專利名稱：抑殺植物病原真菌的郁金活性成分及其制備與應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及植物農藥技術，更具體地說，是涉及一種抑殺植物病原真菌的植物提取物活性成分及其制備方法與應用。
背景技術：
在化學合成農藥使用之前，最早的農藥有很多是從植物中提取出來的，有些植物的天然活性物質已被開發(fā)成商品殺蟲劑，如魚藤酮、煙堿等。但自20世紀40年代以來，有機化學合成農藥紛紛代替了植物性農藥而雄居市場，致使植物源農藥的研究一度陷入低谷。目前在中國使用的農藥80％以上為化學制劑，這些化學農藥對減少植物病蟲害，提高作物產量起到了重要的作用，但同時也帶來了環(huán)境污染、殘毒危害、病菌產生抗藥性、人畜安全受到威脅等一系列問題，給人們的健康帶來隱患。因此開發(fā)生物活性高、對非靶標生物安全、環(huán)境相容性好的天然活性物質已成為農藥發(fā)展的新趨勢，植物源農藥的開發(fā)又成為了研究的熱點，如公告號為CN1218645C的專利申請就公開了一種由百部、南鶴虱、苦楝皮、使君子、苦參、艾葉的抽提物與乳化劑、松節(jié)油和乙醇制成的中草藥殺蟲滅菌劑。李敬武等用山蒼籽油配制成乳劑，對茶樹主要病害茶紅銹病、茶黃萎病、茶云紋葉枯病和棉花枯萎病、黃萎病等進行防治，取得了較好的防治效果。但現今登記的植物源農藥幾乎都是殺蟲劑，抑殺植物病原真菌的制劑產品卻甚少，而在農業(yè)生產中，植物病原真菌對植物的危害極大，是農業(yè)增產、農民增收的障礙，因此，人們迫切需要提供更多品種的能有效抑殺植物病原真菌，且環(huán)境友好能保障人畜安全的農藥制劑產品，以促進農民增收。

發(fā)明內容
針對現有的植物源抑殺植物病原真菌制劑品種甚少的現狀，本發(fā)明目的旨在提供一種可用于制備抑殺植物病原真菌的新制劑，且制劑生物活性高、對非靶標生物安全、環(huán)境相容性好的郁金活性成分，以及該活性成分的制備方法與應用。
本發(fā)明提供的抑殺植物病原真菌的郁金活性成分，為以乙醇或甲醇為萃取溶劑萃取郁金得到的提取物。作為抑殺植物病原真菌活性成分的提取物，可以是以乙醇或甲醇為萃取溶劑萃取郁金得到的總提取物，也可以是以正己烷為萃取溶劑對以乙醇或甲醇為萃取溶劑萃取郁金得到的總提取物進一步萃取得到的精提取物?？偺崛∥锖途崛∥锒伎捎糜谥苽湟謿⒅参锊≡婢苿┑幕钚猿煞郑瑑?yōu)先選用精提取物作為制備抑殺植物病原真菌制劑的活性成分，特別是選用萃取溶劑萃取郁金得到的提取物經進一步濃縮處理得到的膏狀提取物。
在上述方案中，用乙醇或甲醇作為萃取溶劑萃取郁金所得到的提取物，對植物病原真菌的抑殺都有很好的活性，也就是說，既可以選用乙醇作為萃取溶劑，也可以選用甲醇作為萃取溶劑，選用乙醇作萃取溶劑效果更好，優(yōu)先選用體積分數不低于75％的乙醇，尤其是優(yōu)先選用體積分數為90％～98％的乙醇。
本發(fā)明揭示的抑殺植物病原真菌的郁金活性成分，可由包括以下步驟的方法來制備(1)將干燥粉碎的郁金根狀莖或塊根用乙醇或甲醇浸提12～24h，然后在45～55℃的條件下水浴攪拌提取6～12h，使郁金中的活性成分充分浸出，收集浸提液。
(2)將收集到的浸提液濃縮，得到郁金總提物，并回收作為溶劑的乙醇或甲醇。
上述得到的郁金總提物，還可進一步用正己烷萃取，得到郁金精提取物。萃取得到的郁金總提取物與精提取物，可進一步濃縮為膏狀提取物，作為抑殺植物病原真菌制劑的活性成分。膏狀提取物可以用丙酮溶解后直接用于制備抑殺植物病原真菌的制劑。
本發(fā)明揭示的抑殺植物病原真菌的郁金活性成分，可用于制備抑殺植物病原真菌和蘑菇病原真菌制劑，特別是用于制備抑殺山葵墨入菌、油菜菌核菌、番茄灰霉病菌、輪枝孢子菌、小麥赤霉菌、食用菌疣孢霉、橄欖綠霉或蒼白青霉等制劑，作為制劑的活性成分。
本發(fā)明揭示的抑殺植物病原真菌的郁金活性成分，可制備成水劑、可溶性粉劑、可濕性粉劑、濃懸劑和粒劑等劑型的植物病原真菌抑殺制劑。各種劑型的制備方法為本領域的常規(guī)方法，各劑型制備過程中所用助劑為農藥領域中的常用助劑。各劑型在使用時所配制的溶液，其中郁金提取物的濃度應在0.1mg/ml～1000mg/ml的范圍。
郁金中抑菌活性成分還可以進一步采用植物化學的方法進行分離和鑒定，以發(fā)現新的具有殺菌和抑菌活性的化合物，并且可以在此基礎上，以該化合物結構為模板，進行分子結構改造，開發(fā)成新的抑殺真菌制劑品種。
本發(fā)明提供的郁金提取物對山葵墨入菌、油菜菌核菌、番茄灰霉病菌、輪枝孢子菌、小麥赤霉菌、食用菌疣孢霉、橄欖綠霉或蒼白青霉等具有明顯的活性，且由于郁金原料來源廣泛，對人體無毒，對作物無害，作為植物源抑殺真菌制劑有易降解的特點，因此有望開發(fā)為一種無公害的植物源抑殺真菌制劑。
具體實施例方式
以下通過實施例描述本發(fā)明的具體實施方式
，對本發(fā)明的內容再作進一步的詳細說明。但不應將此理解為本發(fā)明的保護范圍僅限于實例，相反地，凡基于本發(fā)明的內容所實現的技術應用均屬于本發(fā)明的保護范圍。
以下實施例使用的是購自四川崇州產的郁金?；钚詼y定是在離體的條件下，采用生長速率法測定所制備樣品對病原真菌的抑菌活性，供試菌種為山葵墨入菌(Phomawasabiae Yokogi)、油菜菌核菌(Sclerotinia sclerotiorum(Lib)de Bary)、番茄灰霉病菌(Botrytis Cirerea)、輪枝孢子菌(Verticillium dahliae Kled)、小麥赤霉菌(Fusariumgraminearum)、食用菌疣孢霉(Mycogone peniciosa)、橄欖綠霉(Chaetomium olivaceumCooket Ell)或蒼白青霉(penicillium pallidum Smith)，分別由四川省農業(yè)廳植檢站、中國科學院成都生物研究所提供。
實施例1郁金提取物的制備及抑菌活性測定制備郁金提取物的步驟(1)將干燥郁金根狀莖(或塊根)粉碎后過40目篩，得到郁金干粉。
(2)取相當于原料質量約7倍(一般控制范圍為5～10倍)體積的95％的乙醇在室溫(溫度一般在18～24℃范圍)下浸提約20h(一般控制范圍為12～24h)。
(3)在約50℃(一般控制范圍為45～60℃)恒溫水浴中連續(xù)攪拌提取約10h(一般控制范圍為6～12h)。用布氏漏斗負壓過濾，去掉殘渣，得濾液①。
(4)將殘渣再用相當于原料質量約6倍(一般控制范圍為5～10倍)體積的95％的乙醇進一步攪拌提取8h(一般控制范圍為6～12h)，使郁金中的活性成分充分提出，用布氏漏斗負壓過濾，去掉殘渣，得濾液②。
(5)合并濾液①和濾液②，濾液用旋轉蒸發(fā)儀在約55℃(一般控制范圍為45～60℃)水浴下濃縮，得到浸提濃縮膏，4℃保存。
(6)取少量郁金總提物，清水配置成濃度為0.05g·ml-1溶液作為實驗備用樣品。
上述提取溶劑也可為甲醇。
生物活性的測定在離體條件下，采用菌絲生長速率法測定郁金提取物的抑菌活性。分別取實驗備用樣品(質量濃度為0.05g·ml-1)配制培養(yǎng)基，制成5個濃度梯度，即2.5mg·ml-1、2.0mg·ml-1、1.0mg·ml-1、0.5mg·ml-1、0.25mg·ml-1。待平板凝固后在平皿中央接入已培養(yǎng)好的、生長一致的山葵墨入菌菌餅(d＝6.0mm)。每皿接一個菌餅，以加入無菌水培養(yǎng)基接種后作為空白對照(CK)，每個處理設3個重復，26℃下恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，至對照培養(yǎng)皿菌落即將長滿培養(yǎng)皿時記錄數據。每個菌落按照十字交叉法測量兩次，以平均數代表其菌落的大小，抑菌率的計算公式如下菌落直徑(mm)＝菌落平均直徑-菌餅直徑(6.0mm)抑菌率(％)＝(對照菌落直徑-處理菌落直徑)÷對照菌落直徑×100％實驗結果如表1所示。
表1郁金提取浸膏對墨入菌的抑制效果

注抑菌率為藥液濃度在1.0mg·ml-1時測定由表1可以看出，郁金甲醇、乙醇提取物對山葵墨入菌表現出較強的抑菌活性，其抑制中濃度即EC50分別為0.6699mg·ml-1、0.5707mg·ml-1。
實施例2郁金乙醇總提物、正己烷萃取物對病原菌孢子萌發(fā)的影響(1)供試菌種山葵墨入菌、橄欖綠霉、蒼白青霉、輪枝孢子菌。
(2)采用凹玻片法取配制的含藥孢子懸浮液(藥液的終濃度為10mg·ml-1)和空白對照、丙酮對照的孢子懸浮液各100μl滴加在凹玻片上，放入已滅菌的培養(yǎng)皿中，置于26℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，藥液處理和對照組均設4個重復。12小時后檢查孢子萌發(fā)情況。鏡檢10個視野，每一處理大約觀察200個孢子，計算孢子萌發(fā)率。當孢子芽管長度超過孢子直徑長度的一半(最小直徑)，作為已經萌發(fā)的孢子，計算公式如下孢子萌發(fā)率＝萌發(fā)孢子數÷檢查孢子數×100％孢子萌發(fā)抑制率＝(對照萌發(fā)率-處理萌發(fā)率)÷對照萌發(fā)率×100％實驗結果如表2所示。
表2郁金提取物對病原菌孢子萌發(fā)抑制作用

由表2可以看出，在供試質量濃度為10mg/ml時，郁金乙醇粗提物對供試病原菌孢子萌發(fā)抑制率均＞90％，正己烷萃取物對孢子萌發(fā)抑制率均＞96％。說明郁金的乙醇粗膏、正己烷萃取浸膏對病原菌孢子萌發(fā)均有較強的抑制能力。
實施例3郁金正己烷萃取物的制備和生物活性測定。
(1)郁金乙醇總提物用8倍體積正己烷萃取分離得到正己烷萃取液，萃取液用旋轉蒸發(fā)儀濃縮，濃縮溫度為40℃左右，得到膏狀萃取物。
(2)上述萃取膏狀物用丙酮溶液配置成濃度為0.05g·ml-1藥液作為實驗備用樣品。以山葵墨入菌、油菜菌核菌、番茄灰霉病菌、輪枝孢子菌、小麥赤霉菌、食用菌疣孢霉、橄欖綠霉、蒼白青霉為供試菌種，測定不同藥液濃度下的抑菌活性，抑菌活性測定方法同實施例1。
實驗結果如表3所示。
表3郁金正己烷萃取物對8種病原菌菌絲生長的抑制作用

注抑菌率為藥液濃度在1.0mg·ml-1時測定由表3可以看出，郁金乙醇總提物正己烷萃取物對8種病原真菌均具有明顯的抑制效果，其中對番茄灰霉菌的抑制率達到100％，對山葵墨入菌的抑菌率和郁金乙醇總提物相比有所提高，說明郁金的有效成分存在于正己烷萃取物中。
實施例4最低抑菌濃度MIC和最低殺菌濃度MBC的測定配制馬鈴薯液體培養(yǎng)基分裝于若干試管中，每管4ml，取郁金醇提物正己烷萃取物配置的母液(濃度0.05g·ml-1)，倍比稀釋法配制培養(yǎng)基，使各管含藥量依次為25mg·ml-1、12.5mg·ml-1、6.25mg·ml-1、3.13mg·ml-1、1.56mg·ml-1、0.78mg·ml-1，分別取調整好濃度的供試菌懸液40μl，加入6支含藥管和清水、丙酮分別做陽性對照管，另外分別以清水、丙酮不接種，作陰性對照。26℃搖床培養(yǎng)48h，以陰性管為對照，若培養(yǎng)物出現渾濁或底部出現絮狀物為生長，即陽性；反之，澄清或無絮狀物則為不生長，即陰性。倍比稀釋的各管以無菌生長的郁金丙酮溶解液的最高稀釋度作為該受試菌種的最低抑菌濃度，即為該菌的MIC值。取出真菌不生長的藥液培養(yǎng)基涂布到馬鈴薯培養(yǎng)基制成的平板上，于26℃培養(yǎng)一周，再觀察結果，真菌不生長的最高稀釋度為該藥的最低殺菌濃度(MBC)。
實驗結果如表4所示。
表4郁金正己烷萃取物的MIC和MBC值

注+生長 -不生長表4可以看出郁金正己烷萃取物對于供試的病原菌均有不同程度的抑制作用，高濃度藥劑對病原菌均具有殺菌能力。
權利要求
1.一種抑殺植物病原真菌的郁金活性成分，其特征在于活性成分是以乙醇或甲醇為萃取溶劑萃取郁金得到的提取物。
2.根據權利要求1所述的抑殺植物病原真菌的郁金活性成分，其特征在于所述活性成分為在以乙醇或甲醇為萃取溶劑萃取郁金得到的提取物基礎上，進一步以正己烷為萃取溶劑萃取提取物得到的提取物。
3.根據權利要求1或2所述的抑殺植物病原真菌的郁金活性成分，其特征在于所述活性成分為提取物經濃縮處理得到的膏狀提取物。
4.根據權利要求1或2所述的抑殺植物病原真菌的郁金活性成分，其特征在于所述萃取溶劑為乙醇。
5.根據權利要求4所述的抑殺植物病原真菌的郁金活性成分，其特征在于作為萃取溶劑的乙醇為體積分數不低于75％的乙醇。
6.根據權利要求5所述的抑殺植物病原真菌的郁金活性成分，其特征在于作為萃取溶劑的乙醇其體積分數為90％～98％的乙醇。
7.關于權利要求1至6中任一項權利要求所述抑殺植物病原真菌的郁金活性成分的制備方法，其特征在于包括以下步驟(1)將干燥粉碎的郁金根莖用乙醇或甲醇浸提12～24h，然后在45～55℃水浴攪拌提取6～12h，使郁金中的活性成分充分浸出，收集浸提液；(2)將收集到的浸提液濃縮，得到膏狀郁金總提物，并回收作為溶劑的乙醇或甲醇；
8.根據權利要求7所述的抑殺植物病原真菌的郁金活性成分的制備方法，其特征在于濃縮得到的膏狀郁金總提物再用正己烷萃取分離得到郁金精提物。
9.關于權利要求1至6中任一項權利要求所述抑殺植物病原真菌的郁金活性成分的應用，其特征在于在制備抑殺植物病原真菌和蘑菇病原真菌制劑中的應用。
10.根據權利要求9所述的抑殺植物病原真菌的郁金活性成分的應用，其特征在于在制備抑殺山葵墨入菌、油菜菌核菌、番茄灰霉病菌、輪枝孢子菌、小麥赤霉菌、食用菌疣孢霉、橄欖綠霉或蒼白青霉制劑中的應用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種抑殺植物病原真菌的郁金活性成分及其制備與應用?；钚猿煞譃橐砸掖蓟蚣状紴檩腿∪軇┹腿∮艚鸬玫降奶崛∥铮蛟谝砸掖蓟蚣状紴檩腿∪軇┹腿〉玫降奶崛∥锘A上再以正己烷為萃取溶劑進一步萃取得到的精提取物。抑殺植物病原真菌的郁金活性成分，可用于制備抑殺植物病原真菌和蘑菇病原真菌的制劑，特別是可用于制備抑殺山葵墨入菌、油菜菌核菌、番茄灰霉病菌、輪枝孢子菌、小麥赤霉菌、食用菌疣孢霉、橄欖綠霉或蒼白青霉等的制劑，制劑的劑型可以是水劑、可溶性粉劑、可濕性粉劑、濃懸劑和粒劑等形式的劑型。本發(fā)明揭示的郁金活性成分具有生產原料來原廣泛，對人體無毒，對作物無害，易降解等特點，可開發(fā)為一種無公害的植物源抑殺真菌制劑。
文檔編號A01P3/00GK101053332SQ20071004904
公開日2007年10月17日 申請日期2007年5月8日 優(yōu)先權日2007年5月8日
發(fā)明者龍章富, 尉研, 崔佳, 劉世貴, 王立洪 申請人:四川大學