專利名稱：纖維素分解混合細(xì)菌的使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及應(yīng)用微生物處理農(nóng)業(yè)廢棄稻草的生物技術(shù)，尤其是應(yīng)用纖維素分解混合細(xì)菌菌劑直接分解還田秸稈的使用方法。
背景技術(shù)：
我國(guó)可利用的植物纖維素資源豐富，僅稻草年產(chǎn)量達(dá)數(shù)億噸。農(nóng)作物秸稈含有豐富的氮、磷、鉀及多種微量元素，但我國(guó)復(fù)種指數(shù)高的農(nóng)業(yè)種植區(qū)稻草大多被焚燒，容易造成對(duì)環(huán)境的嚴(yán)重污染，影響航空和高速公路運(yùn)輸，同時(shí)也大大減少了稻田有機(jī)質(zhì)的投入，由于反復(fù)耕種稻田有機(jī)質(zhì)急劇下降，化肥施用過量最終導(dǎo)致了稻田貧瘠、板結(jié)及鹽堿化，直接后果是農(nóng)作物產(chǎn)量和質(zhì)量均下降。
稻草還田是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上解決農(nóng)業(yè)廢棄稻草和改良土壤、增加土壤有機(jī)質(zhì)的有效方法，將稻草直接還田被當(dāng)季農(nóng)作物利用，有利于作物的生長(zhǎng)，是對(duì)農(nóng)業(yè)資源的有效利用和適應(yīng)生態(tài)農(nóng)業(yè)發(fā)展需要的較佳選擇。但由于組成秸稈的木質(zhì)素是一種高度抵抗生物降解的高分子聚合物且具有一定的結(jié)晶度，而成熟秸稈的纖維素部分處于木質(zhì)素的包蔽鞘中，從而給纖維素的降解帶來困難。此外，稻草自然分解過程中產(chǎn)生的高溫和臭氣，將造成植物燒根和污染空氣的后果。因此，長(zhǎng)期以來對(duì)秸稈還田的推廣較難進(jìn)行。
采用纖維素分解菌群作為秸稈生物腐熟劑，能夠促進(jìn)稻草的快速腐熟，一方面消除了自然分解過程中產(chǎn)生的高溫和臭氣，另一方面加速了有機(jī)物的分解，提高了秸稈的利用率。如專利號(hào)為02133713.6中公開了“一種直接分解秸稈為肥的微生物肥料菌劑及其生產(chǎn)工藝和使用方法”，涉及的微生物肥料菌劑使用方法為將新鮮秸稈均勻鋪在地面，用鋤頭斬成碎片后將菌劑均勻噴灑在秸稈上，兩小時(shí)內(nèi)將秸稈埋入土中，使其與土壤均勻混合于耕作層作為底肥。使用該微生物肥料菌劑進(jìn)行農(nóng)業(yè)秸稈還田試驗(yàn)取得了良好效果，對(duì)于增加土壤有機(jī)質(zhì)含量、抑制有害微生物生長(zhǎng)起到一定效果，但采用鋤頭將新鮮秸稈斬成碎片及將秸稈埋入土壤中這一方法費(fèi)時(shí)又費(fèi)力，給農(nóng)業(yè)推廣使用造成一定難度。專利申請(qǐng)?zhí)枮?00510011217.3中公開了“利用秸稈預(yù)處理和酶解工藝使秸稈纖維素完全酶解的方法”，秸稈首先經(jīng)氣爆進(jìn)行預(yù)處理，然后用熱水沖洗除去半纖維素多糖，干燥后與離子液體混合，微波加熱或直接加熱，然后將處理國(guó)的秸稈用水反復(fù)沖洗，采用這一方法雖然纖維素酶解率很高，但處理過程繁瑣，采用熱水沖洗和微波加熱需消耗大量能量，在一定程度上增加了處理成本，不利于農(nóng)田大面積推廣使用。
然而，微生物菌劑直接用于秸稈還田過程中存在的問題是容易造成微生物與農(nóng)作物爭(zhēng)氮，直接影響苗期生長(zhǎng)，從而影響后期產(chǎn)量。在秸稈還田過程中加入適量氮肥，能加速腐解并有效防止氮素?fù)p失及氨臭味的產(chǎn)生，但一次性加入尿素將為整個(gè)腐解系統(tǒng)中的微生物提供氮源，其中一些不能產(chǎn)生纖維素酶的微生物也大量繁殖，最終導(dǎo)致腐解過程中纖維素分解菌氮源不足，同樣影響腐解效果。此外，由于細(xì)菌產(chǎn)生的纖維素酶屬于胞外附著酶，需要細(xì)菌菌體直接接觸作用物，因此，采用直接加菌在水中的方法會(huì)降低稻草表面的腐解菌濃度，不利于提高腐解效率。
迄今為止，尚未見利用纖維素分解混合細(xì)菌菌劑用于稻草還田使用方法的相關(guān)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種腐解效率高、有害物質(zhì)產(chǎn)生少、適用性廣的稻草腐解細(xì)菌制劑的使用方法。
本發(fā)明的目的是通過下述方式實(shí)現(xiàn)的應(yīng)用混合細(xì)菌用于稻草還田的使用方法為用機(jī)械粉碎法對(duì)稻草進(jìn)行預(yù)處理后，分次施用所需尿素或者施用緩控釋氮肥，將纖維素分解混合細(xì)菌噴霧接種吸附在稻草表面，然后撒開用少耕法或免耕法進(jìn)行稻草還田。
所述的機(jī)械粉碎法采用農(nóng)業(yè)收割配套機(jī)械進(jìn)行。
施用所需尿素的方法為在稻草還田初期分2～3次施用所需尿素，每次施用間隔期為4～5天，每畝共施用尿素40～80kg。
緩控釋氮肥的施用量為每畝50～75kg。
纖維素分解混合細(xì)菌接種量為稻草質(zhì)量的1～2％。
纖維素分解混合菌劑為細(xì)菌制劑，功能菌含量為1～7×109個(gè)/ml。
纖維素分解混合菌劑可以是市場(chǎng)上所提供的具有纖維素分解作用的細(xì)菌菌劑。
本發(fā)明具體稻草還田方法為取保存的產(chǎn)黃纖維單胞菌和枯草芽孢桿菌在液體菌種培養(yǎng)基中活化，按1％接種量接種富集培養(yǎng)；將培養(yǎng)好的菌按一定比例混合，使混合物中產(chǎn)黃纖維單胞菌和枯草芽孢桿菌含量分別為1～5×109個(gè)/ml和1～2×109個(gè)/ml；進(jìn)行纖維素腐解前先使用機(jī)械粉碎法對(duì)稻草進(jìn)行預(yù)處理，在稻草還田初期分2～3次施用所需尿素或者施用緩控釋氮肥，每次施用尿素間隔期為4～5天；將纖維素分解混合細(xì)菌按稻草質(zhì)量的1～2％接種量噴霧接種吸附在稻草表面，10～20天后腐解基本完成。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于1、使用機(jī)械粉碎法對(duì)稻草進(jìn)行預(yù)處理，能降低纖維素的聚合度并增加原料的可及性，從而有效解決纖維素降解困難的問題。
2、以噴霧方式將細(xì)菌制劑接種在稻草表面再撒開，纖維素分解細(xì)菌吸附在稻草上，能夠增加稻草表面的腐解細(xì)菌濃度，從而提高腐解效率。
3、氮源的添加方式為分次施用或采用緩控釋肥，這樣有利于接種的優(yōu)勢(shì)纖維素分解菌群爭(zhēng)奪氮源進(jìn)行繁殖，加速了稻草的腐解并有效防止氮素?fù)p失及氨臭味的產(chǎn)生。
具體實(shí)施例實(shí)施例1纖維素分解混合細(xì)菌用于稻草還田的使用方法本發(fā)明的混合菌劑由產(chǎn)黃纖維單胞菌和枯草芽孢桿菌組成，枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)(ACCC10115)購(gòu)自中國(guó)農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心，其活化及富集培養(yǎng)基為NaNO31g，(NH4)2SO41g，K2HPO41g，KCl 0.5g，MgSO4·7H2O 0.5g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01g，CMC-Na 1g，H2O 1000ml，pH 7.0～7.4。
產(chǎn)黃纖維單胞菌(Cellulomonas flavigena)(CGMCC1.1002)購(gòu)自中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心，其活化富集培養(yǎng)基為酵母膏0.5％；(NH4)2SO40.5％；淀粉1.5％；FeSO4·7H2O 0.02％；NaCl 6g；KH2PO40.5g；CaCl20.1g；KK2HPO40.5g；CMC-Na 5g；pH7.0～7.5。
取保存的產(chǎn)黃纖維單胞菌和枯草芽孢桿菌分別在上述液體培養(yǎng)基中活化，按1％接種量接種到裝有上述液體培養(yǎng)基的500ml三角瓶中，120rpm、36℃培養(yǎng)。將培養(yǎng)好的菌按一定比例混合，使混合物中產(chǎn)黃纖維單胞菌和枯草芽孢桿菌含量分別為1～5×109個(gè)/ml和1～2×109個(gè)/ml。
以下通過三個(gè)腐解效果比較實(shí)驗(yàn)來支持本發(fā)明的技術(shù)方案1、混合菌群對(duì)稻草稈和稻草粉的腐解效果比較實(shí)驗(yàn)分別稱取3.0kg早稻秸稈和稻草粉裝入塑料桶中，按質(zhì)量比稻草∶水＝1∶5進(jìn)行浸泡，并按水的質(zhì)量加入0.1％的尿素，再接種1％的液體菌種，在35℃恒溫箱內(nèi)進(jìn)行腐解，每隔一定時(shí)間取一次水樣，測(cè)定還原糖含量，腐解15天，設(shè)3次重復(fù)。分別以不接纖維素分解菌做為對(duì)照。
由圖(1)可知，稻草粉腐解過程中的還原糖量都要高于稻草稈腐解過程中的還原糖含量，并且稻草粉對(duì)照的還原糖含量要比稻草稈處理的還原糖含量還要高。以上結(jié)果表明在將稻草轉(zhuǎn)化為有機(jī)肥時(shí)，先將稻草粉碎有利于稻草的腐解，提高還田效果。
2、尿素施用方法對(duì)稻草腐解的影響實(shí)驗(yàn)分別稱取3.0kg早稻秸稈裝入尼龍袋后放入塑料桶中，然后按質(zhì)量比稻草∶水＝1∶5進(jìn)行浸泡，并按每桶水質(zhì)量的0.1％稱取尿素，設(shè)處理(1)尿素一次性加入；處理(2)先加入尿素用量的50％，然后分別在第5天和第10天加入尿素用量的25％，各設(shè)3次重復(fù)，接種1％的液體菌種。分別以不接菌種為對(duì)照。在35℃恒溫箱中進(jìn)行腐解，每隔一定時(shí)間取一次水樣，測(cè)定纖維素酶活性，腐解15天后取出用流水洗凈，烘干至恒重并計(jì)算失重率，用鄧肯氏新復(fù)極差法進(jìn)行顯著性分析。
由圖(2)可知，采用不同尿素施用方法時(shí)，加菌發(fā)酵的還原糖量都要比相應(yīng)的對(duì)照高，一次性加入尿素要比分次加入尿素的高。分次加入尿素的纖維素酶活要比對(duì)應(yīng)的一次性加入尿素的高。
由表1可知，加菌腐解的失重率要比相應(yīng)的對(duì)照高，但處理1和CK1的失重率沒有達(dá)到顯著水平，而處理2和CK2的失重率達(dá)到了極顯著水平，處理1和處理2沒有達(dá)到顯著水平，而CK1和CK2達(dá)到顯著水平。這說明分批加入氮源有利于接種優(yōu)勢(shì)纖維素分解菌群爭(zhēng)奪氮源進(jìn)行繁殖，能加速稻草的腐解并防止氮素?fù)p失及氨臭味的產(chǎn)生。在配合稻草還田時(shí)，也應(yīng)該分批施用氮肥。
表1尿素施用方法對(duì)菌腐解稻草的影響


3、菌的使用方法對(duì)稻草的腐解試驗(yàn)分別按每袋稱取3.0kg早稻秸稈，設(shè)處理(1)按稻草量的1％噴霧接種混合液體菌種吸附10min，然后裝入尼龍袋，按質(zhì)量比稻草∶水＝1∶5進(jìn)行浸泡；處理(2)將稻草裝入尼龍袋后，然后按質(zhì)量比稻草∶水＝1∶5進(jìn)行浸泡，再按稻草量的1％接種混合液體菌種；對(duì)照組將稻草裝入尼龍袋后按質(zhì)量比稻草∶水＝1∶5進(jìn)行浸泡但不接菌種。然后分別按每桶水質(zhì)量的0.1％加入尿素，在35℃的恒溫箱中進(jìn)行腐解，每隔一定時(shí)間取一次水樣，測(cè)定纖維素酶活性、還原糖含量、pH值及COD(未提供測(cè)定結(jié)果)，腐解15天后取出用流水洗凈，烘干至恒重并計(jì)算失重率，用鄧肯氏新復(fù)極差法進(jìn)行顯著性分析。以上各設(shè)3次重復(fù)。
由圖(3)可知，噴菌處理的纖維素酶活要高于加菌處理和對(duì)照的，而對(duì)照的纖維素酶活比加菌處理的高，這與纖維素酶是一種誘導(dǎo)酶，菌與稻草的直接接觸影響著纖維素酶的產(chǎn)生。由圖(4)可知，加菌處理的pH要比噴菌處理和對(duì)照的高，這與菌分解其中的尿素及稻草上易分解物質(zhì)的雙重作用緊密聯(lián)系在一起。由圖(5)可知，發(fā)酵初期和末期，添加菌劑的纖維素酶活要比對(duì)照高，而噴菌的纖維素酶活性要比加菌的高，這是由于噴菌直接與稻草接觸，誘導(dǎo)纖維素酶產(chǎn)生較早的緣故。由圖(6)可知，發(fā)酵早期噴菌的COD要比加菌的和CK的都高，并且加菌的COD要比CK的高，這與噴菌處理的菌附著在稻草上，早期產(chǎn)酶活性強(qiáng)，分解的物質(zhì)多，而加菌處理的菌分散在水中，能夠利用其中的物質(zhì)，減少還原性物質(zhì)的量，這與圖(5)的變化有一定的相關(guān)性，在發(fā)酵后期加菌的COD最低。結(jié)合以上指標(biāo)綜合分析，該類菌劑以直接噴在稻草上使用比較適宜。
由表2可知，噴菌(處理1)與加菌(處理2)的失重率達(dá)到顯著水平，但是沒有達(dá)到極顯著水平，而處理有對(duì)照之間的失重率達(dá)到極顯著水平。說明將菌吸附在稻草上能夠有助于這類制劑的作用效果，這主要是由于噴菌在稻草上使用能夠增加稻草表面的腐解菌濃度，而加菌在水中會(huì)減少稻草表面的腐解菌濃度。因此使用這類菌劑宜直接噴在稻草上使用，而不是撒在稻田中。
表2菌使用方法對(duì)菌腐解稻草失重率的影響

基于以上結(jié)果，我們?cè)谶M(jìn)行纖維素腐解前使用機(jī)械粉碎法對(duì)稻草進(jìn)行預(yù)處理，以有利于稻草的腐解，提高還田效果；在稻草還田初期分2～3次施用所需尿素，每次施用尿素間隔期為4～5天，每畝共施用尿素40～80kg，以有利于接種的優(yōu)勢(shì)纖維素分解菌群爭(zhēng)奪氮源進(jìn)行繁殖，加速稻草的腐解并防止氮素?fù)p失及氨臭味的產(chǎn)生；由于細(xì)菌產(chǎn)生的纖維素酶屬于胞外附著酶，需要細(xì)菌菌體直接接觸作用物，我們采用將纖維素分解混合細(xì)菌按稻草質(zhì)量的1～2％接種量噴霧接種吸附在稻草表面，然后再撒開進(jìn)行少耕或免耕，以增加稻草表面的腐解菌濃度。
實(shí)施例2模擬稻田發(fā)酵稻草試驗(yàn)在每個(gè)尼龍袋中裝入早稻秸稈500g，試驗(yàn)設(shè)處理(1)在塑料桶底部裝土2kg，然后將按稻草質(zhì)量1％噴液體菌種的稻草裝入尼龍袋放入桶中，按水質(zhì)量的0.1％加入緩控釋氮肥，然后加水至淹沒稻草為止；處理(2)在塑料桶底部裝土400g，然后按稻草質(zhì)量1％噴液體菌種，再將稻草裝入尼龍袋并放入桶中，在其上面覆土100g，按水質(zhì)量的0.1％加入緩控釋氮肥，然后加水至淹沒稻草為止；對(duì)照組在塑料桶底部裝土2kg，然后將按稻草質(zhì)量1％噴液體菌種的稻草裝入尼龍袋放入桶中，加水至淹沒稻草為止。在35℃的恒溫箱中進(jìn)行腐解，15天后取出用流水洗凈，烘干至恒重并計(jì)算失重率，用鄧肯氏新復(fù)極差法進(jìn)行顯著性分析。各設(shè)3次重復(fù)。
在105℃～110℃烘至恒重并計(jì)算失重率，按失重率＝(腐解前稻草質(zhì)量-腐解后稻草質(zhì)量)/腐解前稻草質(zhì)量×100％。結(jié)果見表4。
表3模擬稻田發(fā)酵稻草試驗(yàn)

由表3可知，2個(gè)處理的失重率與對(duì)照的失重率相比較均達(dá)到極顯著水平，說明采用緩控釋氮肥代替分批加入尿素的方法能夠有效減輕勞動(dòng)強(qiáng)度，且基本能夠達(dá)到同樣的腐解效果；表中覆蓋薄層土壤的失重率雖然比不覆蓋土壤的低，但2者差異沒有達(dá)到顯著水平，說明稻草還田少耕與免耕條件下，該菌劑同樣有效果。
基于以上結(jié)果，我們?cè)诘静葸€田初期每畝施用緩控釋氮肥50-75kg；將纖維素分解混合細(xì)菌按稻草質(zhì)量的1～2％接種量噴霧接種吸附在稻草表面，然后撒開進(jìn)行少耕或免耕，能夠達(dá)到與分批加入尿素同樣的效果。
權(quán)利要求
1.纖維素分解混合細(xì)菌的使用方法，其特征在于用機(jī)械粉碎法對(duì)稻草進(jìn)行預(yù)處理后，分次施用所需尿素或者施用緩控釋氮肥，將纖維素分解混合細(xì)菌噴霧接種吸附在稻草表面，然后撒開用少耕法或免耕法進(jìn)行稻草還田。
2.權(quán)利要求1所述的纖維素分解混合細(xì)菌的使用方法，其特征在于所述的機(jī)械粉碎法采用農(nóng)業(yè)收割配套機(jī)械進(jìn)行。
3.權(quán)利要求1所述的纖維素分解混合細(xì)菌的使用方法，其特征在于施用所需尿素的方法為在稻草還田初期分2～3次施用所需尿素，每次施用間隔期為4～5天，每畝共施用尿素40～80kg。
4.權(quán)利要求1所述的纖維素分解混合細(xì)菌的使用方法，其特征在于緩控釋氮肥的施用量為每畝50～75kg。
5.權(quán)利要求1所述的纖維素分解混合細(xì)菌的使用方法，其特征在于纖維素分解混合細(xì)菌接種量為稻草質(zhì)量的1～2％。
6.權(quán)利要求1所述的纖維素分解混合細(xì)菌的使用方法，其特征在于纖維素分解混合菌劑由細(xì)菌組成，功能菌含量為1～7×109個(gè)/ml。
全文摘要
本發(fā)明涉及了一種纖維素分解混合細(xì)菌的使用方法。其主要特征在于用機(jī)械粉碎法對(duì)稻草進(jìn)行預(yù)處理后，分次施用所需尿素或者施用緩控釋氮肥，將纖維素分解混合細(xì)菌噴霧接種吸附在稻草表面，然后撒開用少耕法或免耕法進(jìn)行稻草還田。10～20天后腐解基本完成，稻草的失重率為50～65％。本發(fā)明顯著提高了植物纖維素腐解效率，同時(shí)具備簡(jiǎn)單易操作的優(yōu)點(diǎn)，適于在廣大農(nóng)村推廣使用。
文檔編號(hào)C05F11/02GK101041598SQ200710034508
公開日2007年9月26日 申請(qǐng)日期2007年3月8日 優(yōu)先權(quán)日2007年3月8日
發(fā)明者劉強(qiáng), 榮湘民, 譚周進(jìn), 謝桂先 申請(qǐng)人:湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)