專利名稱：一種奶牛再克隆的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于胚胎生物工程領(lǐng)域，特別是一種奶牛再克隆的方法。
背景技術(shù)：
克隆綿羊Dolly的誕生，動(dòng)物克隆從此進(jìn)入體細(xì)胞克隆時(shí)代。緊隨Dolly羊之后，許多實(shí)驗(yàn)室開(kāi)展體細(xì)胞克隆研究，各種克隆動(dòng)物相繼問(wèn)世(Baguisi，1999；Wakayama，1998；Kao，1998；Onishi，2000；Shin，2002；Chense，2002；Galli，2003；Woods，2003)。通過(guò)體細(xì)胞克隆技術(shù)，人們可以獲得無(wú)數(shù)同質(zhì)個(gè)體，克服了胚胎細(xì)胞克隆只能達(dá)到有限個(gè)體的缺點(diǎn)。目前該技術(shù)除了在動(dòng)物保種繁衍方面的應(yīng)用之外，已在轉(zhuǎn)基因方面、胚胎干細(xì)胞方面得到了應(yīng)用，已顯示出誘人的應(yīng)用前景。
體細(xì)胞克隆技術(shù)是動(dòng)物保種重要方法之一。通過(guò)體細(xì)胞克隆技術(shù)進(jìn)行保種，可以把一個(gè)動(dòng)物的體細(xì)胞變成一只動(dòng)物。如果要保存一個(gè)物種，就可以先擬定出保持遺傳穩(wěn)定性的動(dòng)物個(gè)體數(shù)，然后在每一頭動(dòng)物身上采集成千上萬(wàn)細(xì)胞，進(jìn)行永久性保存，若需重現(xiàn)一個(gè)動(dòng)物物種或品種時(shí)，只需進(jìn)行同種或異種克隆，就可以獲得這種動(dòng)物。一個(gè)動(dòng)物的體細(xì)胞可以保存在一個(gè)小管內(nèi)，一個(gè)品種或一個(gè)物種就可以保存在一個(gè)小盒內(nèi)，我國(guó)的動(dòng)物物種也許可以裝在一間大房里，這樣就可以建立一個(gè)名副其實(shí)的基因庫(kù)。Comizzoli等(2000)認(rèn)為體細(xì)胞核移植也為拯救珍稀瀕危動(dòng)物開(kāi)辟了一條新的途徑。1998年新西蘭的Wells等(1999)利用這一技術(shù)成功地克隆了當(dāng)?shù)匾活^瀕臨滅種土種牛2000年美國(guó)的Lanza等(2000)通過(guò)種間核移植的方法用家牛的卵母細(xì)胞獲得了種間核移植胚胎，移植到家牛后獲得了妊娠并生出了后代；1999我國(guó)陳大元等用兔卵母細(xì)胞獲得了種間核移植的大熊貓胚胎，這些結(jié)果表明通過(guò)體細(xì)胞核移植方法增加瀕危動(dòng)物的數(shù)量是可行的，通過(guò)種間核移植方法保護(hù)珍稀動(dòng)物可能在不久的將來(lái)會(huì)有突破性的進(jìn)展。
體細(xì)胞克隆技術(shù)還處于研究階段，體細(xì)胞克隆還存在一些問(wèn)題1)結(jié)果不穩(wěn)定，效率低 目前，克隆綿羊只有3％左右的重組胚能發(fā)育為正常后代。在克隆牛的研究過(guò)程中，根據(jù)kato等的結(jié)果，重組胚的囊胚發(fā)育率最高能達(dá)到49％，約有80％的移植胚能發(fā)育為正常胎兒，但胎兒出生后的死亡率達(dá)到50％。Cibelli等在克隆牛的生產(chǎn)過(guò)程中，重組胚的囊胚率僅為17％，移植后只有14％的囊胚發(fā)育正常后代?？寺⌒∈髢H在夏威夷大學(xué)醫(yī)學(xué)院獲得成功，只有2％-3％的重構(gòu)胚能發(fā)育產(chǎn)仔，仔鼠死亡率也高達(dá)40％o以上結(jié)果表明體細(xì)胞克隆技術(shù)僅處于初步研究階段，還需要在其他動(dòng)物上進(jìn)一步研究，提高生產(chǎn)效率。
2)后代死亡率高 胎兒出生后的高死亡率也是體細(xì)胞克隆面臨的問(wèn)題之一，出現(xiàn)這一現(xiàn)象的原因還不清楚。目前只能從優(yōu)化培養(yǎng)條件及操作程序入手以減少胎兒死亡率。
3)用其它體細(xì)胞作供體的探索 目前，用于體細(xì)胞克隆的供體細(xì)胞種類很有限，其它細(xì)胞通過(guò)核移植能否成功有待進(jìn)一步探討。
4)細(xì)胞質(zhì)遺傳問(wèn)題在小鼠和牛的克隆研究中，人們發(fā)現(xiàn)細(xì)胞質(zhì)的遺傳物質(zhì)影響克隆后代的表型，如花斑、毛色等，這是由供體細(xì)胞線粒體DNA，還是由卵子細(xì)胞質(zhì)中的遺傳物質(zhì)引起還不清楚。細(xì)胞質(zhì)中的遺傳物質(zhì)對(duì)克隆后代的其它性狀是否產(chǎn)生影響還需要進(jìn)一步探討.隨著克隆技術(shù)的發(fā)展，細(xì)胞質(zhì)中遺傳物質(zhì)的作用會(huì)越來(lái)越引起人們的重視。
5)供體細(xì)胞的保存和細(xì)胞周期的影響 體細(xì)胞克隆的最大優(yōu)勢(shì)之一是供體細(xì)胞可培養(yǎng)傳代及冷凍保存。但在傳代及冷凍過(guò)程中，細(xì)胞核中遺傳物質(zhì)的損傷及變異勢(shì)必影響克隆胚胎的發(fā)育。同時(shí)，供體細(xì)胞周期直接影響克隆效率，但對(duì)這些問(wèn)題目前知之甚少，急需加以研究。
用克隆動(dòng)物的體細(xì)胞再次進(jìn)行克隆，稱為再克隆。在理論上，通過(guò)克隆和再克隆，可獲得無(wú)限多的克隆動(dòng)物。再克隆技術(shù)與克隆技術(shù)基本原理是一致的，但再克隆技術(shù)進(jìn)一步放大克隆效果，延伸克隆的內(nèi)涵，進(jìn)行再克隆研究將有助于解決上述問(wèn)題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對(duì)上述領(lǐng)域中的缺陷，提供一種奶牛的再克隆方法，使克隆效果再次放大，是提高克隆效率的有效方法之一。
一種奶牛的再克隆方法，包括供體細(xì)胞和受體卵母細(xì)胞培養(yǎng)，核移植、融合與激活，重構(gòu)胚的培養(yǎng)和重構(gòu)胚移植，其特征在于所述受體細(xì)胞的培養(yǎng)液中添加有M199+10％FCS+10μg/ml FSH+1μg/ml LH+1μg/ml Estradiol+0.0625g Penicillium+0.05gStreptomycin+0.57mmol/ml Cysteine+1mmol/ml L-Glutamine+10ng/ml EGF(Epidermal GrowthFactor)；供體細(xì)胞的培養(yǎng)液中添加有1LDMEM(干粉)+2.75g NaHCO3+10％FCS+1mmol/LNa-Pyruvate+1mmol/ml L-Glutamine+0.0625g Penicillium+0.05g Streptomycin+0.1mmol/Lβ-Mercaptoethanol+10ng/ml EGF。
所述重構(gòu)胚的培養(yǎng)采用分三階段培養(yǎng)，所述第一階段的培養(yǎng)液為CR1+1％NEAA+1％EAA+1mmol/ml L-Glutamine+4mg/ml FAF-BSA+0.0625g Penicillium+0.05gStreptomycin，培育時(shí)間0-2天；所述第二階段的培養(yǎng)液第一階段培養(yǎng)液和單層顆粒細(xì)胞，培育時(shí)間2-5天；第三階段的培養(yǎng)液第二階段培養(yǎng)液加入葡萄糖，其濃度為1mg/ml，培養(yǎng)時(shí)間5-9天。
所述激活采用A23187、CHX和CD聯(lián)合激活，激活時(shí)間在卵母細(xì)胞成熟后25小時(shí)進(jìn)行激活處理。
所述激活處理分三步進(jìn)行1.CR1aa+5μmolA23187+1mg/mlFAF-BSA，在38.5℃處理4min；2.移入CR1aa+10μg/ml CHX+3μg/ml CD處理1小時(shí)；3.在含10μg/ml CHX的CR1-aa中繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)。
所述重構(gòu)胚移植到比它晚一天發(fā)情受體牛的子宮內(nèi)。
本發(fā)明一種奶牛的再克隆方法，供體核是第一代克隆牛的體細(xì)胞。再克隆技術(shù)的步驟與克隆技術(shù)的步驟相同，本發(fā)明為提高克隆效率，首先優(yōu)化了供體細(xì)胞和受體細(xì)胞的培養(yǎng)條件，添加了一些有效成分，如Cysteine、L-Glutamine、EGF(Epidermal Growth Factor)和β-Mercaptoethanol等。這些成分都能促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育，可提高細(xì)胞質(zhì)成熟度，增強(qiáng)細(xì)胞活力，進(jìn)而增強(qiáng)重構(gòu)胚的生命力，有助于提高克隆胚胎妊娠率，降低胎兒的出生死亡率。這些有效成分對(duì)細(xì)胞具體作用如下Cysteine是構(gòu)成GSH(谷胱苷肽)的重要成分，GSH可通過(guò)氧化-還原作用使卵母細(xì)胞免受氧化損失，同時(shí)可以清除卵母細(xì)胞內(nèi)的自由基，提高卵母細(xì)胞整體發(fā)育水平。GSH的代謝途徑使胞質(zhì)成熟過(guò)程的重要組成部分，不但能促進(jìn)卵母細(xì)胞成熟，對(duì)早期胚胎發(fā)育也有促進(jìn)作用。
添加L-Glutamine能促進(jìn)各種氨基酸進(jìn)入細(xì)胞膜，它所含的氨基是核酸中嘌呤和嘧啶的來(lái)源，也是能量和碳的來(lái)源，可見(jiàn)卵母細(xì)胞需要L-Glutamine賴以合成核酸和蛋白質(zhì)，促進(jìn)胚胎生長(zhǎng)和分裂。
EGF是一種多肽的生長(zhǎng)因子。可以大大改善細(xì)胞發(fā)育環(huán)境，促進(jìn)細(xì)胞的核、質(zhì)成熟。
β-Mercaptoethanol也能促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)GSH的合成，提高細(xì)胞發(fā)育潛力和耐受力，防止細(xì)胞氧化凋亡。
針對(duì)重構(gòu)胚在不同發(fā)育階段對(duì)營(yíng)養(yǎng)需要以及自身特點(diǎn)，采用分階段培養(yǎng)方法來(lái)調(diào)整其培養(yǎng)液營(yíng)養(yǎng)成分，這樣更有利于重構(gòu)胚的生長(zhǎng)發(fā)育，同時(shí)可提高囊胚的發(fā)育率。在第二階段加入顆粒細(xì)胞共培養(yǎng)。與顆粒細(xì)胞共培養(yǎng)有助于克服胚胎體外發(fā)育阻斷，因?yàn)轭w粒細(xì)胞能分泌多肽和糖蛋白，起著促有絲分裂刺激因子作用，促進(jìn)胚胎分裂活動(dòng)，有效地克服牛胚胎8-16細(xì)胞的阻滯，所以在培養(yǎng)后第2天進(jìn)行了共培養(yǎng)。隨著胚胎發(fā)育，后期代謝越來(lái)越旺盛，需要更多能量，葡萄糖是最易被胚胎吸收的能量物質(zhì)，添加葡萄糖能及時(shí)補(bǔ)充胚胎發(fā)育所需能量。所以在第三階段的培養(yǎng)液是在第二階段的基礎(chǔ)上再添加葡萄糖。
本發(fā)明采用A23187、CHX和CD聯(lián)合激活，激活時(shí)間為卵母細(xì)胞成熟后25小時(shí)(卵母細(xì)胞開(kāi)始成熟為0小時(shí))，多數(shù)文獻(xiàn)記載的第一次克隆激活時(shí)間采用24小時(shí)，本發(fā)明激活延遲1小時(shí)，這樣增加供體核暴露在受體卵母胞質(zhì)的時(shí)間，可以使供核與胞質(zhì)充分相互作用，有助于修正第一次克隆造成核編程的錯(cuò)誤，所以激活比第一次克隆推遲1小時(shí)。
由于再克隆胚胎體外生長(zhǎng)發(fā)育動(dòng)力學(xué)與自然懷孕母牛胚胎的不一致，往往表現(xiàn)為發(fā)育遲緩，為了使受體子宮內(nèi)膜的發(fā)育與供體克隆胚胎發(fā)育時(shí)期相適應(yīng)，同時(shí)給移植到子宮內(nèi)再克隆胚胎一段恢復(fù)時(shí)間，選用比供體胚胎晚一些發(fā)情受體牛，二者方能同步正常發(fā)育。經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)證明，再克隆7天的囊胚移入發(fā)情6天的受體牛子宮內(nèi)更為合適。
本發(fā)明得到282個(gè)重構(gòu)胚，發(fā)育得到76個(gè)囊胚，移植28個(gè)囊胚，發(fā)育得到2頭再克隆奶牛，出生的再克隆牛外表和各項(xiàng)生理指標(biāo)都正常，經(jīng)DNA微衛(wèi)星分析結(jié)果表明，兩頭再克隆奶?；蛐团c克隆奶牛的完全相同。
總之，按照本發(fā)明的奶牛再克隆方法，成功獲得再克隆個(gè)體，出生死亡率為零，產(chǎn)犢率與第一次克隆基本一致，從整個(gè)操作程序來(lái)看，本方法應(yīng)該同樣適用奶牛的第一次克隆。
具體實(shí)施例方式
下面通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明。
實(shí)施例11.主要儀器設(shè)備、藥品顯微操作儀、電融儀、拉針和磨針儀、CO2培養(yǎng)箱、恒溫臺(tái)、視體顯微鏡、水浴鍋、恒溫箱、超凈臺(tái)。
所涉及的到的藥品及試劑均為市售產(chǎn)品。
2.牛群根據(jù)實(shí)驗(yàn)的要求，建立一個(gè)受體牛群，出生一頭克隆牛約需20頭受體牛。
3.供體細(xì)胞的準(zhǔn)備從克隆的荷斯坦奶牛牛耳部剪下一小塊組織后，用裝有0.9％生理鹽水的保溫瓶帶回實(shí)驗(yàn)室。在超凈臺(tái)內(nèi)剪下的耳組織，洗滌3次，剪碎、去軟骨，加適量0.25％的胰酶混勻后轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)瓶中4℃冷消化，18-20小時(shí)后在37℃熱消化40分鐘，消化好后，加入培養(yǎng)液1L DMEM(干粉)+2.75g NaHCO3+10％FCS(Fetal Calf Serum)+1mmol/L Na-Pyruvate+1mmol/mlL-Glutamine+0.0625gPenicillium+0.05gStreptomycin+0.1mmol/Lβ-Mercaptoethanol+10ng/mlEGF(Epidermal Growth Factor)，置于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞貼壁長(zhǎng)滿后，進(jìn)行傳代。將兩代以前的細(xì)胞冷凍保存。
根據(jù)實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)，在用前48小時(shí)解凍培養(yǎng)，用0.25％的胰酶37℃消化傳代或收集，收集起來(lái)的細(xì)胞，用移液器反復(fù)吹打，使細(xì)胞以單個(gè)懸浮，用于核移植。
4.卵母細(xì)胞的成熟從屠宰場(chǎng)收集卵巢。用加有雙抗25℃生理鹽水，在3小時(shí)之內(nèi)運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室。用注射器抽取卵巢上2-7mm大的卵泡，在體視解剖鏡下挑選包有完整顆粒細(xì)胞的卵母細(xì)胞(COCs)用于成熟培養(yǎng)。成熟培養(yǎng)液是由M199+10％FCS(Fetal Calf Serum)+10μg/mlFSH(Follicle-stimulating Hormone)+1μg/ml LH(Luteinizining Hormone)+1μg/ml Estradiol+0.0625g Penicillium+0.05g Streptomycin+0.57mmol/ml Cysteine+1mmol/ml L-Glutamine+10ng/mlEGF(Epidermal Growth Factor)構(gòu)成，在38.5℃，5％CO2，飽和濕度的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18小時(shí)。用0.2％Hyaluronidase脫去顆粒細(xì)胞，在體視顯微鏡下選擇有第一極體的、胞質(zhì)均勻一致的卵母細(xì)胞，置于含有10％血清的Hepes-199液中待用。
5.核移植卵母細(xì)胞的去核采用盲吸法。將20枚脫去顆粒細(xì)胞的成熟卵母細(xì)胞放入操作液滴的一端，操作液滴由Hepes-199，10％血清和7.5ug/ml Cytochalasin B組成，在室溫中預(yù)處理5分鐘后，用持卵針吸住一枚卵母細(xì)胞，調(diào)整極體的位置，使其第一極體位于時(shí)鐘2點(diǎn)的位置。用去核針將第一極體及其下部1/4-1/3物質(zhì)吸出，然后用去核針吸一個(gè)直徑為15-20μm的成纖維細(xì)胞，并從同一個(gè)切口注入到透明帶下，并使供體細(xì)胞膜與卵膜緊密接觸。
6.融合和激活用BTX ECM-2001(BTX，San Diego，USA)型細(xì)胞電融合儀進(jìn)行融合，融合液為0.28MMannitol+0.05mM CaCL2.2H2O+0.1mM MgCL2.6H2O+0.5mM Hepes+5mg/ml BSA(BovineSerum Albumin)。將卵母細(xì)胞和體細(xì)胞的復(fù)合體在電融合液中平衡2min，然后移入充滿電融合液兩電極間，用細(xì)玻璃針撥動(dòng)使體細(xì)胞與受體的接觸面與電極絲平行，以兩次1.3kv/cm、10μs直流電脈沖誘導(dǎo)融合，融合操作后0.5h觀察融合的情況。
所有融合再克隆胚胎在成熟后25h左右進(jìn)行激活處理(第一次克隆是在成熟后24小時(shí)進(jìn)行激活處理，卵母細(xì)胞開(kāi)始成熟培養(yǎng)為0h)。激活處理分三步進(jìn)行1.CR1aa+5μmolA23187+1mg/mlFAF-BSA(Fatty Acid Free-Bovine Serum Albumin)，在38.5℃處理4min；2.移入CR1aa+10μg/ml CHX(Cycloheximide)+3μg/ml CD(Cytochalasin D)處理1小時(shí)；3.在含10μg/ml CHX(Cycloheximide)的CR1-aa中繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)。
7.共培養(yǎng)顆粒細(xì)胞單層的制備用細(xì)的玻璃管將成熟液滴中的成熟卵母細(xì)胞吸出，將部分顆粒細(xì)胞留下，然后換入胚胎發(fā)育液[CR1+1％NEAA(Non-essential Amino Acids)+1％EAA(Essential Amino Acids)+1mmol/mlGlutamine+4mg/ml FAF-BSA(Fatty Acid Free-Bovine Serum Albumin)]，不久就形成顆粒細(xì)胞層，每2天換液一次，這是重構(gòu)胚的第二階段的共培養(yǎng)液滴。
8.重構(gòu)胚發(fā)育第一階段(0-2天)重構(gòu)胚在發(fā)育液CR1+1％NEAA+1％EAA+1mmol/ml L-Glutamine+4mg/ml FAF-BSA+0.0625g Penicillium+0.05g Streptomycin中培養(yǎng)發(fā)育。第二階段(2-5天)將發(fā)育2天的重構(gòu)胚移入共培養(yǎng)的液滴(CR1+1％NEAA+1％EAA+1mmol/ml L-Glutamine+4mg/ml FAF-BSA+0.0625g Penicillium+0.05g Streptomycin和顆粒細(xì)胞層)中。第三階段(5-9天)在第5天胚胎的培養(yǎng)液內(nèi)加入葡萄糖，其濃度為1mg/ml。每2天換液一次，第6天后記錄桑椹胚和囊胚的數(shù)量，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
9.胚胎移植將1枚形態(tài)良好的囊胚移入比它晚一天的發(fā)情受體牛子宮內(nèi)(比如，第7天的囊胚移植到發(fā)情第6天受體牛子宮內(nèi))2個(gè)月后，通過(guò)B-超和確定懷孕情況。如果沒(méi)有合適發(fā)情受體牛，將重構(gòu)胚冷凍保存，以后在移植。
10.再克隆犢牛出生在妊娠期間，用B-超觀察胎兒發(fā)育情況，在臨產(chǎn)前發(fā)現(xiàn)胎兒過(guò)大或胎位不正，進(jìn)行剖腹產(chǎn)，如果胎兒發(fā)育正常讓它自然分娩。
本發(fā)明得到282個(gè)重構(gòu)胚，發(fā)育得到76個(gè)囊胚，囊胚率為26.9％(76/282)；移植28個(gè)囊胚，得到2頭再克隆奶牛，產(chǎn)犢率為7.1％(2/28)，出生的再克隆牛外型和各項(xiàng)生理指標(biāo)都正常。本發(fā)明方法的囊胚率和出生率都得到了提高，以致克隆效率獲得很大提高。
DNA微衛(wèi)星分析結(jié)果表明，兩頭再克隆奶牛基因型與克隆奶牛的完全相同，表明本發(fā)明奶牛的再克隆方法是可行的。
權(quán)利要求
1.一種奶牛的再克隆方法，包括供體細(xì)胞培養(yǎng)、受體卵母細(xì)胞培養(yǎng)，核移植、融合與激活，重構(gòu)胚的培養(yǎng)和重構(gòu)胚移植，其特征在于所述受體卵母細(xì)胞的培養(yǎng)液中添加有M199+10％FCS+10μg/ml FSH+1μg/ml LH+1μg/ml Estradiol+0.0625g Penicillium+0.05gStreptomycin+0.57mmol/ml Cysteine+1mmol/ml L-Glutamine+10ng/ml EGF；供體細(xì)胞的培養(yǎng)液中添加有1LDMEM干粉+2.75g NaHCO3+10％FCS+1mmol/L Na-Pyruvate+1mmol/mlL-Glutamine+0.0625g Penicillium+0.05g Streptomycin+0.1mmol/L β-Mercaptoethanol+10ng/ml EGF。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的奶牛的再克隆方法，所述重構(gòu)胚的培養(yǎng)采用分三階段培養(yǎng)，所述第一階段的培養(yǎng)液為CR1+1％NEAA+1％EAA+1mmol/ml L-Glutamine+4mg/mlFAF-BSA+0.0625g Penicillium+0.05g Streptomycin，培育時(shí)間0-2天；所述第二階段的培養(yǎng)液第一階段培養(yǎng)液和單層顆粒細(xì)胞，培育時(shí)間2-5天；第三階段的培養(yǎng)液第二階段培養(yǎng)液加入葡萄糖，葡萄糖濃度為1mg/ml，培養(yǎng)時(shí)間5-9天。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的奶牛的再克隆方法，所述激活采用A23187、CHX和CD聯(lián)合激活，激活時(shí)間在卵母細(xì)胞成熟后25小時(shí)進(jìn)行激活處理。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的奶牛的再克隆方法，所述激活處理分三步進(jìn)行1.CR1aa+5μmolA23187+1mg/mlFAF-BSA，在38.5℃處理4min；2.移入CR1aa+10μg/ml CHX+3μg/ml CD處理1小時(shí)；3.在含10μg/ml CHX的CR1-aa中繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的奶牛的再克隆方法，所述重構(gòu)胚移植到比它晚一天發(fā)情受體牛的子宮內(nèi)。
全文摘要
本發(fā)明涉及“一種奶牛的再克隆方法”包括供體細(xì)胞和受體卵母細(xì)胞培養(yǎng)，核移植、融合與激活，重構(gòu)胚的培養(yǎng)和重構(gòu)胚移植，其特征在于所述受體細(xì)胞的培養(yǎng)液中添加有M199+10％FCS+10μg/ml FSH+1μg/ml LH+1μg/ml Estradiol+0.0625g Penicillium+0.05gStreptomycin+0.57mmol/ml Cysteine+1mmol/ml L－Glutamine+10ng/ml EGF(Epidermal GrowthFactor)；供體細(xì)胞的培養(yǎng)液中添加有1L DMEM(干粉)+2.75g NaHCO
文檔編號(hào)A61D19/00GK101050458SQ20071006476
公開(kāi)日2007年10月10日 申請(qǐng)日期2007年3月26日 優(yōu)先權(quán)日2007年3月26日
發(fā)明者張家新, 王海, 張向利, 趙孟彬, 張紅霞, 郭麗麗, 安晶, 王月, 郭敏 申請(qǐng)人:北京錦繡大地農(nóng)業(yè)股份有限公司