專利名稱：：一種農(nóng)桿菌介導(dǎo)的無抗生素篩選轉(zhuǎn)基因大麥植株的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于植物轉(zhuǎn)基因
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的無抗生素篩選培育大麥轉(zhuǎn)基因植株的方法。本發(fā)明還涉及到PMI(磷酸甘露糖異構(gòu)酶)/甘露糖篩選體系在人麥遺傳轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用，以及氯酚紅(CPR)顯色法在鑒別大麥轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：大麥?zhǔn)鞘澜缟献罟爬系淖魑镏?，是列于小麥、玉米和水稻之后第四位重要的禾谷類作物，主要用作飼料、食糧、啤酒工業(yè)原料以及近年引起關(guān)注的醫(yī)藥工業(yè)原料和保健食品。大麥也是遺傳學(xué)研究廣泛應(yīng)用的模式植物之一。自1997年Tingay等首次以農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化大麥成功以來，農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法成為近年來大麥遺傳轉(zhuǎn)化中最常用的一種方法(TingayS，McElroyD，KallaR，F(xiàn)iegS，WangM，ThorntonS&BrettellR.Agrobacteriumtumefaciens-mediatedbarleytransformation.JPlant，1997，111369-1376；McCormacAC，WuH，BaoM，WangY，XuR，ElliottMC&ChenDF.Theuseofvisualmarkergenesascell-specificreportersofAgrobacterium-mediatedT-DNAdeliverytowheat(TriticumaestivumL.)andBarley(HordeumvulgareL.).Euphytica，1998，9917-25；MatthewsPR，WangMB，WaterhousePM，ThorntonS，F(xiàn)iegSJ，GublerF，JacobsenJV.Markergeneeliminationfromtransgenicbarley，usingco-transformationwithadjacent‘twinT-DNAs’onastandardAgrobacteriumtransformationvector.MolBreeding，2001，7195-202；MurrayF，BrettellR，MatthewsP，BishopD，JacobsenJ.ComparisonofAgrobacterium-mediatedtransformationoffourbarleycultivarsusingtheGFPandGUSreportergenes.PlantCellRep，2004，22397-402；WuH，McCormacAC，ElliottMC&ChenDF.Agrobacterium-mediatedstabletransformationofcellsuspensionculturesofbarley(HordeumvulgareL.).PlantCellTiss.Org.Cult，1998，54161-171；TrifonovaA，MadsenS，OlesenA.Agrobacterium-mediatedtransgenedeliveryandintegrationintobarleyunderarangeofinvitrocultureconditions.PlantSci，2001，161871-880；FangYD，AkulaC，AltpeterF.Agrobacterium-mediatedbarley(HordeumvulgareL.)transformationusinggreenfluorescentproteinasavisualmarkerandsequenceanalysisoftheT-DNA::barleygenomicDNAjunctions.JPlantPhysiol，2002，159113l-1138；TravellaS，RossSM，HardenJ，EverettC，SnapeJW，HarwoodWA.AcomparisonoftransgenicbarleylinesproducedbyparticlebombardmentandAgrobacterium-mediatedtechniques.PlantCellRep，2005，23780-789；KumlehnJ，SerazetdinovaL，HenselG，BeckerD，LoerzH.Genetictransformationofbarley(HordeumvulgareL.)viainfectionofandrogeneticpollencultureswithAgrobacteriumtumefaciens.PlantBiotechnolJ，2006，4251-261；等等)。Tingay等采用的方法是用基因槍先轟擊愈傷組織，再將具有細(xì)小傷口的愈傷組織作為農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的受體。雖然其具有轉(zhuǎn)基因低拷貝、遺傳穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)，但也加大了實(shí)驗(yàn)難度和提高了實(shí)驗(yàn)成本。同時(shí)，在大麥的農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化中，目前存在的突出問題就是受基因型限制、轉(zhuǎn)化頻率不高以及篩選標(biāo)記單一。在實(shí)際工作中，必須改進(jìn)現(xiàn)有技術(shù)體系的缺陷和不足。本發(fā)明從愈傷組織培養(yǎng)和轉(zhuǎn)化程序入手，并通過PMI/甘露糖篩選體系在大麥遺傳轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用，進(jìn)一步克服愈傷組織在轉(zhuǎn)化過程中由于長(zhǎng)時(shí)間的篩選繼代影響分化的問題，從而建立一種高效的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的大麥遺傳轉(zhuǎn)化方法。PMI/甘露糖篩選系統(tǒng)對(duì)人體和環(huán)境安全、篩選試劑價(jià)格低廉、不影響轉(zhuǎn)化植株的生長(zhǎng)發(fā)育、篩選效率高。氯酚紅(CPR)顯色法是利用植物進(jìn)行甘露糖代謝會(huì)使培養(yǎng)基酸化的原理。pH指示劑氯酚紅在pH6.0時(shí)呈紅色，隨著pH下降轉(zhuǎn)變成黃色。該方法是PMI活性檢測(cè)的最常用方法，在轉(zhuǎn)基因小麥、玉米和甜橙檢測(cè)上均有應(yīng)用(BoscariolRL，AlmeidaWAB，DerbyshireMTVC，MouroFilhoFAA，MendesBMJ.TheuseofthePMI/mannoseselectionsystemtorecovertransgenicsweetorangeplants(CitrussinensisL.Osbeck).PlantCellRep，2003，22122-128；WrightM，DawsonJ，DunderE.Efficientbiolistictransformationofmaize(ZeamaysL.)andwheat(TriticumaestivumL.)usingthephosphomannoseisomerasegene，pmi，astheselectablemarker.PlantCellRep，2001，20429-436；GaoZ，XieX，YanL，MuthukrishnanS，LiangGH.Agrobacteriumtumefaciens-mediatedsorghumransformationusingamannoseselectionsystem.PlantBiotechnolJ，2005，3591-599；DegenhardtJ，PoppeA，MontagJ，SzankowskiI.Theuseofthephosphomannoseisomerase/mannoseselectionsystemtorecovertransgenicappleplants.PlantCellRep，2006，251149-1156；LuccaP，YeXD，PotrykusI.Effectiveselectionandregenerationoftransgenicriceplantswithmannoseasselectiveagent.MolBreeding，2001，743-49；等等)，在大麥的遺傳轉(zhuǎn)化中還尚未有報(bào)道。與GUS組織染色相比，氯酚紅顯色法無需昂貴試劑，干擾反應(yīng)少，結(jié)果可靠。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，研制一種高效的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的無抗生素篩選培育大麥轉(zhuǎn)基因植株的方法，利用PMI(磷酸甘露糖異構(gòu)酶)/甘露糖篩選體系和氯酚紅(CPR)在大麥的遺傳轉(zhuǎn)化和鑒別大麥轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用，以提高大麥基因轉(zhuǎn)化的效率。本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)1、引物設(shè)計(jì)與載體構(gòu)建根據(jù)Genebank公布的DNA序列，設(shè)計(jì)一對(duì)大腸桿菌manA基因的特異引物，該引物的編號(hào)及結(jié)構(gòu)如下1)PMIP15’-ATGGATCCATGCAAAAACTCATTAACTCA-3’；PMIP2’-AAGGATCCTTACAGCTTGTTGTAAACACG-3’。2)從大腸桿菌基因組中PCR擴(kuò)增manA基因，測(cè)序后作為選擇標(biāo)記基因用于載體構(gòu)建。將克隆到pUC18-manA的基因，用BamHI酶切，同時(shí)從中間載體pMBL-3及pBAR(由德國(guó)馬普研究所郭巖博士惠贈(zèng))中分別以HindIII及BamHI-HinIII酶切獲得玉米泛素啟動(dòng)子及相關(guān)序列，克隆連接到以pUC8為基礎(chǔ)的載體上，構(gòu)建形成了pMBL-5植物表達(dá)載體。其具體的構(gòu)建路線見圖2。將構(gòu)建好的植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌。2、利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的無抗生素篩選的大麥遺傳轉(zhuǎn)化，它包括以下步驟1)、愈傷組織的誘導(dǎo)以寬約0.5mm～1.5mm，顏色半透明的大麥幼胚作為外植體。先將未成熟大麥種子用70％乙醇滅菌30秒，無菌水沖洗1遍，再用0.1％升汞滅菌8分鐘，無菌水沖洗3遍，每遍3分鐘。剝?nèi)∷龅耐庵搀w，將外植體盾片向上接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，在25℃黑暗的條件下培養(yǎng)，誘導(dǎo)出愈傷組織。2)、愈傷組織的預(yù)培養(yǎng)從步驟1)得到的愈傷組織中挑取生長(zhǎng)旺盛的接種到預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基上，在25℃黑暗的條件下培養(yǎng)5小時(shí)；3)、愈傷組織的浸梁將經(jīng)過預(yù)培養(yǎng)的愈傷組織轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌懸浮培養(yǎng)基中，置于搖床上振蕩(100轉(zhuǎn)/分鐘)浸染30分鐘；4)、愈傷組織和農(nóng)桿菌共培養(yǎng)將愈傷組織從農(nóng)桿菌懸浮培養(yǎng)基中夾出，置于無菌濾紙上稍微吹干，接種至共培養(yǎng)培養(yǎng)基，在25℃黑暗條件下培養(yǎng)2天；5)、愈傷組織的恢復(fù)培養(yǎng)將愈傷組織轉(zhuǎn)入含有500mg/L頭孢霉素的無菌水中，置于搖床上振蕩(100轉(zhuǎn)/分鐘)浸泡30分鐘，在無菌濾紙上稍微吹干，最后接種到恢復(fù)培養(yǎng)基(以達(dá)到抑菌和恢復(fù)培養(yǎng)的目的)上25℃黑暗培養(yǎng)7天；6)、愈傷組織的篩選培養(yǎng)將抑菌良好的愈傷組織接種到篩選培養(yǎng)基，25℃黑暗條件下篩選培養(yǎng)3周；7)、愈傷組織的分化挑選篩選后新生長(zhǎng)和未褐化死亡的愈傷組織接種到分化培養(yǎng)基，25℃，2000Lux，光照培養(yǎng)至分化出綠色芽點(diǎn)；8)、再生植株的再篩選將分化產(chǎn)生的綠色芽點(diǎn)或小苗接入含有甘露糖的壯苗培養(yǎng)基，25℃，2000Lux，光照培養(yǎng)至移栽，得到候選的轉(zhuǎn)化植株。3、利用氯酚紅液體檢測(cè)培養(yǎng)基檢測(cè)轉(zhuǎn)基因植株磷酸甘露糖異構(gòu)酶(PMI)活性，具體步驟是選上述得到的候選轉(zhuǎn)化植株主莖上最新長(zhǎng)出來的一片葉，剪取約0.3cm×0.5cm面積大小的葉尖段，將葉段浸入氯酚紅液體檢測(cè)培養(yǎng)基中，于25℃避光培養(yǎng)4天后觀察培養(yǎng)基顏色變化。同時(shí)按照相同要求剪取未轉(zhuǎn)化植株的葉段，分別浸入氯酚紅液體檢測(cè)培養(yǎng)基和氯酚紅液體對(duì)照培養(yǎng)基中，于25℃避光培養(yǎng)4天作為對(duì)照。在本發(fā)明中，下列培養(yǎng)基是至關(guān)重要的，各類培養(yǎng)基組分及其配方如下1、誘導(dǎo)培養(yǎng)基(編號(hào)MS2)1900mg/LKNO3，1650mg/LNH4NO3，170mg/LKH2PO4，370mg/LMgSO4·7H2O，440mg/LCaCl2·2H2O，27.8mg/LFeSO4·7H2O，37.3mg/LNa2·EDTA，0.83mg/LKI，6.2mg/LH3BO3，22.3mg/LMnSO4·4H2O，8.6mg/LZnSO4·7H2O，0.25mg/LNa2MoO4·2H2O，1.25mg/LCuSO4·5H2O，0.025mg/LCoCl2·6H2O，2mg/L甘氨酸，1mg/LVB1，0.5mg/LVB6，0.5mg/LVB5，690mg/L脯氨酸，250mg/L肌醇，1000mg/L水解酪蛋白，2mg/L2，4-D，30g/L麥芽糖，6g/L瓊脂，補(bǔ)充水分至1L，pH5.8。2、預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基(編號(hào)MS3)1900mg/LKNO3，1650mg/LNH4NO3，170mg/LKH2PO4，370mg/LMgSO4·7H2O，440mg/LCaCl2·2H2O，27.8mg/LFeSO4·7H2O，37.3mg/LNa2·EDTA，0.83mg/LKI，6.2mg/LH3BO3，22.3mg/LMnSO4·4H2O，8.6mg/LZnSO4·7H2O，0.25mg/LNa2MoO4·2H2O，1.25mg/LCuSO4·5H2O，0.025mg/LCoCl2·6H2O，2mg/L甘氨酸，1mg/LVB1，0.5mg/LVB6，0.5mg/LVB5，690mg/L脯氨酸，250mg/L肌醇，1000mg/L水解酪蛋白，2mg/L2，4-D，0.4mol/L甘露醇，30g/L麥芽糖，6g/L瓊脂，補(bǔ)充水分至1L，pH5.83、農(nóng)桿菌浸染時(shí)的液體懸浮培養(yǎng)基(編號(hào)MS11)1900mg/LKNO3，1650mg/LNH4NO3，170mg/LKH2PO4，370mg/LMgSO4·7H2O，440mg/LCaCl2·2H2O，27.8mg/LFeSO4·7H2O，37.3mg/LNa2·EDTA，0.83mg/LKI，6.2mg/LH3BO3，22.3mg/LMnSO4·4H2O，8.6mg/LZnSO4·7H2O，0.25mg/LNa2MoO4·2H2O，1.25mg/LCuSO4·5H2O，0.025mg/LCoCl2·6H2O，2mg/L甘氨酸，1mg/LVB1，0.5mg/LVB6，0.5mg/LVB5，690mg/L脯氨酸，250mg/L肌醇，1000mg/L水解酪蛋白，2mg/L2，4-D，100μmol/L乙酰丁香酮，30g/L麥芽糖，補(bǔ)充水分至1L，pH5.84、共培養(yǎng)培養(yǎng)基(編號(hào)MS4)1900mg/LKNO3，1650mg/LNH4NO3，170mg/LKH2PO4，370mg/LMgSO4·7H2O，440mg/LCaCl2·2H2O，27.8mg/LFeSO4·7H2O，37.3mg/LNa2·EDTA，0.83mg/LKI，6.2mg/LH3BO3，22.3mg/LMnSO4·4H2O，8.6mg/LZnSO4·7H2O，0.25mg/LNa2MoO4·2H2O，1.25mg/LCuSO4·5H2O，0.025mg/LCoCl2·6H2O，2mg/L甘氨酸，1mg/LVB1，0.5mg/LVB6，0.5mg/LVB5，690mg/L脯氨酸，250mg/L肌醇，1000mg/L水解酪蛋白，2mg/L2，4-D，100μmol/L乙酰丁香酮，30g/L麥芽糖，6g/L瓊脂，補(bǔ)充水分至1L，pH5.8。5、恢復(fù)培養(yǎng)基(編號(hào)MS5)1900mg/LKNO3，1650mg/LNH4NO3，170mg/LKH2PO4，370mg/LMgSO4·7H2O，440mg/LCaCl2·2H2O，27.8mg/LFeSO4·7H2O，37.3mg/LNa2·EDTA，0.83mg/LKI，6.2mg/LH3BO3，22.3mg/LMnSO4·4H2O，8.6mg/LZnSO4·7H2O，0.25mg/LNa2MoO4·2H2O，1.25mg/LCuSO4·5H2O，0.025mg/LCoCl2·6H2O，2mg/L甘氨酸，1mg/LVB1，0.5mg/LVB6，0.5mg/LVB5，690mg/L脯氨酸，250mg/L肌醇，1000mg/L水解酪蛋白，2mg/L2，4-D，500mg/L頭孢霉素，30g/L麥芽糖，6g/L瓊脂，補(bǔ)充水分至1L，pH5.86、篩選培養(yǎng)基(編號(hào)MS6)1900mg/LKNO3，1650mg/LNH4NO3，170mg/LKH2PO4，370mg/LMgSO4·7H2O，440mg/LCaCl2·2H2O，27.8mg/LFeSO4·7H2O，37.3mg/LNa2·EDTA，0.83mg/LKI，6.2mg/LH3BO3，223mg/LMnSO4·4H2O，8.6mg/LZnSO4·7H2O，0.25mg/LNa2MoO4·2H2O，1.25mg/LCuSO4·5H2O，0.025mg/LCoCl2·6H2O，2mg/L甘氨酸，1mg/LVB1，0.5mg/LVB6，0.5mg/LVB5，690mg/L脯氨酸，250mg/L肌醇，1000mg/L水解酪蛋白，2mg/L2，4-D，500mg/L頭孢霉素，10g/L麥芽糖，20g/L甘露糖，6g/L瓊脂，補(bǔ)充水分至1L，pH5.8。7、分化培養(yǎng)基(編號(hào)MS7)1900mg/LKNO3，1650mg/LNH4NO3，170mg/LKH2PO4，370mg/LMgSO4·7H2O，440mg/LCaCl2·2H2O，27.8mg/LFeSO4·7H2O，37.3mg/LNa2·EDTA，0.83mg/LKI，6.2mg/LH3BO3，22.3mg/LMnSO4·4H2O，8.6mg/LZnSO4·7H2O，0.25mg/LNa2MoO4·2H2O，1.25mg/LCuSO4·5H2O，0.025mg/LCoCl2·6H2O，2mg/L甘氨酸，1mg/LVB1，0.5mg/LVB6，0.5mg/LVB5，690mg/L脯氨酸，250mg/L肌醇，1000mg/L水解酪蛋白，300mg/L頭孢霉素，30g/L麥芽糖，6g/L瓊脂，補(bǔ)充水分至1L，pH5.8。8、生根培養(yǎng)基(編號(hào)MS8)950mg/LKNO3，825mg/LNH4NO3，85mg/LKH2PO4，185mg/LMgSO4·7H2O，220mg/LCaCl2·2H2O，13.9mg/LFeSO4·7H2O，18.65mg/LNa2·EDTA，0.415mg/LKI，3.1mg/LH3BO3，11.15mg/LMnSO4·4H2O，4.3mg/LZnSO4·7H2O，0.125mg/LNa2MoO4·2H2O，0.625mg/LCuSO4·5H2O，0.0125mg/LCoCl2·6H2O，2mg/L甘氨酸，0.5mg/LVB1，0.5mg/LVB6，0.5mg/LVB5，690mg/L脯氨酸，250mg/L肌醇，1000mg/L水解酪蛋白，1mg/LNAA，10g/L麥芽糖，20g/L甘露糖，200mg/L頭孢霉素，6g/L瓊脂，補(bǔ)充水分至1L，pH5.8。9、氯酚紅液體檢測(cè)培養(yǎng)基(編號(hào)MS9)1900mg/LKNO3，1650mg/LNH4NO3，170mg/LKH2PO4，370mg/LMgSO4·7H2O，440mg/LCaCl2·2H2O，27.8mg/LFeSO4·7H2O，37.3mg/LNa2·EDTA，0.83mg/LKI，6.2mg/LH3BO3，22.3mg/LMnSO4·4H2O，8.6mg/LZnSO4·7H2O，0.25mg/LNa2MoO4·2H2O，0.025mg/LCuSO4·5H2O，0.025mg/LCoCl2·6H2O，2mg/L甘氨酸，100mg/L肌醇，0.1mg/LVB1，0.5mg/LVB6，0.5mg/LVB5，15g/L甘露糖，100mg/L氯酚紅，補(bǔ)充水分至1L，pH6.0。10、氯酚紅液體對(duì)照培養(yǎng)基(編號(hào)MS10)1900mg/LKNO3，1650mg/LNH4NO3，170mg/LKH2PO4，370mg/LMgSO4·7H2O，440mg/LCaCl2·2H2O，27.8mg/LFeSO4·7H2O，37.3mg/LNa2·EDTA，0.83mg/LKI，6.2mg/LH3BO3，22.3mg/LMnSO4·4H2O，8.6mg/LZnSO4·7H2O，0.25mg/LNa2MoO4·2H2O，0.025mg/LCuSO4·5H2O，0.025mg/LCoCl2·6H2O，2mg/L甘氨酸100mg/L肌醇，0.1mg/LVB1，0.5mg/LVB6，0.5mg/LVB5，15g/L蔗糖，100mg/L氯酚紅，補(bǔ)充水分至1L，pH6.0上述培養(yǎng)基的高壓蒸汽滅菌按照?qǐng)?bào)道的常規(guī)方法進(jìn)行。本發(fā)明的有益效果是本發(fā)明以生產(chǎn)上廣泛推廣種植的三個(gè)大麥品種(早熟3號(hào)、鄂大麥7號(hào)和花30，品種來自湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院)為試驗(yàn)材料，在參考已發(fā)表的大麥農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化方法，并結(jié)合申請(qǐng)人已得到的大麥甘露糖耐受性研究結(jié)果的基礎(chǔ)上獲得。已報(bào)道的大麥農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化中一般都利用抗生素進(jìn)行篩選，采用模式品種GoldenPromise作為受體。GoldenPromise是珍貴的釀酒大麥品種，目前大麥遺傳轉(zhuǎn)化的工作集中在對(duì)GoldenPromise的研究，但其種植成本高昂，在我國(guó)并沒有廣泛種植。同時(shí)，Tingay等(TingayS，McElroyD，KallaR，F(xiàn)iegS，WangM，ThorntonS&BrettellR.Agrobacteriumtumefaciens-mediatedbarleytransformation.JPlant，1997，111369-1376；)的經(jīng)典農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化方法應(yīng)用基因槍轟擊作為輔助手段，提高了實(shí)驗(yàn)成本，抗生素的篩選加大了愈傷的死亡率，轉(zhuǎn)化率僅4.2％。本發(fā)明克服了現(xiàn)有技術(shù)的不足，打破了大麥遺傳轉(zhuǎn)化基因型的限制，利用甘露糖為選擇劑，研制了一種簡(jiǎn)便高效的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化方法和氯酚紅檢測(cè)方法。本發(fā)明所采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化的大麥栽培品種轉(zhuǎn)化率最高達(dá)到12％(見表1)，用氯酚紅顯色法篩選轉(zhuǎn)化植株的效率達(dá)到100％，即所有經(jīng)氯酚紅顯色法檢測(cè)為陽性的轉(zhuǎn)基因植物，PCR分析均為陽性。氯酚紅顯色法鑒定結(jié)果證實(shí)了整合到植物基因組中的基因不僅表達(dá)，而且表達(dá)的蛋白質(zhì)能形成具有功能的生物酶。因此氯酚紅顯色法是一種轉(zhuǎn)基因功能鑒定法。本發(fā)明的方法簡(jiǎn)單，操作簡(jiǎn)便，結(jié)果可靠，具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值。表1本發(fā)明轉(zhuǎn)化的大麥品種與文獻(xiàn)報(bào)道方法轉(zhuǎn)化的模式品種主要技術(shù)參數(shù)比較說明a參考文獻(xiàn)TrifonovaA，MadsenS，OlesenA.Agrobacterium-mediatedtransgenedeliveryandintegrationintobarleyunderarangeofinvitrocultureconditions.PlantSci，2001，161871-880.b本發(fā)明分多批次轉(zhuǎn)化，品種早熟3號(hào)共轉(zhuǎn)化了916個(gè)幼胚，品種鄂大麥7號(hào)共轉(zhuǎn)化了418個(gè)幼胚，品種花30共轉(zhuǎn)化了920個(gè)幼胚。圖1，是本發(fā)明的技術(shù)流程圖。圖2，是本發(fā)明中植物表達(dá)載體pMBL-5物理構(gòu)建圖譜。圖3，是本發(fā)明中利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)無抗生素篩選轉(zhuǎn)化方法得到的轉(zhuǎn)化植株。圖中右上角是已結(jié)實(shí)的單穗。圖4，是本發(fā)明中轉(zhuǎn)化植株的CPR檢測(cè)結(jié)果。圖中標(biāo)注A1和A2是氯酚紅對(duì)照培養(yǎng)基，A2-C4是氯酚紅檢測(cè)培養(yǎng)基，A2和A4是未轉(zhuǎn)化植株的葉片，B1-C4是不同轉(zhuǎn)化植株的葉片。圖5，是本發(fā)明中轉(zhuǎn)化植株的PCR結(jié)果。圖中標(biāo)注M為分子量標(biāo)記，1-8為轉(zhuǎn)基因人麥，9為陽性對(duì)照pMBL-5，10為非轉(zhuǎn)化大麥植株對(duì)照，11為空白對(duì)照。圖6，是甘露糖對(duì)大麥品種花30愈傷誘導(dǎo)、繼代、分化的影響。具體實(shí)施例方式實(shí)施例1農(nóng)桿菌介導(dǎo)的無抗生素的大麥基因轉(zhuǎn)化1、愈傷組織的誘導(dǎo)以寬約0.5mm～1.5mm，顏色半透明的大麥幼胚(品種早熟3號(hào)-來自湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院)作為外植體。先將未成熟大麥種子用70％乙醇滅菌30秒，無菌水沖洗1遍，再用0.1％升汞滅菌8分鐘，無菌水沖洗3遍，每遍3分鐘。剝?nèi)∷龅耐庵搀w，將外植體盾片朝上接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基(參見《
發(fā)明內(nèi)容》部分)上，在25℃黑暗的條件下培養(yǎng)，誘導(dǎo)出愈傷組織。2、愈傷組織的預(yù)培養(yǎng)從第一步得到的愈傷組織中挑取生長(zhǎng)旺盛的接種到預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基(參見《
發(fā)明內(nèi)容》部分)上，在25℃黑暗的條件下培養(yǎng)5小時(shí)；3、愈傷組織的浸染將經(jīng)過預(yù)培養(yǎng)的愈傷組織轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌浸染時(shí)液體懸浮培養(yǎng)基(參見《
發(fā)明內(nèi)容》部分)中，置于搖床上振蕩(100轉(zhuǎn)/分鐘)浸染30分鐘；4、愈傷組織和農(nóng)桿菌共培養(yǎng)將愈傷組織從農(nóng)桿菌懸浮培養(yǎng)基中夾出，置于無菌濾紙上稍微吹干，接種至共培養(yǎng)培養(yǎng)基(參見《
發(fā)明內(nèi)容》部分)，在25℃黑暗條件下培養(yǎng)2天；5、愈傷組織的恢復(fù)培養(yǎng)將愈傷組織轉(zhuǎn)入含有500mg/L頭孢霉素的無菌水中，置于搖床上振蕩(100轉(zhuǎn)/分鐘)浸泡30分鐘，在無菌濾紙上稍微吹干，最后接種到恢復(fù)培養(yǎng)基上25℃黑暗培養(yǎng)7天；6、愈傷組織的篩選培養(yǎng)將抑菌良好的愈傷組織接種到篩選培養(yǎng)基(參見《
發(fā)明內(nèi)容》部分)，25℃黑暗條件下篩選培養(yǎng)3周；7、愈傷組織的分化挑選篩選后新生長(zhǎng)和未褐化死亡的愈傷組織接種到分化培養(yǎng)基(參見《
發(fā)明內(nèi)容》部分)，25℃，2000Lux，光照培養(yǎng)至分化出綠色芽點(diǎn)；8、再生植株的再篩選將分化產(chǎn)生的綠色芽點(diǎn)或小苗接入含有甘露糖的生根培養(yǎng)基(參見《
發(fā)明內(nèi)容》部分)，25℃，2000Lux，光照培養(yǎng)至移栽，得到轉(zhuǎn)化植株。其發(fā)明效果如附圖3所示。實(shí)施例2轉(zhuǎn)化植株的氯酚紅顯色法(CPR)檢測(cè)選實(shí)施例1的轉(zhuǎn)化植株主莖上最新長(zhǎng)出來的一片葉，剪取約0.3cm×0.5cm面積大小的葉尖段，將葉段浸入氯酚紅液體檢測(cè)培養(yǎng)基(該培養(yǎng)基的成分見《
發(fā)明內(nèi)容》中氯酚紅液體檢測(cè)培養(yǎng)基的制備部分)中，于25℃避光培養(yǎng)4天后觀察培養(yǎng)基顏色變化。同時(shí)按照相同要求剪取未轉(zhuǎn)化植株的葉段，分別浸入氯酚紅液體檢測(cè)培養(yǎng)基和氯酚紅液體對(duì)照培養(yǎng)基中(參見《
發(fā)明內(nèi)容》氯酚紅液體對(duì)照培養(yǎng)基的制備部分)，具體操作步驟參見《
發(fā)明內(nèi)容》部分，于25℃避光培養(yǎng)4天作為對(duì)照。如果觀察到氯酚紅液體檢測(cè)培養(yǎng)基的顏色變黃說明檢測(cè)到磷酸甘露糖異構(gòu)酶(PMI)酶的活性，如果該培養(yǎng)基仍保持紅色或者變?yōu)樽仙f明轉(zhuǎn)基因植株葉片中檢測(cè)不到PMI酶的活性。在以蔗糖為碳源的對(duì)照培養(yǎng)基條件下，如果對(duì)照培養(yǎng)基的顏色變?yōu)辄S色，說明被培養(yǎng)的轉(zhuǎn)基因植株的葉片利用了蔗糖。本實(shí)施例的結(jié)果表明，被測(cè)的8株轉(zhuǎn)基因大麥植株中有6株為陽性轉(zhuǎn)化植株，說明了本發(fā)明的特異性。本實(shí)施例的發(fā)明效果如附圖4所示。實(shí)施例3對(duì)轉(zhuǎn)化植株的PCR檢測(cè)取0.1g左右的大麥轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)化植株的葉片，在液氮中研磨成粉末，用常規(guī)的CTAB法(參考本申請(qǐng)人專利申請(qǐng)?zhí)枮?00610019482.0公開的方法)抽提大麥總DNA。設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物Primerl(正向，5’-GTTTCTTTTGTCGATGCTCACCC-3’)和Primer2(反向，5’-TCCGGCTTGTGGTTAGGATC-3’)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。在25ulPCR反應(yīng)液中，含有300ng模板DNA，2.5ulPCR緩沖液，1.5ul25mMMgCl2，2ul1.25mMdNTPs，0.5ulPrimerl(10pmol/ul)，0.5ulPrimer2(10pmol/ul)，1UTaq聚合酶。PCR反應(yīng)條件為95℃5min；94℃1min，58℃50sec，72℃90sec，35個(gè)循環(huán)；最后72℃5min，10℃10min。反應(yīng)完成后，取18ulPCR產(chǎn)物在1.2％瓊脂糖凝膠上電泳。凝膠成像系統(tǒng)中紫外燈下照相，根據(jù)PCR產(chǎn)物片斷判斷外源基因的整合情況。產(chǎn)生的特異性條帶大小為480bp，根據(jù)PCR產(chǎn)物的帶型判斷出被測(cè)的8株轉(zhuǎn)化植株中有6株陽性轉(zhuǎn)化植株，發(fā)明效果如附圖5所示。實(shí)施例4甘露糖對(duì)大麥愈傷組織誘導(dǎo)、繼代和分化影響的試驗(yàn)為了確定以甘露糖作為選擇劑的有效使用濃度，本實(shí)施例以大麥栽培品種(品種為花30-來自湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院)的成熟胚為外植體，每處理50個(gè)外植體，比較了不同甘露糖梯度濃度對(duì)大麥成熟胚的愈傷誘導(dǎo)、繼代和分化的影響，得到如圖6所示的結(jié)果。圖6顯示在愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，當(dāng)培養(yǎng)基中甘露糖濃度為10g/L或15g/L時(shí)，大麥成熟胚的愈傷組織誘導(dǎo)率降低50％，當(dāng)甘露糖濃度增加為20g/L或25g/L時(shí)，大麥成熟胚愈傷誘導(dǎo)和生長(zhǎng)完全受到抑制；另外，愈傷組織在分化培養(yǎng)階段對(duì)甘露糖的耐受性最高。故本發(fā)明確定在愈傷組織生長(zhǎng)階段(即繼代)使用20g/L甘露糖作為選擇劑。在生根階段繼續(xù)使用20g/L甘露糖作為生根成苗的選擇劑，均可以達(dá)到理想的誘導(dǎo)效果。權(quán)利要求1.一種農(nóng)桿菌介導(dǎo)的無抗生素篩選轉(zhuǎn)基因大麥植株的方法，其步驟包括引物設(shè)計(jì)、PCR擴(kuò)增、載體構(gòu)建、遺傳轉(zhuǎn)化、篩選鑒定轉(zhuǎn)基因植物，其特征在于，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)將manA基因?qū)胧荏w大麥中，利用甘露糖替代抗生素作為選擇劑，對(duì)轉(zhuǎn)化后的受體細(xì)胞進(jìn)行篩選，通過鑒定磷酸甘露糖異構(gòu)酶活性和PCR檢測(cè)，篩選獲得轉(zhuǎn)基因植株，其制備步驟如下1)設(shè)計(jì)一對(duì)特異引物PMIP15’-ATGGATCCATGCAAAAACTCATTAACTCA-3’和PMIP25’-AAGGATCCTTACAGCTTGTTGTAAACACG-3’，擴(kuò)增大腸桿菌manA基因，以該基因?yàn)檫x擇標(biāo)記基因構(gòu)建植物表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌；2)在愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上誘導(dǎo)大麥幼胚，得到愈傷組織；3)將步驟2)的愈傷組織轉(zhuǎn)移至預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基上培養(yǎng)5小時(shí)；4)將步驟3)的愈傷組織與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)，將共培后的愈傷組織依次轉(zhuǎn)移至恢復(fù)、篩選、分化和生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)，篩選獲得到侯選轉(zhuǎn)基因植株；5)用氯酚紅顯色法檢測(cè)侯選轉(zhuǎn)基因植株，并將所篩選的候選轉(zhuǎn)基因植株移栽成苗；6)進(jìn)一步用PCR鑒定移栽后的轉(zhuǎn)基因植株，獲得轉(zhuǎn)基因植物；其中步驟2)所述的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基按以下配方制備MS2愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基KNO31900mg/L，NH4NO31650mg/L，KH2PO4170mg/L，MgSO4·7H2O370mg/L，CaCl2·2H2O440mg/L，F(xiàn)eSO4·7H2O27.8mg/L，Na2·EDTA37.3mg/L，KI0.83mg/L，H3BO36.2mg/L，MnSO4·4H2O22.3mg/L，ZnSO4·7H2O8.6mg/L，Na2MoO4·2H2O0.25mg/L，CuSO4·5H2O1.25mg/L，CoCl2·6H2O0.025mg/L，甘氨酸2mg/L，VB11mg/L，VB60.5mg/，VB50.5mg/L，脯氨酸690mg/L，肌醇250mg/L，水解酪蛋白1000mg/L，2，4-D2mg/L，麥芽糖30g/L，瓊脂6g/L，補(bǔ)充水分至1L，pH5.8；步驟3)所述的培養(yǎng)基按以下配方制備MS3預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基以MS2培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，附加甘露醇72.8g/L，pH5.8；步驟4)所述的培養(yǎng)基按以下配方制備MS4共培養(yǎng)培養(yǎng)基以MS2培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，附加乙酰丁香酮100μmol/L，pH5.8；MS5恢復(fù)培養(yǎng)基以MS2培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，附加頭孢霉素500mg/L，pH5.8；MS6篩選培養(yǎng)基，以MS2培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，將其中的麥芽糖30g/L修改為10g/L，附加甘露糖20g/L，pH5.8；MS7分化培養(yǎng)基以MS2為基本培養(yǎng)基，附加頭孢霉素300mg/L，同時(shí)除去2，4-D2mg/L，pH5.8；MS8生根培養(yǎng)基KNO3950mg/L，NH4NO3825mg/L，KH2PO485mg/LMgSO4·7H2O185mg/L，CaCl2·2H2O220mg/L，F(xiàn)eSO4·7H2O13.9mg/L，Na2·EDTA18.65mg/L，Kl0.415mg/L，H3BO33.1mg/L，MnSO4·4H2O11.15mg/L，ZnSO4·7H2O4.3mg/L，Na2MoO4·2H2O0.125mg/L，CuSO4·5H2O0.625mg/L，CoCl2·6H2O0.0125mg/L，甘氨酸2mg/L，VB10.5mg/L，VB60.5mg/L，VB50.5mg/L，脯氨酸690mg/L，肌醇250mg/L，水解酪蛋白1000mg/L，NAA1mg/L，麥芽糖10g/L，甘露糖20g/L，頭孢霉素200mg/L，瓊脂6g/L，補(bǔ)充水分至1L，pH5.8。2.權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的植物表達(dá)載體是pMBL-5。3.權(quán)利要求1所述的方法，其中步驟5)所述的方法如下1)制備氯酚紅檢測(cè)培養(yǎng)基；2)將步驟1)檢測(cè)培養(yǎng)基分裝至細(xì)胞培養(yǎng)板中；3)將轉(zhuǎn)基因植株葉片浸入檢測(cè)培養(yǎng)基中，25℃暗培養(yǎng)4天；4)鑒定轉(zhuǎn)基因植物特異顏色反應(yīng)。4.權(quán)利要求3所述的方法，其中氯酚紅檢測(cè)培養(yǎng)基按照下列配方制備KNO31900mg/L，NH4NO31650mg/L，KH2PO4170mg/L，MgSO4·7H2O370mg/L，CaCl2·2H2O440mg/L，F(xiàn)eSO4·7H2O27.8mg/L，Na2·EDTA37.3mg/L，KI6.2mg/L，H3BO30.83mg/L，MnSO4·4H2O，22.3mg/L，ZnSO4·7H2O8.6mg/L，Na2MoO4·2H2O0.25mg/L，CuSO4·5H2O0.025mg/L，CoCl2·6H2O0.025mg/L，甘氨酸2mg/L，肌醇100mg/L，VB10.1mg/L，VB60.5mg/L，VB50.5mg/L，甘露糖15g/L，氯酚紅100mg/L，補(bǔ)充水分至1L，pH6.0。5.權(quán)利要求1所述的方法，其中步驟6)所述的方法如下采用一對(duì)特異性引物Primer1(正向，5’-GTTTCTTTTGTCGATGCTCACCC-3’)和Primer2(反向，5’-TCCGGCTTGTGGTTAGGATC-3’)PCR擴(kuò)增manA基因特異DNA片段，該片段長(zhǎng)度為480bp。全文摘要本發(fā)明屬于植物轉(zhuǎn)基因
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種農(nóng)桿菌介導(dǎo)的無抗生素篩選培育大麥轉(zhuǎn)基因植株的方法。本發(fā)明的要點(diǎn)是，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)將報(bào)導(dǎo)基因manA導(dǎo)入受體大麥細(xì)胞中，利用甘露糖替代抗生素作為選擇劑，對(duì)轉(zhuǎn)化后的受體細(xì)胞進(jìn)行篩選；通過磷酸甘露糖異構(gòu)酶活性調(diào)節(jié)大麥的遺傳轉(zhuǎn)化進(jìn)程，利用氯酚紅顯色方法和PCR方法對(duì)轉(zhuǎn)基因大麥候選植株作進(jìn)一步篩選，最終獲得高轉(zhuǎn)化率的轉(zhuǎn)基因大麥植株。本發(fā)明所采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化的大麥栽培品種轉(zhuǎn)化率最高達(dá)到12％，用氯酚紅顯色法篩選轉(zhuǎn)化植株的效率達(dá)到100％。文檔編號(hào)A01H1/00GK101016568SQ200710051390公開日2007年8月15日申請(qǐng)日期2007年1月26日優(yōu)先權(quán)日2007年1月26日發(fā)明者廖玉才,李和平,王韜,黃濤申請(qǐng)人:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)