專利名稱：：一種提高牛、羊胚胎移植妊娠率的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及胚胎移植技術(shù)，具體地說涉及一種提高牛、羊胚胎移植妊錄率的方法。
背景技術(shù)：
：胚胎移植技術(shù)能充分利用優(yōu)良種畜的遺傳資源，迅速擴(kuò)大畜群的良種比例。同時(shí)，此技術(shù)也是治療哺乳動(dòng)物不孕癥的有效手段。然而，家畜胚胎移植技術(shù)的效率依然未達(dá)到理想的水平，如奶牛新鮮胚胎受胎率僅為55%-60%,冷凍后解凍胚胎受胎率僅為45%-50%,體外受精胚胎受胎率在30%左右，而體細(xì)胞核移植克隆胚胎的受胎率僅為10%-20%。綿羊和山羊胚胎移植效率基本與此相同。但是，自然交配或人工授精技術(shù)的妊娠率能達(dá)到80%-90%。通過以上數(shù)字比較發(fā)現(xiàn)，移入胚胎有近一半發(fā)生早期死亡，一些新型技術(shù)的死亡率更高，達(dá)80%-90%。由于移植胚胎的遺傳品質(zhì)、生產(chǎn)成本較高，早期胚胎死亡帶來巨大經(jīng)濟(jì)損失，這直接限制了胚胎移植技術(shù)在生產(chǎn)中的應(yīng)用。因此，提高移入胚胎的受胎率是畜牧生產(chǎn)和科學(xué)研究所必需。母畜妊振是胚胎與母體子宮互作的結(jié)果，母畜排出的卵子在輸卵管完成受精以后，轉(zhuǎn)移到子宮，同時(shí)不停向前發(fā)育。牛、羊胚胎發(fā)育到囊胚階段分泌一類酸性糖蛋白分子IFN-tau，IFN-tau作用于子宮內(nèi)膜細(xì)胞，這些細(xì)胞產(chǎn)生反應(yīng)，抑制了溶解黃體物質(zhì)PGF&的合成與釋放，母體卵巢上的周期黃體發(fā)育為妊娠黃體，分泌大量的孕激素。子宮組織在孕激素作用下，腺體發(fā)育并分泌多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，形成子宮乳，促進(jìn)早期胚胎的發(fā)育和附植。目前的研究認(rèn)為IFN-tau是胚胎發(fā)出的最初妊娠信號(hào)。如果胚胎分泌量不足，母體不能發(fā)生妊娠反應(yīng)，卵巢上的黃體將被溶解，繼而孕激素分泌量下降，子宮腺體發(fā)育不全，子宮中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)缺乏，胚胎不能正常發(fā)育，最終妊娠失敗。因此，從理論上說，母體在合適的時(shí)間接受足量的IFN-tau是妊娠建立的基礎(chǔ)，通過提高子宮內(nèi)IFN-tau的水平將有望提高牛、羊胚胎的妊娠率。然而，目前還沒有相關(guān)的研究和報(bào)道。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于針對(duì)上述不足提供一種提高牛、羊胚胎移植妊娠率的方法。該方法通過提高子宮內(nèi)IFN-tau的水平來提高牛、羊胚胎妊娠率。胚胎移植時(shí)，由于胚胎質(zhì)量差或胚胎與母體同期化程度不一致，是導(dǎo)致妊娠識(shí)別失敗的主要原因。提高子宮內(nèi)IFN-tau的水平，母體會(huì)及時(shí)發(fā)生妊娠反應(yīng)，分泌子宮乳，促進(jìn)胚胎發(fā)育，一些級(jí)別稍差或發(fā)育滯后的胚胎會(huì)發(fā)育正常，最終順利完成妊娠建立。本發(fā)明提出三種優(yōu)選方案來提高妊娠識(shí)別期母體子宮內(nèi)IFN-tau的水平，從而增強(qiáng)母體對(duì)胚胎的識(shí)別。第一種方法是在移植液中添加IFN-tau。IFN-tau可以通過基因工程手段大量生產(chǎn)，首先克隆牛、羊IFN-tau基因，并與表達(dá)載體連接后在大腸桿菌中表達(dá)，然后分離純化此蛋白，再將此蛋白添加到胚胎移植液中，與胚胎同時(shí)注入母體子宮內(nèi)，以提高母體妊娠率。IFN-tau的添加量根據(jù)蛋白活性確定，通常約為1-2pg/次移植。第二種方法是將正常胚胎與孤雌發(fā)育胚胎共移植。用體外成熟的牛、羊卵子，經(jīng)化學(xué)試劑或電激活誘導(dǎo)孤雌發(fā)育，發(fā)育到囊胚后冷凍保存。在進(jìn)行胚胎移植時(shí)，孤雌胚胎與正常胚胎按1:1比例同時(shí)注入子宮內(nèi)。孤雌胚胎分泌的IFN-tau會(huì)促進(jìn)正常胚胎發(fā)育與附植。第三種方法是正常胚胎與分泌IFN-tau的活組織碎片共移植。將體外受精胚胎或性別鑒定后不再使用的體內(nèi)受精胚胎，將其內(nèi)細(xì)胞團(tuán)破壞，僅保留滋養(yǎng)層細(xì)胞塊，或附植前胚胎組織片。胚胎移植時(shí)，正常胚胎與滋養(yǎng)層細(xì)胞塊或附植前胚胎組織片(60個(gè)細(xì)胞左右)，按照1:1的比例共同移入受體母牛子宮內(nèi)，滋養(yǎng)層細(xì)胞分泌的IFN-tau會(huì)促進(jìn)正常胚胎發(fā)育和附植。IFN-tau外源增加的量過多還未發(fā)現(xiàn)對(duì)胚胎產(chǎn)生不良影響，但其對(duì)胚胎或子宮腺體發(fā)育的促進(jìn)作用會(huì)消失。當(dāng)然，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以按照本發(fā)明的精神，通過其他途經(jīng)來提高子宮內(nèi)IFN-tau的水平來提高牛、羊胚胎妊娠率，例如IFN-tau與緩釋佐劑混合后注入子宮腔內(nèi)或制備成緩釋微膠囊投入子宮內(nèi)等。本發(fā)明通過提高牛、羊子宮內(nèi)IFN-tau的水平，來提高牛、羊胚胎移植的妊娠率，本發(fā)明方法能使牛、羊胚胎移植妊娠率比現(xiàn)有技術(shù)提高15%_20%，冷凍解凍胚胎的妊娠率達(dá)到65%-75%。本發(fā)明方法操作簡(jiǎn)便，應(yīng)用成本低廉，效果顯著，對(duì)動(dòng)物不產(chǎn)生任何有害影響，可以在牛、羊胚胎移植產(chǎn)業(yè)和胚胎工程中廣泛應(yīng)用，具有廣闊的巿場(chǎng)前景。圖1為一步法PCR產(chǎn)物電泳分析，圖中M:DNALadderMarkerDL2000;1-2:bIFN-tauPCR產(chǎn)物；圖2為重組質(zhì)粒pGEM-bIFNS-tau酶切鑒定圖譜，圖中M:DNALadderMarkerDL2000+15000;1:iVcoI/5^el;2:5p/il/5^el;3:Pwl;4:5g/II/5>waI;5:5g/II;ck:plasmidcontrol;圖3為實(shí)施例1獲得的IFN-tau與(XM593584)的比對(duì)結(jié)果；圖4為pET-bIFNS(+)-tau酶切驗(yàn)證圖譜，M:DNALadderMarkerDL2000+15000;1:A^el/A7ioI;2:S;/iI/A7ioI;3:5g/II/Mfel;4:Z/ioI;5:5fl附/ZI;6:plasmidcontrol;圖5為pET-bIFNS(-)-tau酶切驗(yàn)證圖譜，M:DNALadderMarkerDL2000+15000;1:W&I/Z/ioI;2:S;/iI/Z7ioI;3:萬g/II/A^el;4:Z/ioI;5:5g/II;ck:plasmidcontrol;圖6為pET-blFNS(+)-tau和pET-bIFNS(-)-tau的原核表達(dá)產(chǎn)物SDS-PAGE電泳圖譜，M:PrestainedProtainMarker;1:pET-blFNS(+)-tau誘導(dǎo)前；2:pET-bIFNS(-)-tau誘導(dǎo)前；3:25°C,pET-blFNS(+)-tau表達(dá)產(chǎn)物；4:25°C，pET-bIFNS(-)-tau表達(dá)產(chǎn)物；5:37°C，pET-blFNS(+)-tau表達(dá)產(chǎn)物；6:37°C，pET-bIFNS(-)-tau表達(dá)產(chǎn)物；7:pET-30a(+)陰性對(duì)照；圖7為pET-bIFNS(-)-tau的原核表達(dá)產(chǎn)物SDS-PAGE電泳圖譜，M:PrestainedProtainMarker;1:37°C,pET-bIFNS(-)-tau誘導(dǎo)前；2:25°C，pET-bIFNS(-)-tau表達(dá)產(chǎn)物；3:25°C，pET-bIFNS(-)-tau破碎后上清；4:25°C，pET-bIFNS(-)-tau破碎后沉淀；5:37°C，pET-bIFNS(隱)-tau表達(dá)產(chǎn)物；6:37°C，pET-bIFNS(-)-tau破碎后上清；7:O.lmMIPTQpET-bIFNS(-)-tau表達(dá)產(chǎn)物；8:37°C，pET-bIFNS(-)-tau破碎后沉淀；圖8純化后的rbIFN-tauSDS-PAGE電泳圖譜，M:PrestainedProtainMarker;1-2:純化后的rbIFN-tau;圖9培養(yǎng)液中添加rbIFN-tau后對(duì)牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞形態(tài)變化的影響，a和c:牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞對(duì)照組正常生長(zhǎng)的貼壁細(xì)胞;b:添加lxPBS培養(yǎng)24h后貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞；d:添加rbIFN-tau培養(yǎng)24h后貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞；e:胰蛋白酶消化5min后的對(duì)照組細(xì)胞;f:胰蛋白酶消化5min后的rbIFN-tau處理組細(xì)胞。具體實(shí)施方式下面實(shí)施例用于對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步說明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例一、在移植液中添加牛重組IFN-tau提高牛移植妊娠率的方案本例應(yīng)用基因工程的手段，通過克隆牛IFN-tau基因，構(gòu)建表達(dá)載體，進(jìn)一步轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞來生產(chǎn)IFN-tau蛋白，從中分離、純化得到IFN-tau，并添加到移植液中從而提高胚胎移植妊娠率。(一)牛IFN-tau基因克隆與原核表達(dá)1.胚胎裂解(1)將含有牛雄性胚胎的細(xì)管從液氮中取出后，迅速放入32°C水洛中停留10s解凍，取出細(xì)管；(2)剪掉細(xì)管封口端，用金屬推桿推動(dòng)棉栓，使管中內(nèi)容物連同胚胎流入含有l(wèi)xPBS(或Holding液)溶液的表面皿中；(3)在實(shí)體顯微鏡下迅速回收胚胎，并用PBS洗三遍，10枚為一組；(4)將收集的胚胎放入37。C預(yù)熱的酸性Tyrode's溶液中，在實(shí)體顯微鏡下觀察，待透明帶溶解后，迅速用大量PBS溶液中和、洗滌；(5)將胚胎放入盛有5^1冰洛裂解液(0.8%Igepal+5mmol/LDTT+lU/plRNAsin)的薄壁PCR管中，迅速投入液氮冷凍后30秒后取出，在-8(TC冰箱保存或直接進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。2.bIFN-tau基因的克隆根據(jù)GenBank中已知的bIFN-tau基因序列GenBank(AF238611),設(shè)計(jì)三組引物(表l)。由于bIFN-tau基因沒有內(nèi)含子，可以直接從基因組中擴(kuò)增得到bIFN-tau基因(釆用第一組引物)，反應(yīng)程序94°C，5min;94°C，45s,58.4°C,lmin,72°C，lmin,共35個(gè)循環(huán)；最后72。C延伸8min。擴(kuò)增產(chǎn)物采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)并回收，然后與pGEM-TVector連接，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DHsa感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)過藍(lán)白篩選，挑取白色菌落，SDS-堿裂解法提取質(zhì)粒、酶切鑒定，初步鑒定正確的重組質(zhì)粒進(jìn)行DNA測(cè)序，并將重組質(zhì)粒命名為pGEM-bIFNS-tau。表1用于基因擴(kuò)增的引物序列組別上游引物(5'—3')下游引物序列(5'—3')引入的內(nèi)切酶1ATGGCCTTCGTGCTCTCTCTACAAGTGAGTTCAGATCTCCACCCA2ATACATATGGCCTTCGTGCTCTCCTGCTCGAGAAGTGAGTTCAGATCT3CTACATATGTGTGACCTGTCTCCGACTGCTCGAGAAGTGAGTTCAGATCT注下劃線部分分別為Afel和的酶切位點(diǎn)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)證實(shí)得到585bp的特異性bIFN-tau基因條帶(圖1)。將bIFN-tau擴(kuò)增產(chǎn)物與pGEM-TVector連接后，得到重組質(zhì)粒pGEM-bIFNS-tau，釆用不同的內(nèi)切酶進(jìn)行酶切驗(yàn)證，結(jié)果如圖2，酶切片斷與預(yù)期大小一致。DNA測(cè)序結(jié)果表明，其核苷酸及氨基酸序列如SEQIDNo.l&2所示，得到的bIFN-tau序列與已知序列XM一593584(GeneID:515549)相比，核苷酸和氨基酸的同源性分別達(dá)99%和97%,其核苷酸序列和氨基酸比對(duì)結(jié)果如圖3(Upperline:重組質(zhì)粒pGEM-bIFN-tau測(cè)序后的序列，from1to585;Lowerline:Genbank中的已知序列(XM593584),from1to585)。3.bIFN-tau基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建第二組和第三組(表l)引物均引入了NdeI和XhoI酶切位點(diǎn)，分別用于從pGEM-bIFNS-tau重組質(zhì)粒上擴(kuò)增含信號(hào)肽和不含信號(hào)肽的blFN-tau基因，反應(yīng)程序94。C，3min;94°C，40s,60°C,lmin，72°C,lmin，共30個(gè)循環(huán)；最后72。C延伸8min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)Ndel和Xhol雙酶切、回收，與經(jīng)過同樣雙酶切的pET-30a(+)Vector連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3),提取質(zhì)粒并驗(yàn)證，重組表達(dá)載體分別命名為pET-bIFNS(+)-tau(含信號(hào)肽)和pET-bIFNS(-)-tau(不含信號(hào)肽)。從鑒定正確的重組質(zhì)粒pGEM-bIFNS-tau上擴(kuò)增含信號(hào)肽和不含信號(hào)肽的WFN-tau基因，與pET-30a(+)連接后，酶切鑒定結(jié)果如圖4和圖5，產(chǎn)生的片斷大小均與預(yù)期結(jié)果一致，表明已成功構(gòu)建了bIFN-tau的兩種原核表達(dá)載體。4.bIFN-tau基因的誘導(dǎo)表達(dá)及純化分別挑取含有重組質(zhì)粒pET-bIFNS(+)-tau和pET-bIFNS(-)-tau的菌落接種于50ml含卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37。C活化后按1:10的稀釋比例轉(zhuǎn)移至新的培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)至細(xì)菌OD6(X)=1.0,添加IPTG至終濃度O.lmM,25。C條件下慢速誘導(dǎo)20h，37。C條件下快速誘導(dǎo)4h，離心分別收集菌體，經(jīng)過超聲波破碎收集沉淀，釆用0.1%TritonX-100洗滌和純化包涵體，經(jīng)過10M尿素溶解，最后得到含有rbIFN-tau的上清液。參照ProBondPurificationSystem(Invitrogen)試劑盒說明書，在活性條件下純化rbIFN-tau，用SDS-PAGE電泳檢測(cè)表達(dá)產(chǎn)物分子量及其純度，考馬斯亮蘭R-250染色后觀察結(jié)果，并用Bradford法測(cè)定rbIFN-tau濃度。在25。C和37°C,含pET-bIFNS(-)-tau的表達(dá)菌在兩種溫度條件下誘導(dǎo)后，在約20kD處均有一條較粗的條帶產(chǎn)生，分子量與預(yù)期大小一致(圖6)。破碎后的細(xì)菌沉淀釆用0.1%TritonX-100洗滌后，得到rbIFN-tau的包涵體，經(jīng)過10M尿素溶解，部分rbIFN-tau轉(zhuǎn)移至上清液，采用N產(chǎn)親合層析純化。純化步驟如下(1)取3ml包涵體溶解液，用lxNativePurificationBuffer(7.8g/LNaH2P04.2H20;29.22g/LNaCl,pH8.0)等體積稀釋，稀釋后上柱，4。C條件下，不斷搖動(dòng)柱子lh，始終保持樹脂懸浮(若包涵體溶解液中目的蛋白較少，可增加上柱次數(shù))。(2)自然沉淀樹脂，吸上清，保存上清于4°C,進(jìn)行SDS-PAGE分析。(3)用8ml預(yù)冷的lxNativeWashBuffer(20mMImidazole:1.362gImidazole—1000ml"NativePurificationBuffer,pH8.0)洗滌樹脂，自然沉淀樹脂，吸上清，保存上清于4°C,進(jìn)行SDS-PAGE分析。(4)重復(fù)第3步至少3次。(5)用4ml含350mMImidizole的lxNativeElutionBuffer(23.85gImidazole—1000mllxNativePurificationBuffer,pH到8.0)洗脫靶蛋白，4°C條件下，不斷搖動(dòng)柱子30min，始終保持樹脂懸浮。(可分2步加入洗脫液，2ml/次)(6)用適量大小的超濾管接收洗脫下的蛋白，4°C,7500xg離心15min,小分子量的蛋白被濾下，離心后再加入8mllxPBS，4°C，7500xg離心15min,以除去洗脫液中多余的咪唑，用lxPBS反復(fù)3次，最后收集超濾管中的蛋白，分裝lml/管，-80°C保存，同時(shí)取10pl收集液進(jìn)行SDS-PAGE。最終得到純度在90％以上rbIFN-tau。(如圖8)5.rbIFN-tau的抗病毒活性檢測(cè)以常規(guī)方法在96孔板培養(yǎng)牛腎細(xì)胞，待細(xì)胞長(zhǎng)成單層后去除培養(yǎng)液，加入細(xì)胞維持液，同時(shí)每孔加入成倍稀釋的rblFN-tau200|al,每個(gè)稀釋度接2孔，37。C孵育過夜，IFN處理組和病毒對(duì)照組加入lOOfxl,100TCID50的VSV病毒進(jìn)行攻毒，細(xì)胞對(duì)照組加入維持液(每塊96孔板均設(shè)細(xì)胞對(duì)照組、病毒對(duì)照組和IFN處理組)，37°C培養(yǎng)1-2天，在倒置鏡下觀察結(jié)果，待病毒對(duì)照組細(xì)胞全部發(fā)生明顯病變時(shí)，將抑制50%細(xì)胞病變的干擾素最高稀釋度定為l個(gè)IFN單位。Bradford法測(cè)定rbIFN-tau的濃度為5.8昭/ml，當(dāng)rbIFN-tau稀釋10倍時(shí)，rbIFN-tau處理組細(xì)胞與細(xì)胞對(duì)照組、病毒對(duì)照組相比，rbIFN-tau仍可抑制50%以上的細(xì)胞發(fā)生病變，稀釋度高于10倍時(shí)，處理組細(xì)胞發(fā)生明顯病變，而加入10倍以下干擾素稀釋度的細(xì)胞生長(zhǎng)良好。因此，rbIFN-tau的最高稀釋度為1:10。根據(jù)rbIFN-tau的濃度，計(jì)算出rbIFN-tau的抗病毒活性單位為lxl04U/mg。(二)胚胎移植冷凍胚胎解凍后，在體視顯微鏡下挑選質(zhì)量合格胚胎，移入添加lpg/mlrIFN-tau胚胎移植液中，然后每枚胚胎連同0.2ml此移植液吸入規(guī)格為0.25ml的常用塑料細(xì)管中，裝入胚胎移植槍直接進(jìn)行子宮角移植。釆用上述方法移植胚胎80枚，其中52枚移植受胎，，妊娠率達(dá)到65%;對(duì)照組不添加rIFN-tau,移植胚胎60枚，其中30枚移植受胎，妊娠率為50%。與對(duì)照組相比，本方法受胎率提高了15%。實(shí)施例2胚胎共移植本例將正常胚胎與發(fā)育缺陷胚胎共移植達(dá)到提高INF-tau水平的目的。所述的發(fā)育缺陷胚胎是指用體外成熟的牛卵子，經(jīng)化學(xué)試劑誘導(dǎo)孤雌發(fā)育，發(fā)育到囊胚后冷凍保存。在進(jìn)行胚胎移植時(shí)，孤雌胚胎與正常胚胎按1:1比例同時(shí)注入子宮內(nèi)。孤雌胚胎分泌的IFN-tau會(huì)促進(jìn)正常胚胎發(fā)育與附植。(一)牛卵母細(xì)胞釆集及體外成熟培養(yǎng)將從屠宰場(chǎng)取得的牛卵巢放入25t:的生理鹽水中帶回實(shí)驗(yàn)室。用帶有19G針頭的10mL注射器抽取26mm卵泡中的卵母細(xì)胞，在實(shí)體顯微鏡下選擇帶有完整致密的COCs(卵丘顆粒細(xì)胞和卵母細(xì)胞復(fù)合體)，用成熟培養(yǎng)液洗滌3遍后放入四孔板的成熟培養(yǎng)液中，置于二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為38.5°C，100%濕度，5%C02。培養(yǎng)23h后，把COCs吸入0.2。/。透明質(zhì)酸酶中，消化吹打去除顆粒細(xì)胞，洗滌后挑選形態(tài)正常的卵母細(xì)胞備用。(二)化學(xué)激活將成熟后去除顆粒細(xì)胞的牛卵母細(xì)胞用無鈣鎂DPBS洗滌3次，放入9%乙醇激活液中處理5min,再放入2mmol/L的6-DMAP處理液中處理4h，洗滌3次后放入CRlaa培養(yǎng)液I中培養(yǎng)。(三)胚胎培養(yǎng)與發(fā)育激活后放入CRlaa培養(yǎng)液I中培養(yǎng)計(jì)為第0天，每隔48h以CRlaaII更換一半培養(yǎng)液，培養(yǎng)至第6天收集囊胚，每天收集一次，收集到第8天。CRlaa培養(yǎng)液成分表<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>(四)牛囊胚OPS法玻璃化冷凍保存及解凍將室溫調(diào)至25。C,冷凍操作在3839。C恒溫臺(tái)上進(jìn)行。首先用帶有l(wèi)mL塑料注射針簡(jiǎn)的口吸管連接的OPS管將牛囊胚移入冷凍預(yù)處理液中平衡30s，再移入玻璃化冷凍液中平衡25s后，將囊胚吸入OPS管中直接投入液氮冷凍保存。每支管裝入2-3枚囊胚。OPS管從液氮中取出后，立即將裝有囊胚部分浸入置于恒溫臺(tái)上(3839。C)的含有0.25mol/L蔗糖解凍液的表面皿中，解凍后將囊胚從OPS管中吹出并搖動(dòng)混勻，在此液中平衡lmin,然后移入0.15mol/L蔗糖解凍液中平衡5min，再用DPBS液洗滌2次，移入胚胎移植液中，10-15min后，挑選形態(tài)完整、胚胎恢復(fù)原狀，死亡細(xì)胞少于10%的胚胎用于與正常胚胎共移植。共移植時(shí)，每枚孤雌胚胎與l枚正常胚胎共移植。釆用上述方法移植胚胎60枚，其中45枚移植受胎，妊娠率達(dá)到75%,而對(duì)照組的妊娠率為55%(28/51)比對(duì)照組高20%。(實(shí)施例2、3在同一牛場(chǎng)進(jìn)行，實(shí)施例l在另外一個(gè)牛場(chǎng)進(jìn)行，因此對(duì)照結(jié)果不相同)實(shí)施例3胚胎組織碎片共移植本例的方法是正常胚胎與分泌IFN-tau的活組織碎片共移植。本例使用性別鑒定后不再使用的體內(nèi)受精囊胚，將其內(nèi)細(xì)胞團(tuán)破壞，僅保留滋養(yǎng)層細(xì)胞塊。胚胎移植時(shí)，正常胚胎與滋養(yǎng)層細(xì)胞塊(約含60個(gè)細(xì)胞)共同移入受體母牛子宮內(nèi)，滋養(yǎng)層細(xì)胞分泌的IFN-tau會(huì)促進(jìn)正常胚胎發(fā)育和附植。釆用上述方法移植胚胎40枚,其中28枚移植受胎，妊娠率達(dá)到70%，比對(duì)照組高15%。社會(huì)效益與經(jīng)濟(jì)效益分通過以上實(shí)例可以看出，本發(fā)明方法能顯著提高牛、羊胚胎移植后的妊旅率，胚胎移植效率提高15%-20%，意味著良種胚胎的利用率提高15%-20%，胚胎移植成本也就降低15%-20%左右，良種價(jià)格可以至少降低15%-20%。這樣胚胎移植技術(shù)就更能為廣大農(nóng)牧民所承受，良種擴(kuò)繁速度將明顯加快，良種覆蓋率會(huì)大幅度提高，農(nóng)牧民的經(jīng)濟(jì)收入會(huì)明顯增加，從而帶動(dòng)整個(gè)農(nóng)牧區(qū)經(jīng)濟(jì)發(fā)展。本發(fā)明方法能使牛、羊胚胎移植技術(shù)的效率提高15%-20%,按目前我囯每年奶牛和肉牛胚胎移植數(shù)量在1.5萬頭左右，直接經(jīng)濟(jì)效益12.25億元左右。我國(guó)每年綿羊、山羊胚胎移植數(shù)量目前在2.0萬只左右，經(jīng)濟(jì)效益約0.1億元左右。因此，在我國(guó)推廣此技術(shù)和產(chǎn)品將獲得直接經(jīng)濟(jì)效益10多億左右元。如果在全世界推廣，經(jīng)濟(jì)效益可達(dá)數(shù)十幾億美元。本發(fā)明方法每頭(只)份的生產(chǎn)成本為2-3元，巿場(chǎng)承受價(jià)約為30-50元。因此，該產(chǎn)品在國(guó)內(nèi)推廣后，直接獲利1500-2000萬元。如果在全世界推廣，年收益達(dá)l-2億美元。序歹U表<110>中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)〈120〉一種提高牛、羊胚胎移植妊娠率的方法<130><160>2<170〉Patentlnversion3.3〈210〉1〈211>585<212>DNA〈213〉牛(Bostaurus)<220><221>CDS<222>(1)..(585)〈400>1atggccttcgtgetctctctactgatggccgtggtgctgateagetac48MetAlaPheValLeuSerLeuLeuMetAlaValValLeulieSerTyr151015agectgggaggatccctgggctgtgacctgtctccgaaccatgtgctg96SerLeuGlyGlySerLeuGlyCysAspLeuSerProAsnHisValLeu202530gttggcaggaagaacetcaggetcctgggccaaatgaggagaetctcc144ValGlyArgLysAsnLeuArgLeuLeuGlyGinMetArgArgLeuSer354045cctcgcttctgtctgcaggacagaaaagacttcactttcccccaggag192ProArgPheCysLeuGinAspArgLysAspPheThrPheProGinGlu505560atggtgaagggtggccagetccaggaggcccaggccatetctMetValLysGlyGlyGinLeuGinGluAlaGinAlalieSer657075cacgagctgetccagcagaccttcaacetcttccacacagagHisGluLeuLeuGinGinThrPheAsnLeuPheHisThrGlu8590tctgetgcctgggacaccaccetcctggagcagetccacactSerAlaAlaTrpAspThrThrLeuLeuGluGinLeuHisThr100105110catcagcagctggacgacctggacgcctgcctggggcaggtgHisGinGinLeuAspAspLeuAspAlaCysLeuGlyGinVal115120125gaggaagactctgccctgggaaggacaggccccacactggccGluGluAspSerAlaLeuGlyArgThrGlyProThrLeuAla130135140aggtacttccagggcatecatgtctacctgcaagagaaggaaArgTyrPheGinGlylieHisValTyrLeuGinGluLysGlu145150155gactgtgcctgggaaategtcagactggaaateatgagatecAspCysAlaTrpGlulieValArgLeuGlulieMetArgSer165170teateaaccagettgcaagaaaggttaagaatgatgggtggaSerSerThrSerLeuGinGluArgLeuArgMetMetGlyGly180185190aacteacttAsnSerLeu195gtgetc240ValLeu80cattec288HisSer95ggaccc336GlyProatggga384MetGlygtg卿432ValLystacagt480TyrSer160ttgtct528LeuSer175gatctg576AspLeu585<210>2〈211〉195<212>PRT<213〉牛(Bostaurus)〈400>2MetAlaPheValLeuSerLeuLeuMetAlaValValLeulieSerTyr1Ser51015LeuGlyGlySerLeuGlyCysAspLeuSerProAsnHisValLeu202530ValGlyArgLysAsnLeuArgLeuLeuGlyGinMetProMet65HisArg50Val35Phe40Arg45ArgLeuSerCysLeuGinAspArgLysAspPheThrPheProGinGlu5560LysGlyGlyGinLeuGinGluAlaGinAlalieSerVal7075GluLeuLeuGinGinThrPheAsnLeuPheHisThrGlu8590His95Leu80SerSerAlaAlaTrpAspThrThrLeuLeuGluGinLeuHisThrGlyPro100105110HisGinGinLeuAspAspLeuAspAlaCysLeuGlyGinValMetGly115120125GluGluAspSerAlaLeuGlyArgThrGlyProThrLeuAlaValLys130135140ArgTyrPheGinGlylieHisValTyrLeuGinGluLysGluTyrSer145150155160AspCysAlaTrpGlulieValArgLeuGlulieMetArgSerLeuSer165170Leu175SerSerThrSerLeuGinGluArgLeuArgMetMetGlyGlyAspLeu180185190AsnSerLeu19權(quán)利要求1、一種提高牛、羊胚胎移植妊娠率的方法，其通過提高母體子宮內(nèi)IFN-tau的水平來提高牛、羊胚胎移植妊娠率。2、如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于，胚胎移植時(shí)，在移植液中添加適量IFN-tau。3、如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于，胚胎移植時(shí)，將正常胚胎與孤雌發(fā)育胚胎共同移植。4、如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于，胚胎移植時(shí)，將正常胚胎與分泌IFN-tau的活組織碎片共同移植。5、如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述IFN-tau通過基因工程方法制備獲得。6、如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述孤雌胚胎為體外生產(chǎn)。7、如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述的活組織碎片為胚胎滋養(yǎng)層細(xì)胞塊或附植前胚胎組織片。8、如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述的活組織碎片來自體外受精胚胎或性別鑒定后不再使用的體內(nèi)受精胚胎。全文摘要本發(fā)明提供了一種提高牛、羊胚胎移植妊娠率的方法，該方法通過提高母體子宮內(nèi)IFN-tau的水平來提高移植胚胎妊娠率。本發(fā)明還提供了幾種可行的提高IFN-tau水平的方法，包括在胚胎移植時(shí)在移植液中添加IFN-tau、將孤雌發(fā)育胚胎或分泌IFN-tau的活組織碎片與正常胚胎共移植。通過本發(fā)明的方法能夠顯著提高牛羊胚胎移植妊娠率，與對(duì)照組相比能提高妊娠率15％-20％。本發(fā)明方法操作簡(jiǎn)便，應(yīng)用成本低廉，效果顯著，對(duì)動(dòng)物不產(chǎn)生任何有害影響。其可以在牛、羊胚胎移植產(chǎn)業(yè)和胚胎工程中廣泛應(yīng)用，具有廣闊的市場(chǎng)前景。文檔編號(hào)A61D19/04GK101116640SQ20071012113公開日2008年2月6日申請(qǐng)日期2007年8月30日優(yōu)先權(quán)日2007年8月30日發(fā)明者曾申明申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)