專利名稱：誘導(dǎo)山蒼子叢生芽的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種誘導(dǎo)山蒼子叢生芽的方法，具體涉及一種誘導(dǎo)木本芳香植物山蒼子叢生芽的組織培養(yǎng)快速繁殖方法。

背景技術(shù)：
山蒼子(Litseacubeba)為樟科木姜子屬中諸多植物的統(tǒng)稱，全世界有200余種，我國有72種、18個變種和3個變型，主要分布于長江以南。其別名有山雞椒(浙江)、山蒼樹(廣東)、賽樟樹(福建)、香葉(湖南)、木姜子(廣西)。通過蒸餾方法獲得揮發(fā)性芳香油稱山蒼子油，是出口換匯的大宗精油。山蒼子精油主要用于提取檸檬醛，含量達70％，是制造紫羅蘭酮、甲基紫羅蘭酮、乙位紫羅蘭酮及甲種維生素的主要原料，用于配制食品香精、化妝品和皂用香精；因其可降解致癌物質(zhì)黃曲霉素，而對防止糧食發(fā)生霉菌污染有奇特功效。山蒼子核油可作飛機用的高級潤滑油，亦可用于制皂，提煉甘油、月桂酸、正癸酸、十二稀酸等重要化工原料。山蒼子全株均可入藥，有祛風(fēng)散寒、溫腎健胃、消腫止痛的功效。山蒼子的花、果、根皮極香，是調(diào)味佐料。
山蒼子適應(yīng)性廣，耐瘠薄，截水圍土性能好，可用來治理疏林地水土流失。在退耕還林、還草工程實施以來，人們迫切尋找既能夠保生態(tài)平衡，又能獲得近期收益的樹種。山蒼子是一種將生態(tài)、經(jīng)濟、社會效益高度統(tǒng)一的樹種，因其具有很高的經(jīng)濟價值，人們?yōu)榈玫酱罅繖幟嗜┚痛罅靠撤ド缴n子植株，這不僅嚴重破壞了生態(tài)平衡，還對山蒼子資源的繼續(xù)利用造成極壞的影響。
由于山蒼子多野生，人工栽培極少，傳統(tǒng)栽培主要是種子繁殖，而種子發(fā)芽率低，且極易喪失發(fā)芽力而導(dǎo)致育苗失敗，因此很難滿足國內(nèi)外市場對山蒼子的需求。通過植物組織培養(yǎng)法來快速獲得整齊一致的山蒼子苗木用于生產(chǎn)無疑是一種有效的解決方法。
國內(nèi)已有關(guān)于山蒼子組織培養(yǎng)方面研究報道(馬崇堅、胡嘉凱，山蒼子不同外植體的組織培養(yǎng)[J].林業(yè)科技，2005，30(4)56-57)?，F(xiàn)有的組織培養(yǎng)方法雖能獲得較高的增殖系數(shù)，但存在得苗率低、移栽后成活率不穩(wěn)定的問題。因此，需要探索研究一種既能保證一定增殖系數(shù)又能保證有效的芽苗數(shù)的誘導(dǎo)叢生芽培養(yǎng)方法，解決組織培養(yǎng)山蒼子成苗率不穩(wěn)定的關(guān)鍵問題。


發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種誘導(dǎo)山蒼子叢生芽的方法，既能保證一定增殖系數(shù)，又能保證較高的得苗率和移栽后穩(wěn)定的成活率，使山蒼子叢生芽得到快速繁殖。
為實現(xiàn)這一目的，本發(fā)明采用山蒼子的含節(jié)莖段為外植體，滅菌時省去常規(guī)的用70～75％酒精浸泡材料的環(huán)節(jié)，減少其對材料的殺傷，采取在滅菌液中用軟毛刷不斷刷拭材料的方法控制污染，接種初期采用轉(zhuǎn)換培養(yǎng)基和暗培養(yǎng)的方法控制材料的褐化，然后依次在經(jīng)篩選的芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基和增殖培養(yǎng)基中培養(yǎng)，增殖培養(yǎng)階段中采用增殖培養(yǎng)基和誘導(dǎo)培養(yǎng)基交替使用的方法，使山蒼子叢生芽能正常萌發(fā)生長并迅速進入增殖狀態(tài)，獲得的芽苗健壯而整齊。
本發(fā)明的方法具體包括如下步驟 1、外植體滅菌選取山蒼子干基部幼嫩枝條，去除葉片，清洗后放入質(zhì)量濃度為3％的H2O2中浸泡15～20分鐘，取出立即轉(zhuǎn)入含質(zhì)量濃度為1～5％吐溫-80的0.1％HgCI2溶液中浸泡10～20分鐘，其間不斷用軟毛刷刷拭枝條，然后取出用無菌水沖洗5～6次并用滅菌吸水紙將水吸干，繼而切取含節(jié)莖段作外植.體，迅速接種在MS培養(yǎng)基上，放入暗處培養(yǎng)，第二天將外植體轉(zhuǎn)接到新的MS培養(yǎng)基上。
2、芽誘導(dǎo)將在MS培養(yǎng)基上不再褐化的外植體轉(zhuǎn)入誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+6-BA0.5～1.0mg/L+IBA0.1～0.5mg/L+GA1.0～2.0mg/L+瓊脂7.0g/L+蔗糖30g/L，pH6.0；培養(yǎng)溫度為25±2℃，光照周期12～14h.d-1，光強度為1200～2000lux；誘導(dǎo)培養(yǎng)21天后，獲得誘導(dǎo)芽。
3、芽增殖切取單個誘導(dǎo)芽，去除2/3葉片，切取含節(jié)的莖段接種到增殖培養(yǎng)基上，增殖培養(yǎng)基為MS+6-BA1.0～2.5mg/L+IBA0.2～0.5mg/L+瓊脂7.0g/L+蔗糖30g/L，pH 6.0，培養(yǎng)25～30天，獲得增殖芽。
4、將增殖芽重復(fù)步驟2、步驟3進行繼代培養(yǎng)，獲得健壯山蒼子叢生芽。
本發(fā)明誘導(dǎo)山蒼子叢生芽快速繁殖山蒼子的方法與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有實質(zhì)性的進步 1、提高了繁殖效率山蒼子傳統(tǒng)栽培主要是種子繁殖，而種子發(fā)芽率低，且極易喪失發(fā)芽力，因此常導(dǎo)致育苗失敗。本發(fā)明取山蒼子含節(jié)的莖段，用組織培養(yǎng)法進行叢生芽誘導(dǎo)的快速繁殖方法，不受外界條件的影響，四季皆可進行，不僅節(jié)約育苗占地，降低生產(chǎn)成本，并且保存了母體的全部優(yōu)良性狀，遺傳性狀穩(wěn)定。這種方法可在短期內(nèi)形成大量優(yōu)良試管苗，進行規(guī)?；?、工廠化生產(chǎn)。
2、有效地控制了污染山蒼子精油含量高，現(xiàn)有的用75％酒精消毒外植體的環(huán)節(jié)很容易殺傷材料，難以保證有效外植體的數(shù)量。本發(fā)明在消毒操作時取消了用75％酒精消毒外植體的環(huán)節(jié)，采用3％的H2O2和含1～5％吐溫-80的0.1％HgCI2溶液浸泡材料，其間不斷用軟毛刷刷拭枝條，不僅使消毒效果明顯提高，污染率控制在8.5％以下，還保證了足夠的有效外植體數(shù)量。
3、抑制了培養(yǎng)基和外植體褐化芳香植物產(chǎn)生精油等次生代謝物質(zhì)，按現(xiàn)有將外植體直接接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)的方法易造成材料和培養(yǎng)基褐化，而山蒼子含精油量很高，又屬于木本芳香植物，較其它芳香植物更容易引起材料和培養(yǎng)基的褐化。本發(fā)明選用山蒼子含節(jié)的莖段為外植體，在接種后放入暗處培養(yǎng)，并于第二天將外植體轉(zhuǎn)接到新的培養(yǎng)基上，至不褐化再轉(zhuǎn)接到誘導(dǎo)培養(yǎng)上，有效地控制了外植體和培養(yǎng)基的褐化。
4、篩選出了有效的誘導(dǎo)培養(yǎng)和增殖培養(yǎng)的培養(yǎng)基配方，且交替使用與已有關(guān)于山蒼子組織培養(yǎng)技術(shù)的不同處在于在誘導(dǎo)培養(yǎng)階段加入GA，培養(yǎng)基為MS+6-BA0.5～1.0mg/L+IBA0.1～0.5mg/L+GA1.0～2.0mg/L+瓊脂7.0g/L+蔗糖30g/L，其優(yōu)點在于外植體芽萌發(fā)時間提前至少一周，且得到的芽苗整齊，其節(jié)間明顯；在增殖培養(yǎng)階段采用MS+6-BA1.0～2.5mg/L+IBA0.2～0.5mg/L+瓊脂7.0g/L+蔗糖30g/L pH 6.0的培養(yǎng)基，增殖后再用同樣的方法將芽轉(zhuǎn)入誘導(dǎo)培養(yǎng)基進行繼代培養(yǎng)，如此交替培養(yǎng)，芽能迅速進入增殖狀態(tài)，增殖系數(shù)在4倍左右，且獲得的芽苗健壯而整齊。

具體實施例方式 以下通過具體的實施例對本發(fā)明的技術(shù)方案作進一步描述。
實施例1 取山蒼子干基部幼嫩枝條，去除葉片，流水清洗后放入質(zhì)量濃度為3％的H2O2中浸泡15分鐘，取出立即轉(zhuǎn)入含質(zhì)量濃度為5％吐溫-80的0.1％HgCI2溶液中浸泡20分鐘，不斷用軟毛刷刷拭枝條，然后取出用無菌水沖洗5～6次并用滅菌吸水紙將水吸干，繼而切取含節(jié)莖段作外植體，迅速接種在MS培養(yǎng)基上，放入暗處培養(yǎng)，第二天再將外植體轉(zhuǎn)接到新的MS培養(yǎng)基上。
將在MS培養(yǎng)基上不再褐化的外植體轉(zhuǎn)入MS+6-BA1.0mg/L+IBA0.5mg/L+GA2.0mg/L+瓊脂7.0g/L+蔗糖30g/L，pH 6.0的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，置于溫度25±2℃、光照周期12h.d-1、光強度為1200 lux的培養(yǎng)箱里進行誘導(dǎo)培養(yǎng)。21天后，獲得誘導(dǎo)芽。
切取單個誘導(dǎo)芽，去除2/3葉片，切取含節(jié)的莖段接種到增殖培養(yǎng)基上，增殖培養(yǎng)基為MS+6-BA2.5mg/L+IBA0.5mg/L+瓊脂7.0g/L+蔗糖30g/L，pH6.0，置于溫度為25±2℃，光照周期14h.d-1，光強度為2000lux的培養(yǎng)箱里進行增殖培養(yǎng)。
30天后選取增殖培養(yǎng)中健壯的芽，用同樣的方法將芽轉(zhuǎn)入誘導(dǎo)培養(yǎng)基進行繼代培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為25±2℃，光照周期14h.d-1，光強度為2000lux；如此交替培養(yǎng)，增殖系數(shù)在4倍以上。
實施例2 取山蒼子干基部幼嫩枝條，去除葉片，流水清洗后放入質(zhì)量濃度為3％的H2O2中浸泡20分鐘，取出立即轉(zhuǎn)入含質(zhì)量濃度為5％吐溫-80的0.1％HgCI2溶液中浸泡10分鐘，不斷用軟毛刷刷拭枝條，然后取出用無菌水沖洗5～6次并用滅菌吸水紙將水吸干，繼而切取含節(jié)莖段接種在MS培養(yǎng)基上，放入暗處培養(yǎng)，第二天再轉(zhuǎn)接到新的MS培養(yǎng)基上。
將在MS培養(yǎng)基上不再褐化的外植體轉(zhuǎn)入MS+6-BA0.5mg/L+IBA0.2mg/L+GA1.0mg/L+瓊脂7.0g/L+蔗糖30g/L，pH 6.0的培養(yǎng)基上，置于溫度25±2℃、光照周期12h.d-1、光強度為1200lux的培養(yǎng)箱里進行誘導(dǎo)培養(yǎng)。21天后，獲得誘導(dǎo)芽。
30天后切取誘導(dǎo)培養(yǎng)中單個芽，去除2/3葉片，切取含節(jié)的莖段接種到MS+6-BA1.0mg/L+IBA0.2mg/L+瓊脂7.0g/L+蔗糖30g/L，pH 6.0培養(yǎng)基上，置于溫度為25±2℃，光照周期14h.d-1，光強度為2000lux的培養(yǎng)箱里進行增殖培養(yǎng)。
30天后用同樣的方法將芽轉(zhuǎn)入誘導(dǎo)培養(yǎng)基進行繼代培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為25±2℃，光照周期14h.d-1，光強度為2000 lux；如此交替培養(yǎng)，增殖系數(shù)在3.5倍左右且得到的芽苗健壯整齊。
實施例3 按照實施例1的方法，只是繼代培養(yǎng)階段的激素濃度降低。具體方法在增殖培養(yǎng)30天后切取芽的含節(jié)莖段接種到MS+6-BA1.0mg/L+IBA0.3mg/L+GA1.0mg/L瓊脂7.0g/L+蔗糖30g/L，pH6.0培養(yǎng)基上；30天后用同樣的方法將芽轉(zhuǎn)入MS+6-BA2.0mg/L+IBA0.3mg/L+瓊脂7.0g/L+蔗糖30g/L pH 6.0培養(yǎng)基進行繼代培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為25±2℃，光照周期14h.d-1，光強度為2000 luX；如此交替培養(yǎng)，增殖系數(shù)在4倍以上，得到的芽苗健壯整齊。
權(quán)利要求
1.一種誘導(dǎo)山蒼子叢生芽的方法，其特征在于包括如下步驟
1)外植體滅菌選取山蒼子干基部幼嫩枝條，去除葉片，清洗后放入質(zhì)量濃度為3％的H2O2中浸泡15～20分鐘，取出立即轉(zhuǎn)入含質(zhì)量濃度為1～5％吐溫-80的0.1％HgCI2溶液中浸泡10～20分鐘，其間不斷用軟毛刷刷拭枝條，然后取出用無菌水沖洗5～6次并用滅菌吸水紙將水吸干，繼而切取含節(jié)莖段作外植體，迅速接種在MS培養(yǎng)基上，放入暗處培養(yǎng)，第二天將外植體轉(zhuǎn)接到新的MS培養(yǎng)基上；
2)芽誘導(dǎo)將在MS培養(yǎng)基上不再褐化的外植體轉(zhuǎn)入誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+6-BA0.5～1.0mg/L+IBA0.1～0.5mg/L+GA1.0～2.0mg/L+瓊脂7.0g/L+蔗糖30g/L，pH6.0；培養(yǎng)溫度為25±2℃，光照周期12～14h.d-1，光強度為1200～2000lux；誘導(dǎo)培養(yǎng)21天后，獲得誘導(dǎo)芽；
3)芽增殖切取單個誘導(dǎo)芽，去除2/3葉片，切取含節(jié)的莖段接種到增殖培養(yǎng)基上，增殖培養(yǎng)基為MS+6-BA1.0～2.5mg/L+IBA0.2～0.5mg/L+瓊脂7.0g/L+蔗糖30g/L，pH6.0；培養(yǎng)25～30天，獲得增殖芽；
4)將增殖芽重復(fù)步驟2)、步驟3)進行繼代培養(yǎng)，獲得健壯山蒼子叢生芽。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種誘導(dǎo)山蒼子叢生芽的方法，采用山蒼子的含節(jié)莖段為外植體，采用3％的H2O2和含1～5％吐溫-80的0.1％HgCI2溶液浸泡并不斷用軟毛刷刷拭，以此來代替酒精消毒，高效滅菌的同時保證了足夠的有效外植體數(shù)量；接種初期采用轉(zhuǎn)換培養(yǎng)基和暗培養(yǎng)的方法控制材料的褐化；芽誘導(dǎo)培養(yǎng)階段加入GA，增殖培養(yǎng)階段選用增殖培養(yǎng)基和誘導(dǎo)培養(yǎng)基交替使用的方法，芽萌發(fā)時間提前，迅速進入增殖狀態(tài)，得到的芽苗健壯整齊。采用本發(fā)明誘導(dǎo)繁殖山蒼子，不受外界條件的影響，四季皆可進行，不僅節(jié)約育苗占地，降低生產(chǎn)成本，并且保存了母體的全部優(yōu)良性狀，遺傳性狀穩(wěn)定。本發(fā)明可在短期內(nèi)形成大量優(yōu)良試管苗，進行規(guī)?；⒐S化生產(chǎn)。
文檔編號A01H4/00GK101147469SQ20071017043
公開日2008年3月26日 申請日期2007年11月15日 優(yōu)先權(quán)日2007年11月15日
發(fā)明者張艷玲, 雷 姚, 王維鵬, 張靜懿, 遠 高, 陸偉芳, 燕 陸, 昂 李 申請人:上海交通大學(xué)