專利名稱：：草藥粉末提取物及其制備和使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及用來預(yù)防、輔助治療或治療癌癥及肝炎的草藥粉末提取物，其包含采絨革蓋菌(0)2^^MM^i'cW,)(云芝)粉末。本發(fā)明也涉及制備及使用富含多糖肽的蘑菇粉末提取物，包括云芝，的方法。
背景技術(shù)：
：云芝，也被稱為采絨革蓋菌(6b7^7iAS7ej"^'coJor)或云狀蘑菇，是一種可食用真菌，屬于真菌屬(A^F"2^'ct"s)、多孔菌PW，ora幾s)、擔(dān)子菌類(萬aw'd^7^^s)。它被認(rèn)為是一種藥用真菌并在傳統(tǒng)中藥中使用。.云芝包含多糖活性成分，其已被表明可以增強(qiáng)免疫功能，增加免疫細(xì)胞數(shù)量，吞噬并殺死腫瘤細(xì)胞，增加白血球數(shù)。它也被用來治療慢性、頑固性、活動(dòng)性肝炎，而乙型肝炎一般有效率為82.4%。其治療慢性支氣管炎的有效率達(dá)85%。以其抗衰老和保持健康的功能，它可以清除自由基，促進(jìn)藥物功效，增強(qiáng)腎、肝功能。自從1943年發(fā)現(xiàn)云芝在增強(qiáng)免疫系統(tǒng)功能上的效用以來，就有對(duì)云芝多糖供應(yīng)的需求。重要的是，必須知道，并不是所有的云芝提取物在多糖含量上都一樣。本發(fā)明的目標(biāo)是，提供一種制備更加有效的及包含高純度云芝粉末提取物的云芝制劑的方法。發(fā)明概述本發(fā)明涉及制備一種富含多糖肽的蘑菇粉末提取物的方法。該方法包括提供一種富含多糖肽的蘑菇，將蘑菇壓碎，以垸醇和水溶劑提取，過濾并濃縮提取物，噴霧干燥濃縮物以得到富含多糖肽的蘑菇粉末提取物。烷醇可以是乙醇或乙醇和水的混合物。水溶劑可以是水。本發(fā)明也涉及制備采絨革蓋菌(云芝)粉末提取物的方法。該方法包括提供云芝原材料，將原材料壓碎，以溶劑提取，過濾并濃縮提取物，噴霧干燥濃縮物以形成云芝粉末提取物。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法進(jìn)行四次提取以50%乙醇進(jìn)行兩次，以水進(jìn)行兩次。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法在下述條件下進(jìn)行草藥材料和溶劑的重量體積比分別大約是，第1次和第2次提取時(shí)為l:5和1:23，第3次和第4次提取時(shí)為1:23和1:13。在另一個(gè)方面，本發(fā)明針對(duì)一種由本發(fā)明的方法制備的包含采絨革蓋菌(云芝)粉末的草藥粉末提取物。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的草藥粉末提取物以下述的化學(xué)鑒定為特征。這里揭露的草藥粉末提取物包含云芝粉末，其在抗癌細(xì)胞增殖方面比以其它舊方法制備的云芝粉末效果更強(qiáng)。本發(fā)明的草藥粉末提取物可以進(jìn)一步包含藥學(xué)上可接受的賦形劑和/或載體，并被制成各種劑型，例如顆粒，膠囊，片劑，粉末以及丸劑，以口服施用。優(yōu)選的制劑是膠囊。本發(fā)明的草藥粉末提取物具有潛在的疾病治療功效，可通過刺激或調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)減輕疾病，并可用來預(yù)防和/或治療肝炎及癌癥，包括乳癌和白血病。該草藥藥物組合物可為任何年齡和身體狀況的病人使用，包括體弱，年長及操勞過度。在本發(fā)明的另一方面，提供了一種營養(yǎng)補(bǔ)充物，包括上述提及的草藥粉末提取物，麥芽糖糊精和奶粉。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，草藥提取物，麥芽糖糊精和奶粉的比例處于1:1:10至1:4:50范圍內(nèi)。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，草藥提取物，麥芽糖糊精和奶粉的比例大約是1:2:22。在本發(fā)明的另一方面，提供了一種營養(yǎng)補(bǔ)充物，包括上述提及的草藥粉末提取物，麥芽糖糊精和豆奶粉。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，草藥提取物，麥芽糖糊精和奶粉的比例處于1:1:10至1:4:50范圍內(nèi)。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，草藥提取物，麥芽糖糊精和豆奶粉的比例是大約1:2:22。圖1顯示了云芝粉末提取物F2a和F2在紫外線265rnn處的HPLC(高效液相色譜)圖譜。圖2顯示了以折射率(R.I.)檢測(cè)的云芝粉末提取物F2a和F2的HPLC(高效液相色譜)圖譜。圖3顯示了以折射率(R.I.)檢測(cè)的糊精標(biāo)準(zhǔn)物在堆積色譜中的HPLC(高效液相色譜)圖譜。圖4顯示了F2和F2a在72小時(shí)，不同濃度下對(duì)HL-60細(xì)胞的抗增殖效果(n:6孔，三次重復(fù)實(shí)驗(yàn))。圖5顯示了F2和F2a在48小時(shí)，不同濃度下對(duì)MCF-7細(xì)胞的抗增殖效果(n二6孔，三次重復(fù)實(shí)驗(yàn))。圖6顯示了云芝水提取物和F2在HL-60中的細(xì)胞毒性。圖7顯示了云芝水提取物和F2在MCF-7中的細(xì)胞毒性。圖8顯示了云芝水提取物和F2在WRL-68中的細(xì)胞毒性。詳細(xì)描述本發(fā)明提供了制備一種富含多糖肽的蘑菇粉末提取物的方法。該方法包括(a)提供一種富含多糖肽的蘑菇并將其壓碎成粗粉；(b)以垸醇提取蘑菇粗粉以得到烷醇提取物，過濾烷醇提取物以得到烷醇濾液；(C)以水溶劑提取步驟(b)的殘留物以得到水提取物，過濾水提取物以得到水濾液；(d)合并然后濃縮上述濾液以得到濃縮物；以及(e)噴霧干燥該濃縮物以形成富含多糖肽的蘑菇粉末提取物。本發(fā)明也提供了制備采絨革蓋菌(云芝)粉末提取物的方法。該方法包括(a)提供云芝原材料并將其壓碎成粗粉；(b)以一種溶劑提取該粗粉以得到液體提取物；(c)過濾液體提取物以得到濾液；(d)濃縮該濾液以得到濃縮物；以及(e)噴霧干燥該濃縮物以形成云芝粉末提取物。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法是用50%的乙醇溶于水作為提取的溶劑。同樣在優(yōu)選的實(shí)施方案中，乙醇或水提取的步驟進(jìn)行多于一次。在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，提取的步驟進(jìn)行四次，第一次和第二次所用溶劑為50%乙醇，第三次和第四次為水。以本發(fā)明的方法制備的云芝粉末提取物是高純度的，并且在抑制癌細(xì)胞生長方面更加有效。以本發(fā)明的方法制備的云芝粉末提取物可用于預(yù)防或治療肝炎，抑制癌細(xì)胞生長，包括白血病和乳癌。烷醇可能是以下范圍的烷醇:C「d2的垸醇，C「Cu)的烷醇，C「Cs的烷醇，d-C6的烷醇，d-C4的烷醇，d-G的垸醇，C2-d2的垸醇，C2-d。的烷醇，C2-C9的垸醇，C2-Cs的烷醇，C2-G的垸醇，C2-C6的垸醇，C2-C5的烷醇，C2-C4的烷醇或C2-C3的烷醇，或其混合物。烷醇可能是C2，C3，C4，C5，C6,C7，C8，C9，C1Q，Cu或d2的垸醇。該烷醇可單獨(dú)使用或作為溶劑混合物使用。例如，可能使用一種99:l至20:80的垸醇水的混合物(重量/重量或體積/體積或重量/體積)。一種烷醇水的混合物可作為溶劑用于提取，其范圍為10:90至90:10(體積/體積)，20:80至80:20(體積/體積)，30:70至70:30(體積/體積)，40:60至60:40(體積/體積)或45:55至55:45(體積/體積)。在本說明書和權(quán)利要求書中，術(shù)語"垸醇"是指其本身或垸醇水的混合物。實(shí)施例實(shí)施例1云芝純粉末和制劑本發(fā)明的云芝純粉末和制劑通過以下程序制備(1)制備粗粉將收集自中國廣西、云南和貴州省的云芝原草藥，多孔菌家族(尸a/j7oracesefamily)的采絨革蓋菌(Cotz.cl/〃5"mrsiccL/or)，也禾爾云芝(A^7s"CM^rw'coA^)，壓碎成粗粉，然后用于制備提取物。自然生長的云芝為優(yōu)選，但種植的云芝也可用于提取。(2)制備提取物云芝粗粉以溶劑反復(fù)提取。第一次和第二次提取使用乙醇，優(yōu)選為50%乙醇溶于水(v/v)。第三次和第四次提取用純水。優(yōu)選的粗粉和溶劑的重量體積比在第一、二、三、四次提取分別為大約1:5，1:23，1:23和1:13。每次提取的時(shí)間優(yōu)選為1.52小時(shí)。提取物經(jīng)過濾，濾液被合并、濃縮并制成純粉末，如下所述。(3)提取物的濃縮上述第(2)步得到的濾液在5085QC經(jīng)真空蒸發(fā)濃縮，直至得到最佳相對(duì)密度為1.051.12，優(yōu)選為1.051.08的濃縮物。(4)純粉末的制備第(3)步所述濃縮物，進(jìn)一步經(jīng)噴霧干燥以形成純粉末。在進(jìn)入噴霧干燥器的櫥柜前將濃縮物預(yù)熱至大約60-70°C的溫度。噴霧干燥器櫥柜的進(jìn)入溫度被調(diào)至最適溫度。最適溫度定義為在該溫度下，最終粉末產(chǎn)物中總多糖產(chǎn)量最高。進(jìn)氣的最適溫度的范圍大約是150250°C，優(yōu)選為200230°C，更優(yōu)選為150170°C。流出溫度優(yōu)選為70100°C。最終粉末產(chǎn)物中可得到最高含量的總多糖的優(yōu)選溫度范圍可能根據(jù)所用個(gè)別噴霧干燥器而變化。干燥的粉末然后經(jīng)過網(wǎng)格大小為80的篩子，以確保干燥的粉末粒子的大小在可接受范圍內(nèi)。(5)藥物制劑的制備云芝純粉末可通過本
技術(shù)領(lǐng)域：
，特別是制藥業(yè)的技術(shù)人員熟悉的方法加工成片劑，丸劑，粉末劑，膠囊和顆粒。如有需要，可在純粉末中加入賦形劑，粘合劑，載體，填充劑以形成各種劑型。以下實(shí)施例為示例性目的，并不是為了限制本發(fā)明的范圍?？蛇M(jìn)行合理的改變，例如合理技術(shù)人員所理解的，而不脫離本發(fā)明的范圍。實(shí)施例2云芝粉末提取物F2和F2a的制備根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，命名為F2和F2a的云芝純粉末按照以下步驟制備。生產(chǎn)F2和F2a的區(qū)別在于它們?nèi)绾伪桓稍?。F2是經(jīng)噴霧干燥過程干燥，而F2a是經(jīng)真空干燥過程干燥。原材料云芝原草藥(6b"'CL/〃s1^T5^'cc^ar，也稱尸o7ys^'ciAs^r5^'cc^。z0取自中國田林縣農(nóng)業(yè)局，是中國大陸廣西省田林縣野生的采絨革蓋菌的子實(shí)體。云芝原草藥于9、10月份(秋季)采集。采絨革蓋菌經(jīng)詹小青教授(真菌學(xué)專家，中國科學(xué)院微生物研究所，北京，中國)鑒別確認(rèn)。干燥憑證標(biāo)本(No.2003-2510)保存在香港中文大學(xué)中藥研究所博物館。在預(yù)處理過程中將子實(shí)體洗凈，壓碎。然后把從預(yù)處理得到的加工材料，或云芝粗粉，以50%的乙醇提取。每28kg制成品，需要大約350kg云芝粗粉和2450升50%的乙醇。預(yù)處理和提取步驟如下描述預(yù)處理云芝原草藥首先經(jīng)混合及壓碎預(yù)處理以得到云芝加工材料或云芝粗粉，如下所述1.混合云芝原草藥經(jīng)流動(dòng)自來水快速?zèng)_洗以除去泥沙及雜質(zhì)，然后在不銹鋼蒸煮器中蒸1個(gè)小時(shí)以殺死潛在的寄生蟲和卵，然后在空氣中或60QC烤箱中干燥。2.壓碎367.5kg的云芝原草藥經(jīng)具有網(wǎng)格大小12mm的篩子的磨粉機(jī)(Ha腿erTypeGrinder,ModelNo.9FQ37-18)壓碎，以得到小于或約等于12mm大小的加工植物材料，或粗粉。收集粗粉并保存在密封的塑料容器中。每個(gè)容器貼上標(biāo)簽表明材料名，批次，日期和重量，并置于制定的位置貯存，溫度為0°30。C左右，濕度為大約6075%.提取云芝粗粉反復(fù)以50%的乙醇提取，如下1.第一次提取大約350kg云芝粗粉以1750升50%乙醇50%水(或稱50%的乙醇)提取。兩層紗布排于滲濾器底部，經(jīng)溶劑運(yùn)輸孔加入足量的50%的乙醇以取代底部的空氣。加入大約1/3的云芝粗粉并均勻分布。加入大約875升50%的乙醇，壓平滲濾器中的物質(zhì)。加入余下的2/3云芝粗粉，關(guān)閉材料運(yùn)輸孔并密封。加入另外875升50%的乙醇。開啟循環(huán)泵10分鐘，在繼續(xù)進(jìn)行蒸氣提取前混合物被浸泡超過12小時(shí)。循環(huán)泵接到滲濾器，以允許滲濾器底部的提取物循環(huán)至滲濾器頂部。為進(jìn)行蒸氣提取，將水蒸氣導(dǎo)入滲濾器的蒸氣層。通過位于滲濾器蒸氣2層的手動(dòng)蒸氣閥控制水蒸氣壓力控制在0.10.2MPa。循環(huán)泵每10分鐘開啟一次，在這期間每次持續(xù)io分鐘。隨著水蒸氣進(jìn)入滲濾器的蒸氣層，溶劑被加熱，蒸氣上升，冷卻，冷凝然后下落到滲濾器的底部。這個(gè)循環(huán)過程稱為溶劑回流。一個(gè)連接到滲濾器頂部的蒸氣回收管與一個(gè)冷凝器和一個(gè)冷卻器在不同的部分密切相連以使溶劑回流發(fā)生。當(dāng)提取物的溫度上升至接近溶劑的沸點(diǎn)時(shí)(如果是50%的乙醇，則大約為70°C)，冷卻器和冷凝器的入閥開啟。水流入冷卻器和冷凝器。發(fā)生溶劑回流所需的時(shí)間依賴于溶劑的數(shù)量，蒸氣壓力和溶劑的沸點(diǎn)?；诖颂幩尤氲闹参锊牧希掖继崛r(shí)溶劑回流所需的時(shí)間大約是30分鐘，水提取時(shí)大約是l個(gè)小時(shí)。一旦溶劑回流開始，即觀察并記錄時(shí)間。溶劑回流狀態(tài)得以保持的溫度為用于混合物慢煮的"確定溫度"?；旌衔镌诠潭囟嚷蟠蠹s兩個(gè)小時(shí)，期間滲濾器的內(nèi)部壓力通過蒸氣閥保持在大約0.020.05MPa。如果用50%的乙醇作提取，固定溫度大約是80°C，如果用水，固定溫度大約是9095°C。在這期間，提取物通過循環(huán)泵每1015分鐘分散一次，優(yōu)選為每15分鐘一次，每次5分鐘。這使得液體提取物定期循環(huán)以使草藥材料得到完全提取。提取物以標(biāo)準(zhǔn)操作程序過濾。實(shí)踐中，提取物脫離滲濾器，通過一個(gè)過濾器，濾液通過循環(huán)泵進(jìn)入存貯容器。2第二次提取從以上第一次提取的殘留物以大約700升50%的乙醇按照上述方法進(jìn)一步提取，作為第二次提取。第二次提取的濾液與第一次的合并。3第三次和第四次提取第二次提取的殘留物分別以700升和350升純水再進(jìn)行兩次提取，作為第三次和第四次提取。按照以上所述方法以環(huán)流進(jìn)行水提取，只是環(huán)流下第三次和第四次的提取時(shí)間分別為2小時(shí)和1.5小時(shí)。濃縮合并從以上提取獲得的濾液，然后進(jìn)行乙醇回收和濃縮的過程。1.乙醇回收在-0.07Mpa的真空和大約0.035Mpa的蒸氣壓下從濾液回收乙醇。當(dāng)回收的乙醇濃度低于40%時(shí)停止回收過程。2.濃縮乙醇回收之后，液體提取物被轉(zhuǎn)移到由3個(gè)連續(xù)相連的真空濃縮管組成的3倍濃縮器，按照標(biāo)準(zhǔn)操作程序進(jìn)行同時(shí)濃縮(3個(gè)室同時(shí)運(yùn)行)。濃縮時(shí)，濃縮器中用來加熱提取物的蒸氣壓力保持在0.10.2Mpa，第一室為-0.030.04Mpa真空，溫度為8085。C;第二室為-O.050.06Mpa真空，溫度為6570°C;第三室為-0.070.08Mpa真空，溫度為5055°C。當(dāng)?shù)谝皇液偷诙业奶崛∥矬w積減小時(shí)，濃縮物被轉(zhuǎn)移到第三室繼續(xù)進(jìn)行濃縮過程。當(dāng)?shù)谌覞饪s物的相對(duì)密度到達(dá)大約1.051.12(在60±5°C下測(cè)量)，優(yōu)選1.051.08時(shí)，停止?jié)饪s過程，收集濃縮物以作后面的用途。噴霧干燥以生產(chǎn)F2濃縮物被加熱至大約65°C的溫度并通過離心噴霧注入一個(gè)噴霧干燥器的櫥柜內(nèi)(不加糊精)。櫥柜的進(jìn)氣和出氣溫度分別被調(diào)至215。C和9(TC左右。進(jìn)氣的溫度對(duì)最終粉末產(chǎn)物中總多糖的產(chǎn)量及最終粉末產(chǎn)物的外觀有影響。在160°C，200°C和240°C的進(jìn)氣溫度下，最終粉末產(chǎn)物中總多糖的產(chǎn)量分別為20.6%，16.3%和12.1%。云芝粉末味道稍苦。粉末在進(jìn)氣溫度為160T或20CrC時(shí)是深褐色，在24(TC為褐色。濃縮物在櫥柜內(nèi)變干燥。粉末經(jīng)過80孔篩的磨碎機(jī)。收集成品粉末F2。外包裝粉末(F2)經(jīng)打包并經(jīng)真空包裝機(jī)封裝于鋁箔袋(3kg每袋)。在每批被證明符合所有的檢驗(yàn)后，各袋以第二層鋁箔包裝并貼上正確的標(biāo)簽。然后將袋子置于桶中，存貯于涼爽干燥的條件下。真空干燥以生產(chǎn)F2a為生產(chǎn)F2a，將濃縮物與糊精在混合器中混合25分鐘。然后將混合物置于真空干燥器的潔凈托盤，在70。C，真空壓力小于-0.08Mpa下干燥。當(dāng)混合物中的水成分等于或小于6%時(shí)停止干燥過程。壓碎混合物然后經(jīng)過一個(gè)80孔篩的磨碎機(jī)。收集成品粉末F2a。所得云芝粉末提取物F2a的主要成分被證明為多糖和三萜系化合物。實(shí)施例3高效液相色譜研究本發(fā)明利用高效液相色譜(HPLC)來獲得以不同的干燥方法制得的云芝粉末產(chǎn)品的指紋圖譜。F2和F2a的區(qū)別通過化學(xué)鑒定用高效液相色譜(HPLC)系統(tǒng)來測(cè)定，高效液相色譜可根據(jù)分子大小的區(qū)別分離化學(xué)成分。HPLC的方法和結(jié)果如下所述1.材料和方法1.1HPLC分析的樣品準(zhǔn)備粉末形式的F2或F2a(84mg)分別溶于lml滅菌的雙蒸去離子水，在圓底聚丙烯微管中以100rpm振蕩超過12小時(shí)。每個(gè)溶液經(jīng)0.45jam尼龍acrodisc⑧注射過濾器過濾(PallCorporation,NY，USA，catalogno.4484)，存貯于4。C。1.2分子大小標(biāo)準(zhǔn)物包含分子量為1，010(Fluka，Buchs，瑞士，目錄編號(hào)31416)和80，900(Fluka，Buchs，瑞士，目錄編號(hào)31421)的糊精的分子大小標(biāo)準(zhǔn)物(每標(biāo)準(zhǔn)物為50mg/ml)用作大小標(biāo)記以校驗(yàn)HPLC系統(tǒng)性能的一致性。1.3HPLC系統(tǒng)整套HPLC系統(tǒng)及其機(jī)械部件購自美國馬薩諸塞州WatersCorporation所用儀器包括WatersAlliance2695分離模塊，Waters2410折射率檢測(cè)器(R.I.)，Waters996光(電)二極管矩陣檢測(cè)器(樣品在紫外線265nm處分析)。柱以如下方式依次連接1.Ultrahydrogel保護(hù)柱(目錄編號(hào)11565);2.Ultrahydrogel1000(目錄編號(hào)WAT011535);3.Ultrahydrogel500(目錄編號(hào)WAT011530);和4.Ultrahydrogel250(目錄編號(hào)WAT011525)。Ultrahydrogel保護(hù)柱內(nèi)徑6.0mm，長度40腿。Ultrahydrogel分析柱內(nèi)徑7.8跳長度300mm。1.4HPLC運(yùn)行條件'流動(dòng)相雙蒸去離子(DDI)水，以0.45,尼龍膜洗脫液流速跑樣時(shí)間注樣體積Purge檢測(cè)器乙腈(ACN)，以0.45pm尼龍膜過濾0.3ml/分鐘樣品300分鐘糊精標(biāo)準(zhǔn)120分鐘樣品100pl糊精標(biāo)準(zhǔn)混合物20pl10分鐘(每次注入樣品或糊精標(biāo)準(zhǔn)混合物每次跑樣品后的洗滌步驟持續(xù)時(shí)間流速(ml/分鐘)條件1.10分鐘0.5100%DDI2.30分鐘0.3從100%DDI逐漸改變?yōu)?0。/0DDI+20%ACN3.60分鐘0.380%DDI+20%ACN4.30分鐘0.3從80%DDI+20%ACN逐漸改變?yōu)?00%DDI5.10分鐘從0.3變到0.5100%DDI6.110分鐘0.5100%DDI每次跑大小標(biāo)準(zhǔn)物后的洗滌DDI以0.3ml/分鐘進(jìn)行120分鐘樣品-標(biāo)準(zhǔn)物運(yùn)行次序糊精標(biāo)準(zhǔn)混合物在開始時(shí)，跑樣中間和跑樣結(jié)束后各跑一次。1.5F2和F2a的化學(xué)指紋圖譜分析將從不同樣品批次以兩種檢測(cè)方法(R.I.或265nm紫外線)獲得的色譜圖排列并比較。同時(shí)也將從不同批次的糊精標(biāo)準(zhǔn)混合物以R.I檢測(cè)獲得的色譜圖排列并比較以校驗(yàn)不同運(yùn)行的差異。2結(jié)果基于HPLC的F2a和F2樣品分析(以265nm紫外線檢測(cè))產(chǎn)生了多于7個(gè)不連續(xù)峰，如圖1所示。除三個(gè)峰(A，B，C)的強(qiáng)度差異之外，兩個(gè)樣品的圖譜類似。峰B的強(qiáng)度差異顯著因?yàn)樵谕粋€(gè)樣品內(nèi)這個(gè)峰相對(duì)于其它峰的相對(duì)強(qiáng)度在F2a和F2內(nèi)不同。以差異R.I.檢測(cè)在兩個(gè)樣品中產(chǎn)生了相似的圖案，因此，不適合用來作它們的區(qū)分，如圖2所示。本測(cè)試通過排列糊精標(biāo)準(zhǔn)混合物的圖譜得到校驗(yàn)，沒有檢測(cè)到性能上的顯著差別，如圖3所示。實(shí)施例4藥理學(xué)研究以下的藥理學(xué)研究證明云芝配方F2在白血病和乳癌細(xì)胞系中表現(xiàn)出體外抗增殖活性。并且，F(xiàn)2相對(duì)于云芝純水提取物，具有對(duì)癌細(xì)胞而不是正常人類細(xì)胞的較好的選擇性細(xì)胞毒性。這些制劑可潛在地用于治療白血病或乳癌病人。雖然云芝配方F2和F2a均證明在白血病和乳癌細(xì)胞系中的效用，F(xiàn)2似乎在實(shí)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞系50%生長抑制(IC5Q)所需濃度(按照MTT分析)方面比F2a優(yōu)越。雖然在兩個(gè)人類癌細(xì)胞系中云芝純水提取物的ICs。值比F2小，該提取物也在人類正常細(xì)胞系中表現(xiàn)出很高的細(xì)胞毒性和低ICs。值。因此，云芝純水提取物不像F2—樣具備選擇性細(xì)胞毒性，F(xiàn)2被證明對(duì)所選癌細(xì)胞系而不是正常細(xì)胞系有顯著的細(xì)胞毒性。因此，我們做出結(jié)論F2是比云芝純水提取物更好的抗癌藥物候選。研究F2和F2a的細(xì)胞培養(yǎng)和MTT分析的程序細(xì)胞培養(yǎng)在細(xì)胞培養(yǎng)之前，將F2，F(xiàn)2a和云芝純水提取物溶于普通RPMI1640培養(yǎng)液(InvitrogenGIBC0，紐約州，美國)，分別作為3.0mg/ml，2.2mg/ml和1.15mg/ml的貯備液(由于溶解性不同)，室溫下48小時(shí)持續(xù)振蕩。離心除去不溶物，可溶性上清以0.22Mm過濾器滅菌，然后進(jìn)一步以普通細(xì)胞培養(yǎng)液稀釋。對(duì)于F2和F2a，稀釋后的濃度范圍是25-160(￥g/ml(2倍終濃度)，對(duì)于云芝純水提取物，濃度是1142.86Pg/ml(對(duì)于最終800Pg/ml的劑量)，其范圍是25-800Pg/ml(2倍終濃度)。人類急性早幼粒細(xì)胞白血病(HL-60)細(xì)胞系，乳癌(MCF-7)細(xì)胞系和正常肝臟(WRL-68)細(xì)胞系購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC，馬里蘭州，美國)。細(xì)胞系生長并保養(yǎng)于37°C和5%C02環(huán)境的加濕培養(yǎng)箱。補(bǔ)充了20%胎牛血清(FBS)，100單位/ml青霉素和100Pg/ml鏈霉素(InvitrogenGIBCO)的RPMI1640培養(yǎng)液用于HL-60的細(xì)胞培養(yǎng)。補(bǔ)充了10%胎牛血清(FBS)，100單位/ml青霉素和100Pg/ml鏈霉素的RPMI培養(yǎng)液用作MCF-7和WRL-68細(xì)胞的培養(yǎng)液。從培養(yǎng)瓶收集以后，細(xì)胞以血球計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)，并以臺(tái)盼藍(lán)不兼容方法確定細(xì)胞存活性。對(duì)于以F2和F2a進(jìn)行的測(cè)試，在96孔平底Costar培養(yǎng)板(CorningInc.,馬薩諸塞州，美國)的每個(gè)孔內(nèi)，104個(gè)處于對(duì)數(shù)培養(yǎng)期的HL-60細(xì)胞植于10014補(bǔ)充了40%FBS的RPMI培養(yǎng)液中；對(duì)于MCF-7細(xì)胞，每個(gè)孔內(nèi)為5000個(gè)細(xì)胞植于補(bǔ)充了20%FBS的RPMI培養(yǎng)液中。每孔加入的溶液，其含有普通培養(yǎng)液中F2和F2a終濃度的兩倍。對(duì)照孔只加入10(^1普通培養(yǎng)液。加入終濃度為20~/ml的一種化療抗腫瘤藥，絲裂霉素C(MMC，SigmaChemicalCo，密蘇里州，美國)作為陽性對(duì)照。對(duì)于以云芝純水提取物進(jìn)行的測(cè)試，每個(gè)孔內(nèi)為104個(gè)HL-60細(xì)胞系的細(xì)胞植于60W補(bǔ)充了66.7%FBS的RPMI培養(yǎng)液中；5000個(gè)MCF-7或WRL-68細(xì)胞系的細(xì)胞植于補(bǔ)充了33.3%FBS的RPMI培養(yǎng)液中。對(duì)于800Pg/ml的劑量，每孔加入的普通培養(yǎng)液中濃度為1142.86Pg/ml稀釋提取物。對(duì)于12.5-400Pg/ml的劑量，每孔加入10(￥1的稀釋提取物，其含有普通培養(yǎng)液中終濃度的兩倍。對(duì)照孔只加入普通培養(yǎng)液。然后以藥物培養(yǎng)細(xì)胞48小時(shí)(MCF-7)或72小時(shí)(HL-60)。以MTT分析確定接經(jīng)處理的細(xì)胞的增殖反應(yīng)。MTT細(xì)胞毒性分析MTT分析可測(cè)定MTT[溴化3-(4，5-二甲基-噻唑基)-2，5-二苯基-四唑，Sigma]被線粒體脫氫酶還原成一種綠色甲產(chǎn)物，反映出線粒體的正常功能及活細(xì)胞。以F2，F(xiàn)2a或云芝純水提取物培養(yǎng)細(xì)胞48小時(shí)(MCF-7或WRL-68)或72小時(shí)(HL-60)后，在每個(gè)孔加入溶于磷酸緩沖液(PBS，InvitrogenGIBCO)的5mg/ml的MTT，并將培養(yǎng)板于37°C培養(yǎng)2小時(shí)。然后離心培養(yǎng)板，除去上清。每孔加入的二甲亞砜(DMSO，Sigma)。于37。C培養(yǎng)5分鐘后，用Benchmark微量滴定板讀數(shù)器(Bio-RadLaboratories,加利福尼亞州，美國)在540nm下以分光光度法測(cè)定溶解液的吸光度。未處理的細(xì)胞其吸光度認(rèn)為是100%。結(jié)果以MTT吸光度平均值(云芝粉末提取物處理的細(xì)胞的吸光度除以對(duì)照細(xì)孔的吸光度比率X100。/。)±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示，3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)，每次6孔。經(jīng)處理和未處理對(duì)照(100%)孔之間的差異以Student不成對(duì)檢驗(yàn)測(cè)定。F2和F2a對(duì)人類急性早幼粒細(xì)胞白血病(HL-60)和乳癌(MCF-7)細(xì)胞體外抗腫瘤活性MTT分析結(jié)果的比較圖4和5表明兩個(gè)云芝配方，F(xiàn)2和F2a，對(duì)人類急性早幼粒細(xì)胞白血病(HL-60)和乳癌(MCF-7)細(xì)胞均具有體外抗增殖效應(yīng)。細(xì)胞以濃度漸增(12.5800Pg/ml，以兩倍增長)的云芝粉末提取物在培養(yǎng)液中培養(yǎng)48小時(shí)(MCF-7細(xì)胞)或72小時(shí)(HL-60細(xì)胞)，增殖反應(yīng)以MTT分析測(cè)定。兩個(gè)云芝粉末提取物，F(xiàn)2和F2a，均以劑量依賴性方式顯著性抑制MCF-7細(xì)胞(50-80(￥g/ml)和HL-60細(xì)胞(100-80化/ml)的增殖。這些藥理學(xué)研究證明F2具有較低的IC5。值，因此比F2a更有活性。此，從本發(fā)明得到的云芝證明相對(duì)于由其它過程生產(chǎn)的為較好的制劑。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>"*"表示該數(shù)據(jù)是顯著的圖6，7和8表明了云芝配方，F(xiàn)2和云芝純水提取物，對(duì)人類急性早幼粒細(xì)胞白血病(HL-60)，乳癌(MCF-7)和正常肝臟細(xì)胞(WRL-68)體外抗增殖效應(yīng)的結(jié)果。細(xì)胞以濃度漸增(12.58001^g/ml，以兩倍增長)的云芝配方在培養(yǎng)液中培養(yǎng)48小時(shí)(MCF-7細(xì)胞或WRL-68細(xì)胞)或72小時(shí)(HL-60細(xì)胞)，增殖反應(yīng)以MTT分析測(cè)定。兩個(gè)云芝配方，F(xiàn)2和云芝純水提取物，均能以劑量依賴性方式顯著性抑制MCF-7細(xì)胞(50-800Pg/ml)和HL-60細(xì)胞(100-80Pg/ml)的增殖。但是，只有云芝純水提取物證明可顯著抑制WRL-68細(xì)胞(100-80C^g/ml)的增殖，F(xiàn)2在所測(cè)濃度范圍內(nèi)(12.5-800l^g/ml)未顯示任何顯著性抑制。表2表明了云芝配方F2和云芝純水提取物在所測(cè)細(xì)胞系上的IC5。值。從lOOPg/ml開始，ICs。值分別為235.45±41.23g/ml和59.39±5.92g/ml，MCF-7細(xì)胞的增殖可被F2和云芝純水提取物顯著性抑制。從lOOPg/ml開始，ICs。值分別為150.62±5.65g/mland14.85±1.18g/ml，HL-60細(xì)胞的增殖可被F2和云芝純水提取物顯著性抑制。從100Pg/ml開始，ICs。值為127.91±17.85g/ml，WRL-68細(xì)胞的增殖可被云芝純水提取物顯著性抑制。F2在所測(cè)濃度范圍12.5-800^/ml內(nèi)對(duì)WRL-68細(xì)胞的增殖無顯著性抑制。結(jié)果清晰表明，雖然在人類癌細(xì)胞系HL-60和MCF-7兩種情況下云芝純水提取物的ICs。值均比F2小，該提取物也在正常人類細(xì)胞系WRL-68中顯示出很高的細(xì)胞毒性及低ICs。值。因此，云芝純水提取物不像F2—樣具有選擇性細(xì)胞毒性，F(xiàn)2被證明對(duì)所選癌細(xì)胞系而不是正常細(xì)胞性具有顯著的細(xì)胞毒性。因此，這些藥理學(xué)研究證明本發(fā)明證明為是比云芝純水提取物更好的抗癌藥物候選。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>本發(fā)明也提供了兩種包含云芝提取物的配方。以下描述了這兩種配方的實(shí)施例及其制作方法。實(shí)施例6云芝奶粉配方云芝純粉40kg麥芽糖糊精80kg奶粉880kgI.云芝純粉的制備(1)云芝粗藥的預(yù)處理云芝原草藥經(jīng)洗滌，清洗以除去雜質(zhì)例如塵土或沙粒，經(jīng)干燥并壓碎成粗粉備用。(2)第一次提取在以標(biāo)準(zhǔn)程序提取之前，將500kg云芝粗粉以5倍50°/。的乙醇浸泡超過12小時(shí)。溶劑被加熱至微沸狀態(tài)，并保暖回流2小時(shí)(溶劑每15分鐘被強(qiáng)制循環(huán)5分鐘)，過濾以產(chǎn)生濾液和第一次殘留物。收集濾液備用。(3)第二次提取第一次殘留物以3倍50%的乙醇浸泡并加熱至微沸狀態(tài)，并保暖回流2小時(shí)(溶劑每15分鐘被強(qiáng)制循環(huán)5分鐘)，過濾以產(chǎn)生濾液和第二次殘留物。收集濾液備用。(4)第三次提取第二次殘留物以3倍的水浸泡并加熱至微沸狀態(tài)，并保暖回流2小時(shí)(溶劑每15分鐘被強(qiáng)制循環(huán)5分鐘)，過濾以產(chǎn)生濾液和第三次殘留物。收集濾液備用。(5)第四次提取第三次殘留物以3倍的水浸泡并加熱至微沸狀態(tài)，并保暖回流1.5小時(shí)(溶劑每15分鐘被強(qiáng)制循環(huán)5分鐘)，過濾以產(chǎn)生濾液和第四次殘留物。收集濾液備用。丟棄第四次殘留物。(6)濃縮根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)程序合并并濃縮以上步驟所得濾液至相對(duì)密度為1.051.08(65°C±5°C)。收集并檢測(cè)(水含量和微生物)濃縮物，備用。(7)干燥根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)程序在進(jìn)氣溫度120。C130。C及出氣溫度50°C±20。C下噴霧干燥純凈的糊狀物。通過120孔篩收集干燥的粉末(云芝純粉)，備用。II.與麥芽糖糊精和奶粉混合(8)干燥，混合和?；蒙倭?0%的乙醇做粘合劑將云芝純粉(40kg)和麥芽糖糊精(80kg)充分混合，使云芝純粉和麥芽糖糊精完全混合。依次加入120kg，240kg，520kg的牛奶并與云芝純粉和麥芽糖糊精充分混合。加入適量95%的乙醇作為粘合劑使之成為軟性糊狀物。該軟性糊狀物以高效濕法制粒機(jī)或擺動(dòng)制粒機(jī)(用16孔篩)制粒。濕粒被置于真空干燥管內(nèi)在0.080.09Mpa，60。C±5°C下干燥。收集干粒(水含量幼.0%)，備用。(9)包裝干粒過40目篩。收集通過篩子的顆粒并包裝。每包稱4kg。(10)貯存密封產(chǎn)品包以防止受潮。實(shí)施例7云芝豆奶粉云芝豆奶粉也可以類似于實(shí)施例6中所示生產(chǎn)云芝奶粉的程序生產(chǎn)，除了配方中880kg的奶粉換成880kg的豆奶粉，干粒過20孔篩而不是40孔篩。權(quán)利要求1.一種制備富含多糖肽的蘑菇粉末提取物的方法，包括a.提供一種富含多糖肽的蘑菇并將其切成小碎片；b.以烷醇提取所述蘑菇碎片以得到烷醇提取物，過濾所述烷醇提取物以得到乙醇濾液；c.以水溶劑提取步驟b的殘留物以得到水提取物，過濾所述水提取物以得到水濾液；d.合并然后濃縮所述乙醇濾液和所述水濾液以得到濃縮物；e.噴霧干燥所述濃縮物以形成所述富含多糖肽的蘑菇粉末提取物。2.如權(quán)利要求1的制備富含多糖肽的蘑菇粉末提取物的方法，其中所述富含多糖肽的蘑菇是采絨革蓋菌(6bi^W^7ersj'c^or)(云芝)。3.如權(quán)利要求1的制備富含多糖肽的蘑菇粉末提取物的方法，其中所述垸醇提取步驟b的執(zhí)行多于一次。4.如權(quán)利要求1的制備富含多糖肽的蘑菇粉末提取物的方法，其中所述水溶劑提取步驟c的執(zhí)行多于一次。5.如權(quán)利要求1的制備富含多糖肽的蘑菇粉末提取物的方法，其中所述垸醇提取步驟b和水溶劑提取步驟c的執(zhí)行均多于一次。6.如權(quán)利要求1的制備富含多糖肽的蘑菇粉末提取物的方法，其中所述垸醇是50%的乙醇溶于水(v/v)。7.如權(quán)利要求1的制備富含多糖肽的蘑菇粉末提取物的方法，其中所述噴霧干燥的步驟還包括以下步驟a.預(yù)熱濃縮濾液并將加熱的濃縮濾液注入一個(gè)噴霧干燥器的櫥柜；b.調(diào)節(jié)櫥柜的入氣溫度至最佳溫度；以及C.干燥所述濃縮濾液以得到干燥的粉末。8.如權(quán)利要求l所述的方法，其中所述烷醇是乙醇。9.一種制備采絨革蓋菌(Cbho^AM7^z'coZor)(云芝)粉末提取物的方法，包括-a.提供云芝原材料并將其壓碎成粗粉；b.以一種溶劑提取所述粗粉以得到液體提取物；c.過濾所述液體提取物以得到濾液；d.濃縮所述濾液以得到濃縮物；以及e.噴霧干燥所述濃縮物以形成云芝粉末提取物。10.如權(quán)利要求9的種制備采絨革蓋菌(云芝)粉末提取物的方法，其中所述溶劑是50%乙醇:50%水(v/v)。11.如權(quán)利要求9的種制備采絨革蓋菌(云芝)粉末提取物的方法，其中所述提取步驟a的執(zhí)行多于一次。12.如權(quán)利要求11的種制備采絨革蓋菌(云芝)粉末提取物的方法，其中所述提取步驟a執(zhí)行4次，所用的容劑于第1次和第2次的提取為50%乙醇50%水(v/v)，于第3次和第4次的提取為水。13.如權(quán)利要求12的種制備采絨革蓋菌(云芝)粉末提取物的方法，其中草藥材料與溶劑的重量體積比分別大約是，第1次和第2次提取時(shí)為1:5和l:23，第3次和第4次提取時(shí)為1:23和1:13。14.一種包含采絨革蓋菌(6brio7^MrsicWor)(云芝)的草藥粉末提取物，其中所述云芝粉末獲得通過以一種溶劑提取云芝粗粉后獲得液體提取物；過濾液體所述提取物獲得濾液；濃縮所述濾液得到濃縮濾液；以及噴霧干燥所述濃縮濾液得到所述云芝粉末。15.如權(quán)利要求14所述的草藥粉末提取物，其中所述云芝粉末具有如圖1所示的高效液相色譜的指紋圖譜F2。16.—種包含云芝的草藥粉末提取物，其中所述云芝粉末通過如權(quán)利要求12所述的方法獲得，其中所述云芝粉末具有如圖1所示的高效液相色譜的指紋圖譜F2。17.如權(quán)利要求15所述的草藥粉末提取物，其中所述草藥粉末提取物能夠刺激或調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)，治療肝炎，或抑制人類或其它哺乳動(dòng)物中癌細(xì)胞的生長。18.如權(quán)利要求15所述的草藥粉末提取物，其中所述草藥粉末提取物能夠抑制人類或其它哺乳動(dòng)物中白血病或乳癌癌細(xì)胞的生長。19.如權(quán)利要求15所述的草藥粉末提取物，其中所述草藥粉末提取物制成制劑，選自如下一組顆粒，膠囊，片劑，粉末或丸劑。20.如權(quán)利要求15所述的草藥粉末提取物，其中所述草藥粉末提取物其形式為膠囊。21.—種刺激或調(diào)節(jié)人類或其它哺乳動(dòng)物免疫系統(tǒng)的方法，包括施用有效劑量的如權(quán)利要求15的草藥粉末提取物。22.—種抑制人類或其它哺乳動(dòng)物中癌細(xì)胞的生長的方法，包括施用有效劑量的如權(quán)利要求15的草藥粉末提取物。23.—種預(yù)防或治療人類或其它哺乳動(dòng)物中肝炎的方法，包括施用有效劑量的如權(quán)利要求15的草藥粉末提取物。24.—種營養(yǎng)補(bǔ)充物，包括如權(quán)利要求14的草藥粉末提取物，麥芽糖糊精和奶粉。25.如權(quán)利要求24所述的營養(yǎng)補(bǔ)充物，其中草藥提取物，麥芽糖糊精和奶粉的比例處于1:1:10至1:4:50范圍內(nèi)。26.如權(quán)利要求24的營養(yǎng)補(bǔ)充物，其中草藥提取物，麥芽糖糊精和奶粉的比例是大約1:2:22。27.—種營養(yǎng)補(bǔ)充物，包括如權(quán)利要求14所述的草藥粉末提取物，麥芽糖糊精和豆奶粉。28.如權(quán)利要求27的營養(yǎng)補(bǔ)充物，其中草藥提取物，麥芽糖糊精和豆奶粉的比例處于1:1:10至1:4:50范圍內(nèi)。29.如權(quán)利要求27的營養(yǎng)補(bǔ)充物，其中草藥提取物，麥芽糖糊精和豆奶粉的比例是大約1:2:22。全文摘要公開了從一種富含多糖肽的蘑菇，包括采絨革蓋菌(Coriolusversicolor)(云芝)中制備一種草藥粉末提取物的方法。同時(shí)公開了一種更有效的、高純度的云芝粉末提取物，以及其制備和應(yīng)用于抑制癌細(xì)胞增殖及肝炎的方法。文檔編號(hào)A01N65/00GK101365338SQ200680041124公開日2009年2月11日申請(qǐng)日期2006年11月6日優(yōu)先權(quán)日2005年11月8日發(fā)明者劉碧珊,周檉森,陳曦齡申請(qǐng)人:維特健靈健康產(chǎn)品有限公司