專利名稱：：桫欏的一種繁殖方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及植物的繁殖方法，特別涉及桫欏""o;&'h印^"h^(Wa11.exHook.)Tryon)的一種繁殖方法。
背景技術(shù)：
：全世界挱欏科(O^Meaceae)植物約有6屬500余種，產(chǎn)于熱帶和亞熱帶的山地。我國地處桫欏科植物分布地的北緣，種類不多，目前已知的僅有2屬14種和2個(gè)變種，主要分布于西南和華南地區(qū)。絕大多數(shù)種類的桫欏科植物都具有樹狀的直立莖，呈喬木狀，大型羽狀葉子簇生于莖干的頂端，形成傘狀，故又稱為樹蕨。據(jù)化石記載，在地質(zhì)歷史上桫欏科植物最早出現(xiàn)于中生代的早侏羅紀(jì)或晚三疊紀(jì)，在中生代中期曾廣泛分布，極為繁盛。后來由于地質(zhì)變遷和氣候變化，特別是第四紀(jì)冰川期的影響，大量種類滅絕，分布區(qū)也大幅度收縮，最后僅殘存于熱帶和亞熱帶這些環(huán)境適宜的"避難所"，基于上述原因被稱為植物界的"活化石"。該科植物除了具有較高的園林觀賞價(jià)值，還可藥用，其根狀莖具有清熱解毒、驅(qū)風(fēng)濕等功效；我國蘭花栽培者常用桫欏科植物的樹干作為附生蘭花的載體；此外，其有些種類的樹干還可制備筆筒，如筆筒樹(5^aero;^eri's2印i/er3)等。目前挱欏的數(shù)量已經(jīng)非常稀少，只有在中亞亞熱帶以南低海拔地區(qū)保存較好的常綠闊葉林的林緣才見生長，在我國主要分布于貴州、四川、廣東和臺(tái)灣等地，被列為國家一級(jí)保護(hù)植物。其瀕危的主要原因是孢子壽命短、生長周期長，孢子萌發(fā)、配子體的形成對(duì)環(huán)境條件要求嚴(yán)格。而且由于其具有較高的觀賞及藥用價(jià)值，市場需求量較大，但是桫欏科植物的人工繁殖栽培技術(shù)滯后，導(dǎo)致野生桫欏資源遭到嚴(yán)重破壞。目前，國內(nèi)外主要研究了0^We3rfregei(Finnie&vanStaden.MultiplicationofthetreefernCyat力earfrege丄HortScience，1987，22(4):665)、6yaf力e3-y4w5^rsh.s(GollerK，RybczynskiJJ.In-vitrocultureusedforwoodyfern6yat力e3—勿stra7is.ActaSocietatisBotanicorumPoloniae，1995，64:1-17)、桫欏""op力j7a5^.""2osa(Hook.)Tryon)(KharePB，BeheraSK.Studiesonreproductivebiologyofathreatenedtreefern,CyatheaspinulosaWall,exHook.CurrentScience,2005，89:173-177;畢世榮，蘇成端，徐正蘭，何立明，桫欏組織培養(yǎng)的研究，植物生理學(xué)通訊，1985，(1):38;程治英，張風(fēng)雷，蘭芹英，許再富，陶國達(dá)，桫欏的快速繁殖與種質(zhì)保存技術(shù)的研究，云南植物研究，1991，13(2):181-188)和中華桫欏(A/s，力ihco^^ar^Bak.)(程治英，劉道華，中華桫欏的組織培養(yǎng)，植物生理學(xué)通訊，1992，28(3):210-211)的組織培養(yǎng)方法，但對(duì)桫欏快速萌發(fā)、短期出苗的繁殖方法還未見詳細(xì)報(bào)道。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供桫欏""，^7a5TW力Wosa(Wa11.exHook.)Tryon)的一種繁殖方法。本發(fā)所提供的桫欏C4"op^7a邵^7"乃sa(Wa11.exHook.)Tryon)的繁殖方法，是在如下固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)桫欏的孢子，得到孢子體苗；所述固體培養(yǎng)基的組成成分與MS培養(yǎng)基相同，其中大量元素和微量元素的濃度均為MS培養(yǎng)基的1/8—1，鐵鹽和有機(jī)成分的濃度與MS培養(yǎng)基相同，pH為5.5—6.0。所述固體培養(yǎng)基中，大量元素和微量元素的濃度具體可為MS培養(yǎng)基的1/2，pH為5.8。所述桫欏孢子在培養(yǎng)之前，用含有3-6g/100mlNaC10和0.1-0.3g/100ml吐溫-80溶液進(jìn)行消毒處理，如果材料容易污染，可在所有處理之前用70%酒精浸10-15s。所述消毒處理的時(shí)間為4.5—6min。所述消毒處理具體為用含有5g/100mlNaC10和0.2g/100ml吐溫-80的溶液消毒處理5min。所述桫欏孢子的培養(yǎng)條件為在22—28X:下，先暗培養(yǎng)12-72h，然后將其轉(zhuǎn)至光照下繼續(xù)培養(yǎng)，光照強(qiáng)度為20-80Wno1m—2s—'，光照時(shí)間為8_16h/d所述桫欏孢子的培養(yǎng)條件具體為在25'C下，先暗培養(yǎng)24h，然后將其轉(zhuǎn)至光照下繼續(xù)培養(yǎng)，光照強(qiáng)度為50陶o1m—2s一1，光照時(shí)間為12h/d。上面所述桫欏孢子的繁殖方法還包括移栽所述孢子體苗的步驟。所述移栽過程的管理?xiàng)l件為夏秋遮蔭，春冬季保持白天溫度21-26。C，夜間溫度10-15°C，空氣濕度70-90%，緩苗20-35d后每月施一次l/2MS培養(yǎng)基。本發(fā)明的繁殖方法適合于桫欏C4"叩^7a邵眾w7oss(Wa11.exHook.)Tryon)。本發(fā)明以孢子為材料，利用組織培養(yǎng)技術(shù)，再結(jié)合對(duì)蕨類植物的專有栽培管理措施，建立了桫欏的孢子繁殖方法。利用本發(fā)明的方法，用少量的孢子材料，即可快速繁育出大量孢子體，平均7-9天孢子即可萌發(fā)，25-35天形成配子體，68-97天形成孢子體苗。與其它現(xiàn)有培養(yǎng)方法相比，本發(fā)明方法具有快速萌發(fā)、短期出苗、培育周期短、成本低廉的特點(diǎn)。本發(fā)明方法彌補(bǔ)了現(xiàn)有桫欏繁殖技術(shù)培育周期長、成本高和效率低的不足，開辟了一條人工快速繁殖挱欏的新途徑，使桫欏的規(guī)?；I(yè)生產(chǎn)成為可能，從而滿足市場對(duì)桫欏的需求，同時(shí)可減少對(duì)其野生資源和環(huán)境的破壞。此外，本發(fā)明還為開展該物種遺傳育種和保護(hù)生物學(xué)等方面的研究提供了良好的試驗(yàn)體系，具有廣泛的應(yīng)用前景。圖1為桫欏的配子體。2為桫欏的試管苗(孢子體苗)。圖3為定植的桫欏幼苗。具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明均為常規(guī)方法。實(shí)驗(yàn)中所述MS培養(yǎng)基的組成為MS培養(yǎng)基的組成<table>complextableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>鐵鹽Na2-EDTA37.3FeS04-7H2O27.8有機(jī)成分煙酸0.5鹽酸吡眵醇(VB6)0.5煙酸硫胺素(VB。0.1甘氨酸2,0肌醇100.0實(shí)施例1、桫欏U"c^/Was"/^;Wa^(Wa11.exHook.)Tryon)的繁殖一、1/2MS培養(yǎng)基的配制1/2MS培養(yǎng)基中的組成成分與MS培養(yǎng)基相同，其中，大量元素和微量元素濃度均為MS培養(yǎng)基的1/2，鐵鹽和有機(jī)成分的濃度與MS培養(yǎng)基相同，瓊脂7g/L，pH為5.8。煮沸溶解后分裝至100ml三角瓶中，然后121°C，高壓蒸汽滅菌20min。二、桫欏孢子的滅菌取成熟的桫欏"Aop力i^3印i加7osa(Wa11.exHook.)Tryon)孢子5mg置于1.5ml離心管內(nèi)，滴入無菌水，充分振蕩使成懸濁液，靜置lh后，4000r/min離心2min，棄上清；然后向離心管內(nèi)滴入約1,Oral含有0.2g/100ml吐溫-80和5g/100mlNaC10的消毒液，對(duì)孢子進(jìn)行消毒滅菌，5min后，4000r/min離心1min，棄上清；最后用無菌水沖洗4-5次，獲得無菌的孢子懸濁液。三、無菌孢子的接種及培養(yǎng)在無菌條件下，先用無菌水將上述配制的1/2MS培養(yǎng)基的表面濕潤，使其表面形成一層薄薄的水膜(以傾斜三角瓶時(shí)匯集在底部的水不能讓滴管吸上連續(xù)的水滴為宜)，然后用滴管將步驟二獲得的無菌孢子懸濁液均勻接種在培養(yǎng)基上。接種后，在25"下，先暗培養(yǎng)24h，然后將其轉(zhuǎn)至光照下繼續(xù)培養(yǎng)，光照強(qiáng)度為50Wno1m—2s-1(光源為熒光燈)，光照時(shí)間為12h/d。四、挱欏幼孢子體苗的移栽及管理培養(yǎng)7天后，孢子開始萌發(fā)，萌發(fā)率為82%，25天(從接種當(dāng)天起算)形成配子體(圖l)，68(從接種當(dāng)天起算)天開始形成孢子體苗。至88-90天左右(從接種當(dāng)天起算)，幼苗高3-4cra，將三角瓶置于自然光照下煉苗6天，再打開瓶蓋煉苗6天。然后用鑷子輕輕夾出試管苗(圖2)，洗凈培養(yǎng)基后，將其移栽至100目細(xì)篩篩選的素砂中，并置于培養(yǎng)室內(nèi)培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為25'C，光照強(qiáng)度為50Mmo1m2s—1(光源為熒光燈)，光照時(shí)間為12h/d。1個(gè)月后將其定植到穴盤中(培養(yǎng)基質(zhì)的成份及混合比例為草炭土細(xì)砂有機(jī)肥二4:2:1)，置溫室培養(yǎng)，夏秋遮蔭，春冬季保持白天溫度21-26°C，夜間溫度10-15'C，空氣濕度70-90%。緩苗1個(gè)月后每月施一次1/2MS培養(yǎng)基，經(jīng)120天左右，幼苗長到5-10cm高，且根系發(fā)達(dá)，進(jìn)行分株上盆，定植幼苗(圖3)，平均定植成活率86%。實(shí)施例2、挱欏G41sop力j7a5^';"^^s(Wa11.exHook.)Tryon)的繁殖一、1/8MS培養(yǎng)基的配制1/腦S培養(yǎng)基的組成成分與MS培養(yǎng)基相同，其中，大量元素和微量元素濃度均為MS培養(yǎng)基的1/8，鐵鹽和有機(jī)成分的濃度與MS培養(yǎng)基相同，瓊脂6.5g/L，pH為5.5。煮沸溶解后分裝至100ml三角瓶中，然后121。C，高壓蒸汽滅菌20min。二、桫欏孢子的滅菌取成熟的桫欏孢子2mg,置于1.5ml離心管內(nèi)，滴入無菌水，充分振蕩使成懸濁液，靜置lh后，4000r/rain離心2min，棄上清；然后向離心管內(nèi)滴入約1.0ml含有O.1g/100ml吐溫-80和3g/100mlNaC10的消毒液，對(duì)孢子進(jìn)行消毒滅菌，4.5min后，4000r/min離心1min，棄上清；最后用無菌水沖洗4-5次，獲得無菌的孢子懸濁液。三、無菌孢子的接種及培養(yǎng)在無菌條件下，先用無菌水將上述配制的1/8MS培養(yǎng)基的表面濕潤，使其表面形成一層薄薄的水膜(以傾斜三角瓶時(shí)匯集在底部的水不能讓滴管吸上連續(xù)的水滴為宜)，然后用滴管將步驟二獲得的無菌孢子懸濁液均勻接種在培養(yǎng)基上。接種后，在22"C下，先暗培養(yǎng)12h，然后將其轉(zhuǎn)至光照下繼續(xù)培養(yǎng)，光照強(qiáng)度為20,1m-2s-1(光源為熒光燈)，光照時(shí)間為8h/d。四、桫欏幼孢子體苗的移栽及管理培養(yǎng)7d(從接種當(dāng)天起算)后，孢子開始萌發(fā)，萌發(fā)率為91%，35d(從接種當(dāng)天起算)形成配子體(圖l)，97d開始形成孢子體苗。至148-156天(從接種當(dāng)天起算)，幼苗高3-4cm，將三角瓶置于自然光照下煉苗10d，再打開瓶蓋煉苗10d。然后用鑷子輕輕夾出試管苗(圖2)，洗凈培養(yǎng)基后，將其移栽至經(jīng)100目細(xì)篩篩選的素砂中，并置于培養(yǎng)室內(nèi)培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為22'C光照強(qiáng)度為20,1nf2s-1(光源為熒光燈)，光照時(shí)間為8h/d。40d后將其定植到穴盤中(培養(yǎng)基質(zhì)的成份及混合比例為草炭土細(xì)砂有機(jī)肥=4:2:1)，置溫室培養(yǎng)，夏秋遮蔭，春冬季保持白天溫度21-26°C，夜間溫度10-15°C，空氣濕度79-90%。緩苗25d后每月施一次l/2MS培養(yǎng)基，待幼苗長到5-10cm高且根系發(fā)達(dá)時(shí)，分株上盆，定植孢子體幼苗(圖3)，平均定植成活率70%。實(shí)施例3、挱欏"Zso/7力ih5^^w〗OM(Wa11.exHook.)Tryon)的繁殖一、全量MS培養(yǎng)基的配制大量元素和微量元素與鐵鹽濃度均與MS培養(yǎng)基相同，鐵鹽和有機(jī)成分的濃度與MS培養(yǎng)基相同，瓊脂8g/L，pH為6.0。煮沸溶解后分裝至100ml三角瓶中，然后121。C，高壓蒸汽滅菌20min。二、桫欏孢子的滅菌取成熟的桫欏孢子7mg,置于1.5ml離心管內(nèi)，滴入無菌水，充分振蕩使成懸濁液，靜置lh后，4000r/min離心2min，棄上清；然后向離心管內(nèi)滴入約1.0ml含有0.3g/100ml吐溫-80和6g/100mlNaC10的消毒液，對(duì)孢子進(jìn)行消毒滅菌，6min后，4000r/min離心1min，棄上清；最后用無菌水沖洗4-5次，獲得無菌的孢子懸濁液。三、無菌孢子的接種及培養(yǎng)在無菌條件下，先用無菌水將上述配制的MS培養(yǎng)基的表面濕潤，使其表面形成一層薄薄的水膜(以傾斜三角瓶時(shí)匯集在底部的水不能讓滴管吸上連續(xù)的水滴為宜)，然后用滴管將步驟二獲得的無菌孢子懸濁液均勻接種在培養(yǎng)基上。接種后，在28'C下，先暗培養(yǎng)72h，然后將其轉(zhuǎn)至光照下繼續(xù)培養(yǎng)，光照強(qiáng)度為80Mmo1m—2s-1(光源為熒光燈)，光照時(shí)間為16h/d。四、桫欏幼孢子體苗的移栽及管理培養(yǎng)9d后，孢子開始萌發(fā)，萌發(fā)率為80%，32d形成配子體(圖l)，90d開始形成孢子體苗。至122-130天(從接種當(dāng)天起算)，幼苗高3-4cm時(shí)，將三角瓶置于自然光照下煉苗8d，再打開瓶蓋煉苗8d。然后用鑷子輕輕夾出試管苗(圖2)，洗凈培養(yǎng)基后，將其移栽至經(jīng)100目細(xì)篩篩選的素砂中，并置于培養(yǎng)室內(nèi)培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為28°C，光照強(qiáng)度為80toolirf2s—1(光源為熒光燈)，光照時(shí)間為16h/d。30d后將其定植到穴盤中(培養(yǎng)基質(zhì)的成份及混合比例為草炭土細(xì)砂有機(jī)肥=4:2:1)，置溫室培養(yǎng)，夏秋遮蔭，春冬季保持白天溫度21-26°C，夜間溫度10-15°C，空氣濕度79-90%。緩苗25d后每月施一次1/2MS培養(yǎng)基，待幼苗長到5-10cm高且根系發(fā)達(dá)時(shí)，分株上盆，定植孢子體幼苗(圖3)，平均定植成活率74%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，利用本發(fā)明方法繁殖桫欏，平均7-9d天孢子即可萌發(fā)，25-35d天形成配子體，68-97天形成孢子體苗，幼孢子體苗移栽成活率可達(dá)86%。權(quán)利要求1、一種桫欏的繁殖方法，是在如下固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)桫欏的孢子，得到孢子體苗；所述固體培養(yǎng)基中的組成成分與MS培養(yǎng)基相同，其中大量元素和微量元素的濃度均為MS培養(yǎng)基的1/8-1，鐵鹽和有機(jī)成分的濃度與MS培養(yǎng)基相同，pH為5.5-6.0。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述培養(yǎng)基中，大量元素和微量元素的濃度為MS培養(yǎng)基的1/2，pH為5.8。3、根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于所述桫欏孢子在培養(yǎng)之前，用含有36g/100mlNaClO和0.1-0.3g/100ml吐溫-80溶液進(jìn)行消毒處理。4、根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述消毒處理的時(shí)間為4.5—6min。5、根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于所述消毒處理為用含有5g/100ralNaC10和0.2g/100ml吐溫-80的溶液消毒5min。6、根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述桫欏孢子的培養(yǎng)條件為在22—28t:下，先暗培養(yǎng)12-72h，然后將其轉(zhuǎn)至光照下繼續(xù)培養(yǎng)，光照強(qiáng)度為20-80Mmol'm^.s-1,光照時(shí)間為8—16h/d。7、根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于所述桫欏孢子的培養(yǎng)條件為在25"下，先暗培養(yǎng)24h，然后將其轉(zhuǎn)至光照下繼續(xù)培養(yǎng)，光照強(qiáng)度為50pmol'm^s-1,光照時(shí)間為12h/d。8、根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述桫欏孢子的繁殖方法還包括移栽所述孢子體苗的步驟。9、根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于所述移栽過程的管理?xiàng)l件為夏秋遮蔭，春冬季保持白天溫度2卜26X:，夜間溫度10-15。C，空氣濕度70-90%，緩苗20-35d后每月施一次1/2MS培養(yǎng)基。10、根據(jù)權(quán)利要求1或8所述的方法，其特征在于所述桫欏為桫欏柳'/Wosa(Wa11.exHook.)Tryon)。全文摘要本發(fā)明公開了桫欏的一種繁殖方法。本發(fā)明涉及植物的繁殖方法，特別涉及桫欏(Alsophilaspinulosa(Wall.exHook.)Tryon)的一種繁殖方法。本發(fā)明所提供的桫欏的繁殖方法，是將桫欏的孢子滅菌后接種在MS培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，再經(jīng)移栽管理，最終獲得孢子體苗。本發(fā)明方法用少量的孢子材料即可快速繁育出大量孢子體，70天左右即可成苗，定植成活率可達(dá)80％以上。本發(fā)明方法彌補(bǔ)了現(xiàn)有桫欏繁殖技術(shù)培育周期長、成本高和效率低的不足，開辟了一條人工快速繁殖桫欏的新途徑，使桫欏的規(guī)?；I(yè)生產(chǎn)成為可能，從而滿足市場對(duì)桫欏的需求，同時(shí)可減少對(duì)其野生資源和環(huán)境的破壞。此外，本發(fā)明還為開展該物種遺傳育種和保護(hù)生物學(xué)等方面的研究提供了良好的試驗(yàn)體系，具有廣泛的應(yīng)用前景。文檔編號(hào)A01H4/00GK101194594SQ20071017969公開日2008年6月11日申請(qǐng)日期2007年12月17日優(yōu)先權(quán)日2007年12月17日發(fā)明者東李,楊李,雷石申請(qǐng)人:中國科學(xué)院植物研究所