專利名稱：：紅鰭東方鲀的育種方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種水產(chǎn)養(yǎng)殖魚類——紅鰭東方飩(7i^/^g"WmZ^m)的育種方法，尤其涉及利用微衛(wèi)星DNA多態(tài)性標(biāo)記進(jìn)行遺傳選育的方法。
背景技術(shù)：
：紅鰭東方飩(T^:^/gMiWi^es)分布于日本北海道以南和中國臺灣省以北之間，是一種味道極為鮮美的海洋性魚類。近年因資源衰竭而導(dǎo)致捕獲量減少，養(yǎng)殖和放流逐漸成為維持資源豐度的重要手段。近幾年在我國北方地區(qū)包括遼寧大連、山東煙臺、河北秦皇島等地區(qū)開始了規(guī)?；B(yǎng)殖，大部分產(chǎn)品都出口日本，深受國際市場尤其是日本市場的歡迎，是我國出口創(chuàng)匯的高檔水產(chǎn)品之一。日本有關(guān)紅鰭東方飩養(yǎng)殖技術(shù)的研究開始于1957年。1963年，山口縣開始設(shè)立種苗生產(chǎn)中心和養(yǎng)殖場，并于1965年開始放流人工苗種。此后，各地紛紛設(shè)立生產(chǎn)機(jī)構(gòu)，養(yǎng)殖量和流放量激增。到1994年，全國放流種苗達(dá)234.4萬尾，養(yǎng)殖用苗達(dá)1314萬尾。我國2002年紅鰭東方飩年成品魚產(chǎn)量約4000噸，養(yǎng)殖產(chǎn)量已接近河豚消費大國日本(紅鰭東方飩集約化網(wǎng)箱養(yǎng)殖技術(shù)，《中國水產(chǎn)》，2003，(11):6062)。目前紅鰭東方飩的出口量很大，產(chǎn)值較高，養(yǎng)殖業(yè)者較為青睞。目前，我國養(yǎng)殖魚類的育種技術(shù)主要采用的是雜交育種和群體選育兩種技術(shù)方案。紅鰭東方飩的育種在日本做了一些研究工作(FisheriesandStockManagementofOcellatePufferTakifugumbripesinJapan.Tokyo:Koseisa,1997,16—27)，我國養(yǎng)殖使用的魚苗大部分是從日本商業(yè)購進(jìn)的。國內(nèi)雖然已有紅鰭東方飩國家級原良種場，但直至目前為止，還沒有育出品種的報道和申請良種的信息的公布，即使是常規(guī)育種方法的育成品種也未見報道。采用上述這些傳統(tǒng)的育種方法，由于育種前不清楚選育對象的遺傳組成，很容易產(chǎn)生近親交配，并引起目前常見的經(jīng)濟(jì)性狀和生產(chǎn)性能下降的遺傳衰退現(xiàn)象。近年來，分子標(biāo)記輔助育種技術(shù)在水產(chǎn)動物的遺傳選育中得到越來越多的應(yīng)用，然而多數(shù)僅僅是利用分子標(biāo)記來分析和描述育成品種的遺傳特征，還未見利用分子標(biāo)記檢測親本的遺傳組成來指導(dǎo)品種培育的完整的技術(shù)方案。郝君等對紅鰭東方飩的微衛(wèi)星DNA多態(tài)性進(jìn)行初步分析(紅鰭東方飩微衛(wèi)星DNA多態(tài)性初步分析，(上海水產(chǎn)大學(xué)學(xué)報，2006.1，第15巻第1期21—24)，但并未具體指出利用該微衛(wèi)星多態(tài)性標(biāo)記的分析結(jié)果指導(dǎo)親本1對1配組繁殖的具體技術(shù)方案。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種利用微衛(wèi)星多態(tài)性分析結(jié)果來指導(dǎo)紅鰭東方飩遺傳育種的方案。本發(fā)明所述的紅鰭東方飩的育種方法包括如下步驟①根據(jù)表型性狀選擇用于繁殖的親本紅鰭東方飩對研究對象的每個親本進(jìn)行表型性狀測定，對感興趣的主要數(shù)據(jù)，比如體長、體重等進(jìn)行統(tǒng)計分析，根據(jù)大于或小于平均值+2倍標(biāo)準(zhǔn)差的原則舍去偏離值較大的個體；除了可數(shù)可量數(shù)據(jù)外，外觀與體型等不可量化的表型也是取舍的重要指標(biāo)，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可進(jìn)行相關(guān)取舍。②利用微衛(wèi)星標(biāo)記對親本DNA進(jìn)行檢測，統(tǒng)計分析并計算出個體之間的相似性和遺傳距離與其它分子標(biāo)記相比，微衛(wèi)星DNA在多態(tài)性、群體平均雜合度以及群體間遺傳距離等方面具有較高的微衛(wèi)星位點值，因此，微衛(wèi)星作遺傳標(biāo)記尤其適于檢測個體間的差異。本發(fā)明也正是利用微衛(wèi)星標(biāo)記在檢測個體間差異上的這種優(yōu)勢進(jìn)行紅鰭東方飩種質(zhì)的選育。對步驟①所選定的親本紅鰭東方飩進(jìn)行基因型分析，本發(fā)明所使用的30對微衛(wèi)星標(biāo)記的DNA序列及其適用退火溫度如表1:表1序號退火溫度rc)微衛(wèi)星標(biāo)記的DNA序列F005251ATTTGCTGCGGAGCTGTTTAAGGCGGTGAGTGGTTGF016452CTCTGTATGTTTACTTGGGTCTACAACTGGTGGCTGCTCTF007555GGTCGTCTGGCACCTATCTGACTAACAACTCCCATCCTF006655CCCCTCACATGAAGAAGCGGACCAGCAGAATGAAGTAF002655CCTCCCTCCGTCTAACCTTGCTGTTGTCTGCTGGF002855TCGCTTCACTTGACCTTTCCTCTACTGGAGCCCTCATF018055CTTGCTGGGACATTGCTTCTGGCTCTGAGGTATCTGATTGF014655丁GAAGACAACAGCAGGATTGATTTGACCTTAGTGCCF014855CCAGGACTCTAAGAGCACAAGTGGAGGAGGCAGTAGGTAAAF015255ACAAACAGCCTTCGTCAGAAAAGAAACCAGGAGAACAGGF015755TGGTCCAGAAGAGCAAGACAAAGATGTCCGCTATGTF015955ACCCTCTTTGGTGTCTATCCTTGACTGCTGCTTTATCTF016055TGTCTGGGATGTTTCTGGGTGTTAGCGAGGGTTTGGF016255GCATCTGGTCCTCATCTACTCAGTCCAATTTGCCCTAF012155TAGCCGAAAGGAAGAAGTGTCCGAAGACATGAACATTAF013155ACACTTCTACGGTCTCCCTGTGTTGCCTTCGGTTTCATF009255TGTCCTGATGGGAAGATGGCCAACAGAAATAGGGAGTF003855GCGGGCTTACAGAGGAGACAACAACAGATGCGACCA(續(xù)表l)<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>分析獲得的電泳圖可以用標(biāo)記數(shù)字化軟件處理成下一步軟件接受的數(shù)字(也可人工閱讀成數(shù)字)代表的基因型數(shù)據(jù)；所得基因型數(shù)據(jù)經(jīng)親緣關(guān)系分析軟件獲得每個個體的遺傳結(jié)構(gòu)參數(shù)。③根據(jù)個體間的遺傳距離指導(dǎo)親本l對l的配組繁殖，配組原則是遺傳距離大的配在一組更具體地，配組原則是雌雄間距離大于0.15的從大到小配組,即先選取遺傳距離大的配在一組，至0.15止，低于0.15的作為無法配組的個體或淘汰或與其他群體的親本配組。④子代繁殖及培育配組的親本經(jīng)繁殖獲得子代視網(wǎng)箱大小將所有配組的子代放在同一網(wǎng)箱或分網(wǎng)箱按正常河豚魚養(yǎng)殖技術(shù)進(jìn)行養(yǎng)殖。子代紅鰭東方飩養(yǎng)殖至能夠測定表型的發(fā)育階段，大約1012個月；測定表型，根據(jù)參加單位在基因型分析上的能力，選取目標(biāo)性狀優(yōu)良的部分個體或全部個體進(jìn)行基因型分析，利用分析結(jié)果做下一代親本選擇。即以所養(yǎng)殖的子代為親魚重復(fù)步驟①④的操作，此循環(huán)可以重復(fù)任意多次，也可以在某一代停止，獲得性狀優(yōu)良的紅鰭東方飩品系。采用本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行紅鰭東方飩的遺傳選育，可以有效地避免由于育種前不清楚選育對象的遺傳組成而導(dǎo)致的近親交配，從而避免由此引起的經(jīng)濟(jì)性狀和生產(chǎn)性能下降的遺傳衰退現(xiàn)象。利用微衛(wèi)星標(biāo)記對以個體為單位的親代河豚遺傳性狀的分析，使配對得意以在單獨的個體間進(jìn)行，即l對l配對育種，使親魚資源利用率最大化，并且最有效地實現(xiàn)配種遺傳距離最大化，兼顧了優(yōu)選育種與資源利用。本發(fā)明附圖2幅圖l是實施例2的魚苗體長一養(yǎng)殖時間圖；圖2是實施例2的魚苗體重一養(yǎng)殖時間圖；其中-_，第一組；+，第二組；-▲-，第三組。具體實施方式以下為本發(fā)明的具體實施例。所有實施例中所涉及到的儀器、試劑均購自商品。以下列出一些主要設(shè)備及試劑來源1.儀器(1)紫外分光光度計UV/VisOptizen2120(MECASYS公司)(2)擴(kuò)增反應(yīng)所用DNA擴(kuò)增儀為美國Thermo公司的Px2ThermalCycler型PCR擴(kuò)增儀和AB公司的PE9800PCR擴(kuò)增儀(3)離心機(jī)為HERMLE的Z383K型冷凍離心機(jī)(4)滅菌鍋為TOMY公司的ss-325型滅菌鍋(5)制冰機(jī)為GRANT公司的FM70型制冰機(jī)(6)電泳儀為PharmcciaBiotech公司的PowerPacTMHVPowerSupply型電泳儀。(7)電泳槽DYY-33A(北京六一儀器廠)(8)凝膠成像儀為Kodak公司的IS440型凝膠成像系統(tǒng)(9)80。C冰箱為NUAIRE公司的6382E型低溫冰箱(10)數(shù)顯不銹鋼電熱培養(yǎng)箱LRH—250(上海上海一恒科學(xué)儀器有限公司)(11)實驗用水是經(jīng)Sartoriousarium611型凈水儀處理的去離子水(12)微量移液器(RAIN公司)2.主要試劑TaqDNA聚合酶，Buffer,Mgcl2+，dNTPs，丙烯酰胺，甲叉雙丙烯酰胺(均購自美國BBI生物公司，原裝)；瓊脂糖購自BIOWEST公司，葡聚糖藍(lán)購自SIGMA公司；微衛(wèi)星引物由上海生工生物工程服務(wù)有限公司合成；其他普通化學(xué)試劑和分析純均購自上海生工生物工程有限公司和華美生物工程公司。實施例l(1)紅鰭東方飩的選擇試驗用紅鰭東方飩采自大連天正實業(yè)有限公司2005年4月取5尾紅鰭東方飩親本個體，3個子代家系分別取30尾個體。2006年4月取90尾3個子代家系混養(yǎng)后的個體。并測量其體長及體重。其中紅鰭東方飩的親本分別采自河北南鹽縣(2號)，河北蕭海東(4號)，遼寧莊河(l號，3號，5號)，3號與5號配組，子代為家系一，3號與4號配組，子代為家系二，l號與2號配組，子代為家系三。(2)基因組DNA的提取(1)DNA提取液的成分EDTA(pH8.0)10mmol/L十二烷基肌氨酸鈉0.5%ProteinaseK200|ag/mL(2)樣本DNA的提取a.采新鮮的紅鰭東方飩鰭，每0.1g加200pL裂解液5(TC溫育l1.5h;b.加入等體積飽和苯酚、氯仿、異戊醇混合液(體積比25:24:1)200叱抽提，7000r/min，離心15min，取上清液，再重復(fù)抽提2次；c.在上清液中加入2倍體積的無水乙醇沉淀，一20。C靜置；d.12500r/min，離心20min，用70%乙醇洗沉淀2次，晾干，加入50叱的O.lxTE(pH8.0)溶解，4。C保存?zhèn)溆?，?X的瓊酯糖凝膠電泳檢測DNA提取情況。其中，部分個體DNA提取情況如圖1所示。(3)PCR引物的設(shè)計及篩選紅鰭東方飩鰭基因組序列來源于UKMRCHGMP-RCTheFuguGenomicsProject(http:〃fugu.hgmp.mrc.ac.uk)，運用TandemRepeatsFinder軟1牛查找出微衛(wèi)星序列，在Primer5軟件上設(shè)計引物。共合成300對引物，篩選出67對引物進(jìn)行親本的遺傳結(jié)構(gòu)的分析。引物的序列及退火溫度如表2所示表2引物號上游引物下游引物退火溫度廣cF0002AAACACCAAAGAAAGCCACTATTACCGCACTCCCTACC56F0004GCTGACAGACAAGAGGGACCCTGAAGGGAGGGAATAT56F0022F0026CACCACCACCTACAAGCACTAAAGCAGGCACCAGAA55F0031F0041GGTACGACTGGTGGATGAATTGTGAAAGGAGGCTGA55F0042GGGCACCTGCTTTGAGTTCACCGTGGAAGGGATTTG55F0051F0052F0056F0060AATGCTATGGATGATCGGTGAATTGCTGCCGCTCCTCTGT55F0064F0065F0066CCCCTCACATGAAGAAGCGGACCAGCAGAATGAAGTA58F0070TGTTGAGGACAGTGGAGGAGGCTGGCATCTTTGGGTCT55F0074CACAGGAAACGACCACCACGAACCAGCAGCGTAATG58F幅OGCAGCTCTGCCGTGGTTTAAGGTCGTTCTGATGGATTG55(續(xù)表2)<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>(續(xù)表2)引物號上游引物下游引物退火溫度/'cF0184CACTGAAAGGCAGCCACATGCTCCAACACGCAACAT55F0186F0188GCAGGCAGGTGCTGGAACAAGGGCGCTGGCTAACGAA55F0191F0201CCCTGGTCGATAAATGAAGCTACGAAACCATCCGCCTC57F0220F0225F0226ATCTTCAGTTCTCCTTGGCTCACCAAATCCACCACCTCCAC55F0228TGGTTGGTCGGTTGATGCCGTGAAAGACGGAAGAAGC55F0233GTGAGCAGCAATGGGACTCTTGGGTCAGGCGTAGAG55F0254F0257F0268TGGAGGGACGTGCCTGATCCTGACCCGACAACCACA55F0269F0287CCCACAAACTCCGATGACAAAGAGGAGGATGCAAGG57F0288F0289(4)PCR反應(yīng)條件(請補充)優(yōu)化的PCR反應(yīng)條件:總體積為25uL反應(yīng)體系,內(nèi)含約50ng基因組DNA，lng/iiL引物，1UTaqDNA聚合酶，18uLPCR緩沖液。在PE9700型PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行，94r預(yù)變性35min，38個擴(kuò)增循環(huán)，每個循環(huán)包括94，°C30s，56°C30s，72°C30s，最后72'C延伸7min。擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行(2.0%瓊脂糖凝膠)電泳。用GDS8000型凝膠成像系統(tǒng)(UVP公司)觀察拍照、記錄分析。(5)數(shù)據(jù)統(tǒng)計方法按下列公式計算微衛(wèi)星基因座的等位基因頻率(allelicfrequency,P)、多態(tài)^f言息含量(polymorphisminformationcontent,PIC)禾口基因雜合度(heterozygosity,H)。雜合度計算公式為多態(tài)性信息含量的計算公式為<formula>formulaseeoriginaldocumentpage13</formula>其中m為該位點的等位基因數(shù)；尸/、"分別為第/和第y個等位基因在群體中的頻率，<formula>formulaseeoriginaldocumentpage13</formula>(6)親魚配對根據(jù)5的計算結(jié)果指導(dǎo)親魚1對1配對繁殖配組原則是雌雄間距離大于0.15的從大到小配組,即先選取遺傳距離大的配在一組，至0.15止，低于0J5的作為無法配組的個體或淘汰或與其他群體的親本配組。(7)結(jié)果a.等位基因數(shù)和遺傳雜合度計算出每尾河豚的等位基因數(shù)，有效等位基因數(shù)，觀測雜合度，期望雜合度。有效等位基因數(shù)在1.31251.4583之間，其中個體1的有效等位基因數(shù)最多(1.4583)，而3號個體的有效等位基因數(shù)最少(1.3125)。期望雜合度與有效等位基因數(shù)成正比，1號個體期望雜合度最高(0.2292)，其次為5號個體(0.2188)，4號個體(0.1875)，2號個體(0.1667)，而3號個體的期望雜合度也最低，只有0.1562。由結(jié)果可以得出，1號個體的有效等位基因數(shù)和期望雜合度都最高，說明一號個體具有比較廣泛的遺傳基礎(chǔ)。b.養(yǎng)殖結(jié)果由已區(qū)分出家系的個體及這些個體的表型性狀能夠得出，家系一的平均體重為518.15g，平均體長為27.55cm。家系二的平均體重為459g，平均體長為26.35cm，家系三的平均體重為382.27g，平均體長為24.5cm。很明顯能夠得出家系一在體長及體重方面都優(yōu)于另外兩個家系，這也正好印證了前一章所提到的親本間的遺傳距離越遠(yuǎn)，子代的生長優(yōu)勢越明顯。因為家系的父母本間的遺傳距離最遠(yuǎn)，其子代的生長性狀也最好。(8)結(jié)論三個家系的期望雜合度是1號>2號〉3號三個家系的平均體重是1號>2號>3號實施例2本實施例的具體實驗步驟與實施例1相同，根據(jù)微衛(wèi)星DNA標(biāo)記檢測結(jié)果及對個體之間的相似性和遺傳距離分析，魚苗1對1配對并分成3組，這3組魚苗的期望雜合度是1組>2組>3組，飼養(yǎng)前6個月魚苗生長狀態(tài)如附圖1和2所示。從附圖結(jié)果可見平均體長和平均體重均是1組〉2組>3組，與魚苗期望雜合度的排序一致。權(quán)利要求1.一種紅鰭東方鲀的育種方法，其特征在于該方法包括如下步驟①根據(jù)表型性狀選擇用于繁殖的親本紅鰭東方鲀；②利用微衛(wèi)星標(biāo)記對親本DNA進(jìn)行檢測，統(tǒng)計分析并計算出個體之間的相似性和遺傳距離；③根據(jù)個體間的遺傳距離指導(dǎo)親本1對1的配組繁殖，配組原則是遺傳距離大的配在一組；④子代繁殖及培育。2.根據(jù)權(quán)利要求l所述的紅鰭東方飩的育種方法，其特征在于該方法步驟②具體包括對選定的每個親本紅鰭東方飩用30個以上的共顯性標(biāo)記進(jìn)行基因型分析，對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析并計算出個體間的相似性和遺傳距離。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的紅鰭東方飩的育種方法，其特征在于該方法步驟③配組原則是雌雄間遺傳距離大于0.15的從大到小配組，即先選取遺傳距離大的配在一組，至0.15止，低于0.15的作為無法配組的個體或淘汰。4.根據(jù)權(quán)利要求l所述的紅鰭東方飩的育種方法，其特征在于該方法包括如下步驟①根據(jù)表型性狀選擇用于繁殖的親本紅鰭東方飩；②對選定的每個親本紅鰭東方飩用30個以上的微衛(wèi)星共顯性標(biāo)記進(jìn)行基因型分析，對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析并計算出個體間的相似性和遺傳距離；③根據(jù)個體間的遺傳距離指導(dǎo)親本l對l的配組繁殖，配組原則是雌雄間遺傳距離大于0.15的從大到小配組，即先選取遺傳距離大的配在一組，至0.15止，低于0.15的作為無法配組的個體或淘汰；子代繁殖及培育。5.根據(jù)權(quán)利要求l、2或4所述的紅鰭東方飩的育種方法，其特征在于該方法的步驟④的子代養(yǎng)殖至1012個月時，以所養(yǎng)殖的子代為親魚重復(fù)步驟①④的操作，此循環(huán)可以重復(fù)任意多次，也可以在某一代停止，獲得可以性狀優(yōu)良的紅鰭東方飩品系。6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的紅鰭東方飩的育種方法，其特征在于該方法的步驟④的子代養(yǎng)殖至1012個月時，以所養(yǎng)殖的子代為親魚重復(fù)步驟①④的操作，此循環(huán)可以重復(fù)任意多次，也可以在某一代停止，獲得可以性狀優(yōu)良的紅鰭東方飩品系。全文摘要本發(fā)明提供一種利用微衛(wèi)星多態(tài)性分析結(jié)果來指導(dǎo)紅鰭東方鲀遺傳育種的方案。該方法包括如下步驟①根據(jù)表型性狀選擇用于繁殖的親本紅鰭東方鲀；②利用微衛(wèi)星標(biāo)記對親本DNA進(jìn)行檢測，統(tǒng)計分析并計算出個體之間的相似性和遺傳距離；③根據(jù)個體間的遺傳距離指導(dǎo)親本1對1的配組繁殖，配組原則是遺傳距離大的配在一組；④子代繁殖及培育。采用本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行紅鰭東方鲀的遺傳選育，可以有效地避免由于育種前不清楚選育對象的遺傳組成而導(dǎo)致的近親交配，避免由此引起的經(jīng)濟(jì)性狀和生產(chǎn)性能下降的遺傳衰退現(xiàn)象。配對繁殖在單獨的個體間進(jìn)行，使親魚資源利用率最大化，并且最有效地實現(xiàn)配種遺傳距離最大化，兼顧了優(yōu)選育種與資源利用。文檔編號A01K61/00GK101133722SQ20071001231公開日2008年3月5日申請日期2007年7月27日優(yōu)先權(quán)日2007年7月27日發(fā)明者劉進(jìn)京,孫效文,孟雪松,濤張,旭袁申請人:大連天正實業(yè)有限公司