專利名稱：利用分子標(biāo)記輔助選擇快速轉(zhuǎn)育青花菜不育系的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于雜種優(yōu)勢(shì)利用領(lǐng)域，具體地說，本發(fā)明涉及一種青花菜胞質(zhì)雄性不育系的選育技術(shù)，特別是一種利用分子標(biāo)記輔助選擇快速培育青花菜雄性不育系的方法。
背景技術(shù)：
青花菜，隸屬十字花科(Cruciferae)蕓薹屬甘藍(lán)種中以綠或紫色花球?yàn)楫a(chǎn)品的一個(gè)變種，一、二年生草本植物。學(xué)名Brassica oleracea L.var.italica Planch.染色體數(shù)2n＝2x＝18。青花菜富含維生素C、維生素B1、B2、B5等，并含有抗癌物質(zhì)，因而深受國(guó)內(nèi)外消費(fèi)者的歡迎。青花菜是由甘藍(lán)演化而來，演化中心為地中海東部沿岸地區(qū)。在我國(guó)栽培歷史很短，但發(fā)展很快，在我國(guó)已經(jīng)成為一些地區(qū)出口創(chuàng)匯的重要蔬菜。八十年代，我國(guó)開始引進(jìn)了一些國(guó)外青花菜品種；九十年代，青花菜種植面積快速增長(zhǎng)，但國(guó)內(nèi)青花菜育種遠(yuǎn)遠(yuǎn)落后于十字花科其他種類。目前我國(guó)的育種主要以提純復(fù)壯、系統(tǒng)選育的傳統(tǒng)育種方法為主。生產(chǎn)上應(yīng)用的品種90％以上依賴進(jìn)口，生產(chǎn)上亟待培育有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的優(yōu)良品種。
青花菜是典型的異花授粉作物，品種或自交系間的一代雜種存在明顯的雜種優(yōu)勢(shì)。目前雜交品種多采用自交不親和系，但是由于親本繁殖困難，有時(shí)會(huì)因多代自交后自交系生活力下降，而且易受環(huán)境影響，很難保證100％的雜交率。雄性不育系是青花菜生產(chǎn)一代雜種的理想系統(tǒng)。因此，青花菜雄性不育系的選育及其應(yīng)用研究深受重視。選育并利用雄性不育系生產(chǎn)一代種子，可簡(jiǎn)化制種手續(xù)，節(jié)省成本，并能確保一代雜種的種子純度。青花菜胞質(zhì)雄性不育系繁制一代雜交種子，其生產(chǎn)成本為自交不親系的80％左右，雜交種子的雜交率可達(dá)到100％，不需要進(jìn)行雜交種的純度鑒定，從而節(jié)省時(shí)間，有利于雜交種子的銷售。但是國(guó)內(nèi)青花菜雄性不育系的選育起步較晚，對(duì)雄性不育遺傳規(guī)律的認(rèn)識(shí)還停留在形態(tài)學(xué)和細(xì)胞學(xué)水平，產(chǎn)生雄性不育的分子機(jī)理還不清楚，國(guó)內(nèi)青花菜種質(zhì)資源較為缺乏而且遺傳背景狹窄，國(guó)外引進(jìn)的雄性不育系均為雜種F1代，選育可供生產(chǎn)上利用的不育系還需要通過轉(zhuǎn)育、選擇配合力測(cè)定等一系列工作，轉(zhuǎn)育周期很長(zhǎng)，限制了雄性不育系在生產(chǎn)上的進(jìn)一步應(yīng)用。
分子標(biāo)記方法是實(shí)現(xiàn)作物快速、高效育種的手段。它不受環(huán)境因素變化的影響，結(jié)果可靠，其技術(shù)的核心是獲得與育種目標(biāo)性狀緊密連鎖的分子標(biāo)記，通過PCR技術(shù)實(shí)現(xiàn)其輔助育種的目標(biāo)。目前已獲得了不少與青花菜質(zhì)量性狀緊密連鎖的分子標(biāo)記，并得到了廣泛應(yīng)用。但同青花菜不育系和保持系特異連鎖的分子標(biāo)記尚未見報(bào)道。所以本發(fā)明在鑒定分離青花菜不育系或保持系緊密連鎖的分子標(biāo)記基礎(chǔ)上，建立分子標(biāo)記輔助選擇方法快速轉(zhuǎn)育青花菜雄性不育系的方法。由于利用青花菜胞質(zhì)雄性不育系繁制雜交種子節(jié)約成本，可降低雜交新品種種子價(jià)格，因而有利于新品種的迅速推廣，能夠使新品種更快發(fā)揮出巨大的社會(huì)效益。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對(duì)目前青花菜雜交種常規(guī)制種成本高、雜交種子主要依賴進(jìn)口、價(jià)格昂貴且純度及種源難以保證這一現(xiàn)狀，提出一種利用分子標(biāo)記輔助選擇快速轉(zhuǎn)育青花菜胞質(zhì)雄性不育系的方法。
本發(fā)明為達(dá)到以上目的，是通過這樣的技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的，包括以下步驟1.選擇青花菜胞質(zhì)雄性不育雜合體為母本，以優(yōu)良的青花菜自交系為輪回親本，進(jìn)行常規(guī)有性雜交，所得的雜種一代F1再與輪回親本回交，得到回交一代BC1F1分離群體，種植于田間；2.利用與雄性不育連鎖的特異分子標(biāo)記，其具序列1，序列2的特征；采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)PCR檢測(cè)并對(duì)上述植株苗期選擇含目標(biāo)基因的單株；3.利用與優(yōu)良保持系具有緊密連鎖性的特異SCAR和AFLP標(biāo)記對(duì)上述單株遺傳背景實(shí)施選擇，選出輪回親本遺傳背景最多的單株；4.選取上述入選單株，待開花時(shí)以此為母本，以輪回親本為父本，進(jìn)行回交，得到回交二代BC2F1；成熟后，選取若干個(gè)綜合性狀好的套袋單株進(jìn)行收種并種植；5.然后重復(fù)步驟2)至步驟4)，通過3-4代的回交就能獲得不育性穩(wěn)定的，純度較高的青花菜不育系，輪回親本即為相應(yīng)的保持系。
所述采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)PCR檢測(cè)方法包括以下步驟1)植株的基因組DNA的提取；2)以序列1(5’-TGC ATTGTCTAGAAGTGGTGA)和和序列2(5’-GAAGAATGAAAAGTGGAATGG)所述的核苷酸分子為引物，對(duì)上述基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增；3)對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳，凡呈現(xiàn)DNA條帶的樣品記錄即為陽(yáng)性樣品。
所述利用AFLP分子標(biāo)記篩選遺傳背景的方法包括以下步驟
1)利用SDS法提取青花菜回交各世代單株基因組DNA；2)在37℃對(duì)各待測(cè)單株的DNA進(jìn)行限制性內(nèi)切酶MseI和EcoRI雙酶消化5小時(shí)后，再在65℃滅活30-45分鐘，然后加入T4DNA連接酶在22℃連接4小時(shí)或室溫過夜；3)取酶切連接產(chǎn)物加入EcoRI引物和MseI引物以及TaqDNA聚合酶在56℃的退火溫度下進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增；4)取預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物加入EcoRI+3引物和MseI+3引物以及Taq DNA聚合酶，在65℃向56℃遞減的退火溫度下進(jìn)行選擇性擴(kuò)增；5)PCR產(chǎn)物在6-8％的聚丙烯酞胺凝膠上點(diǎn)樣，在70瓦功率下電泳3-4小時(shí)分離PCR產(chǎn)物；電泳完畢取下膠板按銀染程序進(jìn)行染色與顯影；6)讀取各樣品的AFLP帶型，計(jì)算各樣品恢復(fù)輪回親本基因型的比率。
本發(fā)明具有的有益效果1.利用能穩(wěn)定遺傳的且不受光照、溫度環(huán)境影響的青花菜胞質(zhì)雄性不育系作為不育源通過回交轉(zhuǎn)育的方法選育符合育種目標(biāo)需求的新的青花菜胞質(zhì)雄性不育系，該方法實(shí)用可行。本發(fā)明利用該方法育成了青花菜胞質(zhì)雄性不育系，育成的新的青花菜胞質(zhì)不育系不受光照或溫度的影響能夠穩(wěn)定地遺傳，為青花菜的雜種優(yōu)勢(shì)利用開創(chuàng)了新的途徑；2.通過對(duì)與目標(biāo)基因共分離和緊密連鎖分子標(biāo)記基因型的PCR分析和選擇，有效地解決了青花菜常規(guī)回交育種中長(zhǎng)期存在的連鎖累贅問題，即由于不利基因與目標(biāo)基因緊密連鎖致使所得改良體與預(yù)期的目標(biāo)不盡一致的現(xiàn)象；通過運(yùn)用AFLP技術(shù)對(duì)各回交后代個(gè)體基因組的背景選擇，有效地解決了青花菜常規(guī)回交育種中輪回親本基因型恢復(fù)的偏離問題，使得在改良目標(biāo)性狀的同時(shí)，原輪回親本所特有的高配合力、強(qiáng)適應(yīng)性等優(yōu)良性狀得以保持，因而改良體可以替代原輪回親本直接用于雜種生產(chǎn)；3.利用分子標(biāo)記輔助選擇的方法可以加快不育系轉(zhuǎn)育速度，回交3代即可獲得整齊度達(dá)到95％以上的雄性不育系。而常規(guī)的方法需要7-8代才能達(dá)到這個(gè)純度?？s短不育系回交世代，加快育種速度，減少育種的盲目性。使用本發(fā)明方法能顯著減少各世代群體數(shù)量，提高育種效率。其中，BC2代可由常規(guī)BC2由800株減少至60株左右，而不影響選擇效果。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明利用分子標(biāo)記快速培育青花菜不育系的方法，是一種選用特定的分子標(biāo)記、并結(jié)合常規(guī)PCR配套技術(shù)和普通育種技術(shù)的方法?？删唧w依次進(jìn)行以下步驟1)選擇青花菜胞質(zhì)雄性不育雜合體725為母本，以綜合性狀優(yōu)良的青花菜自交系718為父本，進(jìn)行常規(guī)有性雜交，獲得F1代種子。F1單株播于田間，待其開花后，選擇2-3個(gè)F1單株，取父本718的花粉，授予F1植株上，獲得BC1分離群體種子，種植于田間2)先利用特定PCR引物對(duì)序列1(5’-TGCATTGTCTAGAAGTGGTGA)和序列2(5’-GAAGAATGAAAAGTGGAATGG)對(duì)BC1單株進(jìn)行分子標(biāo)記輔助選育，其步驟如下A、DNA樣品制備0.2g單株嫩葉樣品，加入600μL(預(yù)熱65℃)提取緩沖液，40μL SDS混勻，65℃水浴30min。加入200μL 5M KAc，冰浴60min。離心20min(4℃，12000g)，上清轉(zhuǎn)入新離心管。0.7倍體積(650μL)異丙醇，離心，去上清，加入120μL TE.加2μL RNase，37℃溫浴60min。加400μL TE，600μL酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)抽提，離心10min(10℃，12000g)，上清液轉(zhuǎn)入新離心管。加400μL氯仿∶異戊醇(24∶1)抽提，4℃，12 000g，10min，取上清于新離心管。加1/10體積3M NaAc，2×體積無水乙醇，-20℃，2h，4℃，12000g離心10min。400μL預(yù)冷的75％乙醇洗DNA 1次，干燥。溶于100μL TE。取5μL DNA樣品在0.8％Agarose膠上電泳，檢測(cè)DNA的分子大小。同時(shí)取2μL稀釋50測(cè)OD260/OD280，檢測(cè)DNA含量及質(zhì)量。-20℃保存?zhèn)溆谩?br> B、PCR反應(yīng)在GeneAMP PCR System9700型PCR儀上進(jìn)行。PCR反應(yīng)總體系為20μL，其中樣品DNA模板約30ng，1.0×PCR(含Mg2+)反應(yīng)緩沖液，10mmol/L dNTP，上下游引物10μmol/L，Taq DNA聚合酶0.5U?；靹蚝筮M(jìn)行PCR反應(yīng)第一步94℃預(yù)變性4min，第二步94℃變性保溫1min，58℃退火1min，72℃延伸1.5min，并循環(huán)30次；第三步72℃延伸保溫10min，結(jié)束反應(yīng)。C、凝膠電泳配制1.0-1.2％瓊脂糖凝膠(含0.5-1.0μg/ml的溴化乙錠)，將15-20μL PCR反應(yīng)后的樣品放入凝膠孔中，4.5-5伏特/厘米的電壓進(jìn)行穩(wěn)壓電泳40-60分鐘；取出凝膠，在254nm紫外燈下檢測(cè)。
D、凡呈現(xiàn)DNA條帶的樣品記錄為陽(yáng)性樣品，相反則為陰性樣品。
3)再對(duì)上述PCR擴(kuò)增有條帶的單株利用AFLP分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)BC1F1單株進(jìn)行遺傳背景篩選，選擇輪回親本遺傳背景最多的單株留種。其步驟如下A、利用上述SDS法提取青花菜回交各世代單株基因組DNA；B、在37℃對(duì)各待測(cè)單株的DNA進(jìn)行限制性內(nèi)切酶MseI和EcoRI酶切5小時(shí)后，再在65℃滅活30-45分鐘，然后加入T4 DNA連接酶在22℃連接4小時(shí)或室溫過夜；C、取酶切連接產(chǎn)物加入EcoRI引物和MseI引物以及Taq DNA聚合酶在56℃的退火溫度下進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增；D、取預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物加入EcoRI+3引物和MseI+3引物以及Taq DNA聚合酶，在65℃向56℃遞減的退火溫度下進(jìn)行選擇性擴(kuò)增；E、PCR產(chǎn)物在6-8％的聚丙烯酞胺凝膠上點(diǎn)樣，在70瓦功率下電泳3-4小時(shí)分離PCR產(chǎn)物；F、電泳完畢取下膠板按銀染程序進(jìn)行染色與顯影；G、讀取各樣品的AFLP帶型，計(jì)算各樣品恢復(fù)輪回親本基因型的比率。
4)上述單株結(jié)球后，根據(jù)結(jié)球特性，選擇商品性好的單株留下，去掉混雜單株；待BC1單株開花時(shí)，進(jìn)行田間育性評(píng)價(jià)，選取10-15個(gè)單株套袋，取父本718的花粉進(jìn)行授粉。成熟時(shí)，再次選出3-4個(gè)結(jié)實(shí)率高，綜合性狀好的套袋單株，收種。同時(shí)父本718自交保留。
5)分別種植收獲的單株株系，每個(gè)株系各種植20-30株；6)選取上述入選單株，待開花時(shí)以此為母本，以輪回親本為父本，進(jìn)行回交，得到回交二代BC2F1；成熟后，選取若干個(gè)綜合性狀好的套袋單株進(jìn)行收種并種植；7)然后重復(fù)2)、3)和4)步驟，通過3-4代選育，獲得2-3個(gè)整齊度較一致株系，收種。
本發(fā)明選育新的青花菜胞質(zhì)雄性不育系方法中，在回交轉(zhuǎn)育過程中，不育株的鑒定標(biāo)準(zhǔn)為全株所有花朵雄蕊無花粉或經(jīng)過醋酸洋紅染色鑒定僅有少數(shù)無活力的、畸形花粉粒。
本發(fā)明所育成新的青花菜胞質(zhì)雄性不育系的標(biāo)準(zhǔn)為不育率和不育度均可達(dá)到100％。
實(shí)施例1、雜交以能夠穩(wěn)定遺傳且不受光照、溫度等環(huán)境條件影響的青花菜雄性不育系725(株高約58cm，開展度70cm，花球直徑16.5cm，單球重500g，為胞質(zhì)雄性不育系，柱頭發(fā)育正常，雄花無花粉)為不育源，并作為母本。以申請(qǐng)者選擇的抗病、豐產(chǎn)的718為輪回父本，進(jìn)行雜交，獲得F1再與輪回親本雜交，獲得BC1代分離群體。收獲種子，種植100個(gè)單株。
2、PCR分子標(biāo)記分析1)DNA提取 樣品按單株編號(hào)，加入600μL(預(yù)熱65℃)提取緩沖液，40μL SDS混勻，65℃水浴30min。加入200μL 5M KAc，冰浴60min。離心20min(4℃，12000g)，上清轉(zhuǎn)入新離心管。0.7倍體積(650μL)異丙醇，離心，去上清，加入120μL TE.加2μL RNase，37℃溫浴60min。加400μL TE，600μL酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)抽提，離心10min(10℃，12000g)，上清液轉(zhuǎn)入新離心管。加400μL氯仿∶異戊醇(24∶1)抽提，4℃，12 000g，10min，取上清于新離心管。加1/10體積3M NaAc，2×體積無水乙醇，-20℃，2h，4℃，1 2000g離心10min。400μL預(yù)冷的75％乙醇洗DNA 1次，干燥。溶于100μL TE。取5μL DNA樣品在0.8％Agarose膠上電泳，檢測(cè)DNA的分子大小。同時(shí)取2μL稀釋50測(cè)OD260/OD280，檢測(cè)DNA含量及質(zhì)量。-20℃保存?zhèn)溆谩?br> 2)PCR反應(yīng) 總體系為20μL，其中樣品DNA模板約30ng，1.0×PCR(含Mg2+)反應(yīng)緩沖液，10mmol/L dNTP，上下游引物(序列1和序列2)10μmol/L，Taq DNA聚合酶0.5U(上海生物工程公司)。混勻后在GeneAMP PCR System9700型PCR儀上進(jìn)行PCR反應(yīng)第一步94℃預(yù)變性4min，第二步94℃變性保溫1min，58℃退火1min，72℃延伸1.5min，并循環(huán)30次；第三步72℃延伸保溫10min，結(jié)束反應(yīng)。
3)凝膠電泳 配制1.0-1.2％葡聚糖凝膠(含0.5-1.0μg/ml的溴化乙錠)，將15-20μL PCR反應(yīng)后的樣品放入凝膠孔中，4.5-5伏特/厘米的電壓進(jìn)行穩(wěn)壓電泳40-60分鐘；取出凝膠，在254nm紫外燈下檢測(cè)。凡呈現(xiàn)DNA條帶的樣品記錄為陽(yáng)性樣品，相反則為陰性樣品。所選用的引物，先用序列1和序列2擴(kuò)增，選擇陽(yáng)性樣品。
結(jié)果在檢測(cè)的100個(gè)單株中，利用序列1和序列2有83份樣品呈現(xiàn)陽(yáng)性，17份樣品呈現(xiàn)陰性。
3、對(duì)83份陽(yáng)性樣品利用AFLP分子標(biāo)記篩選單株的遺傳背景。
1)利用SDS法提取青花菜回交各世代單株基因組DNA；2)在37℃對(duì)各待測(cè)單株的DNA進(jìn)行限制性內(nèi)切酶MseI和EcoRI雙酶消化5小時(shí)后，再在65℃滅活30-45分鐘，然后加入T4 DNA連接酶在22℃連接4小時(shí)或室溫過夜；3)取酶切連接產(chǎn)物加入EcoRI引物和MseI引物以及Taq DNA聚合酶在56℃的退火溫度下進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增；4)取預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物加入EcoRI+3引物和MseI+3引物以及Taq DNA聚合酶，在65℃向56℃遞減的退火溫度下進(jìn)行選擇性擴(kuò)增；5)PCR產(chǎn)物在6-8％的聚丙烯酞胺凝膠上點(diǎn)樣，在70瓦功率下電泳3-4小時(shí)分離PCR產(chǎn)物；電泳完畢取下膠板按銀染程序進(jìn)行染色與顯影；6)讀取各樣品的AFLP帶型，計(jì)算各樣品恢復(fù)輪回親本基因型的比率。結(jié)果從83份候選單株中，選擇了26個(gè)輪回親本遺傳背景最多的單株留種。
4、選擇套袋對(duì)上述26份選擇的單株，在結(jié)球時(shí)觀察花球商品性和熟性，選取10-15個(gè)單株套袋，取輪回親本718的花粉進(jìn)行授粉，待BC1單株開花時(shí)，進(jìn)行田間育性評(píng)價(jià)。成熟時(shí)，再次選擇4個(gè)結(jié)實(shí)率高，綜合性狀好的套袋單株收種，即為BC2群體的種子，同時(shí)父本718自交保留。
5、繼續(xù)選擇將收種的4個(gè)單株，各種植30株，并依次重復(fù)步驟2和3的DNA樣品制備、PCR分析和AFLP分析；結(jié)果獲得21個(gè)PCR反應(yīng)為陽(yáng)性，且輪回親本遺傳背景最多的單株。根據(jù)田間性狀、花球商品性、株系一致性以及育性等，選擇9株套袋，用父本718的花粉授粉；種子成熟后，再根據(jù)具體的農(nóng)藝性狀和育種要求，保留了其中綜合農(nóng)藝性狀最優(yōu)秀的6個(gè)單株進(jìn)行收種，即得到BC3株系。(其中，第1個(gè)單株后代保留了2株，第2個(gè)單株后代保留了1株，第3個(gè)單株后代保留了1株，第4個(gè)單株后代保留了2株)。
6、連續(xù)回交，選擇。
將收種的6個(gè)單株，各種植25株，根據(jù)步驟4進(jìn)行繼續(xù)選擇，回交后從4個(gè)單株上收獲BC4種子，BC4按各株系播種，評(píng)價(jià)各株系花球的整齊度和商品性，選擇2個(gè)整齊度高度一致株系的優(yōu)良單株(每個(gè)3株)，評(píng)價(jià)與父本的相似性以及雄性不育性、不育度等。分別同父本718回交，獲得BC5代種子。從中選擇3個(gè)株系即為雄性不育系，命名為ZB718A-1，ZB718A-2和ZB718A-3。三個(gè)轉(zhuǎn)育成功的不育系的不育度都達(dá)到100％。所選育的不育系為早中熟，生長(zhǎng)勢(shì)強(qiáng)，田間表現(xiàn)抗病性好，球形好，色翠綠。
7、選育的胞質(zhì)雄性不育系的應(yīng)用以選育的胞質(zhì)雄性不育系為母本，以不同熟性的青花菜多代自交系724、716、720、712為父本，配制組合，結(jié)果組配后均表現(xiàn)為較強(qiáng)的雜種優(yōu)勢(shì)，與724、716、720、712等組配后，植株高度平均增加10cm，與遲熟自交系配制的組合開展度可達(dá)90cm以上。表明這些組合優(yōu)點(diǎn)明顯，配制的組合較為成功。這也證實(shí)了所轉(zhuǎn)育的雄性不育系的正確性。
8、青花菜胞質(zhì)雄性不育系ZB718A及其相應(yīng)保持系718的繁制方法。
選擇肥力水平較高，適合青花菜繁種的地區(qū)，采用塑料大棚(同其他十字花科作物隔離)作為ZB718A的繁育場(chǎng)所，不育系ZB718A和保持系718以2∶1的比例同時(shí)播種，不育系與保持系隔行定植，開花期放蜜蜂(少量生產(chǎn)可進(jìn)行人工輔助)授粉，同時(shí)對(duì)保持系植株進(jìn)行自交留種。結(jié)果盛期進(jìn)行追肥，結(jié)合田間病蟲害防治，果莢成熟后及時(shí)采收脫粒。不育系植株上采集的種子即為繁種所需的不育系種子，而保持系植株上采收的種子即為保持系種子。
權(quán)利要求
1.一種利用分子標(biāo)記輔助選擇快速培育青花菜雄性不育的方法，其特征是包括以下步驟1)選擇青花菜胞質(zhì)雄性不育雜合體為母本，以優(yōu)良的青花菜自交系為輪回親本，進(jìn)行常規(guī)有性雜交，所得的雜種一代F1再與輪回親本回交，得到回交一代BC1F1分離群體，種植于田間；2)利用與雄性不育連鎖的特異分子標(biāo)記，其具序列1，序列2的特征；采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)PCR檢測(cè)并對(duì)上述植株苗期選擇含目標(biāo)基因的單株；3)利用與優(yōu)良保持系具有緊密連鎖性的特異的AFLP標(biāo)記對(duì)上述單株遺傳背景實(shí)施選擇，選出輪回親本遺傳背景最多的單株；4)選取上述入選單株，待開花時(shí)以此為母本，以輪回親本為父本，進(jìn)行回交，得到回交二代BC2F1；成熟后，選取若干個(gè)綜合性狀好的套袋單株進(jìn)行收種并種植；5)然后重復(fù)步驟2)至步驟4)，通過3-4代的回交就能獲得不育性穩(wěn)定的，純度較高的青花菜不育系，輪回親本即為相應(yīng)的保持系。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用分子標(biāo)記快速培育青花菜雄性不育系的方法，其特征是所述采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)PCR檢測(cè)方法包括以下步驟1)植株的基因組DNA的提??；2)以序列1(5’-TGCATTGTCTAGAAGTGGTGA)和序列2(5’-GAAGAATGAAAAGT GGAATGG)所述的核苷酸分子為引物，對(duì)上述基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增；3)對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳，凡呈現(xiàn)DNA條帶的樣品記錄即為陽(yáng)性樣品。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分子標(biāo)記快速培育青花菜雄性不育系的方法，其特征是所述利用AFLP分子標(biāo)記篩選遺傳背景的方法包括以下步驟1)利用SDS法提取青花菜回交各世代單株基因組DNA；2)在37℃對(duì)各待測(cè)單株的DNA進(jìn)行限制性內(nèi)切酶MseI和EcoRI雙酶消化5小時(shí)后，再在65℃滅活30-45分鐘，然后加入T4DNA連接酶在22℃連接4小時(shí)或室溫過夜；3)取酶切連接產(chǎn)物加入EcoRI引物和MseI引物以及TaqDNA聚合酶在56℃的退火溫度下進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增；4)取預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物加入EcoRI+3引物和MseI+3引物以及Taq DNA聚合酶，在65℃向56℃遞減的退火溫度下進(jìn)行選擇性擴(kuò)增；5)PCR產(chǎn)物在6-8％的聚丙烯酞胺凝膠上點(diǎn)樣，在70瓦功率下電泳3-4小時(shí)分離PCR產(chǎn)物；電泳完畢取下膠板按銀染程序進(jìn)行染色與顯影；6)讀取各樣品的AFLP帶型，計(jì)算各樣品恢復(fù)輪回親本基因型的比率。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種利用分子標(biāo)記快速培育青花菜雄性不育系的方法。包括以下步驟1)以青花菜胞質(zhì)雄性不育雜合體為母本，以優(yōu)良的青花菜自交系為父本，進(jìn)行有性雜交；并以該自交系為輪回親本，進(jìn)行連續(xù)回交；2)利用PCR檢測(cè)技術(shù)，對(duì)各回交后代植株不育性狀實(shí)施苗期選擇；3)應(yīng)用AFLP標(biāo)記對(duì)上述單株遺傳背景實(shí)施選擇；4)選擇分子標(biāo)記反應(yīng)為陽(yáng)性的單株回交；5)重復(fù)步驟2)和3)通過3－4代的回交就能獲得不育性穩(wěn)定的青花菜不育系和相應(yīng)的保持系。本發(fā)明首次利用與雄性不育基因緊密連鎖的分子標(biāo)記，以快速培育純合的雄性不育系。所培育的雄性不育系育性不受溫度變化的影響，不育株率、不育度為100％。
文檔編號(hào)A01H1/04GK101057554SQ200710067888
公開日2007年10月24日 申請(qǐng)日期2007年3月30日 優(yōu)先權(quán)日2007年3月30日
發(fā)明者盧鋼, 朱祝軍, 鄒宜靜, 邵泰良, 何勇 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)