專利名稱：一種植物乳桿菌發(fā)酵制備富含共軛亞油酸豆粕飼料的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬微生物和動物營養(yǎng)與飼料技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種高產(chǎn)共軛亞油酸(CLA，Conjugated linoleic acid)的新菌株及利用其發(fā)酵生產(chǎn)富含CLA的功能性豆粕飼料。
背景技術(shù)：
利用乳酸菌發(fā)酵豆粕國內(nèi)已有研究，但利用產(chǎn)CLA的乳酸菌發(fā)酵豆粕尚未報道。CLA具有抗癌、促進(jìn)生長、抑制脂肪累積、增強(qiáng)機(jī)體免疫能力等功能，能提高豬、禽生長速度和瘦肉率，是當(dāng)前藥物、保健食品和動物營養(yǎng)等學(xué)科的研究熱點(diǎn)。牛奶和牛肉、羊肉是人類最主要的CLA天然來源。人們通過二種日糧營養(yǎng)調(diào)控途徑來提高反芻動物奶、肉中CLA含量一是日糧添加油脂或改變?nèi)占Z脂肪來源，以增加瘤胃中CLA代謝底物亞油酸的含量，進(jìn)而提高畜產(chǎn)品中CLA含量；二是直接添加CLA或瘤胃保護(hù)CLA(即過瘤胃CLA)。但由于CLA價格昂貴，飼料中添加成本過高，生產(chǎn)實(shí)踐中應(yīng)用不多。因此，動物營養(yǎng)與飼料學(xué)家正在尋求其它提高畜產(chǎn)品中CLA含量的適用、低成本方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是旨在克服上述直接添加共軛亞油酸和改變?nèi)占Z脂質(zhì)結(jié)構(gòu)的不足，提供一種能夠高產(chǎn)共軛亞油酸的植物乳桿菌新菌株及利用其發(fā)酵制備富含共軛亞油酸豆粕飼料的方法，以提高反芻動物日糧中共軛亞油酸的含量。
本發(fā)明的植物乳桿菌新菌株系從自玉米青貯中分離、篩選、純化和培育出來，命名為植物乳桿菌ANCLA01(Lactobacillus plantarum ANCLA01)。
該植物乳桿菌發(fā)酵制備富含共軛亞油酸豆粕飼料的方法是先將該高產(chǎn)共軛亞油酸的菌株ANCLA01批量擴(kuò)培后，再將豆粕去雜粉碎后，在豆粕粉中添加麩皮、碳水化合物、酵母、磷鹽、食鹽、鎂鹽，植物油脂和水，混合攪拌均勻消毒滅菌后，將植物乳桿菌ANCLA01或植物乳桿菌ANCLA01菌株培養(yǎng)液接種到豆粕中，控溫發(fā)酵。


圖1為本發(fā)明的植物乳桿菌ANCLA01在顯微鏡下拍攝的照片；圖2為本發(fā)明的植物乳桿菌ANCLA01菌株P(guān)CR擴(kuò)增條帶照片；圖3為不同菌株生物轉(zhuǎn)化共軛亞油酸的能力；圖4為植物乳桿菌ANCLA01對發(fā)酵底物中碳水化合物的利用。
本發(fā)明的植物乳桿菌ANCLA01(Lactobacillus plantarum ANCLA01)已按規(guī)定進(jìn)行了保藏保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，簡稱為CGMCC；地址中國.北京.中關(guān)村，中國科學(xué)院微生物研究所；保藏日期2007年1月8日；保藏登記入冊的編號CGMCCNo.1906。
具體實(shí)施例方式材料與方法1.1材料玉米青貯采集于合肥市白帝乳業(yè)發(fā)展公司；培養(yǎng)基pH6.5-6.8，MRS肉湯培養(yǎng)基，PY培養(yǎng)基，MRS固體培養(yǎng)基、MRS半固體培養(yǎng)基、MRS液體培養(yǎng)基和補(bǔ)添0.1g(100ml)-1LA的MRS液體培養(yǎng)基。培養(yǎng)基用前均于121℃高壓蒸汽下滅菌20min。
1.2主要試劑LA和CLA純度≥99％，購自Sigma公司；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、PCR試劑盒和膠回收試劑盒，購自寶生物工程(大連)有限公司；其它試劑均為分析純。
1.3菌種篩選1.3.1初篩采集青貯后立即選取感官指標(biāo)較好的青貯枝葉浸入37℃雙蒸水中，十分鐘后去除枝葉，吸取新鮮均勻浸泡液10mL加到500mL裝有300mL MRS肉湯培養(yǎng)基的三角燒瓶中。37℃靜止增菌96h后，稀釋涂布平板法傾倒MRS瓊脂平板，四區(qū)劃線后于37℃厭氧培養(yǎng)48h，挑取單菌落穿刺接種于MRS半固體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)后防于冰箱保存。
1.3.2復(fù)篩將初篩保存菌種于37℃活化后，按5％的接種量接種于裝有10mL MRS液體培養(yǎng)基的帶螺帽試管(d18mm×160mm)中，其中MRS液體培養(yǎng)基中亞油酸含量為0.1g(100mL)-1。N2驅(qū)除空氣，厭氧發(fā)酵24h后測定CLA，以篩選出產(chǎn)CLA細(xì)菌。
1.4CLA測定以正己烷為溶劑，將CLA標(biāo)樣配成不同濃度的溶液，以正乙烷為參比，在233nm處測定其吸收值，以CLA濃度(ug/mL)為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。發(fā)酵液中CLA的提取按Jiang等(1998)方法操作。之后，將所獲得脂肪酸提取物用5mL正己烷溶解，以不接種的發(fā)酵液提取物為參比，用紫外分光光度計再00-350nm范圍內(nèi)掃描，讀取特征吸收峰233nm處的吸收值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算發(fā)酵液中CLA的含量(Pariza等，1999)。參比培養(yǎng)基加入與樣品同量的亞油酸，不接菌種，其它步驟同樣品。
1.5菌種鑒定1.5.1菌落及形態(tài)觀察將獲得的高產(chǎn)菌株活化后，通過四區(qū)化線法接種于MRS平板培養(yǎng)基上，厭氧培養(yǎng)24h后觀察菌落特征。革蘭氏染色后于光學(xué)顯微鏡下觀察菌株形態(tài)特征、長度范圍和寬度范圍等。
1.5.2生理生化鑒定參照《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》第九版(1994)，對獲得的共軛亞油酸高產(chǎn)菌株進(jìn)行接觸酶反應(yīng)、明膠液化試驗(yàn)、硫化氫反應(yīng)、吲哚反應(yīng)、溫度生長等實(shí)驗(yàn)進(jìn)行初步鑒定。從葡萄糖產(chǎn)酸、產(chǎn)氣實(shí)驗(yàn)及甘露糖、棉子糖等生理和生化方面進(jìn)行分類鑒定，實(shí)驗(yàn)參照《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》第九版(1994)乳酸菌分類鑒定及實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行具體操作。
1.5.3分子生物學(xué)鑒定模板的制備、菌株16SrDNA的PCR擴(kuò)增及瓊脂糖凝膠電泳后目的片段的回收與純化均按試劑盒說明步驟操作。然后將回收到的目的片段送至由寶生物工程(大連)有限公司測序。將測序結(jié)果運(yùn)用BLAST軟件與GenebanK中已登陸細(xì)菌的16SrRNA序列比較，找到與其相似性最高的登陸菌株序列號并調(diào)出其登陸粗劣，進(jìn)行差異比較。
2.結(jié)果2.1菌種的篩選去除空氣條件下發(fā)酵培養(yǎng)時，共分離出17株生成CLA能力較強(qiáng)的菌株。由表1結(jié)果可知，分離出的菌株CLA生成量在4.316-33.442ug/mL(濕基)之間，其中12號菌株CLA產(chǎn)量最高為33.442ug/mL。該菌株被命名為ANCLA01。
2.2菌種鑒定
2.2.1菌種的菌落及形態(tài)觀察ANCLA01號菌株MRS固體培養(yǎng)后觀察發(fā)現(xiàn)，菌落凸起、圓形、表面光滑并呈白色；如圖1所示，革蘭氏染色后油鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，ANCLA01號菌株呈革蘭氏陽性，菌體短直、兩端鈍圓，無芽孢，菌體寬在0.9～1.1um范圍，長在2～7um范圍內(nèi)，菌體間成單體、隊(duì)列或短鏈狀。因此，ANCLA01號菌落形態(tài)與《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》中所描述的植物乳桿菌形態(tài)特征較為一致。
2.2.2生理生化檢驗(yàn)糖發(fā)酵試驗(yàn)表明，ANCLA01號菌株葡萄糖發(fā)酵結(jié)果無氣體產(chǎn)生；生長溫度檢測發(fā)現(xiàn)，菌株15℃能增殖發(fā)育，45℃基本不生長；乳酸生成檢測試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵液中有乳酸生成。兼顧上述菌株形態(tài)特征，表明該菌屬同型發(fā)酵B型乳酸桿菌。
2.2.2分子生物學(xué)鑒定菌株差異比較發(fā)現(xiàn)，ANCLA01菌株16SrRNA序列的第5個堿基以后的1482個堿基序列與Lactobacillus plantarum strain L5的第26個堿基后的1482個堿基序列完全相同(序列已上傳GenBank，登陸號EF185922)。該結(jié)果證實(shí)ANCLA01號菌株確系植物乳桿菌。
2.3不同發(fā)酵條件對植物乳桿菌ANCLA01發(fā)酵豆粕中CLA產(chǎn)量的影響2.3.1麩皮添加量對豆粕發(fā)酵產(chǎn)生CLA的影響由于植物乳桿菌ANCLA01為兼性厭氧微生物，添加麩皮能增加豆粕間隙，有利于菌體生長。按1t豆粕添加麩皮10、15、20、25、30和35kg麩皮試驗(yàn)，發(fā)酵60h后發(fā)現(xiàn)1t豆粕添加麩皮20kg時，菌體生長最好，CLA產(chǎn)量最高，達(dá)到12.46mg/g(DW基礎(chǔ))。
2.3.2不同碳源對豆粕發(fā)酵產(chǎn)生CLA的影響豆粕中雖然含有少量糖分，但是遠(yuǎn)不能滿足微生物生長需要。以豆粕為基礎(chǔ)，按1t豆粕添加淀粉10、15、20、25、30和35kg淀粉試驗(yàn)或1t豆粕添加蔗糖10、15、20、25、30和35kg蔗糖，發(fā)酵60h后發(fā)現(xiàn)1t豆粕添加淀粉25kg或蔗糖15kg時，菌體生長最好，CLA產(chǎn)量最高，達(dá)到14.53mg/g(DW基礎(chǔ))。
2.3.3.不同磷源對植物乳桿菌ANCLA01發(fā)酵豆粕生產(chǎn)CLA的影響磷酸鹽能夠緩沖在發(fā)酵過程中由于乳酸的產(chǎn)生而造成的培養(yǎng)基pH值下降，從而有利于CLA的產(chǎn)生。以豆粕發(fā)酵培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，在1t豆粕添加麩皮20kg、蔗糖10kg、酵母膏15kg、NaCl 1.5kg的前提下，分別添加15kg磷酸氫鉀、磷酸二氫鉀，磷酸氫銨，磷酸二氫銨、磷酸氫二鈉、磷酸氫鈉等6種磷鹽發(fā)酵，發(fā)酵60h后發(fā)現(xiàn)添加K2HPO4時，菌體生長最好，CLA產(chǎn)量最高，達(dá)到16.21mg/g(DW基礎(chǔ))。
2.3.4.K2HPO4劑量對植物乳桿菌ANCLA01發(fā)酵豆粕生產(chǎn)CLA的影響以豆粕發(fā)酵培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，在1t豆粕添加麩皮20kg、蔗糖10kg、酵母膏15kg、NaCl 1.5kg的前提下，按1t豆粕添加淀粉10、15、20、25、30和35kg K2HPO4，發(fā)酵60h后發(fā)現(xiàn)1t豆粕添加K2HPO415kg時，菌體生長最好，CLA產(chǎn)量最高，達(dá)到18.68mg/g(DW基礎(chǔ))。
2.3.5.酵母膏對植物乳桿菌ANCLA01發(fā)酵豆粕生產(chǎn)CLA的影響植物乳酸桿菌是一類對營養(yǎng)要求較高的菌種，氮源被利用的難易程度必然影響該菌的初級代鰣，從而影響CLA的產(chǎn)量。CLA生產(chǎn)需要稀有氨基酸等生長因子，而酵母膏中含有這些生長因子，因此，在培養(yǎng)基中適量添加酵母膏有利于菌體生長，有利于CLA牛產(chǎn)。以豆粕發(fā)酵培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，在1t豆粕添加麩皮20kg、蔗糖10kg、K2HPO415kg、NaCl 1.5kg的前提下，按1t豆粕添加酵母膏5、10、15、20、25、30kg，發(fā)酵60h后發(fā)現(xiàn)1t豆粕添加酵母膏10kg時，CLA產(chǎn)量為20.36mg/g(DW基礎(chǔ))，加大酵母膏添加量，CLA產(chǎn)量不再明顯提高。
2.3.5.食鹽對植物乳桿菌ANCLA01發(fā)酵豆粕生產(chǎn)CLA的影響以豆粕發(fā)酵培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，在1t豆粕添加麩皮20kg、蔗糖10kg、酵母膏15kg、K2HPO415kg的前提下，按1t豆粕添加淀粉0.5、1.0、1.5、2.0和2.5kg NaCl，發(fā)酵60h后發(fā)現(xiàn)1t豆粕添加NaCl 1kg時，菌體生長最好，CLA產(chǎn)量最高，達(dá)到16.13mg/g(DW基礎(chǔ))。
2.3.7.鎂鹽對植物乳桿菌ANCLA01發(fā)酵豆粕生產(chǎn)CLA的影響以豆粕發(fā)酵培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，在1t豆粕添加麩皮20kg、蔗糖10kg、酵母膏15kg、K2HPO415kg、NaCl 1.5kg的前提下，按1t豆粕添加0.1、0.2、0.3、0.4和0.5kg MgSO4，發(fā)酵60h后發(fā)現(xiàn)1t豆粕添加MgSO40.3kg時，CLA達(dá)到22.41mg/g(DW基礎(chǔ))。加大MgSO4用量，CLA產(chǎn)量反而下降。
2.3.8.發(fā)酵時間對植物乳桿菌ANCLA01發(fā)酵豆粕生產(chǎn)CLA的影響以豆粕發(fā)酵培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，在1t豆粕添加麩皮20kg、蔗糖10kg、酵母膏15kg、K2HPO415kg、NaCl 1.5kg、MgSO40.3kg的前提下，發(fā)酵時間按24、36、48、60、72、84、96h，結(jié)果發(fā)現(xiàn)發(fā)酵48小時后時，CLA不再提高，達(dá)到24.15mg/g(DW基礎(chǔ))，表明最佳發(fā)酵時間為48h。
2.3.9.添加植物油脂對植物乳桿菌ANCLA01發(fā)酵豆粕生產(chǎn)CLA的影響以豆粕為基礎(chǔ)，在1t豆粕添加麩皮20kg、蔗糖10kg、酵母膏15kg、K2HPO415kg、NaCl 1.5kg、MgSO40.3kg的前提下，按1t豆粕添加葵花籽油10、15、20、25、30、35kg，或1t豆粕添加菜籽油或花生油10、15、20、25、30、35kg，發(fā)酵60h后發(fā)現(xiàn)1t豆粕添加葵花籽油10kg，菜籽油或花生油30kg時，CLA產(chǎn)量最高，達(dá)到26.41mg/g(DW基礎(chǔ))。
2.3.10.植物乳桿菌ANCLA01接種量對植物乳桿菌ANCLA01發(fā)酵豆粕生產(chǎn)CLA的影響以豆粕為基礎(chǔ)，在1t豆粕添加麩皮20kg、蔗糖10kg、酵母膏15kg、K2HPO415kg、NaCl 1.5kg、MgSO40.3kg、葵花籽油10kg的前提下，植物乳桿菌ANCLA01接種劑量按6×107、12×107、18×107、24×107、30×107、36×107CFU/g風(fēng)干豆粕或植物乳桿菌ANCLA01純培養(yǎng)液添加量為150、300、450、600、750、900g/t風(fēng)干豆粕，植物乳桿菌ANCLA01及其純培養(yǎng)液用前須滅菌溫水稀釋10倍，便于均勻接種。發(fā)酵60h發(fā)現(xiàn)1t豆粕乳酸菌接種劑量為12×107CFU/g風(fēng)干豆粕或植物乳桿菌ANCLA01純培養(yǎng)液添加量為300g/t風(fēng)干豆粕時，CLA產(chǎn)量最高，達(dá)到30.06mg/g(DW基礎(chǔ))。
2.3.11.發(fā)酵條件組合效應(yīng)對植物乳桿菌ANCLA01發(fā)酵豆粕生產(chǎn)CLA的影響在以上單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過L18(37)正交優(yōu)化設(shè)計考察各因素對豆粕發(fā)酵的整體影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，影響植物乳桿菌ANCLA01產(chǎn)生CLA的各組分的主次順序依次為淀粉或蔗糖、K2HPO4、麩皮、酵母膏、NaCl、MgSO4、發(fā)酵時間，最佳組合為在1t豆粕添加麩皮20kg、淀粉25kg或蔗糖15kg、酵母膏10kg、磷鹽15kg、食鹽1kg、鎂鹽0.3kg，葵花籽油10kg(或菜籽油、花生油30kg)，乳酸菌接種量為12×107CFU/g風(fēng)干豆粕或乳酸菌純培養(yǎng)液添加量為300g/t風(fēng)干豆粕，此時CLA產(chǎn)量高達(dá)36.42mg/g(DW基礎(chǔ))。
利用該植物乳桿菌發(fā)酵制備富含共軛亞油酸豆粕飼料的方法1)對植物乳桿菌ANCLA01菌株進(jìn)行批量擴(kuò)培用上述MRS液體培養(yǎng)基將保存菌株活化兩次后，接種于250mL三角瓶中，每瓶裝液量100mL，37℃恒溫靜置培養(yǎng)48～72h后，再按2×107CFU/mL添加濃度添加到液態(tài)種子發(fā)酵罐中，混合均勻后于37℃條件下培養(yǎng)發(fā)酵48h；2)在豆粕飼料中接種植物乳桿菌ANCLA01將豆粕去雜粉碎至60-80目后，按1t豆粕添加麩皮20kg、淀粉25kg或蔗糖15kg、酵母膏10kg、磷鹽15kg、食鹽1kg、鎂鹽0.3kg，植物油脂(葵花籽油10kg，菜籽油或花生油30kg)10-30kg，水1t，混合攪拌均勻后115℃條件下滅菌20min，待溫度降至35-39℃時，再按乳酸菌劑量12×107CFU/g風(fēng)干豆粕或乳酸菌純培養(yǎng)液添加量為300g/t風(fēng)干豆粕，向豆粕中噴灑接種植物乳桿菌ANCLA01(乳酸菌及其純培養(yǎng)液用前須滅菌溫水稀釋10倍，便于均勻接種)，在35-39℃條件下厭氧發(fā)酵48h。多批發(fā)酵后經(jīng)實(shí)測CLA含量均超過30.52mg/g(DW基礎(chǔ))以上。
權(quán)利要求
1.一種植物乳桿菌ANCLA01，其特征在于所述的菌株為Lactobacillusplantarum ANCLA01，該菌株保藏登記入冊的編號為CGMCCNo.1906。
2.一種植物乳桿菌發(fā)酵制備富含共軛亞油酸豆粕飼料的方法，其特征在于
1)對植物乳桿菌ANCLA01菌株進(jìn)行批量擴(kuò)培用MRS液體培養(yǎng)基將保存菌株活化兩次后，接種于250mL三角瓶中，每瓶裝液量100mL，37℃恒溫靜置培養(yǎng)48～72h后，再按2×107CFU/mL添加濃度添加到液態(tài)種子發(fā)酵罐中，混合均勻后于37℃條件下培養(yǎng)發(fā)酵48h；
2)在豆粕飼料中接種植物乳桿菌ANCLA01將豆粕去雜粉碎后與麩皮、蔗糖或淀粉、酵母膏、磷鹽、食鹽、鎂鹽和植物油脂及水混合攪拌均勻，經(jīng)滅菌后噴灑接種上述擴(kuò)培并經(jīng)稀釋的植物乳桿菌ANCLA01或植物乳桿菌ANCLA01純培養(yǎng)液，厭氧條件下發(fā)酵后即可啟用。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種植物乳桿菌發(fā)酵制備富含共軛亞油酸豆粕飼料的方法，其特征在于所述豆粕與淀粉或蔗糖、酵母膏、磷鹽、食鹽、鎂鹽和植物油脂及水的混合重量比為1∶0.02∶0.015-0.025∶0.01∶0.015∶0.001∶0.0003∶0.01-0.03∶1。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種植物乳桿菌發(fā)酵制備富含共軛亞油酸豆粕飼料的方法，其特征在于所述植物油脂為葵花籽油或菜籽油或花生油。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種植物乳桿菌發(fā)酵制備富含共軛亞油酸豆粕飼料的方法，其特征在于所述噴灑接種植物乳桿菌ANCLA01的劑量按12×107CFU/g風(fēng)干豆粕或植物乳桿菌ANCLA01純培養(yǎng)液添加量為300g/t風(fēng)干豆粕。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種植物乳桿菌發(fā)酵制備富含共軛亞油酸豆粕飼料的方法，其特征在于所述向豆粕中噴灑接種的植物乳桿菌ANCLA01和/或其純培養(yǎng)液經(jīng)稀釋10倍后使用。
全文摘要
一種植物乳桿菌發(fā)酵制備富含共軛亞油酸豆粕飼料的方法屬微生物和動物營養(yǎng)與飼料技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明的菌株(Lactobacillus plantarum ANCLA01)于2007年1月8日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏登記入冊的編號CGMCCNo.1906。植物乳桿菌ANCLA01系從玉米青貯中分離、篩選、純化培育出來，命名為植物乳桿菌ANCLA01(Lactobacillus plantarum ANCLA01)。該植物乳桿菌ANCLA01應(yīng)用于豆粕發(fā)酵，可以提高發(fā)酵豆粕飼料中共軛亞油酸的含量，生產(chǎn)出富含共軛亞油酸的功能性發(fā)酵豆粕飼料。
文檔編號A23K1/14GK101074426SQ20071001965
公開日2007年11月21日 申請日期2007年1月24日 優(yōu)先權(quán)日2007年1月24日
發(fā)明者程茂基, 孟秀麗, 馬廣智, 吳成章, 薛芹, 王菊花 申請人:合肥市科茂隆生物工程有限公司