專(zhuān)利名稱(chēng)：雞胚卵黃囊膜血管生成模型與分析方法及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種新型血管生成活體模型的建立，提供了一種雞胚卵黃囊膜血管生成模型，同時(shí)公開(kāi)該模型在檢測(cè)與篩選影響血管生成藥物中的用途，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
1971年哈佛大學(xué)醫(yī)學(xué)院Folkman提出抗血管生成理論后，對(duì)血管形成機(jī)制、內(nèi)源性血管生成刺激因子和抑制因子及抗血管生成活性類(lèi)藥物的篩選等研究已取得較大的進(jìn)展。血管生成方面的研究主要依賴(lài)于針對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖及體內(nèi)外的血管生成實(shí)驗(yàn)方法與模型。其中，對(duì)活體血管生成影響的定性、定量研究采用兔或大鼠角膜囊、小鼠背囊、地鼠頰囊、鼠耳以及雞胚絨毛尿囊膜等實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?；而以雞胚絨毛尿囊膜模型最為簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)，是一種實(shí)驗(yàn)周期較短、不需要特殊設(shè)備的實(shí)用性方法，一般實(shí)驗(yàn)室均可開(kāi)展，但是尿囊膜血管發(fā)生模型有諸多的不足之處，如試驗(yàn)周期較長(zhǎng)，一般為2周以上；難以保證給藥部位的穩(wěn)定性；對(duì)操作技術(shù)要求高；尿囊膜血管分布廣且個(gè)體差異較大，局部給藥又難以維持藥物植入物部位的統(tǒng)一；難以對(duì)血管生成過(guò)程進(jìn)行動(dòng)態(tài)觀察；難以對(duì)實(shí)驗(yàn)部位的血管生長(zhǎng)進(jìn)行量化分析等等。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是建立一種新型血管生成模型—雞胚卵黃囊膜血管生成模型，用于篩選影響血管生成的藥物，解決了尿囊膜血管發(fā)生模型試驗(yàn)周期較長(zhǎng)、給藥部位的穩(wěn)定性差的問(wèn)題。
本發(fā)明雞胚卵黃囊膜血管生成模型的建立方法如下1、將雞卵置于正常孵化溫度下，有加濕水盤(pán)的孵箱中孵化50-70小時(shí)，再將雞卵內(nèi)容物傾倒入有蓋的無(wú)菌小玻璃燒杯中，繼續(xù)孵育8-16小時(shí)。
2、挑選卵黃膜完整、血管網(wǎng)及胚盤(pán)發(fā)育良好的雞胚，雞胚隨機(jī)分成對(duì)照組和測(cè)試組，將硅膠環(huán)(外徑26毫米，內(nèi)徑22毫米)放置到雞胚的卵黃囊血管網(wǎng)上。
3、對(duì)照組膠圈中加入含有促滲透劑的PBS溶液150-220微升；測(cè)試組膠圈中加入含待檢測(cè)藥物的PBS溶液150-220微升，(也可將待測(cè)藥物溶解于含滲透劑的PBS中)，繼續(xù)孵育8-16小時(shí)后撤走硅膠環(huán)，對(duì)給藥前后卵黃囊血管面積或密度或卵黃囊膜面積變化進(jìn)行測(cè)定，測(cè)試組中卵黃囊膜血管面積或密度或卵黃囊膜面積增長(zhǎng)率明顯大于對(duì)照組的確定為血管生成刺激藥物，明顯低于對(duì)照組的確定為血管生成抑制藥物。
4、根據(jù)下式計(jì)算對(duì)照組、測(cè)試組的卵黃囊膜血管面積與密度增長(zhǎng)率、卵黃囊膜面積，數(shù)據(jù)比較采用t檢驗(yàn)卵黃囊膜血管面積增長(zhǎng)率＝(給藥后YSM血管總面積-給藥前YSM血管總面積/給藥前YSM血管總面積)×100％卵黃囊膜血管密度增長(zhǎng)率＝(給藥后YSM血管密度-給藥前YSM血管密度/給藥前YSM血管密度)×100％卵黃囊膜面積增長(zhǎng)率＝(給藥后YSM總面積-給藥前YSM總面積/給藥前YSM總面積)×100％所述硅膠環(huán)的外徑為26毫米，內(nèi)徑為22毫米，既能限定給藥部位又能承載藥液。
所述的促滲透劑為5-10％的甘油或0.4-0.8％的二甲基亞砜，能夠提高試驗(yàn)藥物的吸收作用。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和效果在于與傳統(tǒng)的雞胚尿囊膜(CAM)血管生成試驗(yàn)相比，本模型具有利于給藥部位的確定、藥物作用的觀察及拍攝、確定最佳的給藥時(shí)間和保證給藥部位的一致性等。通過(guò)在體外培養(yǎng)雞胚，用卵黃囊膜代替尿囊膜進(jìn)行血管生成實(shí)驗(yàn)，使操作更為簡(jiǎn)單、結(jié)果更為直觀。采用無(wú)毒的硅膠環(huán)作為試驗(yàn)藥物的載體，該載體既能限定給藥部位又能承載藥液。由于硅膠環(huán)有一定的重量，會(huì)在環(huán)周?chē)纬砂枷?，使環(huán)內(nèi)藥液與卵黃囊膜緊密接觸，減少了藥液的外溢，有利于藥物的吸收。在硅膠環(huán)內(nèi)給藥的方法避免了以貼片作為藥物載體帶來(lái)的貼片移位及粘連等方面的問(wèn)題。
由于本試驗(yàn)針對(duì)的是整個(gè)卵黃囊膜血管網(wǎng)，從而避免了尿囊膜試驗(yàn)中僅針對(duì)局部血管所帶來(lái)的選點(diǎn)誤差。尿囊膜本身的血管分布個(gè)體差異很大，而尿囊膜氣室給藥區(qū)局部血管的變異更大，局部給藥很難保證給藥部位的一致性。由于雞胚YSM血管上覆蓋有羊膜和漿膜層，可在不同程度上影響待測(cè)藥物的滲透與吸收。通過(guò)不同的滲透劑對(duì)比，選用5-10％的甘油或0.4-0.8％的二甲基亞砜作為本模型的滲透劑，在此濃度下的甘油和二甲基亞砜既對(duì)雞胚胎既沒(méi)有表現(xiàn)出明顯毒性，又能通過(guò)其促滲透作用促進(jìn)卵黃囊血管對(duì)藥物的吸收，同時(shí)甘油也是一種良好的保濕劑，能夠使待測(cè)藥物保持一定濃度。在給藥期間取出箱內(nèi)水盤(pán)，也能使甘油溶液中的待側(cè)藥物保持一定濃度，不會(huì)因吸濕而使藥物濃度下降。以上措施均能使血管生成實(shí)驗(yàn)更加敏感。
綜上所述，本發(fā)明的卵黃囊膜血管生成模型可使實(shí)驗(yàn)周期大為縮短，實(shí)驗(yàn)結(jié)果更為客觀準(zhǔn)確，是一種值得推廣的活體血管生成實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀Ｅc尿囊膜實(shí)驗(yàn)中采用的一次性取膜檢測(cè)相比，具有可動(dòng)態(tài)觀測(cè)的特點(diǎn)。該模型將極大地提高影響血管生成藥物篩選的效率，為影響血管生成藥物的活性檢測(cè)提供了更為有效、實(shí)用的技術(shù)方法。


圖1.硅膠環(huán)(外徑26毫米，內(nèi)徑22毫米)置于卵黃囊膜上形成圓形隔離區(qū)，將待側(cè)藥物加入硅膠環(huán)內(nèi)。
圖2.PBS對(duì)照組，血管網(wǎng)正常生長(zhǎng)，血管粗壯，血流充盈，分支稠密。
圖32微克/卵，血管網(wǎng)發(fā)育遲緩，血管分支密度較對(duì)照減少。
圖4.20微克/卵，血管網(wǎng)發(fā)育不良，外周血管萎縮細(xì)弱，血管分支稀少且不規(guī)則。
圖5.2微克/卵組，血管網(wǎng)發(fā)育受阻，邊緣血管分支密度減少。
圖6.20微克/卵組，血管網(wǎng)發(fā)育不良，外周血管萎縮細(xì)弱，血管分支稀少且不規(guī)則。
圖7.重組人血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(2微克/卵)給藥12-16小時(shí)后，對(duì)雞胚YSM血管生成的影響，雞胚卵黃囊血管生長(zhǎng)與對(duì)照組相比更加茂盛，血管網(wǎng)擴(kuò)展迅速，血管分支更加稠密。
圖8.圖像分析軟件操作界面雞胚周長(zhǎng)10.81毫米，面積6.9平方毫米，形狀系數(shù)1.16；凈卵黃囊膜周長(zhǎng)54.9毫米，面積236.01平方毫米，形狀系數(shù)1.01；血管面積28.36平方毫米；血管密度12.38。
圖9.血管抑素對(duì)卵黃囊膜血管發(fā)生和卵黃囊膜發(fā)育的抑制作用1、卵黃囊膜血管面積增長(zhǎng)率2、卵黃囊膜面積增長(zhǎng)率3、卵黃囊膜血管密度增長(zhǎng)率。**P＜0.01，*P＜0.05，n＝10
具體實(shí)施例方式下列實(shí)施例旨在進(jìn)一步舉例描述本發(fā)明，而不是以任何方式限制本發(fā)明，在不背離本發(fā)明的精神和原則的前提下，對(duì)本發(fā)明所作的本領(lǐng)域普通技術(shù)人員容易實(shí)現(xiàn)的任何改動(dòng)或改變都將落入本發(fā)明的待批權(quán)利要求范圍之內(nèi)。
實(shí)施例1重組人血管抑素K1-3材料雞蛋來(lái)源本地養(yǎng)雞場(chǎng)；重組人血管抑素K1-3；步驟1、雞卵準(zhǔn)備用75％酒精消毒雞蛋表面，晾干后將雞卵氣室向上，長(zhǎng)軸與蛋托呈45°放入37.8℃、60％相對(duì)濕度的孵箱中。
2.雞卵孵化孵化過(guò)程中，每8小時(shí)轉(zhuǎn)蛋一次，轉(zhuǎn)蛋角度以水平位置前俯后仰各45度為宜。孵化至2.5天時(shí)，在超凈臺(tái)中用75％酒精消毒雞卵外殼，在雞卵中間部位輕輕磕出裂口，迅速掰開(kāi)卵殼(以免卵殼劃傷卵黃)，將雞胚傾入無(wú)菌玻璃燒杯中。由于重力及卵系帶的固定作用，雞卵的胚盤(pán)可自動(dòng)翻轉(zhuǎn)到卵黃表面，燒杯加蓋后放入37.8℃、60％相對(duì)濕度的孵箱中繼續(xù)孵育12小時(shí)。
3.雞卵篩選挑選卵黃膜完整、血管網(wǎng)呈近似圓形、胚盤(pán)位于卵黃膜中央且心搏良好、卵黃囊膜直徑接近上樣硅膠環(huán)直徑的雞胚進(jìn)入實(shí)驗(yàn)。
4.給藥沖洗完畢后，將雞卵隨機(jī)分成三組，每組10個(gè)。對(duì)照組在每只位于卵黃囊膜上的硅膠環(huán)內(nèi)加入200微升含8％甘油的磷酸緩沖液(圖1)，給藥組加入溶解于上述磷酸緩沖液，終濃度分別為每毫升含10微克和100微克的血管抑素200微升，將加濕水盤(pán)從孵箱中移出，繼續(xù)孵育12小時(shí)后小心撤走硅膠環(huán)觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果。此后每隔4小時(shí)觀察一次。
結(jié)論重組人血管抑素K1-3具有血管生成抑制作用。
實(shí)施例2內(nèi)皮抑素材料雞蛋來(lái)源本地養(yǎng)雞場(chǎng)；內(nèi)皮抑素；步驟1.雞卵準(zhǔn)備用75％酒精消毒雞蛋表面，晾干后將雞卵氣室向上，長(zhǎng)軸與蛋托呈45°放入37.8℃、60％相對(duì)濕度的孵箱中。
2.雞卵孵化孵化過(guò)程中，每8小時(shí)轉(zhuǎn)蛋一次，轉(zhuǎn)蛋角度以水平位置前俯后仰各45度為宜。孵化至2.5天時(shí)，在超凈臺(tái)中用75％酒精消毒雞卵外殼，在雞卵中間部位輕輕磕出裂口，迅速掰開(kāi)卵殼(以免卵殼劃傷卵黃)，將雞胚傾入無(wú)菌玻璃燒杯中。由于重力及卵系帶的固定作用，雞卵的胚盤(pán)可自動(dòng)翻轉(zhuǎn)到卵黃表面，燒杯加蓋后放入37.8℃、60％相對(duì)濕度的孵箱中繼續(xù)孵育12小時(shí)。
3.雞卵篩選挑選卵黃膜完整、血管網(wǎng)呈近似圓形、胚盤(pán)位于卵黃膜中央且心搏良好、卵黃囊膜直徑接近上樣硅膠環(huán)直徑的雞胚進(jìn)入實(shí)驗(yàn)。
4.給藥沖洗完畢后，將雞卵隨機(jī)分成三組，每組10個(gè)。對(duì)照組在每只位于卵黃囊膜上的硅膠環(huán)內(nèi)加入200微升含0.4-0.8％二甲基亞砜的磷酸緩沖液，給藥組加入溶解于上述磷酸緩沖液，終濃度分別為每毫升含10微克和100微克的內(nèi)皮抑素200微升，將加濕水盤(pán)從孵箱中移出，繼續(xù)孵育12小時(shí)后小心撤走硅膠環(huán)觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果。此后每隔4小時(shí)觀察一次。
結(jié)論內(nèi)皮抑素對(duì)血管生成具有抑制作用。
實(shí)施例3重組人血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子材料雞蛋來(lái)源本地養(yǎng)雞場(chǎng)；重組人血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(購(gòu)自美國(guó)R&D SYSTEM)。
步驟1.雞卵準(zhǔn)備用75％酒精消毒雞蛋表面，晾干后將雞卵氣室向上，長(zhǎng)軸與蛋托呈45°放入37.8℃、60％相對(duì)濕度的孵箱中。
2.雞卵孵化孵化過(guò)程中，每8小時(shí)轉(zhuǎn)蛋一次，轉(zhuǎn)蛋角度以水平位置前俯后仰各45度為宜。孵化至2.5天時(shí)，在超凈臺(tái)中用75％酒精消毒雞卵外殼，在雞卵中間部位輕輕磕出裂口，迅速掰開(kāi)卵殼(以免卵殼劃傷卵黃)，將雞胚傾入無(wú)菌玻璃燒杯中。由于重力及卵系帶的固定作用，雞卵的胚盤(pán)可自動(dòng)翻轉(zhuǎn)到卵黃表面，燒杯加蓋后放入37.8℃、60％相對(duì)濕度的孵箱中繼續(xù)孵育12小時(shí)。
3.雞卵篩選挑選卵黃膜完整、血管網(wǎng)呈近似圓形、胚盤(pán)位于卵黃膜中央且心搏良好、卵黃囊膜直徑接近上樣硅膠環(huán)直徑的雞胚進(jìn)入實(shí)驗(yàn)。
4.給藥沖洗完畢后，將雞卵隨機(jī)分成三組，每組10個(gè)。對(duì)照組在每只位于卵黃囊膜上的硅膠環(huán)內(nèi)加入200微升含5-10％甘油的磷酸緩沖液，給藥組加入溶解于上述磷酸緩沖液，終濃度為每毫升含10微克的血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子200微升，將加濕水盤(pán)從孵箱中移出，繼續(xù)孵育12小時(shí)后小心撤走硅膠環(huán)觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果。此后每隔4小時(shí)觀察一次。
結(jié)論重組人血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子具有血管生成刺激作用。
實(shí)施例4材料雞蛋來(lái)源本地養(yǎng)雞場(chǎng)；重組人血管抑素K1-3；步驟1.雞卵準(zhǔn)備用75％酒精消毒雞蛋表面，晾干后將雞卵氣室向上，長(zhǎng)軸與蛋托呈45°放入37.8℃、60％相對(duì)濕度的孵箱中。
2.雞卵孵化孵化過(guò)程中，每8小時(shí)轉(zhuǎn)蛋一次，轉(zhuǎn)蛋角度以水平位置前俯后仰各45度為宜。孵化至2.5天時(shí)，在超凈臺(tái)中用75％酒精消毒雞卵外殼，在雞卵中間部位輕輕磕出裂口，迅速掰開(kāi)卵殼(以免卵殼劃傷卵黃)，將雞胚傾入無(wú)菌玻璃燒杯中。由于重力及卵系帶的固定作用，雞卵的胚盤(pán)可自動(dòng)翻轉(zhuǎn)到卵黃表面，燒杯加蓋后放入37.8℃、60％相對(duì)濕度的孵箱中繼續(xù)孵育12小時(shí)。
3.雞卵篩選挑選卵黃膜完整、血管網(wǎng)呈近似圓形、胚盤(pán)位于卵黃膜中央且心搏良好、卵黃囊膜直徑接近上樣硅膠環(huán)直徑的雞胚進(jìn)入實(shí)驗(yàn)。
4.給藥沖洗完畢后，將雞卵隨機(jī)分成三組，每組10個(gè)。對(duì)照組在每只位于卵黃囊膜上的硅膠環(huán)內(nèi)加入200微升0.4-0.8％二甲基亞砜的磷酸緩沖液，給藥組加入溶解于上述磷酸緩沖液，終濃度分別為每毫升含10微克和100微克的血管抑素200微升，將加濕水盤(pán)從孵箱中移出，繼續(xù)孵育12小時(shí)后小心撤走硅膠環(huán)觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果。此后每隔4小時(shí)觀察一次。
結(jié)論重組人血管抑素K1-3對(duì)血管生長(zhǎng)具有抑制作用。
結(jié)果分析1.形態(tài)學(xué)觀察通過(guò)上述實(shí)施例1-4表明，以重組人血管抑素和內(nèi)皮抑素以及血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子作用于雞胚YSM，選用血管生長(zhǎng)影響藥物的溶劑磷酸鹽緩沖液作對(duì)照(圖2)。作用12小時(shí)后給藥組與對(duì)照組相比，兩者血管生成狀態(tài)差異顯著。在攝影體視顯微鏡下可觀察到對(duì)照組血管正常生長(zhǎng)，血管粗壯，血流充盈，分支稠密，卵黃動(dòng)脈及靜脈呈規(guī)則生長(zhǎng)對(duì)稱(chēng)分布；重組人血管抑素和內(nèi)皮抑素組周?chē)艹蕪浬⒉贿B續(xù)狀，且卵黃囊血管和毛細(xì)血管生長(zhǎng)緩慢，卵黃動(dòng)脈及靜脈常呈雜亂、不對(duì)稱(chēng)生長(zhǎng)，毛細(xì)血管分支稀少。結(jié)果表明兩種血管生長(zhǎng)抑制劑組的血管生長(zhǎng)受到一定程度的抑制(圖3-圖6)。血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子組的卵黃囊膜血管密度分布及血管網(wǎng)面積都明顯高于對(duì)照，結(jié)果表明血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子對(duì)卵黃囊膜血管生長(zhǎng)有明顯的刺激作用(圖7)。
2.圖像統(tǒng)計(jì)分析采用為本實(shí)驗(yàn)專(zhuān)門(mén)設(shè)計(jì)的圖像分析軟件針對(duì)重組人血管抑素對(duì)雞胚血管生成抑制活性進(jìn)行定量分析。本實(shí)驗(yàn)采用卵黃囊膜血管面積增長(zhǎng)率，卵黃囊膜血管密度增長(zhǎng)率及卵黃囊膜面積增長(zhǎng)率作為血管生成定量指標(biāo)(圖8)。重組人血管抑素組的卵黃囊膜血管密度增長(zhǎng)率顯著小于對(duì)照組(P均＜0.05)；而重組人血管抑素組的卵黃囊膜血管面積增長(zhǎng)率及卵黃囊膜面積增長(zhǎng)率也都極顯著小于對(duì)照組(P均＜0.01)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，雞胚YSM的血管生成能被重組人血管抑素顯著抑制(圖9)。
權(quán)利要求
1.一種雞胚卵黃囊膜血管生成試驗(yàn)?zāi)Ｐ偷姆椒ń?，包括以下步驟1)將雞卵置于正常孵化溫度下、有加濕水盤(pán)的孵箱中孵化50-70小時(shí)，再將雞卵內(nèi)容物傾倒入有蓋的無(wú)菌小玻璃燒杯中，繼續(xù)孵育8-16小時(shí)；2)挑選卵黃膜完整、血管網(wǎng)及胚盤(pán)發(fā)育良好的雞胚，雞胚隨機(jī)分成對(duì)照組和測(cè)試組，將硅膠環(huán)放置到雞胚的卵黃囊血管網(wǎng)上；3)對(duì)照組膠圈中加入含有促滲透劑的PBS溶液150-220微升；測(cè)試組膠圈中加入含待檢測(cè)藥物的上述對(duì)照溶液150-220微升，繼續(xù)孵育8-16小時(shí)后撤走硅膠環(huán)，對(duì)給藥前后卵黃囊血管面積或密度或卵黃囊膜面積變化進(jìn)行測(cè)定，測(cè)試組中卵黃囊膜血管面積或密度或卵黃囊膜面積增長(zhǎng)率明顯大于對(duì)照組的確定為血管生成刺激藥物，明顯低于對(duì)照組的確定為血管生成抑制藥物。
2.卵黃囊膜血管生成試驗(yàn)?zāi)Ｐ驮跈z測(cè)和篩選影響血管生成藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明為一種雞胚卵黃囊膜血管生成模型，本模型是用于檢測(cè)或篩選對(duì)新生血管生成具有影響作用藥物的活體實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?。本發(fā)明的主要步驟是將孵化60小時(shí)的雞胚離殼后移入小燒杯中，繼續(xù)孵育12小時(shí)，將待測(cè)藥物加入到放置在卵黃囊膜上的硅膠環(huán)內(nèi)，在對(duì)照液和待測(cè)藥液中都含有甘油或二甲基亞砜作為滲透劑，12小時(shí)后取下硅膠環(huán)，開(kāi)始動(dòng)態(tài)觀察藥物對(duì)卵黃囊膜血管生成的影響作用。根據(jù)卵黃囊膜血管在影響血管生成藥物作用下表現(xiàn)出相應(yīng)的生長(zhǎng)狀態(tài)，判斷出檢測(cè)藥物對(duì)血管生成具有抑制還是刺激作用或無(wú)作用，使本發(fā)明與傳統(tǒng)的雞胚尿囊膜血管生成試驗(yàn)?zāi)Ｐ拖啾?，具有?jiǎn)單、直觀、快速、準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)A61D99/00GK101041080SQ20071005554
公開(kāi)日2007年9月26日 申請(qǐng)日期2007年4月20日 優(yōu)先權(quán)日2007年4月20日
發(fā)明者烏垠, 李玉新, 鮑永利, 王紅梅 申請(qǐng)人:東北師范大學(xué)遺傳與細(xì)胞研究所