專利名稱：：在植物中產(chǎn)生所需蛋白質(zhì)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及表達(dá)有用蛋白質(zhì)的植物基因表達(dá)系統(tǒng)。這類蛋白質(zhì)包括藥物、抗體鏈和具有高營養(yǎng)價值的蛋白質(zhì)。本發(fā)明是關(guān)于產(chǎn)生與植物儲藏蛋白谷蛋白相融合的所需蛋白質(zhì)。根據(jù)所選擇的控制序列，可采用種子特異性啟動子在種子中或在植物的其它部分中產(chǎn)生所述融合蛋白。
背景技術(shù)：
：早已知道，若產(chǎn)生的所需蛋白質(zhì)是融合蛋白，尤其是含有與表達(dá)宿主同源的氨基酸序列的融合蛋白是有利的。例如，LaVallie，E.R.等，Cw/^e/7tQw'y^o/i/Ai"ec力(1995)6:501-506提供了關(guān)于利用在大腸桿菌中融合表達(dá)所需蛋白質(zhì)來克服與細(xì)菌表達(dá)有關(guān)的問題如形成包含體(需要再折疊方案)，或大腸桿菌不能完全除去氨基末端甲硫氨酸起始密碼子的綜述和評論。也可以將融合蛋白用于植物中產(chǎn)生多種效果。例如，Pa匿nter，D.L.等，#。丄腸丄(1995)29:1167-1180描述了產(chǎn)生作為與種子特異性蛋白質(zhì)油質(zhì)蛋白相融合的蛋白質(zhì)的抗凝血蛋白水蛭素。油質(zhì)蛋白是小蛋白質(zhì)，埋在油體的磷脂單層內(nèi)，因此此融合蛋白較易純化。用此法在油菜籽中成功產(chǎn)生了水蛭素。VanRooijen，G.J.H.等，歷'o々ec力/7o^^j(1995)13:72-77也證明了油質(zhì)蛋白編碼序列在歐洲油菜09r^w'cs朋p"s)籽中能與異源e-葡糖醛酸糖苷酶成功融合。另一方面，盡管Vendekerckhove,J.等，A'o/fec//7t^og/(1989)7:929-932利用與2S種子儲藏白蛋白融合在歐洲油菜和耳芥籽中產(chǎn)生了外源蛋白亮氨酸-腦啡肽，但由于融合影響到修飾種子儲藏蛋白的翻譯后變化，看來此法不太成功。尤其相關(guān)的是Sardana，R.K.等，7，柳/w'c紋(2002)11:521-531的報道，此報道說在稻米乳胚特異性谷蛋白啟動子Gt3調(diào)控下與谷蛋白的8個N末端氨基酸融合，可在轉(zhuǎn)基因煙草植物中產(chǎn)生人粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)。看來提取自植物的包含8個谷蛋白氨基酸或只包含GM-CSF構(gòu)建物的蛋白質(zhì)具有生物活性。盡管本發(fā)明涉及通常在植物中融合而產(chǎn)生的所需蛋白質(zhì)，但具體應(yīng)用是利用這類融合蛋白來提高營養(yǎng)物含量。植物蛋白質(zhì)中，哺乳動物所需的9種必需氨基酸的含量較低。因此，例如，由于谷物蛋白質(zhì)大都缺乏賴氨酸和其它必需氨基酸(Sun，S.S.M.等，r濯獲朋ic尸7朋ts(1993)1:339-371)，因此其營養(yǎng)價值嚴(yán)重限制了它們用作人類食品和動物詞料。稻米，一種低成本的能量和蛋白質(zhì)來源和全世界超過一半人的主要食物，其必需氨基酸含量相對不平衡，賴氨酸是含量最有限的必需氨基酸。為谷物種子補(bǔ)充晶體賴氨酸或其它營養(yǎng)均衡的蛋白質(zhì)來糾正該缺乏費(fèi)用昂貴有時不可行。因此，改善稻米種子的蛋白質(zhì)，提高其賴氨酸含量對依靠稻米作為主要主食的人們來說極其重要。過去已做了大量努力來提高谷物蛋白質(zhì)的質(zhì)量(賴氨酸含量)，例如建立了玉米的不透明-2(c^a，e-2(c^))突變體(Mertz，E.T.等，5W，e(1964)145:279-280)。不幸的是，這類改良農(nóng)作物常常伴有不良性狀，如產(chǎn)量較低和對害蟲和疾病更易感，而妨礙了它們在農(nóng)業(yè)中的應(yīng)用。類似地，種植賴氨酸含量較高稻米秧苗的努力也未獲得顯著成功。近年來，隨著生物技術(shù)的進(jìn)展，已證明可通過引入富含必需氨基酸的異源或改良基因編碼儲藏蛋白來提高農(nóng)作物的營養(yǎng)價值可行。例如，提高了豆類和其它農(nóng)作物，尤其是谷物中的含硫氨基酸甲硫氨酸和半胱氨酸的含量，但未能提高賴氨酸的含量(Sun，S.S.M.等，InVitroCell.Dev.Biol.-Plant(2004)40:155-162)。克隆四棱豆0^op力ocaip^z^z^3^/2o乃力iAs)的編碼18kDa富含賴氨酸蛋白質(zhì)(LRP)的cDNA的方法可參見Sun,S.S.M.等的美國專利6，184，437所述。該蛋白質(zhì)的賴氨酸含量為10.7摩爾％，具有提高谷物賴氨酸含量的極大潛力。更近年來，證明了LRP能在稻米谷蛋白"7啟動子的控制下在轉(zhuǎn)基因稻米植物種子中組織特異性表達(dá)和在轉(zhuǎn)基因稻米的成熟種子中穩(wěn)定積累(Liu等，未發(fā)表)。然而，LRP在轉(zhuǎn)基因稻米種子中的積累水平不特別高，即使在最高表達(dá)情況下，其含量只約占種子儲藏總蛋白的1%，導(dǎo)致干燥稻米種子中的賴氨酸含量只升高很少的％。因此，為了有效提高谷物的營養(yǎng)價值需要進(jìn)一步提高賴氨酸含量。即使可通過提高轉(zhuǎn)錄水平，如采用種子特異性強(qiáng)啟動子而利用異源蛋白質(zhì)，但仍然存在與產(chǎn)生穩(wěn)定的成熟蛋白質(zhì)所需的各種轉(zhuǎn)錄后步驟有關(guān)的障礙，例如，構(gòu)象和亞細(xì)胞靶向和沉積。在以前的研究中，我們嘗試過采用更強(qiáng)的啟動子和/或與稻米儲藏蛋白基因的信號肽序列相融合來增強(qiáng)LRP基因的表達(dá)，但在成熟的轉(zhuǎn)基因種子中沒觀察到蛋白質(zhì)產(chǎn)量的顯著增加(Liu等，未發(fā)表)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明利用種子儲藏蛋白谷蛋白的高效合成和包裝系統(tǒng)產(chǎn)生了包含至少一種谷蛋白亞基的氨基酸序列和所需蛋白質(zhì)序列的融合蛋白?？僧a(chǎn)生能提高植物營養(yǎng)價值的蛋白質(zhì)。一實(shí)施方式是提高賴氨酸的含量。因此，在一方面，本發(fā)明涉及包含與谷蛋白至少一種亞基的氨基酸序列融合的所需蛋白質(zhì)的氨基酸序列的融合蛋白。還包含任選含有切割位點(diǎn)，具體是酶切割位點(diǎn)的接頭序列。所需蛋白質(zhì)可具有提高的營養(yǎng)價值和/或顯示具有其它所需特性。本發(fā)明還包括產(chǎn)生這些蛋白質(zhì)的重組材料，包括表達(dá)系統(tǒng)、包含所述表達(dá)系統(tǒng)的載體、含有這些表達(dá)系統(tǒng)的植物細(xì)胞和植物，和產(chǎn)生的融合蛋白和各種植物組織，具體是含有它們和/或所述融合蛋白本身的種子。所述谷蛋白可來源于任何植物。本發(fā)明說明了如何與四棱豆(尸.tefrag朋o"^s)的編碼富含賴氨酸蛋白質(zhì)(LRP)的異源cDNA融合來改良編碼谷蛋白儲藏蛋白的稻米天然Gtl基因，而形成可高表達(dá)的Gt:LRP融合蛋白基因以提高其營養(yǎng)甲酯；然而，也可采用其它谷蛋白基因和可產(chǎn)生除LRP以外的其它蛋白質(zhì)進(jìn)行融合。因為谷蛋白具有兩個亞基，可將所需蛋白質(zhì)序列與一個或另一個或兩個亞基偶聯(lián)。所述融合蛋白還可包含任選含有切割位點(diǎn)的接頭部分，以便回收獨(dú)立于谷蛋白序列的所需蛋白質(zhì)。因此，本發(fā)明還包括在啟動子序列控制下的種子特異性表達(dá)本發(fā)明融合蛋白的DNA構(gòu)建物?？尚揎梿巫尤~植物或雙子葉植物使其包含該構(gòu)建物。稻米(^y^L.)由于缺乏必需氨基酸賴氨酸，是一種營養(yǎng)不完全的主食，只用它來說明本發(fā)明。本發(fā)明范圍還包括修飾植物使其包含本發(fā)明的DNA構(gòu)建物的方法，由所得植物或其后代或組織產(chǎn)生的食品和食品補(bǔ)充劑，和利用這些食品來增加營養(yǎng)的方法。附圖簡要說明圖la是用于轉(zhuǎn)化稻米的二元構(gòu)建物pGLF-B的示意圖。圖lb是轉(zhuǎn)基因稻米植物的Southern印跡分析。用于Southern和Northern印跡分析的ZW和"J特異性探針分別標(biāo)示為"探針1"和"探針2"。圖2a-2c是Gt:LRP(B)融合蛋白基因在轉(zhuǎn)基因稻米中表達(dá)的Northern印跡分析。圖3a-3c是Gt:LRP融合蛋白在轉(zhuǎn)基因稻米成熟種子中積累的SDS-PAGE分析。實(shí)施本發(fā)明的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明提供了使包含衍生自谷蛋白至少一種亞基的氨基酸序列和所需蛋白質(zhì)的氨基酸序列的編碼序列在植物中表達(dá)產(chǎn)生所需蛋白質(zhì)的方法。所需蛋白質(zhì)可以是需要產(chǎn)生的任何蛋白質(zhì)，包括可用于治療目的或可用來增強(qiáng)生物機(jī)體如哺乳動物、鳥類和魚類生理機(jī)能或代謝的蛋白質(zhì)。這類蛋白質(zhì)包括，例如，人生長激素、人血清白蛋白、人表皮生長因子、鮭魚生長因子、人a-干擾素、水蛭素、紅細(xì)胞生成素、人al-抗胰蛋白酶、人胚胎堿性磷酸酶、白介素、人毒蕈堿的膽堿能受體、葡糖腦苷脂酶、亞基疫苗(如，乙型肝炎)、抗體、植物口服疫苗等。該列表并不窮盡，僅是說明性的。在一尤其重要的實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了通過引入和表達(dá)一種或多種本發(fā)明轉(zhuǎn)基因而顯著提高植物各組織，包括種子如稻谷的營養(yǎng)價值的方法。這種提高不是通過提高蛋白總量，而是提高必需氨基酸的水平而實(shí)現(xiàn)。由于植物各組織的總蛋白質(zhì)過剩會對其質(zhì)地和儲藏性能造成有害影響，因此優(yōu)選不改變蛋白質(zhì)總含量而能提高其營養(yǎng)質(zhì)量。本發(fā)明以下所述的方法涉及天然植物儲藏蛋白基因的基因工程改造方法，以使高營養(yǎng)價值的重組蛋白質(zhì)在植物各組織中過量積累，供人和動物的消費(fèi)。在一些實(shí)施方式中，通過與谷蛋白融合在植物中產(chǎn)生的所需蛋白質(zhì)含有更高價值的9種必需氨基酸中一種或多種。這些"必需"氨基酸是組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、蘇氨酸、色氨酸和纈氨酸。"含量增加"或"富含"指，當(dāng)經(jīng)修飾的植物產(chǎn)生了此種融合蛋白時，這類氨基酸的含量高于未修飾植物中相應(yīng)氨基酸的含量。或者，所需蛋白質(zhì)中的此種氨基酸含量顯著水平高于植物中所見的任何蛋白質(zhì)的相應(yīng)氨基酸的含量。"顯著水平"指所述蛋白質(zhì)占蛋白質(zhì)總含量的至少10%、20%、30%或甚至50%。如
背景技術(shù)：
部分所述，稻米的氨基酸含量相對不均衡，其中賴氨酸是第一種含量有限氨基酸。其它谷類植物也如此。因此，本發(fā)明的一類重要植物是谷類植物，如稻米、小麥、燕麥和大麥。利用天然種子儲藏蛋白的較高效表達(dá)和包裝系統(tǒng)，本發(fā)明提供了定量修飾種子蛋白質(zhì)的組成而顯著提高植物種子如谷物的營養(yǎng)質(zhì)量的方法。在以下實(shí)施例中，通過將谷蛋白與LRP融合來提高賴氨酸含量而提高轉(zhuǎn)基因稻米種子的營養(yǎng)質(zhì)量。賴氨酸含量的這種提高得自兩個因素，其一是LRP多肽的賴氨酸含量高，另一是稻米谷蛋白的賴氨酸殘基水平較高。將這兩種谷蛋白和LRP的賴氨酸含量相組合，以及隨后Gt:LRP融合蛋白在稻米胚乳中的過量積累會導(dǎo)致必需氨基酸賴氨酸的顯著提高。在一實(shí)施方式中，通過與編碼四棱豆LRP的異源cDNA融合修飾種子儲藏蛋白基因，稻米谷蛋白Gtl基因，使其富含賴氨酸殘基。將此融合基因轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞，優(yōu)選稻米細(xì)胞中。此宿主細(xì)胞再生成為植物表達(dá)靶蛋白，和得到子代。已證明在高表達(dá)轉(zhuǎn)基因稻米系中，工程改造的融合蛋白能夠種子特異性地表達(dá)和積累到約占種子總蛋白質(zhì)的30%和種子干重的2.7%。融合蛋白在種子中的過量積累能導(dǎo)致種子總賴氨酸含量顯著增長，含量比非轉(zhuǎn)基因親本品系高45%以上，而未觀察到轉(zhuǎn)基因種子的總氮含量有統(tǒng)計學(xué)顯著增長。還觀察到轉(zhuǎn)基因種子中其它一些氨基酸的濃度變化但其余的必需氨基酸水平無顯著降低(如Met)?？磥恚珿t:LRP融合蛋白在轉(zhuǎn)基因稻米種子中的高表達(dá)對其它種子蛋白的表達(dá)和種子外觀有所影響。從轉(zhuǎn)化株的后續(xù)子代中選擇到多株純合轉(zhuǎn)基因品系進(jìn)行田間試驗。轉(zhuǎn)基因與對照品系之間的農(nóng)學(xué)性能沒有差異或差異有限。在飼養(yǎng)大鼠的飼養(yǎng)試驗中，當(dāng)與非轉(zhuǎn)基因野生型種子相比時，轉(zhuǎn)基因稻米種子導(dǎo)致了體重、飼養(yǎng)效率、純蛋白質(zhì)消化率、生物利用值和蛋白質(zhì)凈利用的統(tǒng)計學(xué)顯著性增加。這些發(fā)現(xiàn)證明了利用基因工程改造提高供人和動物消費(fèi)的谷物農(nóng)作物的營養(yǎng)價值是可行的。以上概述僅說明了本發(fā)明的工作。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知對除LRP外的其它有關(guān)所需蛋白質(zhì)、有關(guān)的各種谷蛋白基因和有關(guān)的各種各樣植物可進(jìn)行類似操作。本發(fā)明采用谷蛋白亞基作為所需蛋白質(zhì)的融合伴侶。對谷蛋白用作種子儲藏蛋白的描述大體如下種子儲藏蛋白，如來源自稻米的那些蛋白質(zhì)，根據(jù)它們的溶解度，可分成白蛋白(水溶性)、球蛋白(鹽溶性)、醇溶谷蛋白(醇溶性)和谷蛋白(殘余物)。它們包裝和儲藏在稱為蛋白體(PB)的細(xì)胞器內(nèi)。谷蛋白和球蛋白位于液泡室(PBII)內(nèi)，而醇溶谷蛋白位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)-衍生的PBI(Tanaka，K.等，力^ric.57o丄C力e肌(1980)44:16331639)、0kita，T.W.等，舶加./e^尸7朋f尸力j^j'o7.#。丄(1996)47:327350)內(nèi)。谷蛋白是稻米的主要儲藏蛋白，其含量占種子胚乳蛋白的60-80%。與其它種子儲藏蛋白相比，稻米谷蛋白含有更多的賴氨酸殘基，儲藏在PBII內(nèi)。已證實(shí)易于被人和牲畜消化。這些特點(diǎn)使谷蛋白具有比其它谷物儲藏蛋白更好的營養(yǎng)質(zhì)量。而且，谷蛋白由至少6種不同類型組成的多基因家族所編碼(Takaiwa，F(xiàn).等，《種子蛋白(SeedProteins)》(1999)401-425，P.R.Shewry、R.Casey編，庫魯學(xué)術(shù)出版社(KluwerAcademicPublishers),荷蘭多德雷赫特市)，大多數(shù)谷蛋白基因在稻米胚乳中高表達(dá)和積累。因此，最宜將谷蛋白用作融合受體蛋白質(zhì)有效產(chǎn)生靶蛋白來提高稻米的營養(yǎng)質(zhì)量。成功所需要的是構(gòu)建的融合蛋白能否導(dǎo)致其高水平合成和積累，進(jìn)而顯著提高有關(guān)的必需氨基酸(含量)?？蓪⑺璧鞍踪|(zhì)插入谷蛋白的一個或兩個亞基中來實(shí)現(xiàn)這種需要。本發(fā)明包括修飾植物使之能產(chǎn)生營養(yǎng)價值顯著高于那些未修飾植物的種子或其它組織，或產(chǎn)生感興趣的蛋白質(zhì)的方法。所述方法包括以下步驟a)構(gòu)建包含表達(dá)上述融合蛋白的DNA構(gòu)建物的載體；b)直接用該載體或經(jīng)農(nóng)桿菌C^ro力scter7》歷)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞；c)使植物細(xì)胞再生成為含本文所述DNA構(gòu)建物的轉(zhuǎn)基因植物或其子代；和d)回收再生轉(zhuǎn)基因植物的種子或其它組織如葉子。轉(zhuǎn)基因植物或其子代或植物細(xì)胞的繁殖物質(zhì)可用于維持原種。載體和DNA構(gòu)建物的性質(zhì)取決于所選擇的用于轉(zhuǎn)化的植物、轉(zhuǎn)化方式和產(chǎn)生所需蛋白質(zhì)的植物組織。啟動子的性質(zhì)能影響所述植物組織中的表達(dá)；合適的啟動子包括，例如，對任何具體植物組織無特異性的常用的花椰菜花斑病毒35S啟動子，以及那些組織特異性更強(qiáng)的啟動子，如玉米醇溶蛋白和谷蛋白基因的啟動子及光可誘導(dǎo)的可在曝光組織中表達(dá)的二磷酸核酮糖羧化酶小亞基的啟動子。其它更常見的基因包括持家基因，如玉米肌動蛋白基因。尤其合適的是馬鈴薯的塊莖蛋白基因啟動子，因為它能在可食用植物組織中高表達(dá)。其它種子特異性啟動子包括以谷蛋白為代表的與多基因家族那些啟動子有關(guān)的啟動子，如GluA1-4、GluB1-4、GluA2-Gtl等。其它可采用其啟動子的種子特異性基因是醇溶谷蛋白基因(RP3、pro117、RP5);白蛋白基因(RA5、14、16和17);和球蛋白基因(26kD和Gbl)。可選擇啟動子來提供所需的表達(dá)，根據(jù)時間和空間條件改變表達(dá)的強(qiáng)度。因此，可根據(jù)已知的植物細(xì)胞表達(dá)技術(shù)和根據(jù)需要表達(dá)的植物組織而選擇的調(diào)控序列來制備所需蛋白質(zhì)的融合蛋白表達(dá)系統(tǒng)。在大多數(shù)情況下，優(yōu)選植物的可食用部分。可采用本領(lǐng)域已知的各種方法，包括直接攝入DNA，有些情況下攝入原生質(zhì)體中，或粒子轟擊或采用顯微注射，或直接培育DNA與發(fā)芽花粉，或采用植物病毒，用構(gòu)建的載體轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞。常用方法是農(nóng)桿菌介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移，需要用含有DNA區(qū)段的載體將其整合入植物基因組DNA中。。因此，此載體中采用了根癌農(nóng)桿菌的腫瘤誘導(dǎo)(Ti)質(zhì)粒，因為這些質(zhì)粒包含能夠整合入植物細(xì)胞基因組中的轉(zhuǎn)化DNA。為了構(gòu)建這類載體，使編碼融合蛋白的DNA側(cè)接T-DNA邊緣序列。載體中還可含有可選擇標(biāo)記。該系統(tǒng)尤其適用于雙子葉植物，但也知道可用于單子葉植物?；蛘撸乖|(zhì)體暴露于強(qiáng)電場進(jìn)行DNA轉(zhuǎn)化，或者用小型微量移液器注射DNA或使其吸附到微粒如硫酸鎂晶體或金顆粒上。需要時，選擇得到的細(xì)胞、培養(yǎng)，然后使它們再生成植物。然后收獲含有融合蛋白的組織，根據(jù)所需蛋白質(zhì)的性質(zhì)進(jìn)行加工。如上所述，融合蛋白可含有接頭以便回收無谷蛋白融合配體的所需蛋白質(zhì)。接頭的切割位點(diǎn)可包括對酶，如腸激酶或其它內(nèi)肽酶處理敏感的那些位點(diǎn)，以及對試劑的特異性切割敏感的位點(diǎn)。可用于本發(fā)明方法的合適植物包括谷類植物，如谷物(corn)、玉米(maize)、稻米、大麥、燕麥等，以及塊莖植物如山藥和馬鈴薯以及種植方便含有可食用部分的任何植物。如果所需蛋白質(zhì)是治療劑或疫苗，或是診斷劑如抗體，則需要回收融合蛋白中的這些蛋白質(zhì)。然后以本領(lǐng)域已知的方法所產(chǎn)生的具體的所需蛋白進(jìn)行應(yīng)用。如果目的是提高植物的營養(yǎng)價值而包含所需蛋白質(zhì)，仍然可回收融合蛋白中的這種蛋白質(zhì)，但不一定要。植物的可食用部分可直接用作食品供人消費(fèi)或作為動物飼料。加工相關(guān)植物組織供牲畜消費(fèi)或作為人類食譜成分的標(biāo)準(zhǔn)方法隨所選擇的具體植物和組織而不同，這是普通技術(shù)人員所熟知的。實(shí)施例概述在以下實(shí)施例中，利用稻米天然種子儲藏蛋白谷蛋白與LRP融合，轉(zhuǎn)基因稻米種子高水平產(chǎn)生了LRP。商品化稻米變種或育種系均可用于轉(zhuǎn)化實(shí)驗。稻米組織培養(yǎng)和農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化的方法先前已有報道(Liu，Q.Q.等，力cta/%/鄉(xiāng)力，'。257/2(1998)24:259-271)。使篩選的具有潮霉素抗性的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化植物再生，將T。轉(zhuǎn)基因植物移種土壤作分子鑒定并使其生長，L種子種在溫室中。用從各L植物收獲的T2種子來鑒定具有純合子轉(zhuǎn)基因的植物。進(jìn)一步繁殖選擇的純合子轉(zhuǎn)基因品系和非轉(zhuǎn)基因野生型植株進(jìn)行田間試驗和動物詞養(yǎng)研究。進(jìn)行RNA凝膠印染以確證轉(zhuǎn)基因稻米谷粒中的融合基因表達(dá)。授粉后12-15天(DAP)用冷苯酚法分離得到發(fā)育稻米種子的總RNA(Liu，Q.Q.等，7^s/^g朋icWes.(2003)12:71-82)。使這些印跡與地高辛配基(DIG)標(biāo)記的LRP或"7cDNA片段雜交，通過DIG核酸標(biāo)記和檢測系統(tǒng)(Roche)顯色。分析轉(zhuǎn)基因植物種子的提取蛋白質(zhì)的營養(yǎng)價值。發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因種子比野生型含有更高水平的賴氨酸。此外，用SDS凝膠電泳和Western印跡評估產(chǎn)生的融合蛋白水平從而鑒定特定的轉(zhuǎn)基因植物系。在溫室中繁殖選擇的純合轉(zhuǎn)基因植物系以獲得足夠多的種子作進(jìn)一步的大規(guī)模田間試驗。進(jìn)行田間試驗評價和評估在相同環(huán)境條件下所選轉(zhuǎn)基因品系與未轉(zhuǎn)化變種相比的形態(tài)學(xué)特性、產(chǎn)量和其它的谷物生理化學(xué)特性。該試驗期間對主要的農(nóng)學(xué)特性進(jìn)行了仔細(xì)研究。種子成熟后，收獲各小塊試驗田的米谷，小部分用來質(zhì)量評估。余下的種子留作進(jìn)一步繁殖和動物飼養(yǎng)試驗。所有田間試驗和轉(zhuǎn)基因稻米的進(jìn)一步商業(yè)推廣均需要中國農(nóng)業(yè)部的許可。這些均按中國政府提出的生物安全指導(dǎo)方針要求下進(jìn)行。通過實(shí)施本發(fā)明而產(chǎn)生的植物種子可用作新穎的營養(yǎng)增強(qiáng)動物飼料或飼料補(bǔ)充劑。出于該目的，按照上述用稻米作為例子的實(shí)施方式所發(fā)育成的轉(zhuǎn)基因植物的成熟種子可以不經(jīng)加工、或除殼和碾凈成為糙米、去殼米和米糠碎片。完整谷物或經(jīng)加工的一種碎片均可直接使用或與其它成分組合來飼養(yǎng)動物。用稻米種子作為動物的唯一或部分膳食源喂養(yǎng)的動物顯示比非轉(zhuǎn)基因?qū)φ战M體重增加更為顯著。證明與非轉(zhuǎn)基因種子相比，轉(zhuǎn)基因植物種子的詞料和蛋白質(zhì)效率顯著更高。本發(fā)明不受以下公開實(shí)施例的限制?？梢詫D(zhuǎn)基因種子的蛋白質(zhì)進(jìn)行修飾，使其富含其它所需的營養(yǎng)性能供動物和人類消費(fèi)，和其它農(nóng)業(yè)應(yīng)用。為了說明提供以下具體實(shí)施方式，不應(yīng)解釋為限制本發(fā)明的范圍。應(yīng)理解對本文所述內(nèi)容進(jìn)行的修飾和變化也屬于本專利的思路和范圍內(nèi)。實(shí)施例1設(shè)計谷蛋白LRP融合蛋白該實(shí)施例中，分別在谷蛋白的酸性和堿性亞基的編碼區(qū)中選擇兩個位點(diǎn)，插入LRPcDNA，研制了三類嵌合融合蛋白基因Gt:LRP(A)、Gt:LRP(B)和Gt:LRP(AB)，分別代表將LRPcDNA插入谷蛋白編碼序列酸性亞基(A)的AxlAy、堿性亞基(B)的AzIAw或兩個亞基(AB)的讀碼框內(nèi)的。這3種融合蛋白中的賴氨酸含量是4.41摩爾%、4.41摩爾％或5.64摩爾％，分別比正常谷蛋白中的含量高84%、84%或135%。然后將這3種融合基因構(gòu)建物引入稻米中，研究它們的表達(dá)和對轉(zhuǎn)基因種子賴氨酸含量的影響。用Gt:LRP(B)構(gòu)建物做了進(jìn)一步的工作。克隆包含稻米谷蛋白Gtl基因整個開放閱讀框的基因組DNA片段(0kita，T.W.等，/..C力柳.(1989)264:12573-12581)，通過分別在5，和3'末端加入BamHI和Sacl限制性酶切位點(diǎn)進(jìn)行擴(kuò)增。圖la顯示稻米Gtl基因是包含全部4個外顯子、3個內(nèi)含子、啟動子(1.8kb)和部分3'UTR區(qū)(136bp)序列的3.8kb片段。限制性酶切位點(diǎn)的縮寫H為ffi威II;B為^3/dn;Nc為lot;H2為AVcI1;Sa為5"acl;E為fcoRI。潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(力P?；蚴怯糜诘久邹D(zhuǎn)化的選擇性抗生素抗性基因。然后將四棱豆的編碼富含賴氨酸蛋白質(zhì)(LRP)的含有起始密碼子ATG但不含終止密碼子的474bpcDNA序列(參見納入本文的U.S.6，184，437)插入到&7基因的堿性亞基編碼區(qū)的Az4Aw處，g卩，距第4個外顯子5'末端下游的69位與70位核苷酸之間。這不會影響稻米基因或四棱豆LRPcDNA的開放閱讀框，從而獲得編碼賴氨酸含量提高的Gt:LRP融合蛋白的融合基因。將該融合基因克隆到二載體PCAMBIA1300多接頭內(nèi)的1.8kb"7啟動子與胭脂堿合酶(NOS)終止子之間(網(wǎng)址cambia.com)。自動化測序驗證所有的克隆和融合序列，將得到的質(zhì)粒pGLF-B轉(zhuǎn)移到根癌農(nóng)桿菌U^ro^cfei^'鵬z^/77e/3cie"s)菌株EHA105中。實(shí)施例2產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因稻米利用高效的農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化系統(tǒng)(Liu，同上，1998)，用實(shí)施例1的pGLF-B構(gòu)建物轉(zhuǎn)化良種稻米栽培品種武香粳9。經(jīng)含有50mg/l潮霉素的培養(yǎng)基選擇后，產(chǎn)生了超過100個原代轉(zhuǎn)基因稻米植物(T。植物)，代表了至少16種獨(dú)立的轉(zhuǎn)基因品系FBI-16。DNA凝膠印跡分析進(jìn)一步證實(shí)轉(zhuǎn)基因已整合入轉(zhuǎn)基因植物的基因組中。找到了轉(zhuǎn)基因的l-3個整合拷貝。圖lb顯示轉(zhuǎn)基因稻米植物的Southern印跡。用f"RI消化所選的原代轉(zhuǎn)化子(泳道1-12)和非轉(zhuǎn)基因植物(泳道W)的基因組總DNA(10mg)，與DIG標(biāo)記的LRPcDNA探針雜交(位于圖la的探針l)。標(biāo)出了DNA分子質(zhì)量標(biāo)記的位置。如圖所示，可用設(shè)計的能與LRP編碼序列雜交的探針來檢測這些提取物。在溫室中，大多數(shù)轉(zhuǎn)基因植物均表現(xiàn)出正常表型，對成熟種子作進(jìn)一步分析和繁殖。利用PCR分析和潮霉素抗性檢驗Ti一代中的轉(zhuǎn)基因分離。大多數(shù)轉(zhuǎn)基因品系的轉(zhuǎn)基因陽性與陰性秧苗的比率約為3:1(數(shù)據(jù)未顯示)，表明在所分析的轉(zhuǎn)基因品系中發(fā)生了簡單的轉(zhuǎn)基因基因座整合。對T,和T2植物進(jìn)行這種分離的分析后，篩選各原代轉(zhuǎn)化子的含有純合轉(zhuǎn)基因的L品系。實(shí)施例3在轉(zhuǎn)基因稻米種子中表達(dá)融合蛋白基因為了評估引入的融合蛋白基因的表達(dá)，首先利用分離自5原代轉(zhuǎn)基因稻米植物發(fā)育種子的總RNA來檢測該融合蛋白基因的轉(zhuǎn)錄情況。如圖2所示，對5種轉(zhuǎn)化子每一種的12-15DAP發(fā)育種子(泳道FB1、2、5、6和8)和非轉(zhuǎn)基因稻米(泳道W)的總RNA(5pg)進(jìn)行電泳，印跡到尼龍膜上，與DIG標(biāo)記的LRPcDNA(分圖a)或Gtl基因(分圖b)雜交。將溴乙錠染色的核糖體RNA置于UV光下來評估相同RNA樣品的凝膠加載情況(分圖c)。該分析顯示當(dāng)與LRPcDNA探針雜交時，在轉(zhuǎn)基因品系中只檢測到一種穩(wěn)態(tài)轉(zhuǎn)錄物，該轉(zhuǎn)錄物的分子量正如預(yù)期那樣。在"野生型"對照稻米栽培品種(分圖a)中未檢測到這類轉(zhuǎn)錄物。當(dāng)將同一凝膠與稻米Gtl探針雜交時，所有選擇的轉(zhuǎn)基因品系(分圖b)顯示有兩種轉(zhuǎn)錄物。一種分子量低，在非轉(zhuǎn)化植物中也存在，代表天然稻米谷蛋白基因轉(zhuǎn)錄物；而另一種分子量較高，僅在轉(zhuǎn)基因品系中檢測到，代表該融合蛋白基因的轉(zhuǎn)錄物。Northern印跡分析顯示該引入的融合蛋白基因轉(zhuǎn)錄正常，還顯示轉(zhuǎn)錄物含量在不同的獨(dú)立轉(zhuǎn)基因品系中存在差異。此種差異與轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)沒有關(guān)系，可能是由于轉(zhuǎn)基因的位置效應(yīng)所致。在所有轉(zhuǎn)基因稻米品系中融合蛋白基因的穩(wěn)態(tài)轉(zhuǎn)錄水平均低于天然谷蛋白轉(zhuǎn)錄物(分圖b)。實(shí)施例4融合蛋白在轉(zhuǎn)基因稻米成熟種子中的高度積累如圖3所示，可經(jīng)SDS-PAGE分離后考馬斯藍(lán)染色和免疫印跡分析來檢測轉(zhuǎn)基因植物種子中融合蛋白的穩(wěn)定表達(dá)和高度積累。將每種植物的成熟種子碾磨和碾碎成粉末，用1.5ml提取緩沖液(125mMTris-Cl、p服.8、4Murea、4%SDS和5%2-巰基乙醇)提取100mg稻米粉的種子總蛋白質(zhì)(Yamagata，H.等，尸ZaM尸力戸'o丄(1982)70:1094-1100)。離心粗提取物，取上清液進(jìn)行SDS-PAGE,然后作Western印跡分析。為了定量測定轉(zhuǎn)基因稻米種子中表達(dá)的融合蛋白，將標(biāo)準(zhǔn)蛋白牛血清白蛋白(BSA)和稻米種子總蛋白質(zhì)提取物同時加到同一凝膠上。電泳后，作蛋白質(zhì)染色，掃描輸入GS690成像密度計掃描(ImagingDensitometerscan,BioRad)儀的計算機(jī)中，用分子分析儀(MolecularAnalyst"軟件進(jìn)行分析。將凝膠中的蛋白質(zhì)電泳轉(zhuǎn)移到硝基纖維素膜上用兔抗LRP血清進(jìn)行探查，進(jìn)行Western印跡分析。釆用與堿性磷酸酶偶聯(lián)的山羊抗兔IgG檢測Gt:LRP融合蛋白。抽提原代轉(zhuǎn)化子FB2(泳道l-4)和野生型對照(泳道W)各種仁的種子總蛋白質(zhì)，在10%SDS-PAGE上進(jìn)行分析。經(jīng)考馬斯藍(lán)染色(塊圖a)和用LRP抗體(分圖B)進(jìn)行Western印跡分析后顯示泳道1、3和4的種仁中存在Gt:LRP。經(jīng)SDS-PAGE分離后，對提取自不同獨(dú)立轉(zhuǎn)基因FB品系含純合轉(zhuǎn)基因(泳道1-12)和野生型對照(泳道W)的種子總蛋白進(jìn)行的考馬斯藍(lán)染色分析見分圖c所示。(表達(dá)的Gt:LRP融合蛋白和稻米主要儲藏蛋白質(zhì)用右邊的箭頭標(biāo)出。)分子量標(biāo)記在分圖b和c之間示出。例如，在轉(zhuǎn)基因品系FB2中，有一條強(qiáng)的額外條帶，大小約為70kDa與融合蛋白的估計大小一致，在3/4的T,成熟種子中清晰可見。用LRP抗體進(jìn)行免疫印跡證實(shí)它就是融合蛋白(分圖a和b)。所分析的12種原代轉(zhuǎn)基因品系中，ll種品系顯示結(jié)果與FB2類似。在所有檢測的L種子中只有一種品系(FB12)未顯示有融合蛋白的表達(dá)。這些結(jié)果證明該融合蛋白可以穩(wěn)定翻譯和在轉(zhuǎn)基因稻米植物的種子中積累，也證實(shí)了轉(zhuǎn)基因可在它們的子代中正常分離。進(jìn)一步從每種原代轉(zhuǎn)基因品系中選出一種T2純合品系以檢測其成熟種子中融合蛋白的表達(dá)水平。如圖3的分圖c所示，融合蛋白的表達(dá)水平在不同的轉(zhuǎn)基因品系中差異顯著，F(xiàn)B1和FB2中最高。通過掃描分析SDS-PAGE中的染色蛋白質(zhì)，估計轉(zhuǎn)基因稻米種子中融合蛋白的含量達(dá)到胚乳干重的0.2-2.7%，根據(jù)種子總蛋白質(zhì)含量占親本稻米變種成熟干燥種子的8-10%計，占FBI品系種子總蛋白質(zhì)的30%。在正常稻米的種子中，谷蛋白先合成為57kDa的前谷蛋白原前體，轉(zhuǎn)移到液泡內(nèi)，在那里被部分蛋白水解加工成酸性和堿性亞基。轉(zhuǎn)基因稻米種子中的融合蛋白表達(dá)只能產(chǎn)生一種穩(wěn)態(tài)蛋白質(zhì)，具有完整融合蛋白的分子量，表明該前融合蛋白原在轉(zhuǎn)基因稻米的胚乳中未經(jīng)加工，Gt:LRP融合蛋白中保存了谷蛋白的酸性與堿性亞基之間的加工位點(diǎn)。除了此融合蛋白的額外條帶外，在幾種轉(zhuǎn)基因稻米品系如FB1、FB2和FB10的種子中也觀察到總蛋白質(zhì)表達(dá)模式的明顯改變，包括其它儲藏蛋白的表達(dá)水平降低和谷蛋白前體的加工效力降低。這些蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄水平降低進(jìn)一步證實(shí)了它們的水平發(fā)生改變(數(shù)據(jù)未顯示)。然而，在積累了高水平融合蛋白的一些轉(zhuǎn)基因品系如FB5和FB8中沒有或幾乎沒有觀察到其它儲藏蛋白模式的改變(圖3，分圖c)。選擇顯示有高水平融合蛋白的3種純合轉(zhuǎn)基因品系FB1、FB2和FB8，通過田間、品質(zhì)和動物飼養(yǎng)試驗作進(jìn)一步評估。實(shí)施例5轉(zhuǎn)基因稻米種子的營養(yǎng)組成為了檢測Gt:LRP融合蛋白對轉(zhuǎn)基因稻米種子營養(yǎng)含量的貢獻(xiàn)，在相同的田間條件下培養(yǎng)純合轉(zhuǎn)基因稻米品系和它們的非轉(zhuǎn)基因親本到成熟。碾磨成熟種子樣品，分析它們的氨基酸和總蛋白質(zhì)水平(表1)。轉(zhuǎn)基因種子中的蛋白質(zhì)總含量與非轉(zhuǎn)基因親本的含量相當(dāng)或略低。如表1所示，例如，轉(zhuǎn)基因品系FB8成熟種子的粗蛋白質(zhì)總水平與非轉(zhuǎn)基因?qū)φ疹愃疲D(zhuǎn)基因品系FBI和FB2的粗蛋白質(zhì)總水平分別低13.5%和7.9%。這些數(shù)據(jù)顯示其它種子蛋白質(zhì)水平降低以補(bǔ)償融合蛋白在轉(zhuǎn)基因種子中的高度積累。為了分析轉(zhuǎn)基因種子的總蛋白質(zhì)和氨基酸組成，采用因子為5.95的Kjeldahl方法測定總氮量計算碾碎的轉(zhuǎn)基因種子的粗蛋白質(zhì)總含量。ll(TC用6NHC1水解24小時后，在貝克曼(Beckman)6300氨基酸分析儀上用離子交換色譜測定氨基酸濃度。表l3種純合轉(zhuǎn)基因品系和非轉(zhuǎn)基因野生型成熟稻米種子的氨基酸組成和蛋白質(zhì)總含量(碾碎種子干重%)氨基酸野生型(WT)FB2FB8FBI<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>*數(shù)值表示3次重復(fù)的平均值加減標(biāo)準(zhǔn)誤差。如表1所示，與總蛋白質(zhì)組成的變化一致，種子氨基酸的分布有顯著差異，尤其是賴氨酸。高水平積累融合蛋白的轉(zhuǎn)基因植物干燥種子賴氨酸含量比野生型顯著提高。這種提高與融合蛋白的表達(dá)水平正相關(guān)，在純合轉(zhuǎn)基因品系FB2中，可以達(dá)到比對照高出45%。轉(zhuǎn)基因種子總蛋白質(zhì)中的賴氨酸含量也比野生型對照高得多，轉(zhuǎn)基因品系中高出10-60%的水平明顯高于以種子干重為基礎(chǔ)的水平。這種提高還伴有少數(shù)其它氨基酸濃度的某些改變，如轉(zhuǎn)基因植物中，天冬氨酸、蘇氨酸和異亮氨酸的含量顯著提高，而酪氨酸和精氨酸的水平有些下降。然而，這些氨基酸的變化范圍比賴氨酸低得多。因此，通過表達(dá)Gt:LRP融合蛋白，其賴氨酸含量提高表示稻米種子蛋白質(zhì)的總體營養(yǎng)質(zhì)量得到非常顯著的提高。實(shí)施例6田間表現(xiàn)和谷物質(zhì)量的評價2003年早期中國農(nóng)業(yè)部批準(zhǔn)了該轉(zhuǎn)基因稻米的田間評價。在中國江蘇揚(yáng)州大學(xué)的實(shí)驗農(nóng)場上培育了4種稻米材料，包括3種純合轉(zhuǎn)基因稻米的T3代，F(xiàn)B1、FB2和FB8以及它們的非轉(zhuǎn)化野生型栽培品種武香粳9進(jìn)行試驗。將稻米種子播種到苗床內(nèi)培育1個月后移植到隔離良好的安全田地上。每種試驗材料安排3份復(fù)制，每份復(fù)制種植4種試驗品系作為隨機(jī)小試驗田。每塊小試驗田的大小為12.4m2，種上400株植物(每穴一棵植物)。接著進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化的正常農(nóng)業(yè)作業(yè)，在實(shí)驗過程中仔細(xì)研究主要農(nóng)業(yè)特性。種子成熟后，分別收割每塊小試驗田的稻米谷粒，根據(jù)中國糧谷質(zhì)量國家標(biāo)準(zhǔn)對它們的質(zhì)量進(jìn)行評估。在不同的轉(zhuǎn)基因品系與未轉(zhuǎn)化對照中或它們之間，均未觀察到整個植株以及圓錐花序的形態(tài)學(xué)特性有統(tǒng)計學(xué)差異(表2)。這些稻米品系中，種仁形狀(如，種仁長度和寬度)和谷物理化質(zhì)量(如，淀粉組成和加工性能)也無明顯差異(數(shù)據(jù)未顯示)。但是，在FB2轉(zhuǎn)基因品系中觀察到對谷物的外觀性狀和重量有負(fù)面影響，其中與未轉(zhuǎn)化對照相比可觀察到不透明胚乳表型。如表2所示，谷物白粉化(chalkiness)程度，即影響稻米外觀品質(zhì)的因素，F(xiàn)B2轉(zhuǎn)基因品系比未轉(zhuǎn)化對照高得多。在野生型對照中，不到一半的谷物胚乳呈現(xiàn)某種程度的白粉化，白粉化胚乳內(nèi)只有少量區(qū)域不透明。在幾乎所有的轉(zhuǎn)基因品系FB2谷物中觀察到白粉化外觀，每個胚乳中的白粉化面積有所擴(kuò)大。在高表達(dá)和積累融合蛋白的天然種子蛋白分布模式發(fā)生改變的幾種其它轉(zhuǎn)基因品系如FB1、FB5和FB10中也可觀察到這種現(xiàn)象。這些數(shù)據(jù)顯示負(fù)面外觀表型與融合蛋白的高表達(dá)和種子蛋白分布模式后續(xù)變化有關(guān)。FB2轉(zhuǎn)基因品系白粉化程度增加導(dǎo)致的谷物重量比未轉(zhuǎn)化對照輕，進(jìn)而引起產(chǎn)量降低。表2田間試驗的轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因稻米品系的農(nóng)業(yè)性狀和谷物白粉化(中國揚(yáng)州，2003)_稻米抽穗日植株高度圓錐花序高度圓錐花序/株谷粒/圓錐花序<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>括號內(nèi)為標(biāo)準(zhǔn)誤差。然而，也有例外，因為我們?nèi)钥设b定和選擇到幾種轉(zhuǎn)基因品系，其谷物的外觀和重量不因它們高表達(dá)融合蛋白而受影響，如表2的FB8品系顯示的那樣。與野生型相比，轉(zhuǎn)基因品系FB8在其天然種子蛋白的表達(dá)分布模式、各谷物組分和產(chǎn)量未顯示有任何顯著差異，然而，其稻谷中高表達(dá)了此融合蛋白而營養(yǎng)價值顯著提高。實(shí)施例7動物飼養(yǎng)試驗在飼養(yǎng)試驗中用轉(zhuǎn)基因稻米喂養(yǎng)大鼠以評估其營養(yǎng)價值的提高。碾磨作為上述田間試驗一式二份的混合物(來自3塊小試驗田)的每種稻米品系谷粒，碾碎，然后用作動物飼養(yǎng)研究的唯一淀粉和蛋白質(zhì)來源。食物成分采用美國營養(yǎng)研究學(xué)會推薦的AIN-93G配方(Reeves,P.G.等，/.(1993)123:1939-1951)，由850g/kg碾碎稻米粉、35g/kg無機(jī)鹽混合物(AIN-93-MX)、10g/kg維生素混合物(AIN-93G-VX)、40g/kg纖維質(zhì)、60g/kg大豆油、3g/kg胱氨酸、2.5g/kg膽堿酒石酸氫鹽和14mg/kg叔丁基氫醌組成。用純化玉米淀粉代替稻米粉和胱氨酸制備無蛋白質(zhì)食物，進(jìn)行氮平衡估計。將體重70-80g的四周齡雄性斯普拉-道來(Sprague-Dawley)大鼠圈養(yǎng)在不銹鋼網(wǎng)底代謝籠內(nèi)，分別收集糞便和尿液。每種食物隨機(jī)選擇6只大鼠作為一組，在整個30天實(shí)驗過程中，每只動物自由獲取水和食物。仔細(xì)記錄每只大鼠食物攝取量和體重增加量。如表3所示，與非轉(zhuǎn)基因食物相比，大鼠消耗了更多的轉(zhuǎn)基因種子食物。每只大鼠每天攝入12克以上的轉(zhuǎn)基因食物，相比只攝入9.5克非轉(zhuǎn)基因食物。觀察到轉(zhuǎn)基因食物的純蛋白質(zhì)消化率、生物值和蛋白質(zhì)凈利用率均有統(tǒng)計學(xué)顯著提高。接收轉(zhuǎn)基因稻米種子作為其唯一氮源的大鼠比非轉(zhuǎn)基因?qū)φ战M增重更為顯著。表3通過飼養(yǎng)大鼠評估轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因稻米的營養(yǎng)價值<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>括號中為標(biāo)準(zhǔn)誤差。權(quán)利要求1.一種融合蛋白，包含至少一種谷蛋白亞基的氨基酸序列和所需蛋白質(zhì)的氨基酸序列。2.如權(quán)利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所需蛋白質(zhì)富含9種必需氨基酸組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、蘇氨酸、色氨酸和/或纈氨酸中的一種或多種。3.如權(quán)利要求2所述的融合蛋白，其特征在于，所需蛋白質(zhì)富含賴氨酸、甲硫氨酸、半胱氨酸、蘇氨酸和/或色氨酸。4.如權(quán)利要求2所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白由植物產(chǎn)生，所需蛋白質(zhì)中的組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、蘇氨酸、色氨酸和/或纈氨酸含量高于所述植物蛋白質(zhì)中的相應(yīng)氨基酸含量。5.如權(quán)利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所需蛋白質(zhì)由植物產(chǎn)生，其賴氨酸、甲硫氨酸、蘇氨酸、色氨酸和/或半胱氨酸含量提高。6.如權(quán)利要求4所述的融合蛋白，其特征在于，所需蛋白質(zhì)的賴氨酸含量高于所述植物蛋白質(zhì)的賴氨酸含量。7.如權(quán)利要求5所述的融合蛋白，其特征在于，所需蛋白質(zhì)是四棱豆(LRP)來源的富含賴氨酸的蛋白質(zhì)。8.如權(quán)利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，在谷蛋白亞基和所需蛋白質(zhì)間還包含具有切割位點(diǎn)的接頭序列。9.一種核酸，包含編碼權(quán)利要求1所述融合蛋白的核苷酸序列。10.—種可在植物細(xì)胞中操作的表達(dá)系統(tǒng)，包含權(quán)利要求8所述的核苷酸序列，操作性地相連于能影響其在植物細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的控制序列。11.一種包含權(quán)利要求9所述表達(dá)系統(tǒng)的載體。12.如權(quán)利要求10所述的載體，其特征在于，其包含在農(nóng)桿菌中。13.經(jīng)修飾包含權(quán)利要求8所述表達(dá)系統(tǒng)的植物細(xì)胞。14.如權(quán)利要求12所述的植物細(xì)胞，其特征在于，其是谷類植物細(xì)胞。15.—種產(chǎn)生包含谷蛋白的至少一亞基和所需蛋白質(zhì)的氨基酸序列的融合蛋白的方法，所述方法包括在能產(chǎn)生所述融合蛋白的條件下培養(yǎng)權(quán)利要求12所述的細(xì)胞。16.包含權(quán)利要求12所述的細(xì)胞的植物或植物部分。17.如權(quán)利要求15所述的植物部分，其特征在于，其是種子。18.—種包含權(quán)利要求15所述植物或植物部分的食物或食品。19.如權(quán)利要求17所述的食品，其特征在于，其用于飼養(yǎng)牲畜。20.—種包含權(quán)利要求1所述融合蛋白的食物或食品。全文摘要包含谷蛋白的至少一種亞基和所需蛋白質(zhì)的融合蛋白能提高植物中可利用形式的所需蛋白質(zhì)的產(chǎn)生。這類融合蛋白可以通過提高可利用形式的特殊必需氨基酸的產(chǎn)量而改進(jìn)植物，如稻米的營養(yǎng)價值。文檔編號A01H1/00GK101340814SQ200680041156公開日2009年1月7日申請日期2006年10月10日優(yōu)先權(quán)日2005年10月11日發(fā)明者S·S·M·孫,劉巧泉申請人:香港中文大學(xué)