專利名稱：一種提高超聲波破碎效率的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種提高超聲波破碎效率的方法，適用于基因工程和細(xì)胞工程中的細(xì)胞破壁，從而利用胞內(nèi)制藥和提取活性物質(zhì)。

背景技術(shù)：
現(xiàn)代生物制藥產(chǎn)業(yè)中，為了提取微生物和藻類細(xì)胞內(nèi)的活性物質(zhì)，常常需要進(jìn)行細(xì)胞破碎。在細(xì)胞破碎時(shí)，通常不用化學(xué)法或生物化學(xué)法，以免有外加化學(xué)物質(zhì)污染目的產(chǎn)物，一般用物理或機(jī)械法。適用于實(shí)驗(yàn)室內(nèi)小規(guī)模的細(xì)胞破碎的物理或機(jī)械法有French壓榨法、珠磨法、超聲波和凍融法。珠磨法中，在珠磨機(jī)的破碎室內(nèi)填充玻璃或氧化鋯微珠，填充率為80％-85％。在攪拌漿的高速攪拌下微珠高速運(yùn)動(dòng)，微珠和微珠之間以及微珠和細(xì)胞之間發(fā)生沖擊和研磨，使懸浮液中的細(xì)胞受到研磨剪切和撞擊而破碎。珠磨破碎操作的有效能量利用率僅為1％左右，破碎過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生大量的熱能，因此，在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中應(yīng)充分考慮換熱能力問(wèn)題。
超聲波破碎法是利用發(fā)射15-25kHz的超聲波探頭處理細(xì)胞懸浮液。超聲波破碎是很強(qiáng)烈的破碎方法，適用于多數(shù)微生物和藻類的破碎。超聲波破碎的有效能量利用率極低，操作過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生極大的熱量，所以在實(shí)驗(yàn)中需在冰水中進(jìn)行，防止胞內(nèi)生化物質(zhì)變性失活。


發(fā)明內(nèi)容
將實(shí)驗(yàn)室中用于細(xì)胞破碎的兩種方法——超聲波破碎法和珠磨法聯(lián)合使用，在超聲波破碎的同時(shí)向破碎液中加入70-100目的經(jīng)過(guò)預(yù)處理過(guò)的石英砂，使石英砂的填充率達(dá)到5％-10％，可以大大提高破碎效率，縮短破碎時(shí)間，降低能耗，同時(shí)，可以防止長(zhǎng)時(shí)間超聲波破碎時(shí)產(chǎn)生的大量熱能使蛋白變性失活。
由于石英砂在制作過(guò)程中不同于實(shí)驗(yàn)室使用的其它藥品，在使用石英砂之前應(yīng)對(duì)石英砂做預(yù)處理，具體方法是用0.1mol/L的HCL反復(fù)沖洗石英砂3遍，后用蒸餾水調(diào)PH至中性，用超聲波對(duì)石英砂進(jìn)行超聲處理至上清清澈，用75％的無(wú)水乙醇封存。使用前，將無(wú)水乙醇洗凈并將PH值調(diào)至中性。使用后的石英砂在洗凈后可以反復(fù)使用多次。
本專利技術(shù)主要應(yīng)用于基因工程和細(xì)胞工程等技術(shù)等領(lǐng)域。



圖1，加入石英砂的樣品的破碎率明顯增高。添加石英砂后，破碎6min時(shí)的細(xì)胞破碎率和不添加石英砂時(shí)破碎8min時(shí)的細(xì)胞破碎率相當(dāng)。
圖2，加入石英砂后，隨著細(xì)胞破碎率的提高，蛋白質(zhì)溶出率明顯增高。但是在添加石英砂利不添加石英砂的樣品中，破碎8min后，總蛋白含量均有下降。

具體實(shí)施例方式 實(shí)驗(yàn)1 取等量濕藻體溶于Tris-HCl緩沖液(EDTA3.7240g/L，pH＝7.5，NaCl0.2mol/L)中，以50ml為一份，共配置等體積兩分。向其中一份中加入適量石英砂，每隔一分鐘取樣一次，以細(xì)胞破碎率、上清中總蛋白含量研究石英砂對(duì)超聲波破碎的影響。(圖1、2) 實(shí)驗(yàn)2 取適量濕藻體溶于Tris-HCl緩沖液(EDTA3.7240g/L，pH＝7.5，NaCl0.2mol/L)中，按每份總體積50ml配制9份。根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)，設(shè)石英砂添加量(A)、超聲波功率(B)、破碎時(shí)間(C)和破碎液濃度(D)四個(gè)因素，每個(gè)因素下設(shè)3個(gè)水平，取L9(34)正交表進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，以細(xì)胞破碎率、上清中總蛋白含量對(duì)超聲波破碎條件進(jìn)行優(yōu)化。具體實(shí)驗(yàn)方案如表1所示。
表1超聲波破碎條件實(shí)驗(yàn)方案 根據(jù)表2、3可知，影響細(xì)胞破碎率的主次因素為A＞C＞D＞B，實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)最優(yōu)條件為A3C3D3B3。
表2超聲波破碎后細(xì)胞破碎率直觀分析表 表3超聲波破碎后細(xì)胞破碎率方差分析表 根據(jù)表4、5可知，影響總蛋白含量的主次因素為A＞C＞D＞B，實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)的最優(yōu)實(shí)驗(yàn)條件為A3C3D3B2。
表4超聲波破碎后總蛋白含量(μg/μl)直觀分析表 表5超聲波破碎后總蛋白含量方差分析表 實(shí)驗(yàn)3 取轉(zhuǎn)人腫瘤壞死因子-α(TNF-α)基因的工程魚腥藻，稱適量溶于Tris-HCl緩沖液(EDTA3.7240g/L，pH＝7.5，NaCl0.2mol/L)中，按每份總體積50ml配制2份，向其中一份中加入適量的石英砂。在兩份樣品的細(xì)胞破碎率達(dá)到93％時(shí)，用ELISA測(cè)定破碎后上清中的TNF-ct含量，以測(cè)定優(yōu)化后的超聲波破碎條件對(duì)目的蛋白的保護(hù)作用。
根據(jù)下表可知，在相同破碎條件下，添加石英砂后TNF-α的含量上升約17.5％。
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權(quán)利要求
1、提高超聲波破碎效率的方法
在使用超聲波破碎細(xì)胞時(shí)，向破碎液中加入適量的石英砂或玻璃渣等填充物，可以提高破碎效率。
2、超聲波破碎條件優(yōu)化
加入石英砂后，對(duì)超聲波破碎條件進(jìn)行優(yōu)化，可以縮短破碎時(shí)間，在保證蛋白質(zhì)活性的同時(shí)提高破碎效率。
全文摘要
本發(fā)明技術(shù)屬于生物科學(xué)和生物技術(shù)等領(lǐng)域。在超聲波破碎的同時(shí)，向破碎液中加入適量的石英砂或玻璃渣等填充物，可以提高破碎效率，縮短破碎時(shí)間，減少能耗，降低由于高溫而使蛋白質(zhì)變性失活的可能。本發(fā)明技術(shù)主要應(yīng)用于細(xì)胞工程和基因工程中細(xì)胞破壁等領(lǐng)域。
文檔編號(hào)B02C19/18GK101100642SQ20071005764
公開(kāi)日2008年1月9日 申請(qǐng)日期2007年6月15日 優(yōu)先權(quán)日2007年6月15日
發(fā)明者施定基, 軒 李, 丹 李, 悅 王, 趙興貴, 宋冬輝 申請(qǐng)人:天津科技大學(xué)