專利名稱：治療呼吸道分泌過多的組合物和方法
治療呼吸道分泌過多的組合物和方法本發(fā)明受政府支持，在NHLBI資助的POl HL29594下完成。政府在 本發(fā)明中具有某些權(quán)利。發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明一般涉及用于治療呼吸道疾病的組合物和方法。背景呼吸道分泌過多是呼吸道疾病的特征，包括慢性阻塞性肺疾病 (COPD)、嚢性纖維化和哮喘。在患分泌過多的個(gè)體中，粘液堆積在呼 吸道中并引起呼吸道阻塞。沿所述呼吸道上皮排列的呼吸道粘膜下腺和杯 形細(xì)胞分泌粘液一一由水、碳7K化合物、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)組成的粘性的、粘 彈性凝膠。在健康個(gè)體中，粘液是吸入的外源顆粒和病原體的第一道防御 屏障。粘液捕獲這些顆粒和病原體并促進(jìn)對它們的清除，同時(shí)也預(yù)防組織 脫水。含有許多杯形細(xì)胞的小呼吸道及外周呼吸道和那些不能通過咳嗽清 除的尤其易受粘液堆積和粘液逐漸阻塞。大量個(gè)體患有呼吸道分泌過多疾 病，因?yàn)樗驮S多呼吸道疾病相關(guān)，包括COPD、嚢性纖維化和哮喘及呼 吸系統(tǒng)感染，包括病毒性支氣管炎和細(xì)支氣管炎。在美國，大約1.42億人 已被診斷患有COPD。嚢性纖維化影響超過30，000美國人并且哞喘影響1.7 億美國人。皮質(zhì)類固醇、抗膽堿能藥、抗生素療法、支氣管舒張劑(例如曱基黃嘌呤)、 具有強(qiáng)p2腎上腺素能刺激性質(zhì)的擬交感神經(jīng)藥、氣溶膠送遞"粘液溶解" 劑(例如水、高滲鹽溶液)和口服施用祛痰劑(例如愈創(chuàng)甘油醚)。尤其關(guān)于嚢性纖維化，最近的方法已施用DNA酶來減少富含DNA的粘液或痰 的粘度，以更容易地從呼吸道中清除所述粘液(Shak等人，Proc. Natl. Acad, 87:9188-9192， 1990; Hubbard等人，N. Engl. J. Med" 326:812， 1991)。除 了藥療法，由拍擊法、振動(dòng)療法和引流法組成的胸部理療也用于從呼吸道 中清除粘液。作為最后的依靠手段，肺移植對那些患有嚴(yán)重肺疾病的人可 以是個(gè)選擇。許多上面描述的藥療法具有嚴(yán)重的副作用。例如，吸入的皮 質(zhì)類固醇能引起真菌性口炎(口部酵母感染)、咳嗽、或嘶啞并且全身的 皮質(zhì)類固醇具有甚至更嚴(yán)重的副作用，如性發(fā)育延遲、月經(jīng)周期改變、體 重增加及血糖增加(糖尿病)。曱基黃嘌呤的副作用包括嚴(yán)重的惡心、震 顫、肌肉顫搐、抽搐和心臟跳動(dòng)不規(guī)則。例如在圖28中顯示的是病毒誘導(dǎo)的依賴EGFR和IL-13的途徑控制 上皮宿主和重塑的圖解。受體二聚化和受體酪氨酸激酶磷酸化作用激活 EGFR導(dǎo)致三條途徑的激活(1)募集Ral，隨后激活c-Src導(dǎo)致Statl 和Stat3的激活；(2)募集Shc/Grb2，接著激活Sos、 Ras和c-Raf導(dǎo)致 MEK1/2激活ERK1/2;和(3 )募集Gabl,接著激活PI3K導(dǎo)致產(chǎn)生磷脂 酰肌醇-3，4，5-磷酸(PI-3，4，5-P3 ),激活PDK1/2并然后激活A(yù)kt，該Akt 使促凋亡因子(例如，Bad)失活。IL-13信號轉(zhuǎn)導(dǎo)也能激活ERK1/2和 PI3K及Stat6， ERK1/2、 PI3K和Stat6中的每一個(gè)促進(jìn)基因(CLCA和 MUC )上調(diào)，促使纖毛轉(zhuǎn)分化為杯形細(xì)胞。IL-13信號轉(zhuǎn)導(dǎo)激活依賴IRS1/2 的至ERK1/2和Stat6的級聯(lián)，ERK1/2和Stat6中的每一個(gè)促進(jìn)基因(CLCA 和MUC)的上調(diào)，促使纖毛轉(zhuǎn)分化為杯形細(xì)胞。在生理?xiàng)l件下，這些途 徑可(與Statl的依賴IFN的激活結(jié)合)導(dǎo)致免受病毒感染，但是如果在 敏感的遺傳背景下存在持續(xù)激活，該相同的途徑可導(dǎo)致纖毛細(xì)胞增生和杯 形細(xì)胞組織轉(zhuǎn)化。合理使用特異性抑制劑，例如EGFR和IL-13受體阻斷 劑，可完全恢復(fù)正常的上皮結(jié)構(gòu)。已表明在大鼠中，上皮生長因子受體(EGFR)系統(tǒng)被其配體激活導(dǎo) 致在呼吸道上皮細(xì)胞中黏蛋白合成及杯形細(xì)胞組織轉(zhuǎn)化(Takeyama等人， Proc. Natl. Acad. Sci.， 96:3081-3086， 1999 )。此外，已表明健康個(gè)體的呼吸道中EGFR的表達(dá)稀少，但是所述受體在哞喘個(gè)體中表達(dá)(Burgel和 Nadel， Thorax, 59:992-996， 2004 )。刺激呼吸道上皮中EGFR表達(dá)的因子 或途徑為腫瘤壞死因子a (TNFa )途徑(Takeyama等人，Proc. Natl. Acad. Sci.， 96:3081-3086， 1999) 。 Nadel等人在美國專利號6,270,747中公開通過 施用EGFR拮抗物來治療分泌過多。白細(xì)胞介素-13 (IL-13)信號途徑與呼吸道重塑和分泌過多密切相關(guān)。 發(fā)現(xiàn)IL-13的誘斜受體(sIL-13Ra2-Fc )在小鼠中抑制變應(yīng)原誘導(dǎo)的杯形 細(xì)胞的形成(Wills-Karp等人，Science, 282:2258-2261 )。已表明IL-13直 接驅(qū)動(dòng)呼吸道上皮細(xì)胞中黏蛋白基因的表達(dá)，該呼吸道上皮細(xì)胞在生理?xiàng)l 件并在體內(nèi)培養(yǎng)(Laoukili等人，J. Clin. Invest, 108:1817-1824， 2001 ; Kondo等人，Am. J. Respir. Cell Mol. Biol" 27:536-541 ， 2002 )。也已經(jīng)報(bào) 道IL-13刺激TGFa從人類呼吸上皮細(xì)胞膜上釋放，該TGFa結(jié)合到EGFR 上并激活EGFR (Booth等人，Am. J. Respir. Cell Mol. Biol" 25: 739-743， 2001 ) 。 IL-13向大鼠肺的氣管內(nèi)滴注通過復(fù)雜的機(jī)制引起杯形細(xì)胞的組 織轉(zhuǎn)化并增加l^蛋白產(chǎn)生，IL-13通過所述機(jī)制誘導(dǎo)產(chǎn)生IL-8，導(dǎo)致嗜中 性粒細(xì)胞募集(Shim等人，Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol.， 280: L134-L140, 2001)。發(fā)明概述本發(fā)明的多個(gè)方面提供用于呼吸道分泌過多的改進(jìn)治療。呼吸道分泌 過多的發(fā)病原理涉及EFGR和IL-13信號途徑，兩者都在杯形細(xì)胞形成中 起作用。因此，通過抑制EFGR和IL-13信號途徑，所述呼吸道上皮可更 接近它最初的結(jié)構(gòu)。簡單而言，因此，本發(fā)明涉及治療個(gè)體呼吸道分泌過多的方法，所述方法包括施用EGFR信號途徑的抑制劑和IL-13信號途徑的抑制劑。本發(fā)明還涉及治療呼吸道分泌過多的組合物，該組合物包含EGFR信號途徑的抑制劑和IL-13信號途徑的抑制劑和藥學(xué)上可接受的載體。 其他目的和特征將在下文中部分地明確并部分地指出。附圖簡述


圖1A、 1B、 1C、 1D、 1E和1F為C57BL/6J小鼠呼吸道切片的代表 性顯微照片，其中用SeV或等量UV滅活的SeV (SeV-UV)接種后21天 獲得所述C57BL/6J小鼠切片，然后進(jìn)行EGFR和磷酸-EGFR ( p-EGFR) 免疫染色并用50倍抗原過剩竟?fàn)?。?biāo)尺-20jim。在實(shí)施例1中進(jìn)一步描 述方法學(xué)。圖2A、 2B、 2C、 2D、 2E、 2F、 2G、 2H和21為小鼠呼吸道切片的代 表性顯微照片，該切片在用SeV接種后21天獲得，然后進(jìn)行EGFR、卩 微管蛋白、CCSP和MUC5AC單獨(dú)和組合的免疫熒光染色。用抗CY3的 抗體(紅色熒光)檢測主要的抗EGFR抗體結(jié)合，用抗FITC的抗體(綠 色熒光)檢測其他。標(biāo)尺-20jim。在實(shí)施例1中進(jìn)一步描述方法學(xué)。圖3A、 3B、 3C和3D為呼吸道切片的代表性顯微照片，該呼吸道切 片在用SeV或SeV-UV接種后21天并然后用蘇木精/曙紅染色，進(jìn)行卩微 管蛋白IV(綠色熒光)和CCSP(紅色熒光)免疫熒光染色，和進(jìn)行MUC5AC 免疫染色后獲得。用非免疫IgG進(jìn)行免疫染色在背景上不產(chǎn)生信號(數(shù)據(jù) 未顯示)。標(biāo)尺-20pm。在實(shí)施例2中進(jìn)一步描述方法學(xué)。圖4A和4B為條形圖，顯示的是圖3的條件下及SeV接種后第12天 不加處理和SeV接種后在第12天用EKB-569處理10-21天下對應(yīng)的定量 數(shù)據(jù)。數(shù)值代表均值士SEM,并用(*)標(biāo)明與SeV-UV對照的顯著差異。在 實(shí)施例2中進(jìn)一步描述方法學(xué)。圖5A、 5B和5C為C57BL/6J和Balb/cJ小鼠中獲得的呼吸道切片的 代表性顯微照片，該小鼠在用SeV接種后指定天內(nèi)獲得，并然后進(jìn)行BrdU (圖5A)、磷酸EGFR (圖5B)和MUC5AC (圖5C )免疫染色。標(biāo)尺= 20jim。在實(shí)施例2和3中進(jìn)一步描述方法學(xué)。圖6為條形圖，顯示的是在圖5A的條件下對應(yīng)的定量數(shù)據(jù)。數(shù)值代 表均值士SEM，并用(*)標(biāo)明與O天的顯著差異。在實(shí)施例2和3中進(jìn)一步 描述方法學(xué)。圖7為條形圖，顯示的是對從Balb/cJ小鼠中獲得的呼吸道切片的對應(yīng)的定量形態(tài)計(jì)量，用SeV或SeV-UV接種該小鼠后21天，然后進(jìn)行p 微管蛋白、CCSP和MUC5AC免疫染色。數(shù)值代表均值士SEM，并用(*) 標(biāo)明與SeV-UV對照的顯著差異。在實(shí)施例2和3中進(jìn)一步描述方法學(xué)。圖8A、 8B和8C為呼吸道上皮細(xì)胞(mTEC )培養(yǎng)物的代表性顯微照 片，該培養(yǎng)物置于氣液界面條件下IO天，接著進(jìn)行EGFR(上)免疫染色 或雙免疫熒光，接著對卩微管蛋白和EGFR或者p-EGFR的共焦顯微術(shù)。 在實(shí)施例2中進(jìn)一步描述方法學(xué)。圖9是mTEC培養(yǎng)物的蛋白質(zhì)印跡分析圖像，該培養(yǎng)物置于基礎(chǔ)培養(yǎng) 基中1天并然后在有或無伴隨抑制劑下用EGF (1或10 ng/ml)處理10 分鐘。在向兩個(gè)室中加入EGF前，將每種抑制劑以最高有效濃度加入到下 層室中6小時(shí)并在上層室中持續(xù)2.5小時(shí)。對于每一種情況，細(xì)胞裂解物 具有抗EGFR、 p- EGFR、磷酸Akt ( p-Akt)或磷酸—ERK1/2 ( p-ERK1/2 ) 抗體并通過增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光來檢測。在實(shí)施例2中進(jìn)一步描述方法學(xué)。圖IOA、 IOB、 10C和10D為mTEC培養(yǎng)物的代表性顯微照片，用載 體或PD153035 (0.3 fiM)在37°C下處理該培養(yǎng)物7天，并然后進(jìn)行p微 管蛋白和Hoechst 33432免疫熒光染色。標(biāo)尺=20^111。在實(shí)施例2中進(jìn)一 步描述方法學(xué)。圖ll為一系列條形圖，顯示的是用指示劑量的PD153035、 LY294002 和PD98059處理和不用其處理7天，p孩i管蛋白染色的細(xì)胞(以總Hoechst 染色細(xì)胞的a。/。表示)的定量分析。用(*)標(biāo)明顯著差異。在實(shí)施例2中進(jìn) 一步描述方法學(xué)。
圖12A、 12B、 12C、 12D、 12E、 12F、 12G和12H為mTEC培養(yǎng)物 的代表性顯樣吏照片，用載體、PD153035 (0.3 jiM) 、 LY294002 (50 jiM) 和PD98059 ( 50 jiM )在37°C下處理該mTEC培養(yǎng)物3天并然后進(jìn)行活 性胱天蛋白酶3 (Act-C-3)剪切片段的免疫熒光染色或TUNEL反應(yīng)。標(biāo) 尺-20nm。在實(shí)施例3中進(jìn)一步描述方法學(xué)。
圖13A和13B為條形圖，顯示的是使用
圖12的處理?xiàng)l件及PD15305 力口zVAD-fmk (lOOfiM)對
圖12中活性胱天蛋白酶3染色的細(xì)胞的定量8分析(以總Hoechst染色細(xì)胞的a。/o表示)。數(shù)值代表均值士 SEM，并用 (*)標(biāo)明與僅僅載體的顯著差異。在實(shí)施例3中進(jìn)一步描述方法學(xué)。
圖14為使用
圖12的處理?xiàng)l件對來自mTEC培養(yǎng)物的細(xì)胞裂解物中活 性胱天蛋白酶3 (Act-C-3)和胱天蛋白酶9 (Act-C-9)的免疫印跡分析圖 像?？闺滋斓鞍酌?的抗體識別前體(C-9 )和活性胱天蛋白酶9 (Act-C-9 ) 的剪切片段。在實(shí)施例3中進(jìn)一步描述方法學(xué)。
圖15為條形圖，顯示的是使用
圖12的處理?xiàng)l件對mTEC培養(yǎng)物的 JC-1染色的流式細(xì)胞術(shù)分析。數(shù)值代表線粒體膜電位(AYm)降低的細(xì)胞 的百分比，該線粒體膜電位的降低通過從FL2向FL1的偏移來檢測。數(shù) 值代表均值士SEM，并用(*)標(biāo)明與僅僅載體的顯著差異。在實(shí)施例3中進(jìn) 一步描述方法學(xué)。
圖16為mTEC培養(yǎng)物的代表性顯微照片，該mTEC培養(yǎng)物在有或無 IL-13 (100ng/ml, 5天)并隨后在有或無PD153035 (0.3 jiM, 3天)下 進(jìn)行處理并進(jìn)行MUC5AC (紅色)和活性胱天蛋白酶3 (綠色)免疫熒光 染色，并用Hoechst染料復(fù)染(藍(lán)色)。在實(shí)施例4中進(jìn)一步描述方法學(xué)。
圖17A和17B為條形圖，顯示的是
圖16的對應(yīng)定量數(shù)據(jù)。數(shù)值代表 活性胱天蛋白酶3陽性杯形細(xì)胞百分比(MUC5AC+活性胱天蛋白酶 3+/MUC5AC+細(xì)胞)和非杯形陽性細(xì)胞百分比(總TUNEL染色細(xì)胞/總 Hoechst染色細(xì)胞)的均值士SEM。用(*)標(biāo)明與載體對照的顯著差異。在 實(shí)施例4中進(jìn)一步描述方法學(xué)。
圖18A、 18B、 18C和18D為培養(yǎng)的mTECs在處理前(
圖18A)和用 IL-13 (100 ng/ml，在37。C下2天)處理后(
圖18B-18D )的代表性透射 電鏡顯微照片。用在細(xì)胞表面可見的纖毛鑒定早期纖毛-杯形細(xì)胞(也含有 少量粘液顆粒)(
圖18B);晚期纖毛-杯形細(xì)胞在細(xì)胞質(zhì)中呈現(xiàn)更多數(shù)目 的粘液顆粒(
圖18C);并且成熟的杯形細(xì)胞含有特征性的粘液顆粒并且 沒有纖毛(
圖18D)。在實(shí)施例4中進(jìn)一步描述方法學(xué)。
圖19A、19B和19C是從小鼠中獲得的呼吸道切片的代表性顯微照片， 該切片在用SeV接種后第21天時(shí)獲得并進(jìn)行p微管蛋白(綠色)和免疫熒光顯微術(shù)。箭頭指示的是P微管蛋白染色的 纖毛細(xì)胞(c) 、 MUC5AC染色的杯形細(xì)胞(g)及p微管蛋白和MUC5AC 均染色的細(xì)胞(cg)。在實(shí)施例4中進(jìn)一步描述方法學(xué)。圖20A、 20B和20C為
圖19中獲得呼吸道切片的代表性顯微照片， 但是將p-EGFR (紅色)和MUC5AC (綠色)免疫染色。箭頭指示的是 p-EGFR染色的阡毛細(xì)胞(c) 、 MUC5AC染色的杯形細(xì)胞(g)及p-EGFR 和MUC5AC均染色的細(xì)胞(cg)。在實(shí)施例4中進(jìn)一步描述方法學(xué)。圖21 A、 21 B和21 C為
圖19中獲得呼吸道切片的代表性顯^:照片， 但是將CCSP (綠色)和MUC5AC (紅色)免疫染色。箭頭指示的是CCSP 染色的(cc)或CCSP和MUC5AC均染色的細(xì)胞(ccg)。在實(shí)施例4中 進(jìn)一步描述方法學(xué)。圖22為條形圖，顯示的是對表達(dá)MUC5AC的細(xì)胞(其CCSP或卩微 管蛋白也4皮免疫染色)的定量分析。數(shù)值代表均值士SEM，并用(*)標(biāo)明與 相應(yīng)的SeV-UV對照的顯著差異。在實(shí)施例4中進(jìn)一步描述方法學(xué)。圖23 A、23 B和23 C為條形圖，顯示的是肺IL-13(圖23A )、mCLCA3 (圖23B )和MUC5AC (圖23C) mRNA水平(在用SeV接種后指定時(shí) 間由GAPDH對照水平校正)的實(shí)時(shí)PCR結(jié)果。數(shù)值代表均值士 SEM， 并用(*)標(biāo)明與相應(yīng)的SeV-UV對照的顯著差異。在實(shí)施例4中進(jìn)一步描述 方法學(xué)。圖24為條形圖，顯示的是在接種后第12、 14、 17和20天受SeV感 染并用sIL-13受體拮抗劑(sIL-13Ra2-Fc)或?qū)φ誌gG處理的小鼠呼吸道 中p微管蛋白(纖毛細(xì)胞)、CCSP (克拉拉細(xì)胞)和MUC5AC (杯形細(xì) 胞)免疫染色的定量分析。標(biāo)尺-20nm。用(*)標(biāo)明與相應(yīng)的IgG處理的顯 著差異。在實(shí)施例4中進(jìn)一步描述方法學(xué)。圖25A、 25 B和25 C為肺切片的代表性顯微照片，該肺切片從COPD 患者中獲得并進(jìn)行p微管蛋白、MUC5AC或CCSP免疫染色并用免疫熒 光觀察(圖25A )，或者進(jìn)行p微管蛋白和MUC5AC或CCSP和MUC5AC 免疫染色并用激光共聚焦掃描顯樣i鏡觀察(分別為圖25B和圖25C)。箭頭和輪廓線指示的是表達(dá)MUC5AC的杯形細(xì)胞(g)、表達(dá)CCSP的克拉 拉細(xì)胞(cc)、共表達(dá)卩微管蛋白和MUC5AC的纖毛杯形細(xì)胞(cig)或 共表達(dá)CCSP的杯形細(xì)胞(ccg)。圖26 A、 26 B和26 C為人大呼吸道上皮細(xì)胞(hLAECs)的代表性顯 微照片，該人大呼吸道上皮細(xì)胞(hLAECs )從COPD患者中培養(yǎng)獲得， 用IL-13(100ng/ml)溫育5天，然后進(jìn)行y微管蛋白(紅色)(圖26A )、 MUC5AC (綠色)(圖26B)及y微管蛋白和MUC5AC (圖26C )免疫 染色。箭頭指示的是y微管蛋白和MUC5AC免疫染色的細(xì)胞。圖27A、 27B、 27C和27D為hLAECs的代表性顯微照片，該hLAECs 從對照(非COPD )受試者中培養(yǎng)獲得，用IL-13溫育1天，如圖26中進(jìn) 行免疫染色，然后用激光共聚焦掃描顯微鏡在x-y軸(圖27A)和z軸視 圖上(圖27B-27D)進(jìn)行觀察。箭頭指示的是y微管蛋白和MUC5AC均 免疫染色的細(xì)胞。圖28表示的是病毒誘導(dǎo)的依賴EGFR和IL-13的途徑的圖解，所述 途徑控制上皮宿主反應(yīng)和重塑。圖29A、 29B、 29C和29D為從健康對照和哮喘受試者中獲得的支氣 管內(nèi)活組織檢查切片的代表性顯微照片。用
圖1和圖2中相同的方法對切 片進(jìn)行EGFR和磷酸化EGFR免疫染色。標(biāo)尺-20jim。在實(shí)施例2中進(jìn)一 步描述方法學(xué)。圖30A和30B為蛋白質(zhì)印跡分析圖像，顯示的是在體外(圖30A)和 在體內(nèi)(圖30B) EKB-569處理的影響。圖30A為人氣管支氣管上皮細(xì)胞 (hTECs)細(xì)胞裂解物的蛋白質(zhì)印跡圖像，在氣液界面條件下培養(yǎng)該 hTECs并在存在或不存在EKB-569 (1 jiM， 37°C下10分鐘)時(shí)，有或無 EGF (100ng/ml)或者有或無IL-13 (lOOng/ml)下溫育并用指定抗體進(jìn) 行印跡。圖30B為肺裂解物的蛋白質(zhì)印跡圖像，從C57BL/6J小鼠中獲得 該肺裂解物，其中C57BL/6J小鼠用SeV或SeV-UV接種并在接種后第 10-21天用或不用EKB-569處理。用指定抗體進(jìn)行印跡。在實(shí)施例1和2 中進(jìn)一步描述方法學(xué)。發(fā)明詳述如果未加檢查，免疫信號可導(dǎo)致慢性呼吸道疾病特有的上皮表型。尤 其是，導(dǎo)致慢性哞喘/支氣管炎疾病表型的持續(xù)的杯形細(xì)胞組織轉(zhuǎn)化依賴于纖毛上皮細(xì)胞依賴EGFR的存活和纖毛細(xì)胞依賴1L-13的轉(zhuǎn)分化為杯形細(xì) 胞(見例如實(shí)施例1和2 )。可通過定向抑制EGFR和IL-13信號途徑中 的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)步驟來校正這種異常。用EGFR抑制劑處理允許所述纖毛細(xì)胞 向程序性細(xì)胞死亡前進(jìn)，而IL-13阻斷阻止纖毛細(xì)胞向杯形細(xì)胞轉(zhuǎn)化(見 例如實(shí)施例2和3)。因此，如此處描述，阻斷EGFR和IL-13信號途徑 可將所述呼吸道上皮恢復(fù)到其最初的結(jié)構(gòu)(見例如實(shí)施例4)。因此，本發(fā)明的一方面通過靶定所述EGFR和IL-13信號途徑來預(yù)防 性或治療性治療上皮增生和組織轉(zhuǎn)化。本發(fā)明的另一方面是靶定所述 EGFR和IL-13信號途徑的組合物，其可用于治療此處描述的上皮增生和 組織轉(zhuǎn)化。此類治療例如可用作預(yù)防性的治療來全部或部分保護(hù)免受慢性 哮喘和/或支氣管炎。所述組合物和治療也可用于例如治療性改善在哮喘、 支氣管炎、細(xì)支氣管炎、和/或相關(guān)炎癥和感染性疾病(其特征在于具有 EGFR激活、IL-13表達(dá)和杯形細(xì)胞組織轉(zhuǎn)化的相似模式)中改變的上皮 結(jié)構(gòu)。所述組合物和治療也可用來治療呼吸道疾病或特征為粘液分泌過多 的疾病。表明需要用EGFR和IL-13信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑治療的疾病狀態(tài)和易于用 EGFR和IL-13信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑治療的疾病狀態(tài)包括，例如慢性阻塞性肺 疾病、鼻分泌過多疾病(例如鼻變態(tài)反應(yīng))、炎性疾病(例如哞喘、支氣 管擴(kuò)張和肺纖維化)和慢性阻塞性肺部疾病(例如慢性支氣管炎)及遺傳 疾病，包括嚢性纖維化、呼吸道的家族性非嚢性纖維化粘液濃縮、卡塔格 內(nèi)綜合征、a-l抗胰蛋白酶缺乏和觸發(fā)或引起分泌過多疾病的上呼吸道或 下呼吸道感染(例如病毒性細(xì)支氣管炎或鼻炎)。需要治療的確定將通常通過如下評估病史和體檢(其同過量產(chǎn)生粘 液(例如產(chǎn)生粘液的咳嗽)相一致)、呼吸道的放射照相或其他成傳^f究 (其指出過量產(chǎn)生粘液的疾病或狀況)或者肺功能檢測(指出呼吸道阻塞和/或高反應(yīng)性證據(jù))。在本發(fā)明的一個(gè)方面，所述方法包含通過施用EGFR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑 和IL-13信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑降低上皮組織中EGFR和IL-13信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的水平。 施用的量至少足夠預(yù)防纖毛細(xì)胞增加并且也預(yù)防纖毛細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為杯形細(xì) 胞。在一項(xiàng)典型的研究中，在病毒感染后第12、 14、 17和20天用阻斷IL-13 的誘斜受體進(jìn)行處理可有效預(yù)防病毒誘導(dǎo)的杯形細(xì)胞組織轉(zhuǎn)化，而從感染 后10-20天，用EGFR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的選擇性抑制劑每天處理引起纖毛細(xì)胞不 成比例的劑量依賴性損失，導(dǎo)致總的上皮細(xì)胞減少(見例如實(shí)施例4)。 這些結(jié)果表明用EGFR和IL-13信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑進(jìn)行處理可校正特征在于 EGFR激活、IL-13表達(dá)和杯形細(xì)胞組織轉(zhuǎn)化的炎性疾病中的上皮結(jié)構(gòu)。信號抑制劑EGFR或IL-13信號途'徑的抑制劑可直接或間接靶定與生物級聯(lián)相關(guān) 的任何因子或組分，該生物級聯(lián)可分別引起促進(jìn)纖毛細(xì)胞的增加和杯形細(xì) 胞的組織轉(zhuǎn)化。EGFR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑包括靶定EGF、 EGFR、 EGFR配體(例如雙 調(diào)蛋白、HB-BGF和TGF-a) 、 EGFR表達(dá)的刺激物、EGFR的組分(例 如hev-l和hev-2 )和EGFR下游信號組分的抑制劑。例如，EGFR信號 轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑可靶定EGFR激活(例如受體二聚化或受體酪氨酸激酶磷酸化) 或可靶定激活觸發(fā)的一條或多條途徑(i) Ral募集，c-Src激活和隨后Statl 和Stat3激活；(ii)Shc/Grb2募集，Sos、 Ras和c-Raf激活和隨后ERK1/2 的MEK1/2激活；或(iii) Gabl募集，PI3K激活，隨后產(chǎn)生磷脂酰肌醇-3，4，5-磷酸(PI-3，4,5-P3 )、激活PDK1/2并然后激活A(yù)kt (其失活促凋亡因子) (見例如圖8、 9、 lO和ll)。作為另一實(shí)例，可使用TNFa (呼吸道上皮中EGFR表達(dá)的刺激物) 的抑制劑來抑制所述EGFR信號途徑。類似地，所述抑制劑可靶定TNFa 下游組分并實(shí)現(xiàn)抑制EGFR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。可通過依賴配體或不依賴配體的機(jī) 制激活EGFR，分別導(dǎo)致自磷酸化作用或轉(zhuǎn)磷酸作用。EGFR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的依賴配體的激活物包括氧化脅迫(見例如Takeyama等人，Am" J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol.， 280:L165-L172， 2001)、紫外線和滲透脅迫、內(nèi)皮 素l對G蛋白偶聯(lián)受體的刺激、溶血磷脂酸和凝血酶、ml毒萆堿乙酰膽 堿受體和人生長激素。IL-13信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的抑制劑包括，例如靶定IL-4Ra、 IL-13Ral、 IL-4Ra 配體、IL-13Ral配體和下游IL-13信號轉(zhuǎn)導(dǎo)組分的抑制劑(見例如圖4)。 例如，可通過靶定IL-4/IL-13受體來抑制IL-13信號轉(zhuǎn)導(dǎo)?；蛘撸碳に?述IL-4/IL-13受體表達(dá)的因子或途徑(例如IL-13 )是IL-13信號途徑抑制 劑的靭，標(biāo)。IL-13途徑的其他激活劑包括IL-4和IL-9。作為另外的實(shí)例， IL-13信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的抑制劑可靶定(i)IRSl/2募集，Grb2/Sos激活，Ras/c-Raf 激活和隨后ERK1/2和PI3K激活和/或(ii) Stat6激活，其中每一個(gè)Stat6 促進(jìn)基因(例如CLCA和MUC)上調(diào)，促進(jìn)纖毛轉(zhuǎn)分化為杯形細(xì)胞(見 例如圖4s)。 IL-13信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的抑制劑也可靼定IRSl/2募集，PI3K激活， 隨后磷脂酰肌醇-3，4，5-磷酸(PI-3,4，5-P3)的產(chǎn)生，PDK1/2的激活和然后 Akt的激活，其失活促凋亡因子(見例如圖8、 9、 lO和ll)。也可使用EGFR和IL-13激動(dòng)劑來抑制各信號途徑。EGFR和IL-13 的激動(dòng)劑是分別模擬與EGFR和IL-13信號途徑相關(guān)受體相互作用的分 子。此類激動(dòng)劑可以是信號分子類似物或片段、或針對受體上配體結(jié)合位 點(diǎn)表位的免疫肽、或針對特定免疫肽(其結(jié)合到與受體相互作用的部分) 的抗獨(dú)特型免疫肽。拮抗劑可以是蛋白質(zhì)或結(jié)合分子(例如免疫肽)的形 式，其中蛋白質(zhì)與受體結(jié)合竟?fàn)幍鄙偌せ钍荏w的能力?？笽L-13信號轉(zhuǎn) 導(dǎo)激動(dòng)劑的實(shí)例包括重組的可溶性IL-13受體cx2 Fc融合蛋白 sIL-13Ra2-Fc，其作為誘辨受體特異地阻斷IL-13的作用(見例如實(shí)施例 4)。EGFR和IL-13信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑通常包括免疫肽、作為竟?fàn)幮曰虿豢?逆的拮抗劑的小分子、反義寡核苷酸和小干擾RNAs。免疫肽抑制劑EGFR和IL-13信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的免疫肽抑制劑包括，例如多克隆抗體、單 克隆抗體和抗體片段?？赏ㄟ^本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何合適的方法來產(chǎn) 生此類抗體；也可使用商業(yè)生產(chǎn)的抗體。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可從溫血?jiǎng)游锶珩R、奶牛、多種家禽、兔、小鼠 或大鼠容易地產(chǎn)生多克隆抗體。簡單而言，利用抗原與佐劑如弗氏完全或 不完全佐劑，通過經(jīng)腹膜內(nèi)、肌內(nèi)、眼內(nèi)或皮下注射來免疫所述動(dòng)物。幾 次加強(qiáng)免疫后，收集血清樣品并檢測其對預(yù)期乾標(biāo)的反應(yīng)性。尤其優(yōu)選的 多克隆抗血清將在一項(xiàng)這些測定中給出高于背景至少3倍的信號。 一旦所 述動(dòng)物的效價(jià)在其反應(yīng)性方面已達(dá)平臺，更多數(shù)量的抗血清可容易地通過 每周取血或?qū)λ鰟?dòng)物放血來獲得?？墒褂脝慰寺】贵w(MAb )技術(shù)來獲得能夠干擾EGFR和/或IL-13 信號途徑的MAbs 。作為EGF拮抗劑起作用的抗體的實(shí)例包括所述中和 抗EGFR的單克隆抗體C225( Kawamoto等人(1983) Proc. Nat，l. Acad. Sci. (USA) 80:1337-1341 ; Petit等人(1997) J. Path. 151 :1523-153，由ImClone Systems New York, N.Y.生產(chǎn))和所述抗EGFR的單克隆抗體EMD55卯0(也被稱為Mab425) ( Merck， Darmstadt,德國)。簡單而言，使用來自 抗原免疫過的小鼠的脾細(xì)胞來產(chǎn)生雜交瘤。例如使用聚乙二醇融合方法(Galfre， G.和Milstein， C.， Methods Enzymol" 73:3-46 (1981))將每只,皮免 疫過的小鼠的脾細(xì)胞和小鼠骨髓瘤Sp2/0細(xì)胞融合。使用標(biāo)準(zhǔn)方法學(xué)(Galfre， G.和Milstein, C.， Methods Enzymol" 73:3-46 (1981))進(jìn)行雜交瘤 的生長、HAT培養(yǎng)基上的選擇、克隆和篩選抗抗原的克隆。將在HAT選 擇的克隆注射到小鼠中，在其腹水中產(chǎn)生大量的MAb,如Galfre，G.和 Milstein, C.在Methods Enzymol.， 73:3-46 (1981)中描述，該MAb可通過使 用蛋白A柱層析法(BioRad， Hercules, Calif.)來純化?；谒鼈兊?a)特 異性、(b)高結(jié)合親和力、(c)同種型和(d)穩(wěn)定性來選擇MAbs?？墒褂枚喾N 標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)中任何技術(shù)包括蛋白質(zhì)印跡(Koren，E.等人，Biochim. Biophys. Acta 876:91-100 (1986))和酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA) (Koren等人， Biochim. Biophys. Acta 876:91-100 (1986))來篩選MAbs或檢測其特異性。這些單克隆抗體通常將以至少約lmM,更通常至少約300 jiM，通常至少 約10 jiM，更通常至少約30 nM,優(yōu)選至少約10 jiM，并更優(yōu)選至少約3jiM 或更多的Kd結(jié)合。希望生產(chǎn)并使用功能性抗體片段，例如Fab、 F(ab')2、 Fc和單鏈Fv (scFv)片段。這些片段將通常包括含有作為互補(bǔ)性決定區(qū)的氨基^列 段的高變區(qū)，其負(fù)責(zé)所述抗體對抗原分子上一個(gè)特定位點(diǎn)的特異性。用木 瓜蛋白酶進(jìn)行的蛋白酶剪切產(chǎn)生兩個(gè)分開的抗原結(jié)合片段，稱為Fab片段， 其含有完整的輕鏈，該輕鏈通過二硫鍵連接鄰近重鏈的氨基末端部分。用 木瓜蛋白酶對典型的IgG分子進(jìn)行蛋白酶剪切產(chǎn)生F(ab')2片段(實(shí)驗(yàn)免疫 學(xué)手冊Vol 1 : Immunochemistry， Weir， D. M.,編者，Blackwell Scientific Publications, Oxford (1986))。同樣，重組DNA方法允許產(chǎn)生并選擇重組 免疫球蛋白肽，其為單鏈抗原結(jié)合多肽，稱作scFv抗體(Lowman等人(1991) Biochemistry, 30， 10832-10838; Clackson等人(1991) Nature 352， 624-628; 和Cwirla等人(19卯)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87， 6378-6382 )。免疫肽抑制劑可以以例如每次注射約0.05 mg至約2.5 mg的量施用。 作為另外的實(shí)例，免疫肽抑制劑可以以每次注射約0.1 mg至約1 mg的濃 度注射。優(yōu)選地，免疫肽抑制劑可以以每次注射約0.3mg至約0.5mg的濃 度注射。小分子抑制劑EGFR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的小分子抑制劑包括EGFR酪氨酸激酶抑制劑。許多 此類EGFR酪氨酸激酶抑制劑為本領(lǐng)域已知并包括PD153035、 EKB-569 和AG1478 (4-(3-氯代苯胺基)-6，7-二甲氧基喹唑啉)；非酚酪氨酸磷酸化 抑制劑類似物EGFR抑制劑RG-14620; EGFR受體激酶抑制劑酪氨酸磷 酸化抑制劑23 (RG-50810)、酪氨酸磷酸化抑制劑25 (RG-50875)、酪 氨酸磷酸化抑制劑46、酪氨酸砩酸化抑制劑47 (RG-50864; AG-213 )、 酪氨酸磷酸化抑制劑51 ( BIOMOL Research Laboratories, Plymoth Meeting, PA; BioSource International, Camarillo CA ) ; BIBX1522(Boehringer Ingelheim， Inc., Ingelhdm,德國)；CGP59326B (Novartis Corporation, Basel,瑞士 ) ； 4-氨基喹唑啉EGFR抑制劑(在美國專利號 5,760,041中描述)；取代的苯乙烯化合物，其也可以為萘、1，2-二氫化茚 或苯并嗜、溱，包括腈和molononitrile化合物(在美國專利號5,217,999有 描述)；在美國專利號5，773，476中公開的抑制劑；馬鈴薯羧肽酶抑制劑(PCI)、具有三個(gè)二硫鍵的39氨基酸蛋白酶抑制劑(Blanco-Aparicio等 人(1998) J Biol Chem 273(20): 12370-12377);鈴蟾肽拮抗劑RC-3095(Szepeshazi等人(1997)ProcNatlAcadSci USA 94:10913-10918);吡啶 并嗜咬、嘧，定并嘧咬、吡咯并嘧咬，如CGP 59326、 CGP 60261和CGP 62706及吡唑并嘧咬(Strawn和Shawver (1998) Exp.畫Opin. Invest. Drugs 7(4)， 553-573 ) ; 4-(苯氨基)-7H-吡咯并[2，3-d嗜啶(Traxier等人(1996) J. Med. Chem 39:2285-2292);姜黃色素(Korutla等人(1994) Biochim Biophys Acta 1224:597-600 ); (Laxmin arayana (1995)， Carcinogen 16:1741-1745); 等等。EGFR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的小分子抑制劑也包括G蛋白解偶聯(lián)劑蘇拉明鈉 (BIOMOL Research Laboratories, Plymoth Meeting, PA; BioSource International, Camarillo )。IL-13信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的小分子抑制劑包括那些靶定下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑如 PD98059 (靼定MEK 1/2 — ERK 1/2 )和LY294002 (靼定P13K—AKT )。小分子抑制劑可以以每次給藥每kg受試者體重約0.1 fig至約100 mg 的量施用。沖支術(shù)人員將容易地理解劑量水平作為特定化合物、癥狀的嚴(yán)重 程度和所迷受試者對副作用的敏感程度的函數(shù)而變化，如下文更全面的討 論。反義抑制劑反義寡脫氧核苷酸通過與互補(bǔ)的mRNA雜交并降低蛋白質(zhì)表達(dá)以高 選擇性和特異的方式來抑制基因表達(dá)。反義寡核苷酸EGFR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑和它們的生產(chǎn)方法包括，例如那些在Kronmiller等人(1991) Dev Biol. 147(2)， 485-8; Hu等人(1992) lnt J Dev Biol. 36(4)， 505-16; Roy和Harris (1994) Molecular Endocrinology 8， 1175-1181; Casamassimi等人(2000)Ann畫Onco111(3)， 319-325; Normanno 等人(1996) Cancer Detection and Prevention 20(5); He等人(2000) World J Gastroentero 6(5)， 747-749; Riedel等人，Int J Oncol (2002) 21 ， 11-16; Zeng 等人(2002) J Exp Ther Oncol 2(3)， 174-186; Deng等人(2003) Di Yi Jim Yi Da Xue Xue Bao 23(9)， 877-81; Li等人(2002) Clin Cancer Res 8， 3570-3578 中描述的。反義寡核苷酸EbFR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑也包括那些通過與上面那 些方法相似的方法生產(chǎn)的抑制劑。在Zeng等人(2002) J Exp Ther Oncol 2(3)， 174-186中討論了 EGFR反義基因療法的安全與功效。反義寡核苷酸IL-13信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑和它們的生產(chǎn)方法包括，例如那 些在Mousavi等人(2004) Iran. Biomed. J. 8(4)， 185-191中描述的。反義寡核苷酸可以以每天約10 jig至每天約3 mg的濃度通過玻璃體內(nèi) 注射施用。例如，給藥劑量可為每天約30jtg至每天約300 ng。作為另外 的實(shí)例，反義寡核苷酸可以以每天約100jig施用。反義寡核苷酸的給藥可 作為單次事件或在治療時(shí)間過程內(nèi)發(fā)生。例如，可以每日一次、每周一次、 兩周一次或每月 一次注射反義寡核苷酸。治療時(shí)間過程可以從約一周到約 一年或更多。在一個(gè)實(shí)例中，每天注射反義寡核苷酸，持續(xù)一年。在另外 的實(shí)例中，每6周注射反義寡核苷酸，持續(xù)48周。RNA干擾可通過對患者施用治療有效量的小干擾RNAs (siRNA)通過RNA干 擾下調(diào)EGFR和IL-13信號途徑，該小干擾RNA對這些途徑的組分如 EGF、EGFR、IL-13、IL-4Ra或L-13Ral是特異的?？蓮娜鏏mbion( Austin, TX)的來源通過商業(yè)途徑獲得siRNA。所述siRNA可以通過適合于將織轉(zhuǎn)化和/或分泌過多區(qū)域處或其附近。例如，所述siRNA可通過基因槍、 電穿孔或通過其他合適的腸胃外或經(jīng)腸給藥途徑如玻璃體內(nèi)注射施用。RNA干擾為通過雙鏈RNA ( dsRNA)特異地抑制帶有其互補(bǔ)序列的 基因表達(dá)的方法。所述基因的抑制抑制了對應(yīng)蛋白質(zhì)的產(chǎn)生。引入時(shí)，所 述長dsRNAs進(jìn)入細(xì)胞途徑，該途徑通常被稱作RNA干擾(RNAi)途徑。 首先，所述dsRNAs通過稱為切丁酶的RNA酶III樣酶加工為20-25個(gè)核 苷酸(nt)的小干擾RNAs (siRNAs)(起始步驟)。然后，所述siRNAs 裝配到含有內(nèi)切核糖核酸酶的復(fù)合體(稱為RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體 (RISCs))中，在該過程中進(jìn)行解鏈。所述siRNA鏈隨后將該RISCs引 導(dǎo)至互補(bǔ)的RNA分子，在那里它們剪切并破壞同源RNA (效應(yīng)步驟)。 同源RNA的剪切發(fā)生在siRNA鏈結(jié)合的區(qū)域中間附近。優(yōu)選地，所述 siRNA包含長度約17個(gè)核苷酸到約29個(gè)核苷酸、優(yōu)選長度為約19到約 25個(gè)核苷酸的短雙鏈RNA，該siRNA可耙定到目的mRNA上。例如，所述siRNA的有效量為足夠引起目的mRNA的RNAi介導(dǎo)的 降解的量，或足夠抑制受試者中所述EGFR或IL-13信號途徑的量。通過 考慮因素如受試者的大小和體重；新血管形成或疾病侵入的程度；受試者 的年齡、健康和性別；給藥途徑；和所述給藥是局部的還是全身的，本領(lǐng) 域技術(shù)人員可容易地確定對指定受試者施用的本發(fā)明siRNA的有效量。通 常，siRNA的有效量包含在上皮細(xì)胞增生和組織轉(zhuǎn)化位點(diǎn)或其附近的細(xì)胞 間濃度為約1納摩爾(nM)至約100 nM，優(yōu)選從約2 nM至約50 nM， 更優(yōu)選從約2.5 nM至約10 nM。可考慮施用更多量或更少量的siRNA。所述siRNA可把定到任何mRNA目的序列中的任何一段大約19-25 個(gè)連續(xù)的核苷酸上?？蛇M(jìn)行人類基因組數(shù)據(jù)庫搜索(BLAST)來保證選擇 的siRNA序列不靶定其他基因轉(zhuǎn)錄物。例如在Elbashir等人((2001 ) Nature 411 ，494-498)中給出了選擇siRNA的目的序列的技術(shù)。因此，本siRNA的 有義鏈含有與EGF、 EGFR、 IL-13、 IL-4Ra或IL-13Ral的目標(biāo)mRNA 中任何一段約19至約25個(gè)核苷酸連續(xù)序列同一的核苷酸序列。通常，目 標(biāo)mRNA上的目的序列可選自對應(yīng)于所述目標(biāo)mRNA的給定的cDNA序 列，優(yōu)選從起始密碼子下游(即3'方向)50至100nt開始。然而所述目的 序列可定位在5'或3'非翻譯區(qū)，或定位在起始密碼子附近區(qū)域。治 療劑量和時(shí)間過程當(dāng)用于此處描述的治療時(shí)，治療有效量的本發(fā)明化合物可以以純的形 式使用或此形式存在時(shí)，以藥學(xué)上可接受的鹽形式使用，有或無藥學(xué)上可接受的賦形劑。例如，本發(fā)明的組合物可以以足夠抑制EGFR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和 IL-13信號轉(zhuǎn)導(dǎo)或以減少EGFR和IL-13信號級聯(lián)引起的產(chǎn)物形成的量以 適用于任何醫(yī)學(xué)治療的合理的益處/風(fēng)險(xiǎn)比例施用。每種類型抑制劑的特定 劑量在上面有更全面的討論。然而，應(yīng)了解本發(fā)明化合物和組合物的總的 每日使用將由主治醫(yī)師在合理醫(yī)學(xué)判斷范圍內(nèi)決定。任何特定患者的特定治療有效劑量水平將依賴于多種因素，包括治療 的疾病和所述疾病的嚴(yán)重性；使用的特定化合物的活性；使用的特定組合 物；所述患者的年齡、體重、 一般健康、性別和飲食；給藥時(shí)間；給藥途 徑；使用的特定化合物的排泄速率；治療持續(xù)時(shí)間；組合使用或與使用的 特定化合物同時(shí)使用的藥物及其他醫(yī)學(xué)領(lǐng)域熟知的因素。例如，本領(lǐng)域技 術(shù)人員熟知的是化合物的開始劑量低于實(shí)現(xiàn)渴望的治療效果所需的水平并 逐漸增加所述劑量直至達(dá)到渴望的效果。如果需要的話，為給藥目的，可 將所述有效日劑量分成多次劑量。結(jié)果， 一次劑量組合物可含有此量或其 因數(shù)來組成日劑量。施用EGFR和IL-13信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑可作為單個(gè)事件或在治療時(shí)間過 程內(nèi)發(fā)生。例如，可每日一次、每周一次、每兩周一次或每月一次施用抑 制劑。對于治療急性疾病，所述治療時(shí)間過程將通常為至少幾天。某些疾 病的治療可延長幾天到幾周。例如，治療可延長超過一周、兩周或三周。 對于更多的慢性疾病，治療可延長幾周至幾個(gè)月或甚至一年或更長。根據(jù)此處給出的方法，通過施用EGFR和IL-13信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的抑制 劑阻斷、減少或下調(diào)EGFR和IL-13信號轉(zhuǎn)導(dǎo)來實(shí)現(xiàn)炎性疾病的預(yù)防性和 治療性治療，所述炎性疾病的特征在于EGFR激活、IL-13表達(dá)和杯形細(xì) 胞組織轉(zhuǎn)化。治療給藥所述EGFR和IL-13信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑可治療性作為外源性物質(zhì)或內(nèi)源 性物質(zhì)使用。外源性物質(zhì)是在體外產(chǎn)生或生產(chǎn)并施用于身體的那些。內(nèi)源 性物質(zhì)是通過某種類型的裝置(生物學(xué)的或其他)在體內(nèi)生產(chǎn)或制備以向 體內(nèi)或體內(nèi)其他器官遞送的那些。外源治療EGFR和IL-13信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑的安全并有效量是例如可在患者中導(dǎo) 致所希望的治療效果同時(shí)將不想要的副作用降到最少的量。所述劑量方案 將由熟練的臨床醫(yī)師基于如治療疾病的準(zhǔn)確性質(zhì)、所述疾病的嚴(yán)重程度、 所述患者的年齡和一般健康情況等等因素來確定。本發(fā)明組合物將包括一種或更多的EGFR和IL-13信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑和 所述化合物的藥學(xué)上可接受的載體。可使用多種類型的載體。所述載體性 質(zhì)可為含水的。所述化合物也可容易地?fù)竭M(jìn)其他類型的組合物中，如懸浮 液、粘性或半粘性的凝膠或其他類型的固體或半固體組合物。懸浮液優(yōu)選 為相對不溶于水的物質(zhì)。本發(fā)明組合物也可包括多種其他成分，如緩沖劑、 防腐劑、共溶劑和粘性建立劑(viscosity building agent)。根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的配制技術(shù)，在多種類型的藥物組合物中可 包含所述EGFR和IL-13信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑。所選制劑的特定類型將依賴于 多種因素，如使用的EGFR和IL-13信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑、劑量頻率和治療的 部位。例如，在溶液劑、混懸劑和其他適合局部應(yīng)用于相關(guān)組織的劑型， 如組織灌洗液或?qū)ο嚓P(guān)組織的注射劑中包含所述物質(zhì)?？杉尤牒线m的緩沖 體系(例如磷酸鈉、乙酸鈉或硼酸鈉)來預(yù)防在l&存條件下的pH變動(dòng)。因此通常需要防腐劑來預(yù)防在使用過程中微生物污染。合適的防腐劑 的實(shí)例包括苯扎氯銨、硫柳汞、氯代丁醇、對羥基苯甲酸曱酯、對羥基 苯甲酸丙酯、苯乙醇、乙二胺四乙酸二鈉、山梨酸、polyquaternium-1或 其他本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的試劑。此類防腐劑通常以基于所述組合物總重 量按重量計(jì)約百分之0.001至約1.0的水平使用。一些EGFR和IL-13信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑可能在水中的溶解度有限并因此在所述組合物中需要表面活性劑或其他合適的共溶劑。此類共溶劑包括 聚乙氧基化蓖麻油、聚山梨醇酯20、 60和80; Pluronic注冊的TM F48、 F畫84和P-103 (BASF Corp.， Parsippany NJ.，美國)；環(huán)糊精；或本領(lǐng)域 技術(shù)人員已知的其他共溶劑。此類共溶劑通常以從約0.01至約2 wt. %的 水平使用。生理學(xué)上平衡的灌洗液可用作EGFR和IL-13信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑的藥物 載體。如此處所用，術(shù)語"生理學(xué)上平衡的灌洗液"指適于在侵入的或非侵 入的醫(yī)學(xué)操作中保持組織的生理結(jié)構(gòu)和功能的溶液。該類型的溶液將通常 含有電解質(zhì)，如鈉、鉀、鈣、鎂和/或氯化物；能源，如葡萄糖；和維持所 述溶液的pH在生理水平或其附近的緩沖劑。多種該類型溶液為已知的(例 如乳酸鹽林格溶液)。BSS注冊的TM無菌灌洗液和BSS+注冊的TM無 菌眼內(nèi)灌洗液(Alcon Laboratories, Inc., Fort Worth, Tex.，美國)為生理 學(xué)上平衡的眼內(nèi)灌洗液的實(shí)例。期望用高于簡單的水溶液粘度的粘度增加所述活性化合物的組織吸 收，降低在配制制劑中的可變性，減少制劑懸浮液或乳液成分的物理分離 和/或另外改善眼科制劑。此類粘性建立劑包括，例如，聚乙烯醇、聚乙烯 吡咯烷酮、甲基纖維素、羥丙基曱基纖維素、羥乙基纖維素、羧曱基纖維 素、羥丙基纖維素或本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其他試劑。此類試劑通常以從 約0.01至約2 wt. %的水平^[吏用。本發(fā)明組合物可以包裝成多劑量形式。內(nèi)源療法用于生產(chǎn)治療產(chǎn)物的基因治療的原理可用于遞送EGFR和IL-13信號 轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑。在臨床環(huán)境中，可通過許多方法中任何一種方法(每種方法 為本領(lǐng)域已知)將治療性EGFR和IL-13信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑的基因送遞系統(tǒng) 引入患者(或非人動(dòng)物)。例如可通過遞送運(yùn)載工具(稱為載體)引入EGFR 和IL-13反義核酸信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑，其中所述載體可以為非病原病毒變種 (例如復(fù)制缺陷型鼠的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體和腺伴隨病毒載體)、脂嚢泡(例22如脂質(zhì)體、脂轉(zhuǎn)染和細(xì)胞轉(zhuǎn)染劑)、碳7jC化合物和/或編碼治療蛋白質(zhì)或物 質(zhì)的核苷酸序列的其他化學(xué)綴合物。作為另外的實(shí)例，可通過物理(例如 顯微注射、電穿孔和氣動(dòng)"基因槍，，)、化學(xué)或細(xì)胞受體(例如基于受體的 內(nèi)吞作用)介導(dǎo)的攝入將載體引入身體的細(xì)胞中。 一旦進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，所述 核苷酸序列在細(xì)胞(游離型)或核(細(xì)胞核)環(huán)境中可產(chǎn)生治療性物質(zhì)。 游離基因通常在有限的時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生預(yù)期產(chǎn)物，然而核摻入的核苷*列可 長期，包括永久產(chǎn)生治療性產(chǎn)物?；蛑委煒?gòu)建體的藥物制劑可基本上由在可接受的稀釋劑中的基因遞 送系統(tǒng)組成，或可包含緩釋基質(zhì)，其中包埋所述基因送遞載體?；蛘?，當(dāng) 從重組細(xì)胞完整產(chǎn)生完整的基因送遞系統(tǒng)，例如逆轉(zhuǎn)錄病毒載體時(shí)，所述 藥物制劑可包含一種或更多產(chǎn)生基因送遞系統(tǒng)的細(xì)胞。也可通過遞送位點(diǎn)描述基因治療方法學(xué)。遞送基因的基本方法包括先 體外后體內(nèi)基因轉(zhuǎn)移、體內(nèi)基因轉(zhuǎn)移和體外基因轉(zhuǎn)移。在先體外后體內(nèi)基因轉(zhuǎn)移中，從所述患者中取得細(xì)胞并在細(xì)胞培養(yǎng)基中生長。將所述DNA 轉(zhuǎn)染進(jìn)入細(xì)胞中，并且使所述轉(zhuǎn)染細(xì)胞在數(shù)目上增多并然后再植入患者內(nèi)。 在體外基因轉(zhuǎn)移中，所述轉(zhuǎn)化細(xì)胞為培養(yǎng)生長的細(xì)胞，如組織培養(yǎng)細(xì)胞， 并且不是來自特定患者的特定細(xì)胞。這些"實(shí)驗(yàn)室細(xì)胞"經(jīng)過轉(zhuǎn)染，并且選 擇所述轉(zhuǎn)染細(xì)胞并將其擴(kuò)大用于植入患者或用于其他用途。體內(nèi)基因轉(zhuǎn)移 涉及當(dāng)細(xì)胞在患者體內(nèi)內(nèi)將DNA導(dǎo)入患者細(xì)胞。體內(nèi)基因轉(zhuǎn)移也涉及使 用含有內(nèi)皮特異性啟動(dòng)子的基因治療載體將所述DNA特異性導(dǎo)入患者眼 睛內(nèi)皮細(xì)胞。上迷所有三種廣義分類可用于實(shí)現(xiàn)體內(nèi)、先體外后體內(nèi)和體 外基因轉(zhuǎn)移?；蛑委熞部紤]蛋白質(zhì)或多肽的產(chǎn)生，其中細(xì)胞已經(jīng)用編碼所述蛋白 質(zhì)的天然存在的基因的遺傳序列轉(zhuǎn)化，即內(nèi)源基因激活技術(shù)。已詳盡描述了本發(fā)明，顯然在不背離附加權(quán)利要求中定義的本發(fā)明范 圍下可以進(jìn)行修改和改變。此外，應(yīng)理解在本公開的所有實(shí)施例為非限定 性實(shí)施例。實(shí)施例下面的非限定性實(shí)施例用于進(jìn)一 步闡述本發(fā)明。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理行良好的方法，并因此認(rèn)為構(gòu)成了其實(shí)施的模式實(shí)施例。然而，考慮到本 公開內(nèi)容，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解在公開的特定實(shí)施方案中可做許多修改， 并在不背離本發(fā)明精神和范圍的情況下仍得到同樣或相似的結(jié)果。 以下實(shí)施例中使用的方法盡管下述實(shí)施例使用的一些方法包含在所述實(shí)施例本身，也使用額外 的技術(shù)并且下面立即進(jìn)行描述。 增殖標(biāo)i己對于BrdU免疫染色，小鼠在安樂死前48小時(shí)、24小時(shí)和4小時(shí)經(jīng) 腹膜內(nèi)接受BrdU (100mg/kg)。根據(jù)制造商的方案，用抗BrdU染色試 劑盒(Zymed Laboratories, Inc., San Francisco, CA )檢測BrdU。寸吏用與 EGFR免疫染色相同的方案用抗Ki67抗體(Novocastra Laboratories Ltd, Newcastle, UK)進(jìn)行Ki67免疫染色，只是使用抗原暴露溶液(Vector Laboratories)預(yù)處理熱誘導(dǎo)的抗原回收。使用ABC方法(Vector Laboratories )用生物素化的抗小鼠PCNA抗體(DAKO公司，Carpinteria, CA)進(jìn)行PCNA染色。呼吸道上皮細(xì)胞培養(yǎng)與處理如先前描述來建立小鼠氣管上皮細(xì)胞(mTECs)的主要?dú)庖航缑媾囵B(yǎng) 物(You等人(2002) Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 283:L1315-1321)。從進(jìn)行移植的COPD患者肺外植體中和從無肺疾病的 肺移植供體中采集氣管支氣管樣本并使用相同的培養(yǎng)條件建立人呼吸道上皮細(xì)胞培養(yǎng)物。在所有情況下，細(xì)胞在上層和下層隔室中補(bǔ)充了 lO^ig/ml 胰島素、10fig/ml轉(zhuǎn)鐵蛋白、0.1 ng/ml霍亂毒素、5 ng/ml EGF ( Bectin Dickinson, Bedford, MA) 、 30將/ml牛垂體浸膏和5% FBS的基本培養(yǎng)基 (含有30mMHEPES、 4mML-谷氨酰胺、3.5mMNaHC03、 0.01 %兩 性霉素B和青霉素/鏈霉素的DMEM/Ham，s F-12 )中生長。在所述細(xì)胞發(fā)展到跨膜電阻〉1000Ohn.cm2后，通過用PBS洗滌所述膜并將下層隔室中 的培養(yǎng)基更換成補(bǔ)充有2% NuSerum (BD Biosciences, San Diego, CA )的 基本培養(yǎng)基來建立氣-液界面條件。為了刺激EGFR， 37°C下細(xì)胞在基本 培養(yǎng)基中溫育24小時(shí)并然后在含有向上層和/或下層隔室加入的EGF (1-100 ng/ml， Upstate Biotechnology, Lake placid, NY )的基本培養(yǎng)基中溫 育10分鐘。對于長期實(shí)驗(yàn)，每天向下層隔室加入EGFR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑 或載體對照(0.1%DMSO),或者對于短期實(shí)驗(yàn)，將其加入到向上層和 下層隔室中持續(xù)1.5到6小時(shí)。EGFR酪氨酸激酶抑制劑PD153(B5、 MEKl/2抑制劑PD98059、 EGFR酪氨酸激酶抑制劑AG1478和PI3K抑 制劑LY294002來自Calbiochem ( La JoIIa， CA )，并且z-Val畫Ala-Asp氟 代曱基酮(z畫VAD-fmk)來自Enzyme Systems Products (Livermore, CA )。 在氣液界面條件前24小時(shí)將來自Preprotech (Rocky Hill, NJ)的重組人 或小鼠IL-13加入到上層和下層隔室中并在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中將其維持在下 層隔室中。免疫細(xì)胞化學(xué)在4°C下用PBS洗涂培養(yǎng)的細(xì)胞兩次，25。C下在4%的多聚甲醛中固 定10分鐘，用PBS洗滌，并在-20。C用乙醇乙酸(2: 1，體積/體積) 透化處理5分鐘來進(jìn)行TUNEL反應(yīng)或在25。C下用0.2%的Triton-X透化 處理5分鐘來進(jìn)行免疫染色。然后用PBS洗滌透化處理的細(xì)胞并進(jìn)行所述 TUNEL反應(yīng)(Intergen， Purchase, NY )或用2%的魚凝膠在25。C下封閉 1小時(shí)并與兔抗活性胱天蛋白酶3 (BD Biosciences, San Diego, CA)、兔 抗EGFR( Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz， CA )、兔抗p畫EGFR( Cell Signaling Technology, Inc.， Beverly, MA)、小鼠抗卩微管蛋白IV或兔抗 P微管蛋白(Sigma, St. Louis, MO )抗體在4。C下溫育過夜。用山羊抗小 鼠或驢抗兔FITC或CY3 二級抗體檢測一級抗體的結(jié)合。用4 pg/ml Hoechst 33258 (Molecular Probes, Eugene, OR)復(fù)染細(xì)胞來檢測核形態(tài)， 然后如上描述進(jìn)行成像。25流式細(xì)胞術(shù)如上培養(yǎng)小鼠氣管上皮細(xì)胞并使用含有0.25%胰蛋白酶和0.1 % EDTA的細(xì)胞解離溶液(Sigma， St. Louis， MO)將其從Transwell培養(yǎng)物 中分離。用含有0.2% BSA的HBSS洗滌細(xì)胞并與5照/ml JC-l( Molecular Probes, Eugene, OR)在25。C下溫育15分鐘。使用FACSCalibur流式細(xì) 月包4義和CellQuest軟件(Becton Dickinson, Mountain View, CA)通過綠色 熒光(FL1)從低發(fā)射到高發(fā)射的移動(dòng)來檢測線粒體膜去極化的細(xì)胞。電子顯微術(shù)如先前描述準(zhǔn)備透射電子顯微術(shù)(TEM )用的膜上細(xì)胞(You等人(2004) Am.丄Physiol. Lung Cell. Mol. Physiol. 286:L650畫657 )。簡單而言，用2.5% 戊二醛將樣品固定并用1.25%四氧化鋨染色。用2.0%鞣酸將細(xì)胞復(fù)染，封 閉用于切片，并在Zeiss 902型顯微鏡下成像。統(tǒng)計(jì)分析使用析因?qū)嶒?yàn)沒計(jì)的單向方差分析法(ANOVA)對小鼠組織的組織 化學(xué)數(shù)值進(jìn)行分析。如果單向分析能達(dá)到顯著性，可使用ScheffeF檢驗(yàn)進(jìn) 行ANOVA后平均值的比較。實(shí)施例1:纖毛上皮細(xì)胞上EGFR的持續(xù)激活由于常見人類副粘病毒(例如，呼吸道合胞病毒或間質(zhì)肺病毒)通常 在小鼠中復(fù)制不充分，因此用小鼠副流感病毒(仙臺病毒；SeV)接種的小 鼠來評估小鼠呼吸道上皮中的EGFR行為。在該模式系統(tǒng)中，接種導(dǎo)致在 細(xì)支氣管粘膜內(nèi)高效復(fù)制并隨后誘導(dǎo)免疫應(yīng)答基因表達(dá)、免疫細(xì)胞滲透和 上皮的破壞(Walter等人(2001) J.Exp. Med. 193,339-352)。該宿主應(yīng)答 允許接種后10-12天徹底清除SeV (Walter等人(2002). J. Clin. Invest. 110:165-175; Tyner等人(2005) Nat. Med. 11 :1180-1187 )。在一些小鼠品 系中所述損傷伴隨上皮修復(fù)并恢復(fù)正常呼吸道結(jié)構(gòu)，但在C57BL/6J小鼠 中接種約21天后出現(xiàn)長期(可能永久性的)杯形細(xì)胞組織轉(zhuǎn)化(Walter 等人(2002) J. Clin. Invest. 110， 165-175 )。從Jackson實(shí)驗(yàn)室(Bar Harbor, Maine)獲得C57BL/6J和Balb/cJ 小鼠并在無病原體條件下保持和監(jiān)測，用于在如前述7周齡時(shí)進(jìn)行研究 (Walter等人(2001); Walter等人(2002); Tyner等人(2006) J. Clin. Invest. 116:309-321)。在含胚雞蛋中生長并收集SeV (Fushimi品系52) 用于提供病毒貯存液，使得5000 EID50( 50%雞蛋感染劑量)等同于2 x 105 PFU (空斑形成單位)。在氯胺酮/甲苯瘞喚麻醉下用30jilPBS將該接種 物或等量UV滅活的SeV鋒鼻遞送。在這些條件下，病毒組織水平在感染 后3-5天達(dá)到最高并且在第12天時(shí)病毒被徹底清除(Walter等人(2001); Walter等人(2002); Tyner等人(2006) J. Clin. Invest. 116:309-321 )。崗 哨小鼠和實(shí)驗(yàn)對照小鼠進(jìn)行和接種小鼠同樣的處理并且未顯示接觸11種 嚙齒動(dòng)物病原體(包括SeV)的血清學(xué)和組織學(xué)證據(jù)。對于EGFR阻斷， 用EKB國569 (從Lee Greenberger， Wyeth Ayerst Pharmaceuticals, Pearl River, NY獲得;通過管飼法以20 mg/kg (在pH 2.0水中)給予)或用從感 染后10-21天每日給予的載體對照處理小鼠。對于IL-13阻斷，將可溶性 的融合Fc的鼠IL-13Ra2經(jīng)皮下注射處理小鼠(sIL實(shí)施例2: EGFR的 抑制減少重塑上皮的13Ra2-Fc的方面；從Deborah Donaldson, Wyeth Ayerst獲得；在PBS中200 fig/小鼠)或用對照Fc在感染后12、 14、 17 和20天經(jīng)皮下注射該小鼠(Donaldson(1998) J. Immunol. 161 ， 2317 )。對于全肺分析，將小鼠肺的左葉在含磷酸酶抑制劑混合物(Sigma ) 的RIPA緩沖液Page 16 (含1 % NP-40、 0.5%去氧膽酸鈉、0.1% SDS的 PBS)中勻漿。在含有20 mM Tris-HCl、 150 mM NaCl、 1 mM EDTA、 1 mM EGTA、 l%Triton-X100、 1.0 jig/ml亮抑蛋白酶肽、10fig/ml抑酶肽、0.2 mM苯甲基磺酰氟、lmM原釩酸鈉、0.1 mM氟化鈉、2.5 mM焦磷酸鈉 和ImM p甘油磷酸的細(xì)胞裂解緩沖液中收集氣管組織和mTECs。通過離 心除去細(xì)胞裂解物，并且將上清液蛋白質(zhì)在4-15%梯度SDS-PAGE上分離 并轉(zhuǎn)移到PVDF膜上(Millipore， Bedford, MA )。用抗EGFR、磷酸EGFR、 磷酸ERK1/2、活化的胱天蛋白酶3、磷酸-Stat6( Cell Signaling Technology Beverly, MA)、褲酸Akt ( BD Biosciences, San Diego， CA)、胱天蛋白酶9 ( Stressgen， San Diego, CA )和p肌動(dòng)蛋白(Chemicon， Temecula， CA ) 的抗體印跡所述膜。用綴合辣根過氧化物酶的二級抗體和增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光 檢測一級抗體的結(jié)合(Amersham Pharmacia Biotech, Buckinghamshire, UK)。在25-cm水壓下通過氣管內(nèi)滴入4%多聚甲醛將小鼠肺固定。組織在 4。C固定過夜后，包埋于石蠟中，切成3-nm厚的切片用于蘇木精/曙紅染 色或免疫染色。對于人類組織，招募譯喘受試者(經(jīng)過或未經(jīng)過糖皮質(zhì)激素治療)和 健康對照受試者，描述其特征并如先前所述進(jìn)行支氣管內(nèi)活組織檢查 (Walter等人(2001); Sampath等人(1999) J. Clin. Invest. 103:1353-1361 ; Taguchi (1998) J. Exp. Med. 187， 1927-1940 )。簡而言之，對哮喘受試者 用吸入的丙酸氟替卡松(1760 jig/天)處理30天后進(jìn)行支氣管內(nèi)活組織檢 查，隨后中斷氟替卡松6周或直至呼氣流量峰值已降低25%并且1秒內(nèi)強(qiáng) 壓呼氣量降低15%時(shí)進(jìn)行支氣管內(nèi)活組織檢查。所有受試者在之前三個(gè)月 內(nèi)無呼吸系統(tǒng)感染史。用PBS洗滌支氣管內(nèi)活組織檢查樣品并將其用10 %中性緩沖福爾馬林在25°C下溫育18小時(shí)，隨后進(jìn)行如上述的組織化學(xué)。 此外，從經(jīng)歷肺切除或肺移植的COPD患者中獲得肺組織樣品并對其進(jìn)行 上述處理。對于免疫染色，將組織切片脫蠟，用梯度乙醇再水化并用疏水性膜 (ImmEdge PEN, Vector laboratories, Burlingame， CA)包圍。為進(jìn)4亍抗 原回收，切片用終濃度為40 ng/ml(在PBS中)的蛋白酶K( Sigma， St. Louis, MO)消化5分鐘，并然后在3%過氧化氫(蒸餾水中)處理10分鐘來淬 滅內(nèi)源過氧化物酶的活性。用含0.2% Tween 20的Tris緩沖鹽溶液(pH 8 ) (TBST )中的3% BSA和2%的山羊血清封閉非特異性蛋白質(zhì)結(jié)合1小時(shí)。 在封閉緩沖液中稀釋一級抗體并對于人和小鼠組織切片以終濃度0.05或 0.1 ng/ml分別在4。C溫育過夜。使用來自Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA )的兔抗人EGFR抗體SC-03檢測EGFR，該抗體針對 與鼠EGFR對應(yīng)序列相同的氨基酸殘基1005-1016。使用來自Cell SignalingTechnology Inc. ( Beverly, MA )的兔抗砩酸EGFR ( Tyr845 )抗體#2231 檢測磷酸化的EGFR (p-EGFR)，該抗體針對砩酸化的Tyr84S。對于該抗 體，0.16和0.32 jig/ml終濃度分別用于人和小鼠組織。分別使用小鼠抗p 微管蛋白IVmAb (Sigma)、山羊抗克拉拉細(xì)胞分泌蛋白質(zhì)(CCSP)抗 體(Santa Cruz Biotechnology)和小鼠抗人MUC5AC mAb 45M1 (Lab Vision Corp., Fremont, CA )鑒定纖毛細(xì)胞、克拉拉細(xì)胞和杯形細(xì)胞。為 了驗(yàn)證特異性，切片也與用10倍過量的多肽抗原預(yù)吸收的一級抗體或非免 疫兔IgG (Santa Cruz)溫育。 一級抗體結(jié)合后，用TBST洗滌切片并然 后用生物素化的山羊抗兔IgG (2 fig/ml)溫育。4艮據(jù)生產(chǎn)商的方案(Vector Laboratories )用Elite ABC法和3，3'二氨基聯(lián)苯胺色原放大信號。切片經(jīng) 蘇木精復(fù)染、脫水并用Cytoseal 60 ( St印hens Scientific, Riverdale， NJ)封 固。用與光學(xué)顯微術(shù)的免疫染色相同的方式進(jìn)行免疫熒光檢測，只是在 Tissue-Tek OCT ( Sakura Finetek, Torrance, CA )中冰凍組織，用2%驢 血清(Jackson ImmunoResearch Labs, West Grove, PA )封閉切片，在250C 使用CY-3或FITC綴合的抗體(Jackson ImmunoResearch Labs )檢測一 級抗體的結(jié)合30分鐘，并用Hoechst染料33432( Molecular Probes, Eugene, OR)將切片復(fù)染。切片在接有數(shù)字顯微照相系統(tǒng)(Optronix CCD照相機(jī) 和Magnafire v2軟件)的光學(xué)或免疫熒光顯微鏡(Olympus Model BX-51) 下成像。如前所迷(Walter等人(2001); Walter等人(2002); Sampath等人 (1999))，在Macintosh電腦上使用公共區(qū)域NIH圖傳^呈序(由美國國立衛(wèi) 生研究院開發(fā)并可從rsb.info.nih.gov/nih-image網(wǎng)址獲得)分析，通過對 肺部呼吸道中每mm基膜上的纖毛細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)來定量報(bào)道子。使用帶有 LSM-510軟件的Zeiss激光掃描系統(tǒng)(Zeiss， Thornwood， NY)進(jìn)行共焦顯微 術(shù)。識別呼吸道組織樣品中所述受體(結(jié)果未顯示)?？笶GFR抗體對呼吸道 組織的免疫染色結(jié)果表明EGFR表達(dá)主要集定位于纖毛上皮細(xì)胞頂膜 (epical membrane ),盡管其他細(xì)胞類型(例如，基細(xì)胞和呼吸道平滑肌細(xì)胞)也被;微弱地免疫染色(
圖1)。在SeV感染的小鼠和接種SeV-UV 的對照小鼠之間未觀察到抗EGFR免疫染色模式和水平上的顯著差異。與 "M目對，磷酸-EGFR的免疫染色(使用識別磷酸化Tyi^s的抗磷酸-EGFR抗體)表明與未接種或接種SeV-UV的對照小鼠相比，接種SeV后 約21天活化的EGFR水平持續(xù)升高。與EGFR表達(dá)模式類似，磷酸-EGFR 也主要定位于纖毛上皮細(xì)胞頂端表面，但在該情況下，頂端細(xì)胞染色也伴 隨在相同纖毛細(xì)胞群中對應(yīng)的核染色(
圖1)。其他細(xì)胞類型(例如，基 細(xì)胞)也在核及胞質(zhì)溶膠部位被微弱地免疫染色。該發(fā)現(xiàn)與活化的EGFR 核轉(zhuǎn)運(yùn)的報(bào)道相一致(Lin等人(2001) Nature Cell Biol. 3:302-808)。該免疫 染色模式說明原始EGFR抗體主要識別非磷酸化受體。對于兩種抗體，通 過用對應(yīng)抗原的預(yù)吸收可使免疫染色完全去除。此外，用正常兔IgG做為 陰性同種型對照并且未顯示高于背景的明顯信號。雙標(biāo)記和用激光掃描共 聚焦顯孩史鏡檢測的免疫焚光結(jié)果說明在小鼠呼吸道中EGFR與纖毛上皮細(xì) 胞的標(biāo)記(如p微管蛋白)共定位，而不與克拉拉細(xì)胞的標(biāo)記(如CCSP) 或杯狀細(xì)胞的標(biāo)記(如MUC5AC )共定位(圖2 )。這與EGFR表達(dá)主 要定位于纖毛上皮細(xì)胞是一致的。小鼠中發(fā)現(xiàn)的EGFR免疫染色模式與人類受試者中結(jié)果類似。尤其是， EGFR表達(dá)也定位于正常受試者和哮喘受試者纖毛上皮細(xì)胞的頂細(xì)胞膜， 并且在也顯示杯狀細(xì)胞組織變形的哮喘受試者中磷酸EGFR增加(圖29)。 磷酸-EGFR的表達(dá)類似地定位于纖毛上皮細(xì)胞的頂端部分，并且表達(dá)伴 隨有在相同纖毛細(xì)胞中對應(yīng)的核染色。此外，在正常受試者和哮喘受試者 的基細(xì)胞中也存在較弱的磷酸-EGFR免疫染色。實(shí)施例2:纖毛上皮細(xì)胞上EGFR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的功能作用 為定義持續(xù)的EGFR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)在纖毛上皮細(xì)胞上的功能作用，用纖毛上皮細(xì)胞、克拉拉細(xì)胞和杯形細(xì)胞的標(biāo)記對肺部切片進(jìn)行免疫染色。組織制備和免疫染色如上描迷。在呼吸道上皮中發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞類型的定量分析表明與接種SeV-UV的對照小鼠相比，SeV感染的小鼠在接種后第21天呈現(xiàn)(但到第12天未出現(xiàn)) 纖毛細(xì)胞和杯形細(xì)胞增加并伴隨細(xì)克拉拉細(xì)胞減少(圖3-4)。隨后確定 EGFR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)對上皮結(jié)構(gòu)中觀察到這些改變是否是必須的。從感染后第 10到21天每天使用口服施用的不可逆的EGFR抑制劑EKB-569來處理小 鼠，感染后第21天在整個(gè)小鼠肺部Akt的激活被完全抑制(圖30 )，表 明在這些條件下有效阻斷EGFR的促存活信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。使用新的不可逆的 EGFR抑制劑(EKB-569)用于這些研究，該抑制劑選擇性抑制體外呼吸 道上皮細(xì)胞中EGFR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)(圖30)。為實(shí)現(xiàn)體內(nèi)阻斷，從接種后第 10天(為不干擾病毒清除或上皮修復(fù))到第21天(發(fā)生了重塑反應(yīng))每 天口服施用EKB-569。在這些處理?xiàng)l件下，EKB-569也阻斷體內(nèi)的EGFR 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)(圖30 )。還觀察到EGFR抑制劑處理幫助校正上皮重塑的所有三個(gè)方面。特別 是，觀察到纖毛細(xì)胞增加和克拉拉細(xì)胞減少的完全阻斷，和杯形細(xì)胞組織 轉(zhuǎn)化的部分但顯著地抑制(圖6) 。 EKB-569處理對呼吸道上皮細(xì)胞的總 數(shù)目沒有影響(在接種后笫21天用栽體處理后細(xì)胞角蛋白染色細(xì)胞為133 ±3，用藥物處理后每mm基膜為137±5),與其他上皮細(xì)胞(例如基細(xì) 胞和克拉拉細(xì)胞)群體中補(bǔ)償性變化一致?；诿庖呓M織化學(xué)數(shù)據(jù)(顯示 了在相同的纖毛細(xì)胞群體中EGFR的定位和卩微管蛋白的表達(dá))，期望 EGFR阻斷可以影響纖毛細(xì)胞超常增生。然而，基于在任一種這些細(xì)胞類 型中相對缺少活化的EGFR表達(dá)，在克拉拉細(xì)胞或杯形細(xì)胞水平上中斷 EGFR信號的影響是不可預(yù)料的。設(shè)計(jì)進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)來更好地理解EGFR在慢性上皮重塑中的作用機(jī) 制。上皮增生可以是增加的'增殖或減少的細(xì)胞死亡的結(jié)果。因此，尋找在 上皮重塑的小鼠中增殖增加的證據(jù)。如先前所指出的，在感染后第5-12天 內(nèi)有短暫的上皮增殖(由BrdU標(biāo)記法標(biāo)記)(圖5A和圖6; ( Look等 人(2001) Am. J. Pathol. 159， 2055- 2069 ))。為Ki-67和PCNA增殖標(biāo)記 發(fā)現(xiàn)相同的免疫染色圖式(數(shù)據(jù)未顯示)。該增殖反應(yīng)很可能允許替代那 些遭受直接細(xì)胞病變效應(yīng)并且在病毒復(fù)制后緊接著發(fā)生免疫介導(dǎo)的細(xì)胞死亡的宿主細(xì)胞(Tyner，J.W.等人(2006) J. Clin. Invest. 116:309-321 )。并不驚奇的是，該修復(fù)期伴隨有EGFR在上皮細(xì)胞(通常為基細(xì)胞)及上 皮下(可能為免疫)細(xì)胞中的激活(圖5B)。然而，截至接種后第21天， 不再有進(jìn)行中的增殖反應(yīng)的證據(jù)，因?yàn)榧?xì)胞增殖與未接種的對照小鼠沒有 差別(圖3A和3B )。此外，該替代期(由基細(xì)胞區(qū)域中BrdU攝入和EGFR 激活為標(biāo)志)在不產(chǎn)生長期的上皮重塑的小鼠品系(Balbc/J)中是相同的 (圖5A-5C、 6和7)。因此，該短暫增殖反應(yīng)不能解釋隨后的只在遺傳敏 感的小鼠(C57BL6J)中發(fā)現(xiàn)的長期重塑。此外，缺乏進(jìn)行中的上皮增殖 反應(yīng)暗示纖毛細(xì)胞超常增生可能反映了基于在該上皮細(xì)胞亞群中細(xì)胞死亡 的抑制的依賴EGFR細(xì)胞的存活的選擇性增加。實(shí)施例3:培養(yǎng)物中的EGFR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和纖毛細(xì)胞存活 為確定EGFR是否為纖毛上皮細(xì)胞提供必要的存活信號，在組織培養(yǎng) 物中分析EGFR的阻斷，其中巨噬細(xì)胞的清除將不會使凋亡細(xì)胞的檢測變 得模糊并且其中可更好的定義信號轉(zhuǎn)導(dǎo)事件。初始實(shí)驗(yàn)旨在確定EGFR是 否如在體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的那樣定位在培養(yǎng)物中的纖毛上皮細(xì)胞。使用從小鼠氣管 采集的呼吸道上皮細(xì)胞的氣液界面培養(yǎng)物在體外重構(gòu)上皮系統(tǒng)。在該系統(tǒng) 中，纖毛細(xì)胞(p微管蛋白陽性)占總細(xì)胞群體的45±1%,該水平與正常 小鼠呼吸道(大尺寸呼吸道占36% )及以前報(bào)道的小鼠氣管樣品的數(shù)值相 似(Pack等人(1980) Cell Tissue Res. 208， 65-84 )。如在體內(nèi)的情況，培 養(yǎng)物中纖毛上皮細(xì)胞呈現(xiàn)EGFR和磷酸-EGFR沿頂端細(xì)胞膜組成型表達(dá) 并且在該位置及細(xì)胞核(被配體激活后)發(fā)現(xiàn)磷酸-EGFR (圖5和數(shù)據(jù) 未顯示)。其他人^JlEGFR也可定位在培養(yǎng)的呼吸道上皮細(xì)胞中基底外 側(cè)的細(xì)胞膜上(Vermeer等人(2003) Nature 422， 322-326 ),但是任何差 別取決于培養(yǎng)條件、影響不同抗體識別的受體異質(zhì)性或受體豐度(可影響 頂端與基底外側(cè)定位)(Kuwada等人(1998) Am. J. Physiol. Cell Physiol. 275， C1419-C1428 )。隨后使用選擇性抑制劑處理來定義EGFR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)在纖毛上皮細(xì)胞生長和存活中的作用。初始實(shí)驗(yàn)使用培養(yǎng)物驗(yàn)證抑制劑的特異性，首先從完全培養(yǎng)基中取出該培養(yǎng)物并然后用EGF刺激來將依賴EGFR的信號最大 化。在這些條件下，發(fā)現(xiàn)用PD153035抑制EGFR酪氨酸激酶阻斷了所有 的下游信號，同時(shí)用LY294002抑制PI3K阻斷Akt的磷酸化作用并且用 PD98059抑制MEK1/2阻斷ERK1/2的磷酸化作用(圖5和圖6)。然后， 確定這些EGFR信號對纖毛細(xì)胞存活的影響。發(fā)現(xiàn)用PD153035處理引起 纖毛細(xì)胞不成比例的劑量依賴性損失，導(dǎo)致總上皮細(xì)胞減少(圖6和圖7)。 用另 一的EGFR特異性抑制劑AG1478獲得相似的結(jié)果(數(shù)據(jù)未顯示)。 確認(rèn)EGFR的激活觸發(fā)若干下游信號途徑，然后用PI3K和MEK1/2的抑 制劑處理小鼠氣管上皮細(xì)胞(mTEC)培養(yǎng)物并發(fā)現(xiàn)只有用LY294002處 理才引起纖毛上皮細(xì)胞相似的損失(
圖11)。由于該培養(yǎng)體系不顯示顯著 的高密度細(xì)胞生長，很可能顯得纖毛上皮細(xì)胞的損失是由于細(xì)胞存活降低造成o隨后檢測EGFR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的阻斷是否導(dǎo)致在程序性細(xì)胞死亡水平上一 致的變化。與纖毛上皮細(xì)胞損失平行的是，在相同的細(xì)胞損失模式中觀察 到胱天蛋白酶3的快速激活和TUNEL陽性細(xì)胞(6小時(shí)內(nèi))，即當(dāng)EGFR 或PI3K而不是MEK1/2信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蜂皮阻斷時(shí)(圖8 )。在該背景中，TUNEL 陽性細(xì)胞進(jìn)行程序性細(xì)胞死亡，因?yàn)樵撨^程通過胱天蛋白酶抑制劑 z-VAD-fmk處理4皮阻斷(圖9 )并與胱天蛋白酶3和胱天蛋白酶9剪切/ 激活(圖IO)及線粒體膜電位喪失(圖ll)相關(guān)。這些結(jié)果因此確定EGFR 信號途徑，該途徑通過選擇性的PI3K信號轉(zhuǎn)導(dǎo)至下游因子(其阻止線粒 體功能異常和因此程序性細(xì)胞死亡)保護(hù)纖毛細(xì)胞免受程序性細(xì)胞死亡。 這些發(fā)現(xiàn)與對EGFR和ERK1/2的其他受體信號(在其他環(huán)境中預(yù)防細(xì)胞 死亡)的報(bào)道有些對立(Tyner等人(2005) Nat. Med. 11 :1180-1187; Monick等人(2005) J. Biol. Chem. 280:2147-2158; Roux等人(2004) Microbiol. Mol. Biol. Rev. 68:320-344)。實(shí)施例4:體外和體內(nèi)的EGFR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和杯形細(xì)胞的組織轉(zhuǎn)化如上面指出，EGFR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)對纖毛細(xì)胞的作用不能容易地解釋 EGFR阻斷對體內(nèi)杯形細(xì)胞組織轉(zhuǎn)化的影響。選擇性EGFR的表達(dá)和隨后 在纖毛細(xì)胞的存活功能解釋了纖毛細(xì)胞增生的抑制作用，但是不直接解釋 杯形細(xì)胞組織轉(zhuǎn)化的阻斷。隨后質(zhì)疑的是EGFR是否仍對杯形細(xì)胞存活具 有相似的功能影響。利用伴隨的研究檢測這種可能性，該研究確定病毒感 染后杯形細(xì)胞組織轉(zhuǎn)化的IL-13依賴性(未發(fā)表的觀察結(jié)果，EY Kim和 MJHoltzman)。該效應(yīng)器途徑因此與變應(yīng)原攻擊后黏蛋白產(chǎn)生的研究中 確定的途徑重疊(Grunig等人(1998) Science 282， 2261-2263; Wills-Karp 等人(1998) Science 282， 2258-2261 )。此外，認(rèn)識到IL-13處理能夠刺激 呼吸道上皮細(xì)胞中杯形細(xì)胞的形成，該呼吸道上皮細(xì)胞從豚鼠和人 (Laoukili等人(2001) J. Clin. Invest. 108:1817-1824; Kondo等人(2002) Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 27:536-541; Atherton等人(2003) Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 285:L730- L739 )及小鼠(未發(fā)表的觀察， JD Morton和MJ Holtzman )中獲得。用IL-13處理培養(yǎng)的小鼠氣管上皮 細(xì)胞，并通過MUC5AC的表達(dá)來標(biāo)記杯形細(xì)胞的隨后發(fā)展(Nakanishi 等人(2001) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 98， 5175-51809; Zhou等人 (2001) Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 25， 486-491 )。因?yàn)門UNEL反應(yīng)的程 序減少黏蛋白含量，所以用胱天蛋白酶3的激活追蹤細(xì)胞死亡。與纖毛細(xì) 胞相反，發(fā)現(xiàn)杯形細(xì)胞不顯示出響應(yīng)EGFR抑制引起的細(xì)胞死亡率增加(圖 12)。對MUC5AC陽性相對于MUC5AC陰性群體中活性胱天蛋白酶3 細(xì)胞的水平進(jìn)行定量表明在EGFR阻斷或未阻斷的杯形細(xì)胞中程序性細(xì)胞 死亡的水平相似，然而在這些處理?xiàng)l件下非杯形細(xì)胞(如纖毛上皮細(xì)胞) 顯示出顯著的胱天蛋白酶陽性染色(圖5C)。此外，用IL-13處理或未處 理的非杯形細(xì)胞死亡的水平相似，表明對杯形細(xì)胞形成的依賴IL-13的作 用沒有影響纖毛細(xì)胞中的死亡途徑。由于EGFR阻斷沒有引起對體外杯形細(xì)胞存活的影響，可以推論的是 EGFR阻斷對體內(nèi)杯形細(xì)胞組織轉(zhuǎn)化的強(qiáng)烈影響可能是在纖毛細(xì)胞增生的 EGFR阻斷的下游。對這種可能性的支持來自下一步的發(fā)現(xiàn)IL-13處理導(dǎo)致短暫具有纖毛細(xì)胞和杯形細(xì)胞特征的細(xì)胞的A艮。因此，mTEC培養(yǎng) 物的電子顯孩支鏡術(shù)提供了在IL-13影響下保持纖毛和逐漸產(chǎn)生粘液顆粒的 纖毛-杯形細(xì)胞亞群的證據(jù)(
圖18 )。在IL-13處理的起始后早期(1-2天) 這些過渡型細(xì)胞最顯著，而沒有纖毛的成熟杯形細(xì)胞在處理晚期(5天) 最多。在這些條件下纖毛-杯形細(xì)胞的形態(tài)特征與含粘液顆粒的纖毛細(xì)胞相 似，該粘液顆粒在變應(yīng)原激發(fā)的小鼠呼吸道中通過電子顯微術(shù)發(fā)現(xiàn) (Hayashi等人(2004) Virchows Arch. 444:66-73 )。由于在利用IL-13處理來促進(jìn)杯形細(xì)胞形成的條件下在否則將產(chǎn)生纖 毛細(xì)胞的環(huán)境中建立了呼吸道上皮培養(yǎng)物，這些纖毛-杯形細(xì)胞可能是通過 IL-13轉(zhuǎn)向以從纖毛細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為杯形細(xì)胞表型。用切片證實(shí)在體內(nèi)也發(fā) 生相似的轉(zhuǎn)分化可能性，該切片從SeV接種后顯示杯形細(xì)胞組織轉(zhuǎn)化的小 鼠中獲得。共聚焦顯微鏡術(shù)顯示，盡管大多數(shù)纖毛細(xì)胞或杯形細(xì)胞分別表 達(dá)P微管蛋白或MUC5AC，但是存在上皮細(xì)胞亞群表達(dá)p微管蛋白和 MUC5AC (
圖19)。類似地，共聚焦圖像也顯示， 一般而言纖毛細(xì)胞表達(dá)EGFR而杯形細(xì)胞不表達(dá)EGFR，但 是額外的細(xì)胞亞群表達(dá)EGPR和MUC5AC (圖20)。在每種情況中，使 用沿z軸多個(gè)共聚焦切片和三維重建來證實(shí)在單個(gè)細(xì)胞中的共定位。表達(dá) MUC5AC和p微管蛋白和/或MUC5AC和EGFR的亞群似乎處于過渡中， 因?yàn)樗鼈冊谡衬ど掀又胁幌裨诔墒毂渭?xì)胞中發(fā)現(xiàn)的那樣能經(jīng)常達(dá)到它 們特征性的形狀和位置。此外，在這些過渡型細(xì)胞中，相對于完全分化的 杯形細(xì)胞的更頂端定位，所述粘液顆粒通常定位在細(xì)胞的更基底隔室。該 形態(tài)行為也暗示這些纖毛-杯形細(xì)胞代表杯形細(xì)胞的前體。如先前對變應(yīng)原 誘導(dǎo)的杯形細(xì)胞組織轉(zhuǎn)化指出的，也在檢測纖毛-杯形細(xì)胞(圖23 )可相當(dāng) 的水平上檢測到共表達(dá)CCSP和MUC5AC的上皮細(xì)胞亞群(圖21)。下一步目標(biāo)是確定IL-13是否如已在體外觀察到的那樣也促使纖毛細(xì) 胞在體內(nèi)形成杯形細(xì)胞。這些實(shí)驗(yàn)利用重組的可溶性IL-13受體a2 Fc融 合蛋白(命名為sIL-13Rai-Fc)，其被遞送給小鼠時(shí)作為誘鉺受體特異阻 斷IL-13作用(Grunig等人(1998) Science 282， 2261-2263; Wills畫Karp等人(1998) Science 282， 2258-2261 )。選擇與那些用于EGFR阻斷相似的處 理?xiàng)l件，所以在病毒接種后將處理從第12天延長至第21天。該時(shí)間范圍 也與IL-13、 mCLCA3和MUC5AC基因表達(dá)的誘導(dǎo)一致，其與杯形細(xì)胞 組織轉(zhuǎn)化的發(fā)生一致(圖22 )。在這些條件下，我們發(fā)現(xiàn)sIL-13Ra2-Fc 處理高效預(yù)防病毒誘導(dǎo)的杯形細(xì)胞組織轉(zhuǎn)化(圖23)。然而，與EGFR阻 斷相比，sIL-13Ra2-Fc處理也引起纖毛細(xì)胞增生水平的進(jìn)一步提高(與它 們向杯形細(xì)胞移動(dòng)的阻斷一致)并且在克拉拉細(xì)胞水平上沒有變化(符合 杯形細(xì)胞的形成至少部分來自纖毛細(xì)胞而不是克拉拉細(xì)胞亞群這一可能 性)。不能完全排除在該環(huán)境中其他細(xì)胞來源(例如克拉拉細(xì)胞或基細(xì)胞) 也促進(jìn)杯形細(xì)胞組織轉(zhuǎn)化的可能性，但是在IL-13阻斷后纖毛細(xì)胞增加和 杯形細(xì)胞減少之間的密切匹配提示在這些條件下，纖毛細(xì)胞群體的轉(zhuǎn)分化 是杯形細(xì)胞組織轉(zhuǎn)化的重要途徑。實(shí)際上，連同克拉拉細(xì)胞表達(dá)黏蛋白基 因的先前的和現(xiàn)在的證據(jù)，本結(jié)果可能簡單地提供上皮細(xì)胞分化具有額外 可塑性的證據(jù)。在最后兩組實(shí)驗(yàn)中，所述發(fā)現(xiàn)再次從小鼠擴(kuò)展到人類受試者。在第一 組實(shí)驗(yàn)中，分析來自COPD患者的呼吸道組織，所述COPD患者顯示出 呼吸道杯形細(xì)胞水平顯著的提高并且在肺移植時(shí)提供足夠的肺組織用于分 析。通過應(yīng)用與為小鼠模型應(yīng)用的相同的免疫熒光和共聚焦顯微術(shù)免疫染 色方案，發(fā)現(xiàn)來自COPD患者的肺外植體的切片也顯示在呼吸道上皮細(xì)胞 亞群中p微管蛋白-MUC5AC共表達(dá)的證據(jù)(圖25)。沒有檢測到人(或 小鼠)呼吸道中p微管蛋白的腔內(nèi)染色，與纖毛可能通過內(nèi)體降解而不是 脫落來加工的提議一致。如先前指出(Boers等人(1999) Am. J， Respir. Crit. Care Med. 159)，在上皮細(xì)胞亞群中也發(fā)現(xiàn)CCSP-MUC5AC的共表 達(dá)。在第二組實(shí)驗(yàn)中，再次應(yīng)用用于小鼠研究的策略并且分析人呼吸道上 皮細(xì)胞在氣液界面培養(yǎng)條件下，無或有IL-13時(shí)的行為。在該情況下，發(fā) 現(xiàn)來自COPD患者的培養(yǎng)的呼吸道上皮細(xì)胞導(dǎo)致在IL-13影響下共表達(dá)p 微管蛋白和MUC5AC的細(xì)胞亞群的發(fā)展。如先前指出，P微管蛋白定位 在纖毛細(xì)胞的基體內(nèi)(You等人(2004) Am. J. Physiol. Lung Cell. Mol.)，并且因此提供與粘液顆粒中發(fā)現(xiàn)的MUC5AC甚 至更靠近的共定位。在來自其他健康肺外植體供者的培養(yǎng)的呼吸道上皮細(xì) 胞中發(fā)現(xiàn)纖毛細(xì)胞標(biāo)記和杯形細(xì)胞標(biāo)記的IL-13誘導(dǎo)的共表達(dá)的相同^=莫式 (甚至在IL-13處理后第一天內(nèi))(圖27)。對于小鼠和人組織的研究， 檢測沿z軸和三維重建的多個(gè)共聚焦圖像來確立纖毛細(xì)胞和杯形細(xì)胞標(biāo)記 在單個(gè)細(xì)胞中的共定位。因此，類似于在人類受試者中經(jīng)歷的EGFR激活， 發(fā)現(xiàn)在小鼠模式中發(fā)現(xiàn)的杯形細(xì)胞組織轉(zhuǎn)化的下游機(jī)制，即IL-13驅(qū)動(dòng)的 纖毛到杯形細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化似乎在分泌過多的人類疾病中具有副本。
權(quán)利要求
1. 用于治療呼吸道分泌過多的組合物，其包含EGFR信號途徑的抑制劑、IL-13信號途徑的抑制劑和藥學(xué)上可接受的載體。
2. 權(quán)利要求l的組合物，其中所述EGFR信號途徑的抑制劑為免疫肽。
3. 權(quán)利要求l的組合物，其中所述IL-13信號途徑的抑制劑為免疫肽。
4. 權(quán)利要求2的組合物，其中所述免疫肽為多克隆抗體、單克隆抗體 或抗體片段。
5. 權(quán)利要求3的組合物，其中所述免疫肽為多克隆抗體、單克隆抗體 或抗體片段。
6. 權(quán)利要求2的組合物，其中所述抗EGFR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)免疫肽為C225 或EMD55900。
7. 權(quán)利要求3的組合物，其中所述抗IL-13信號轉(zhuǎn)導(dǎo)免疫肽為 sIL-13Ra2-Fc。
8. 權(quán)利要求l的組合物，其中所述EGFR信號途徑的抑制劑為降低 EGF或EGFR表達(dá)的反義核酸。
9. 權(quán)利要求l的組合物，其中所述IL-13信號途徑的抑制劑為降低 IL-13、 IL-13R或IL- 4R表達(dá)的反義核酸。
10. 權(quán)利要求l的組合物，其中所述EGFR信號途徑的抑制劑為酪氨 酸激酶抑制劑。
11. 權(quán)利要求10的組合物，其中所述酪氨酸激酶抑制劑為PD153035、 EKB-569、 4-(3-氯代苯胺基)-6;7-二曱氧基喹唑啉、RG-14620;酪氨酸磷 酸化抑制劑23、酪氨酸磷酸化抑制劑25、酪氨酸磷酸化抑制劑46、酪氨 酸磷酸化抑制劑47或酪氨酸磷酸化抑制劑51。
12. 權(quán)利要求1的組合物，其中所述EGFR信號途徑或IL-13信號途 徑的抑制劑為PI3K的特異性抑制劑。
13. 權(quán)利要求12的組合物，其中所述PI3K抑制劑為LY294002。
14. 權(quán)利要求1的組合物，其中所述IL-13信號途徑的抑制劑為PD98059或LY294002。
15. 治療個(gè)體中呼吸道分泌過多的方法，所述方法包括施用EGFR信 號途徑的抑制劑和IL-13信號途徑的抑制劑。
16. 權(quán)利要求15的方法，其中同時(shí)施用所述EGFR信號途徑的抑制劑 和所述IL-13信號途徑的抑制劑。
17. 權(quán)利要求15的方法，其中作為權(quán)利要求1的組合物同時(shí)施用所述 EGFR信號途徑的抑制劑和所述IL-13信號途徑的抑制劑。
18. 權(quán)利要求15的方法，其中至少一種抑制劑為以(i)約0.05 mg至約 2.5 mg; (ii)約0.1 mg至約1 mg;或(iii)約0.3 mg至約0.5 mg的量施用的 免疫肽。
19. 權(quán)利要求15的方法，其中至少一種抑制劑為以(i)約10 ng/天至約 3 mg/天；(ii)約30 ng/天至約300 fig/天；或(iii)約100 fig/天的量施用的反義 抑制劑。
20. 權(quán)利要求15的方法，其中至少一種抑制劑為每次施用以每kg約 0.1 jig至約100 mg的量施用的酪氨酸激酶抑制劑。
21. 權(quán)利要求15的方法，其中通過注射、吸入、口服、脂質(zhì)體或逆轉(zhuǎn) 錄病毒載體施用所述兩種抑制劑。
全文摘要
本發(fā)明一般涉及治療肺部疾病的領(lǐng)域。更具體地，本發(fā)明涉及通過施用表皮生長因子受體(EGFR)信號途徑抑制劑和白細(xì)胞介素-13(IL-13)信號途徑抑制劑組合來治療呼吸道分泌過多，及其組合物。
文檔編號A01N61/00GK101282650SQ200680037655
公開日2008年10月8日 申請日期2006年10月10日 優(yōu)先權(quán)日2005年10月11日
發(fā)明者M·J·霍爾茨曼 申請人:華盛頓大學(xué)