說明的過氧化物或產生過 氧化物的化合物相比較，包含至少 一個-(OH)C-C(OH)-結構的化合物 是較低侵蝕性的(較低的氧化性，較低的可燃性)，這對于加工孢囊 的生產機構中的勞動者或對于使用孢嚢的農夫是較低傷害的。本發(fā)明還涉及一定量的一個或多個囟蟲種的孢囊，預定將該孢囊 在孵化介質中孵育，來產生自由游動的無節(jié)幼體，并且在不含包含至 少 一個-(OH)C-C(OH)-結構的化合物的孵化介質中孵化它們時，顯示 出全部孢嚢總數的X。/。的孵化百分率。根據本發(fā)明的孢囊的特征在于 它們結合一定量的至少 一種包含至少 一個-(OH)C-C(OH)-結構的化 合物，該量足以將孢囊的孵化百分率從X。/。提高至將該量的所述化合 物引入孵化介質中時高于X %的孵化百分率。使用 一種或多種包含至少一個-(OH)C-C(OH)-結構的化合物替 代EP1195088中提及的過氧化氫或產生過氧化物的化合物的優(yōu)勢是對 孵化百分率的影響較少依賴于其量。此外，這些特定的化合物更易于 溶于水，而沒有失去其提高孵化百分率的特定活性。因此，更易于使它們停留(包被)在孢嚢上。再一個優(yōu)勢是所述化合物附著在孢囊上，當孢嚢的密度低于或高 于常規(guī)實踐中所用的常見密度時仍然具有它們提高孵化百分率的比 活。另 一個優(yōu)勢是將所述化合物引入孵化介質中時，TCBS-瓊脂上的 細菌數同時得到抑制，而沒有傷害孵化過程中或孵化之后的自由游動 卣蟲無節(jié)幼體。本發(fā)明的其他特征和優(yōu)勢將從以下根據本發(fā)明的孵化方法和容器 中包裝的孢嚢的一些特定實施方案的描述中變得明顯。在本說明中， 參考其中附圖。在圖中，對可購得的綠茶提取物給出數據，這種綠茶提取物含有 最少98%的多酚，其中至少50%含有表沒食子兒茶精沒食子酸鹽。將 這種商業(yè)化合物稱為"EGCG，，并且以毫克化合物/升或ppm來計算劑本發(fā)明一般性地涉及從含有一定數量滯育孢嚢的卣蟲孢嚢開始， 產生自由游動的面蟲無節(jié)幼體的方法。就如在常規(guī)孵化方法中一樣，育孢囊，通常但不是必需的:在一天(24小時)的孵育期內。將干燥 的孢嚢或儲存于鹽水中的孢囊(濕的孢嚢)加入至少含有水的孵化介 質中時，即，孢嚢開始水合時，孵育期開始。因為孵化介質的組成和 最佳的孵化條件通常是本領域技術人員已知的并在文獻中有描述，特 別是在如上所提及的Van Stappen ( 1996)中，在此不需要對這種組 成和這些條件作進一步描述。然而，應當注意到也可以在稍微不同于 最佳條件的條件下孵化孢嚢。例如，可以在低于或高于28X:的溫度， 例如，在約30'C的溫度或在含有低于或高于35g/l溶解的鹽的孵化介 質中孵化孢囊。盡管在實踐條件下，優(yōu)選約2g/l或稍微低一些的孢嚢 密度，孢囊密度也可以低于或高于2g/1。然而，通常孢嚢密度低于10g/l 或甚至低于5g/l。根據本發(fā)明的方法的本質特征是使孢囊接觸至少 一種提高孵化的化合物，該化合物包含至少一個-(OH)C-C(OH)-結構，特別是通過將 這種提高孵化的化合物引入孵化介質中，來破壞至少一定數量滯育囟 蟲孢嚢的滯育，以便還能夠使這樣的滯育孢囊產生自由游動的無節(jié)幼 體。在孢囊含有部分滯育孢囊的情況中，將孵化百分率從沒有引入所 述化合物的孵化介質中孵化孢嚢時的全部孢嚢總數的X %提高至在 含有所述化合物的孵化介質中孵化時的高于X %的孵化百分率。清楚 的是，在根據本發(fā)明的方法中，孵化至少部分滯育孢囊，但不必需孵 化加入孵化介質中的所有滯育孢囊，盡管優(yōu)選孵化盡可能多的滯育孢 嚢。孢囊中更高的孵化百分率的結果是在更多孢囊孵化時，孵化介質 中釋放更多用于異養(yǎng)海洋細菌的底物。令人意外地，當通過在孵化介 質中引入所述化合物提高孢囊醉化時，孵化介質中的相同化合物同時 抑制了細菌(主要是弧菌)的生長。圖4顯示五個不同孢嚢林系(孢囊1至孢嚢5)的孵化介質的 Marine瓊脂和TCBS (硫代硫酸鹽檸檬酸鹽膽汁鹽蔗糖瓊脂)上的細 菌數，這些孢嚢中的至少一些處于滯育中，使其接觸不同濃度的 EGCG，在有效破壞最大數量特定林系孢囊滯育的范圍中選擇所述濃 度。沒有使用包含至少一個-(OH)C-C(OH)-結構的提高孵化的化合物 的孵化介質中在孵育24小時后在TCBS上的細菌數(主要是弧菌) 通常高于106 CFU/ml。令人意外地，用EGCG孵化孢囊時，孵化介 質中的弧菌量在孵育24小時后顯著降低(與對照相比較，2-4個對數 單位)。在根據本發(fā)明的方法中，引入孵化基質中的含有至少一個 -(OH)C-C(OH)-結構的化合物的量優(yōu)選為至少1 mg/1，更優(yōu)選至少3 mg/1。使用至少5mg化合物/升孵化介質的量時，獲得最佳結果，并且 最優(yōu)選至少10mg化合物/升孵化介質?；诒灰敕趸橘|中并提高 孵化的含有至少一個-(OH)C-C(OH)-結構的所有不同化合物的總和 來計算所述量，因為在實踐中含有可以用來提高孵化百分率的所述化合物的 一些產品包括多于一種所述化合物的混合物?？梢栽诜跤陂_始時將包含至少一個-(OH)C=C(OH)-結構的化 合物引入孵化介質中，特別是在將孢囊加入孵化介質中時將所述化合 物引入孵化介質中。如下文中所解釋的，這將是將所述化合物混合干 燥孢嚢時的情況。也可以在將孢嚢加入孵化介質之前將包含至少一個 -(OH)C-C(OH)-結構的化合物引入孵化介質中。在這種情況中，應將 引入賻化介質中的所述化合物的量理解為在向孵化介質中加入孢嚢時 其中存在的所述化合物的量，因為加入所述化合物后，其中一部分已 經反應掉。當包含至少一個-(OH)C-C(OH)-結構的化合物沒有和孢囊同時 引入孵化介質中時，優(yōu)選在孵育期開始后少于IO小時，更優(yōu)選少于8 小時，將它們引入其中。在孵育期開始后少于6小時，尤其是少于5 小時將所述化合物引入孵化介質中時，獲得對孵化百分率的最佳效果。 清楚的是不必將所述化合物的總量一次引入孵化介質中，但可以分幾 次將其引入其中。為了獲得最大孵化百分率，根據本發(fā)明待引入孵化介質中的包含 至少 一 個-(OH)C-C(OH)-結構的化合物的量取決于孢嚢的具體林系 或具體批次。它特別取決于滯育孢囊的數量，尤其是還取決于滯育的 深度，即，取決于滯育階段。然而，與使用過氧化氫(EP1195088) 的現有技術的方法相反，其中可以達到最大孵化百分率的范圍大得多， 以至于可以使用至少雙倍或三倍量而對鹵蟲無節(jié)幼體沒有任何毒性影 響。此外，最大孵化百分率值通常甚至高于使用過氧化氫的方法中的 最大孵化百分率值。圖1中說明了 EPGC對孵化百分率(H+和H-)的劑量作用對比 過氧化氫的劑量作用。在這個實施例中，使用一系列l(wèi)升的圃錐桶， 其中將2g相同批次的鹵蟲孢囊，包括滯育孢嚢(含水量'.7.5%)， 引入人造海水中(25g/l)。圃錐桶中的水溫保持恒定在大約30'C,將 水不斷地充氣和照明。在孢囊孵育開始時將不同劑量的EGCG和過氧 化氫(H202)加入孵化介質中。每個處理重復進行三次，并且處理結果為三次的平均值。從圖1中可以看出，在該實施例中，加入8mg/L 過氧化氫獲得最大78.9%的孵化百分率，對于EGCG的最大孵化百分 率為83.8%。更重要的，在9mg過氧化物/L的濃度，孵化百分率已經 顯著降低。使用高于8 mg/L過氧化氫劑量顯現出來的H-和H+之間的 差異證明了對自由游動的無節(jié)幼體的毒性影響。這種毒性影響在 EGCG曲線中沒有出現。在16mgEGCG/L的濃度，孵化百分率顯示 超過80%,并且甚至在引入至少兩倍(40 mg/L )或至少三倍(60 mg/L) 量EGCG時，孵化百分率停留在80%以上。劑量的范圍比過氧化氫 更寬得多，這實際上暗示了將方法擴大規(guī)模至商業(yè)實踐時，對于超劑 量存在較低的風險。在圖2中，在與圖l相同的實驗條件中使用三個不同的EGCG劑 量，用于鹵蟲孢囊的五個不同林系或批次。最大孵化百分率隨林系與 林系或批次與批次的不同而不同，但是將例如30mg EGCG/L劑量應 用于所有批次時，沒有測定這些批次中每一批的最大孵化百分率的特 定濃度，直到應用的劑量對這些批次中的任意一批沒有毒性作用。因 此，不是必需測定用于獲得孢嚢每個批次或林系的最大孵化百分率的 最佳范圍，但是優(yōu)選，至少測定以上的濃度的下限，其對應的孵化百 分率接近于最大孵化百分率。在根據本發(fā)明的方法中，可以使用包括提高孵化的化合物的產品， 該提高孵化的化合物包含至少一個-(OH)C-C(OH)-結構，或多于一種 這樣的提高孵化的化合物的混合物。提高孵化的化合物中的 -(OH)C-C(OH)-結構優(yōu)選是所述化合物的芳香族結構的 一部分.更優(yōu) 選，提高孵化的化合物選自含有多酚和/或類黃酮的組，更優(yōu)選這些多 酴和/或類黃酮含有兒茶酚和/或掊酚結構(兒茶酚結構或基團 -C6H502;掊酚結構或基團-C6H503)。這樣產品的實例是可購得的產品，如綠茶提取物，兒茶提取物， 葡萄籽提取物等。這些產品通常含有高百分比的不同多酚和/或類黃酮 的混合物。多酚和類黃酮包括一大組次級植物代謝產物。目前超過5000種單獨的化合物是已知的，這是基于非常少的核心結構。它們多數主要源 自各種羥基化模式(至多六個羥基)和通過簡單曱基化或不同的單-和雙-糖的醚取代。原花色素大部分產生于綠茶(C"附/仏'"^V^"s")、 葡萄軒和皮(v/w,/er")， 或可可(77^6ra附"cflc"o )。尤其是含有兒茶酚和/或掊酚結構的多酚和/或類黃酮成為提高滯育孢嚢孵化百分率的良好候選物。該組的實例是兒茶酚，焦性沒食 子酸，焦性兒茶酚，沒食子酸丙酯，沒食子酸月桂酯，沒食子酸辛酯， 甲基兒茶酚，丙基兒茶酚，二羥基苯曱醛，鞣花酸水合物，多巴胺HC1, DL-異丙基腎上腺素硫酸鹽脫水物，沒食子苯乙酮，迷迭香酸，間苯 三酚，并特別屬于類黃酮組二氫黃酮組，例如木犀草素；黃酮醇 組，例如槲皮素，漆樹黃酮，楊梅黃酮；二氫黃酮醇組，如紫杉 葉素；黃烷-3-醇組，例如兒茶素，表兒茶素，表沒食子兒茶精，表 兒茶素沒食子酸鹽，表沒食子兒茶精沒食子酸鹽和其他如花青素。實際上，含有至少一個兒茶酚或格酚形式的芳香族結構的大多數 類黃酮或多酚是提高滯育孢嚢孵化百分率的良好候選物。類黃酮的綜 述可以在Pietta (2000)的綜述中找到，在此引入作為參考。在實踐中，使用含有上述化合物的混合物的產品(大部分是可購 得的產品)。盡管如此，也可利用包括不超過一種所述化合物的產品。可以通過采取一定數量的孢嚢樣品并在實質上相同的條件下(相 同的溫度，含鹽量，孢囊密度等)孵化這些樣品，來測定孢囊的最大 孵化百分率(M%)，所述條件相互之間唯一的差異是每單位體積引 入其中的一種或多種選定的包含至少一個-(OH)C-C(OH)-結構的提 高孵化的化合物的量不同。接著，可以測定對于產生孵化百分率可能 提高的不同量的孵化百分率，特別是可以選擇產生最高孵化百分率 M。/。的最佳量。替代選擇產生最大孵化百分率M。/。的量，也可能選擇 產生更小孵化百分率的量，特別是產生至少等于X % + 0.4*(M-X) %(X %=沒有添加提高孵化的化合物時的孵化百分率)的孵化百分率 的量，并且優(yōu)選是產生至少等于X %+0.6*(M-X) 。/。的孵化百分率的 量，其為實質上對應于產生最優(yōu)選選擇的所述最大孵化百分率M。/。的所述量的量。


圖1是顯示加入孵化介質中的過氧化氫和EGCG對包括滯育孢囊 的卣蟲孢嚢孵化的劑量相關效果的圖。計算為無節(jié)幼體加傘部加胚胎 總數上的孵化的無節(jié)幼體數量的孵化百分率稱為h-。計算為無節(jié)幼體 加傘部加胚胎總數上的孵化的無節(jié)幼體加數量的孵化百分率稱為h+。圖2是顯示不同批次的包括滯育孢囊的囟蟲孢囊之間EGCG的最 佳劑量可變性的圖。圖3是顯示將EGCG引入孵化介質時對將其包被在孢囊上時孵化 介質中孢嚢密度對孵化百分率的影響的圖，更特別是以每克孢嚢8mg EGCG的量。圖4是顯示孵化介質中引入30mg EGCG/1后24小時，Marine 瓊脂(MA)和TCBS-瓊脂上的微生物數的圖。
具體實施方式
在以下的實施例中，用下列產品獲得最大孵化百分率，該產品包 含以下濃度的不超過一種不同的化合物，該化合物包含至少一個 -(oh)C-C(oh)-結構焦性兒茶酚孵化介質中14ppm焦性沒食子酸孵化介質中14ppm槲皮素孵化介質中30ppm甲基兒茶酚孵化介質中15ppm沒食子酸丙酯孵化介質中40ppm預定用于根據本發(fā)明方法中的孢囊是一個或多個鹵蟲種的孢囊。 將它們投放市場時，通常將它們包含于容器中，特別是在罐中。然而， 還可以將它們包裝于其他容器中，如袋子，壇子，瓶子等。容器可以 含有不同量的孢嚢，即孢囊的量例如在0.01和50kg之間，更特別在 O.l和lOkg之間變化。根據本發(fā)明，容器中優(yōu)選含有所述量的孢囊并 結合一定量的一種或多種上述提高孵化的化合物，其含有至少一個-(OH)C-C(OH)-結構。將包裝的孢囊以任意密度加入孵化介質中時，這種結合孢嚢的提高孵化的化合物的量至少足以將上述量的所述化合物引入孵化介質中。優(yōu)選，結合所述量孢嚢的所述提高孵化的化合物的量使得在孵化 介質中存在該量的提高孵化的化合物下孵化孢嚢時，孵化百分率至少 等于X。/o + 0.^(M-X)。/。，優(yōu)選至少等于X %+0.6*(M-X) %，最優(yōu)選 實質上等于MVo。如上已經解釋的，M。/。是在孵化介質中引入最佳量 的提高孵化的化合物時在應用的孵化條件下可獲得的最大孵化百分率，而x %是在相同孵化條件但沒有添加這些化合物下的孵化百分率。根據本發(fā)明，已經發(fā)現孵化介質中含有至少一個-(OH)C-C(OH)-結構的化合物的最佳量取決于孵化介質中孢囊的密度。從發(fā)明人進行 的實驗可以看出，實際上在2g/1的孢囊密度下引入孵化介質中的提高 孵化的化合物的濃度沒有引起與使用更高的孢嚢密度時(例如6g/1) 相同的孵化百分率提高。這意味著在更高的孢囊密度下，為了獲得對 孵化百分率的相同效果，必需獲得更高濃度的所述化合物。因為含有至少一個-(OH)C=C(OH)-結構的化合物比過氧化物更 穩(wěn)定，并且是溶于水的，因此更容易以均勻的方式將它們混合或包被 在孢囊上，使得以低密度(例如，低于2g/L的密度)或高密度(例如， 高于2g/l的密度，特別地甚至高于5g/l的密度)在罐中孵育孢囊時， 孵化介質中所述化合物的濃度隨著遞增的孢嚢密度而增加，使得仍然 至少等于獲得比沒有將所述化合物加入孢囊中時更高的孵化百分率需 要的最小濃度。相反，過氧化氫或產生過氧化氫的化合物大部分不穩(wěn) 定并因此難以附著于孢嚢。通常，這些化合物必需與孢嚢混合，特別 是當將孢嚢以高密度加入時，這將導致孵化介質中不正確的濃度。在圖3中，觀察到將提高孵化的化合物包被在孢囊上的優(yōu)勢。在 與上文所述的相同孵化條件下，例如圖l中所說明的，在l升圓錐桶 中孵化卣蟲孢嚢，包括滯育孢囊，但是以每升2g孢嚢或更高的不同密 度。對一個系列的孢嚢，在孵育孢嚢的相同時刻將EGCG以20ppm(20 mg/L )濃度加入孵化介質中。當使用更高的孢嚢濃度時，將相同 量的EGCG引入孵化介質中，EGCG的量不足以將孵化提高至最大孵 化百分率(參見圖3)。在另一個系列中，將具有7.5%含水量的孢嚢用每克孢囊8mg EGCG包被(即，每克孢嚢干物質約8.6mgEGCG)并在孵化介質中 孵育。在正常的密度(2g/L),這種包被在孵化介質中獲得16ppm (mg/L) EGCG的濃度。當使用更高密度時，濃度也變得更高，顯示 出將化合物包被在孢囊上的優(yōu)勢。在每升4g孢嚢的密度，EGCG的 濃度為32ppm(每克孢囊8mg EGCGx4g孢囊/升=每升孵化介質32mg EGCG)。以6g/L的密度孵育孢囊時，濃度變成每升孵化介質48mg EGCG，并且該實施例中的孵化百分率保持80%以上。結合所述量孢囊的含有至少一個-(OH)C-C(OH)-結構的提高孵 化的化合物，優(yōu)選結合至少lmg/克孢囊干物質量的孢嚢，優(yōu)選至少2 mg/g孢嚢干物質，更優(yōu)選至少3 mg/g孢囊干物質和最優(yōu)選至少5 mg/g 孢囊干物質，孢囊優(yōu)選包含在容器中，特別是在罐中。在實踐中，孢 嚢從來不是絕對干燥的，因此根據孢嚢的含水量(其通常低于10%)， 每克實際孢囊的所述化合物的相應量稍微小一些。在本專利申請中， 孵化介質中的孢嚢密度通常仍然表示為每升孵化介質的實際孢嚢(其 含水量低于10% )的克數。結合孢嚢的提高孵化的化合物優(yōu)選是其所述結構是所述化合物的 芳香結構一部分的化合物。這些化合物優(yōu)選選自多酚和/或類黃酮，特 別是含有兒茶酚和/或掊酚結構的多酚和/或類黃酮。在實踐中，有時候將包含超過一種所述化合物的混合物的產品結 合包裝中的孢嚢。以上給出了這樣產品的實際實例。將一定量的孢囊包含在容器中時，可以通過將提高孵化的化合物 包裝在分開的包裝中來使其結合容器中所含的孢嚢，使得含有孢囊的 容器和含有提高孵化的化合物的包裝形成可以原樣銷售的套裝(set)。優(yōu)選，將所述提高孵化的化合物與孢嚢共同包裝，例如，固定在含有 孢嚢的容器外部或與該容器一起包含在相同的包裝中。然而，更優(yōu)選，也可以將提高孵化的化合物包含在容器中。當使 用液體溶液時，例如，可以將其包含于玻璃或塑料瓶或小瓶(瓶子) 中并與容器特別是罐中的孢嚢包裝在一起。當使用固體的提高孵化的化合物時，可以將該化合物直接與孢嚢混合成粉末或顆粒或片劑或其 他固體形狀。當然，例如，也可以與孢嚢混合包裝于膠囊中。最優(yōu)選， 將提高孵化的化合物附著或換句話說包被在孢嚢上。這樣，總是將正 確量的孵化提高化合物加入孵化介質中，尤其是當只將容器中所含的 一部分孢嚢引入孵化介質中時。參考文獻Pietta， P-G. Reviews: flavonoids as antioxidants (綜述作為 抗氧化劑的類黃酮)，(2000)在:J. Nat. Prod.Vol.63. pl035畫1042Van Stappen, G. Introduction, biology and ecology of Artemia (卣蟲的介紹，生物學和生態(tài)學)，(1996)在:Manual on the production and use of live food for aquaculture (水產養(yǎng)殖的活食物的生產和使用 指南)。Lavens， P.和Sorgeloos, P.編輯。Laboratory of Aquaculture and Artemia Reference Center (水產養(yǎng)殖和卣蟲參照中心的實驗室)， University of Ghent (根特大學)，比利時，p. 79-13權利要求
1.通過在允許至少一部分孢囊孵化并釋放自由游動的無節(jié)幼體的條件下在孵化介質中孵育孢囊，從一定量的一個或多個鹵蟲種的包括滯育孢囊在內的孢囊開始產生自由游動的鹵蟲無節(jié)幼體的方法，其特征在于使孢囊接觸至少一種包含至少一個-C(OH)＝C(OH)-結構的化合物來破壞至少許多所述滯育孢囊的滯育，以便使它們產生自由游動的無節(jié)幼體，從而將孵化的孢囊的孵化百分率從所述孢囊沒有接觸所述化合物時的全部孢囊總數的X％提高至它們接觸所述化合物時的高于X％的孵化百分率。
2. 根據權利要求1的方法，其特征在于將所述化合物引入所述孵 化介質中。
3. 根據權利要求2的方法，其特征在于以高于1 mg/1，特別是高 于3 mg/1，更特別高于5 mg/l和最特別高于10 mg/1的量，將所述化 合物引入所述孵化介質中。
4. 根據權利要求1至3任一項的方法，其特征在于所述孢囊包含 如此量的滯育孢囊，以致通過在以所述孵化介質中引入最佳量的所述 化合物，可以將孵化百分率從X。/。提高至最大孵化百分率M。/。，并且 選擇所述化合物的所述量來將孵化百分率從X %提高至至少等于X % + 0.4*(M-X) %的孵化百分率，并且優(yōu)選提高至至少等于X % + 0.5*(M-X) %的孵化百分率。
5. 才艮據權利要求l至4任一項的方法，其特征在于所述化合物的 -C(OH) -C(OH)-結構是該化合物的芳香亞結構的一部分，所述化合物 優(yōu)選選自多酚和/或類黃酮，更優(yōu)選選自含有兒茶酚和/或格酚結構的 多酚和/或類黃酮。
6. 根據權利要求1至5任一項的方法，其特征在于在開始孵化其 中的孢囊后少于IO小時，優(yōu)選少于8小時，更優(yōu)選少于6小時和最優(yōu) 選少于5小時，將所述化合物引入孵化介質中。
7. 根據權利要求6的方法，其特征在于將所述化合物與孢囊實質上同時引入孵化介質中，特別是通過與孢囊混合和/或通過附著或包被 在其上。
8. —定量的一個或多個卣蟲種的孢囊，預定將該孢囊在孵化介質 中孵育來產生自由游動的無節(jié)幼體，并且在不存在包含至少一個 -(OH)C-C(OH)-結構的化合物的孵化介質中孵化時顯示出全部孢嚢總數xy。的孵化百分率，其特征在于將所述孢囊與一定量的至少一種包含至少一個-(OH)C-C(OH)-結構的化合物混合，該量足以將所迷量 孢囊的孵化百分率從X %提高至將該量的所述化合物引入孵化介質 中時的高于XV。的孵化百分率。
9. 根據權利要求8的一定量的孢囊，其特征在于所述量的所述化 合物包括至少l mg/g孢囊干物質，優(yōu)選至少2 mg/g孢囊千物質，更 優(yōu)選至少3 mg/g孢囊干物質和最優(yōu)選至少5 mg/g孢囊干物質。
10. 根據權利要求8或9的一定量的孢囊，其特征在于所述孢囊 包括如此量的滯育孢囊，以致通過在孵化介質中引入最佳量的所述化 合物，可以將孵化百分率從X。/。提高至最大孵化百分率MV。，并且所 述量的所述化合物使得該量的孢囊在其存在下孵化時，孵化百分率至 少等于X % + 0.4*(M-X) %，并且優(yōu)選至少等于X % + 0.6*(M-X) %。
11. 根據權利要求8至IO任一項的一定量的孢嚢，其特征在于所 述化合物的-(OH)C -C(OH)-結構是該化合物的芳香亞結構的一部分， 所述化合物優(yōu)選選自多酚和/或類黃酮，更優(yōu)選選自含有兒茶酚和/或 掊酚結構的多酚和/或類黃酮。
12. 根據權利要求8至11任一項的一定量的孢囊，其特征在于將 所述孢嚢包含于容器中。
13. 根據權利要求12的一定量的孢囊，其特征在于所述容器除了 含有所述孢嚢以外，還含有所述量的所述化合物。
14. 根據權利要求13的一定量的孢囊，其特征在于所述容器含有 包封在包裝中的所述化合物，該包裝將該化合物與孢囊分開。
15. 根據權利要求14的一定量的孢嚢，其特征在于將所述化合物 與孢囊混合和/或附著或包被在其上。
16. 根據權利要求15的一定量的孢囊，其特征在于將所述容器與 所述量的所述化合物共同包裝。
17. 第一容器和第二容器的套裝，第一容器含有一定量的一個或 多個卣蟲種的孢嚢，預定將該孢嚢在孵化介質中孵育來產生自由游動 的無節(jié)幼體，并且在不存在包含至少 一個-(OH)C-C(OH)-結構的化合 物的孵化介質中孵化時顯示出全部孢囊總數X %的孵化百分率，第二 容器含有一定量的至少一種包含至少 一 個-(OH)C-C(OH)-結構的化 合物，該量足以將所述量孢囊的孵化百分率從X。/。提高至將該量的所 述化合物引入孵化介質中時的高于X %的孵化百分率。
18. 包含至少一個-C(OH)-C(OH)-結構的化合物的用途，用于提 高一定量的一個或多個鹵蟲種的孢嚢的孵化百分率，更特別用于提高 一定量的包含滯育孢囊的孢囊的孵化百分率。
全文摘要
從一定量的包括滯育孢囊的鹵蟲孢囊開始孵化鹵蟲無節(jié)幼體的方法，其通過在預定的孵育期內，在允許至少一部分孢囊孵化并釋放自由游動的無節(jié)幼體的條件下，在孵化介質中孵育孢囊而進行，在該方法中，使孢囊接觸包含至少一個-(OH)C＝C(OH)-結構的化合物，來破壞至少許多所述滯育孢囊的滯育，以便使它們能夠在所述的預先決定的孵育期內產生自由游動的無節(jié)幼體，從而將孵化的孢囊的孵化百分率從沒有使該孢囊接觸所述化合物時的全部孢囊總數的X％提高至它們接觸所述化合物時的高于X％的孵化百分率。
文檔編號A01K61/00GK101272698SQ200680035576
公開日2008年9月24日 申請日期2006年9月25日 優(yōu)先權日2005年9月26日
發(fā)明者E·奈森斯-福克特, G·龍博, L·A·J·范紐文霍夫 申請人:Inve技術股份有限公司