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      口腔組織再生和修復(fù)的制作方法

      文檔序號(hào):368821閱讀:310來源:國(guó)知局

      專利名稱::口腔組織再生和修復(fù)的制作方法
      技術(shù)領(lǐng)域
      :本發(fā)明涉及組織工程學(xué)領(lǐng)域,特別涉及一種培養(yǎng)組織構(gòu)建體在口腔組織再生和^修復(fù)中的應(yīng)用。
      背景技術(shù)
      :組織工程學(xué)領(lǐng)域?qū)⑸锕こ谭椒ㄅc生命科學(xué)原理相結(jié)合,用于了解正常的和病態(tài)的哺乳動(dòng)物組織中結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系。組織工程學(xué)的目標(biāo)是開發(fā)和最終使用生物替代物以修復(fù)、保持或改善組織功能。因此,通過組織工程學(xué),有可能在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)設(shè)計(jì)并制造出生物工程化組織。生物工程化組織可以包含通常與自然的哺乳動(dòng)物或人的組織以及合成的或外源性的基質(zhì)支架有關(guān)的細(xì)胞。新的生物工程化組織當(dāng)被移植到宿主上時(shí)必發(fā)揮作用,并且永久地結(jié)合在宿主體內(nèi)或者被作為接受者的宿主患者的細(xì)胞逐漸地生物重塑。制造一種沒有支撐件或支架的組織等效材料在創(chuàng)造新的生物工程化組織中帶來了科學(xué)挑戰(zhàn)。大多數(shù)的口腔軟組織移植過程使用來自腭的自體組織進(jìn)行。盡管這可能在一些過程中非常好地進(jìn)行,但是其缺點(diǎn)是需要制造對(duì)患者而言非常疼痛的"供體部位"。這種附加的供體部位還提供了有限的組織,即,一次僅可治療少數(shù)牙齒。這可導(dǎo)致需要進(jìn)行多次手術(shù)或者牙科醫(yī)生僅僅治療"損壞最重的牙齒",盡管可能遺留下若干個(gè)未經(jīng)治療的也可受益于該移植過程的牙齒。
      發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明涉及通過向受試者的口腔組織移植培養(yǎng)組織構(gòu)建體來治療受試者的口腔病況的方法。本發(fā)明的培養(yǎng)組織構(gòu)建體包括培養(yǎng)的細(xì)胞和內(nèi)源性產(chǎn)生的細(xì)胞外基質(zhì)組分,不需要外源性的基質(zhì)組分或網(wǎng)絡(luò)支撐部件或支架。本發(fā)明因使;。、、'、土、、_、5培養(yǎng)組織構(gòu)建體的移植物包括產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì)組分的成纖維細(xì)胞,而不添加外源性的基質(zhì)組分、網(wǎng)絡(luò)支撐件或支架部件。培養(yǎng)組織構(gòu)建體包括在成分確定的(defined)培養(yǎng)基系統(tǒng)中和/或不使用非成分確定的(undefined)或非人由來的生物組分諸如牛血清或器官提取物的情況下產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì)組分的成纖維細(xì)胞。另外,培養(yǎng)組織構(gòu)建體可由不同類型的連續(xù)的種子細(xì)胞制造,所述種子細(xì)胞產(chǎn)生的培養(yǎng)組織構(gòu)建體^t擬自然組織的細(xì)胞組成和組織構(gòu)造。具體而言,這種培養(yǎng)組織構(gòu)建體包含施用于培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞層上的至少一層上皮細(xì)胞層。進(jìn)一步地,組織構(gòu)建體經(jīng)由培養(yǎng)的細(xì)胞產(chǎn)生和自我裝配,而無需支架支撐件或加入外源性的細(xì)胞外基質(zhì)組分。本發(fā)明的培養(yǎng)組織構(gòu)建體移植物還包括膠原蛋白溶液與收縮劑的凝膠混合物。另外,本發(fā)明的培養(yǎng)組織構(gòu)建體移植物包括布置在非細(xì)胞膠原蛋白凝膠層上的膠原蛋白凝膠層,膠原蛋白凝膠層包含膠原蛋白和收縮劑。在本發(fā)明的又一實(shí)施方案中,將上皮細(xì)胞加入到包含膠原蛋白凝膠和收縮劑的膠原蛋白凝膠層中。組織構(gòu)建體的強(qiáng)度特性使得該組織構(gòu)建體易于操作,因?yàn)樵摻M織構(gòu)建體可從形成其的培養(yǎng)設(shè)備中容易地和可剝離地除去,并且在臨床或試驗(yàn)應(yīng)用中可被直接移植,無需任何支撐件或載體。本發(fā)明的組織構(gòu)建體可用于治療具有口腔組織疾病的患者,所述口腔組織疾病諸如口腔齒齦退縮,牙間乳頭缺失,牙槽嵴缺陷,口腔植入失敗,牙齒分叉缺陷(dentalfurcationdefect),和用于治療在頜面部腫瘤切除后需要組織重建的患者。圖1表示通過羥脯氨酸試,驗(yàn)測(cè)定的,與實(shí)施例1中所述的人新生兒包皮細(xì)胞由來的皮膚構(gòu)建體中的細(xì)胞數(shù)目相比,膠原蛋白濃度的增加。圖2是說明使用成纖維細(xì)胞,水合膠原蛋白網(wǎng)格(lattice)的收縮數(shù)據(jù)圖3是說明使用成纖維細(xì)胞,具有不同膠原蛋白含量的水合膠原蛋白網(wǎng);^各的收縮數(shù)據(jù)圖4是說明使用成纖維細(xì)胞,含有不同數(shù)目的成纖維細(xì)胞的水合膠原蛋白網(wǎng)格收縮數(shù)據(jù)圖5是說明成纖維細(xì)胞對(duì)采用不同群體倍增水平的細(xì)胞的水合膠原蛋白網(wǎng)格的收縮能力的數(shù)據(jù)圖6是說明10.0)ug/ml的抑制劑細(xì)胞松弛素B對(duì)成纖維細(xì)胞收縮水合膠原蛋白網(wǎng)格的能力的作用的數(shù)據(jù)圖7是說明0.36|iig/ml的抑制劑秋水仙酰胺對(duì)成纖維細(xì)胞收縮水合膠原蛋白網(wǎng)格的能力的作用的數(shù)據(jù)圖8是說明阿糖胞苷對(duì)成纖維細(xì)胞收縮水合膠原蛋白網(wǎng)格的能力的作用的數(shù)據(jù)圖9是說明在凝血酶濃度為4.0單位/毫升條件下凝血酶對(duì)血小板收縮膠原蛋白網(wǎng)格的作用圖IO是說明在凝血酶濃度為4.0單位/毫升條件下膠原蛋白網(wǎng)格收縮作為血小板濃度的函數(shù)的圖11A-11D是說明膠原蛋白網(wǎng)格的網(wǎng)格收縮作為所用膠原蛋白的類型和濃度的函數(shù)的圖;和圖12是說明抑制劑細(xì)胞松弛素B和秋水仙酰胺對(duì)血小板收縮水合膠原蛋白網(wǎng)格的作用圖13是本發(fā)明的一個(gè)裝置的立體圖,一部分被分解;圖14是圖13中所示裝置的分解立體圖15是圖13中所示裝置的沿著3—3的截面;圖16是本發(fā)明的另一個(gè)裝置的立體圖,一部分被分解;圖17是圖16中所示裝置自上方顯示的分解圖;和圖18是圖16中所示裝置的沿著6—6的分解截面。發(fā)明詳述本發(fā)明涉及通過移植培養(yǎng)組織構(gòu)建體來治療受試者的口腔病況的方法。應(yīng)當(dāng)注意到,"培養(yǎng)組織構(gòu)建體","工程化活組織","細(xì)胞-基質(zhì)構(gòu)建體","細(xì)胞-基質(zhì)層","皮膚等效材料","活組織"和"活連接組織"作為本發(fā)明的培養(yǎng)組織構(gòu)建體的實(shí)施方案可互換使用。因此,目前的工程化的活組織構(gòu)建體不完全是細(xì)胞裝配的,并且必需依靠加入或結(jié)合外源性基質(zhì)組分或依靠用于構(gòu)造或支撐的合成部件,7或者二者兼有。本文所述的生物工程化組織構(gòu)建體表現(xiàn)出它們的細(xì)胞所由來的組織的許多自然特征,如此產(chǎn)生的組織構(gòu)建體可用于治療患者的口腔病況。一種優(yōu)選方案是包含第一細(xì)胞類型和內(nèi)源性產(chǎn)生的細(xì)胞外基質(zhì)的細(xì)胞-基質(zhì)構(gòu)建體,其中第一細(xì)胞類型能夠合成和分泌細(xì)胞外基質(zhì)以產(chǎn)生細(xì)胞-基質(zhì)構(gòu)建體。另一優(yōu)選方案是雙層構(gòu)建體,其包含第一細(xì)胞類型和內(nèi)源性產(chǎn)生的細(xì)胞外基質(zhì)以及布置在由第一細(xì)胞類型形成的細(xì)胞-基質(zhì)構(gòu)建體上或內(nèi)的第二類型細(xì)胞的細(xì)胞層。更優(yōu)選方案是細(xì)胞-基質(zhì)構(gòu)建體,其包含成纖維細(xì)胞諸如得自真皮的成纖維細(xì)胞以形成培養(yǎng)的真皮構(gòu)建體。另一更優(yōu)選方案是細(xì)胞-基質(zhì)構(gòu)建體,其包含成纖維細(xì)胞諸如得自真皮的成纖維細(xì)胞以形成培養(yǎng)的真皮構(gòu)建體,以及在其上培養(yǎng)的角化細(xì)胞層以形成表皮層,從而得到培養(yǎng)的雙層皮膚構(gòu)建體。本發(fā)明的培養(yǎng)皮膚構(gòu)建體表現(xiàn)了自然皮膚的許多物理學(xué)的、形態(tài)學(xué)的和生物化學(xué)的特征。在更優(yōu)選方案中,細(xì)胞基質(zhì)構(gòu)建體是類似于皮膚的真皮層的組織構(gòu)建體,即人真皮構(gòu)建體,其在包含人由來細(xì)胞的、成分確定的系統(tǒng)中形在最優(yōu)選方案中,本發(fā)明的組織構(gòu)建體在化學(xué)上成分確定的系統(tǒng)中被制造,這個(gè)系統(tǒng)包含人由來細(xì)胞但是不含化學(xué)上非成分確定的或非人生物組分或細(xì)月包。在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中,培養(yǎng)組織構(gòu)建體包含凝膠混合物,該凝膠混合物包含月交原蛋白溶液和收縮劑。在本發(fā)明的優(yōu)選方案中,培養(yǎng)組織構(gòu)建體包括含非細(xì)胞膠原蛋白凝膠的第一層和布置在第一層上的第二層,其中第二層包含第二膠原蛋白凝膠,該第二膠原蛋白凝膠含有膠原蛋白和收縮劑。在本發(fā)明的更優(yōu)選方案中,膠原蛋白與收縮劑的第二層用角化細(xì)胞接種。A:培養(yǎng)組織構(gòu)建體的應(yīng)用本發(fā)明的培養(yǎng)組織構(gòu)建體可用于治療口腔病況,諸如口腔齒齦退縮,牙間乳頭缺失,牙槽嵴缺陷,口腔植入物失敗或頜面部腫瘤退縮。通常認(rèn)為每顆牙齒周圍的附著齦功能區(qū)是健康所必需的。在沒有這種組織時(shí),經(jīng)常發(fā)生牙齦退縮,導(dǎo)致一部分外板喪失,導(dǎo)致牙齒預(yù)后更加惡化。另外,面向沒有附著齦功能區(qū)的牙齒的粘膜通常被發(fā)現(xiàn)是發(fā)炎的,盡管受試者具有良好的家庭保健。這種炎癥可能引起牙齒周圍的骨缺失。自二十世紀(jì)六十年代末期以來,這一類型的問題通常通過游離自體移植被校正。除去面向正關(guān)注的牙齒的粘膜,并從腭收獲角質(zhì)化組織并將其縫合到移植床上。最初,移植物被等離激元循環(huán)所支撐,之后從周圍床進(jìn)行血管再形成。這類移植的成功率近乎100%。然而,大多數(shù)受試者強(qiáng)烈地要求設(shè)法鑒定可以代替腭組織而使用的供體材料。當(dāng)然,這會(huì)使該過程所必需的手術(shù)部位的數(shù)目減少一半。這些年來已經(jīng)使用了許多可替代的供體材料。過去已經(jīng)使用了冷凍干燥的尸體皮膚并且最近已經(jīng)使用非細(xì)胞皮膚移植物作為供體材料。盡管非常輕微,但是與這類皮膚材料有關(guān)的潛在的感染風(fēng)險(xiǎn)(主要是AIDS和肝炎)阻止了它們的應(yīng)用。除此之外,采用這些供體材料的移植物的最終美學(xué)效果通常不那么理^tH、。B:包含至少一種類型的產(chǎn)生細(xì)胞外層的細(xì)胞和內(nèi)源性產(chǎn)生的細(xì)胞外基質(zhì)的構(gòu)造層的培養(yǎng)組織構(gòu)建體本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選方案包括至少一種類型的產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì)的細(xì)胞和內(nèi)源性產(chǎn)生的細(xì)胞外基質(zhì)組分(說得再簡(jiǎn)單些被稱作"基質(zhì)")的構(gòu)造層,其中該基質(zhì)完全由細(xì)胞合成并且通過培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行裝配。該層在本文中被稱作"細(xì)胞-基質(zhì)構(gòu)建體"或"細(xì)胞-基質(zhì)層",因?yàn)榧?xì)胞分泌基質(zhì)并在它們所分泌的基質(zhì)內(nèi)和整個(gè)基質(zhì)中包含細(xì)胞自己。如在200年3月3曰提交的待審美國(guó)專利申請(qǐng)09/523,809中所公開的,其全文并入本文作為參考,培養(yǎng)組織構(gòu)建體不要求外源性基質(zhì)組分,因此不包含外源性基質(zhì)組分,也就是,不通過培養(yǎng)細(xì)胞產(chǎn)生而是用其它方式引入的基質(zhì)組分。在更優(yōu)選方案中,由人真皮成纖維細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞-基質(zhì)構(gòu)建體表現(xiàn)出與自然真皮類似的主導(dǎo)濃度的膠原蛋白。通過電子顯微鏡檢查證實(shí),基質(zhì)實(shí)質(zhì)上是包含膠原蛋白的纖維質(zhì)(該膠原蛋白表現(xiàn)四分之一交錯(cuò)(quarter-staggered)的67nm帶型(bandingpattern)),以及與自然月交原蛋白類似的原纖維和原纖維束的堆積組構(gòu)(packingorganization)。9延遲還原SDS-PAGE已經(jīng)在這些構(gòu)建體中檢測(cè)到存在I型和III型兩種膠原蛋白,它們是在自然人真皮中被發(fā)現(xiàn)的主要膠原蛋白類型。使用標(biāo)準(zhǔn)的免疫組織化學(xué)(IHC)技術(shù),真皮細(xì)胞-基質(zhì)構(gòu)建體對(duì)于核心蛋白聚糖染色呈陽(yáng)性,核心蛋白聚糖是已知與膠原原纖維結(jié)合并被認(rèn)為在體內(nèi)調(diào)節(jié)原纖維直徑的硫酸皮膚素蛋白多糖。核心蛋白聚糖還可通過TEM在構(gòu)建體中被觀察到。產(chǎn)生的組織對(duì)于生腱蛋白染色也呈陽(yáng)性,生腱蛋白是例如在正在修復(fù)的間充質(zhì)或組織中被發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞外基質(zhì)糖蛋白。與體內(nèi)正在修復(fù)的組織非常相似,培養(yǎng)產(chǎn)生的組織已經(jīng)表現(xiàn)出當(dāng)基質(zhì)形成時(shí)其I型膠原蛋白對(duì)III型膠原蛋白的比增加。盡管不希望束縛于理論,但是據(jù)信細(xì)胞在它們之間的開放空間內(nèi)迅速地用與主要由III型膠原蛋白和纖連蛋白組成的肉芽組織類似的松散基質(zhì)填充,然后使用主要由I型膠原蛋白組成的致密基質(zhì)對(duì)這一松散基質(zhì)進(jìn)行重塑。產(chǎn)生的細(xì)胞-基質(zhì)已經(jīng)表現(xiàn)出含有糖胺聚糖(GAG),諸如透明質(zhì)酸(HA);纖連蛋白;除了核心蛋白聚糖之外的蛋白多糖,諸如雙糖鏈蛋白聚糖和多能聚糖;和一系列的硫酸糖胺聚糖,諸如二透明質(zhì)酸;二-軟骨素-O-硫酸酯;二-軟骨素-4-硫酸酯;二-軟骨素-6-硫酸酯;二-軟骨素_4,6-硫酸酯;二-軟骨素-4-硫酸酯-UA-2S;和二-軟骨素-6-硫酸酯-UA-2S。這些結(jié)構(gòu)特征和生化特征隨著構(gòu)建體在培養(yǎng)基中的發(fā)展而展現(xiàn)它們自己并且當(dāng)構(gòu)建體接近其最終形態(tài)時(shí)變得明顯不同。在充分形成的培養(yǎng)真皮細(xì)胞-基質(zhì)構(gòu)建體中這些組分的存在表明了構(gòu)建體具有的結(jié)構(gòu)特征和生化特征接近正常真皮的這些特征。盡管上述列舉的是由真皮成纖維細(xì)胞形成的培養(yǎng)細(xì)胞-基質(zhì)構(gòu)建體的生化特征和結(jié)構(gòu)特征,但是應(yīng)當(dāng)認(rèn)識(shí)到由其它類型的成纖維細(xì)胞形成的培養(yǎng)細(xì)胞-基質(zhì)構(gòu)建體將產(chǎn)生所述細(xì)胞所由來的組織類型的許多這些特征和其它表型特征。有時(shí)候,成纖維細(xì)胞可通過化學(xué)暴露或接觸,物理應(yīng)力,或通過轉(zhuǎn)基因手段被誘導(dǎo)表達(dá)非表型組分。本發(fā)明的另一優(yōu)選方案是具有在其上布置有第二細(xì)胞層的細(xì)胞-基建體,在更優(yōu)選方案中,^"二層細(xì)胞^上皮由來細(xì)胞。在最優(yōu)選方案中:第二層細(xì)胞包含培養(yǎng)的人角化細(xì)胞,其與笫一細(xì)胞-基質(zhì)層(由真皮成纖維細(xì)胞和內(nèi)源性基質(zhì)形成的細(xì)胞-基質(zhì)構(gòu)建體以形成真皮層)一起,包括活皮膚構(gòu)建體。當(dāng)完全形成時(shí),表皮層是多層的、層狀的和分化良好的10角化細(xì)胞層,其顯示出基底層,基底上層,顆粒層和角質(zhì)層。通過透射電子顯微鏡(TEM)顯示,皮膚構(gòu)建體在真皮-表皮連接處具有發(fā)育良好的基底膜。通過TEM可觀察到,基底膜似乎在半橋粒周圍最厚,這以由VII型膠原蛋白組成的錨定原纖維(anchoringfibril)為標(biāo)記??梢杂^察到錨定原纖維從基底膜離開并在真皮層內(nèi)截留膠原原纖維。這些錨定原纖維以及其它基底膜組分由角化細(xì)胞分泌。還已知的是盡管角化細(xì)胞能夠自己?jiǎn)为?dú)地分泌基底膜組分,但是可識(shí)別的基底膜在沒有成纖維細(xì)胞存在下不會(huì)形成。本發(fā)明的皮膚構(gòu)建體的免疫組織化學(xué)染色還表明存在層粘連蛋白,其是基底膜蛋白。在本發(fā)明的用于形成細(xì)胞-基質(zhì)構(gòu)建體的優(yōu)選方法中,將第一細(xì)胞類型,即產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì)的細(xì)胞類型接種到底物上,進(jìn)行培養(yǎng),并被誘導(dǎo)以在其周圍合成和分泌經(jīng)過組構(gòu)的細(xì)胞外基質(zhì),從而形成細(xì)胞-基質(zhì)構(gòu)建體。在本發(fā)明的另一優(yōu)選方法中,細(xì)胞-基質(zhì)構(gòu)建體的表面用第二細(xì)胞類型的細(xì)胞接種并進(jìn)行培養(yǎng)以形成雙層組織構(gòu)建體。在更優(yōu)選方法中,具有與自然人皮膚類似特征的全厚度皮膚構(gòu)建體由如下形成在足以誘導(dǎo)基質(zhì)合成的條件下培養(yǎng)成纖維細(xì)胞諸如人真皮成纖維細(xì)胞,形成真皮細(xì)胞和基質(zhì)的細(xì)胞-基質(zhì),即真皮層,在其上接種人上皮細(xì)胞如角化細(xì)胞,因此,獲得本發(fā)明的培養(yǎng)組織構(gòu)建體的一種方法包括(a)在沒有外源性細(xì)胞外基質(zhì)組分或結(jié)構(gòu)支撐件的條件下培養(yǎng)至少一種產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì)的細(xì)胞類型;和(b)刺激步驟(a)的細(xì)胞以合成、分泌和組構(gòu)細(xì)胞外基質(zhì)組分以形成由細(xì)胞以及由這些細(xì)胞合成的基質(zhì)組成的組織-構(gòu)建體;其中步驟(a)和(b)可同時(shí)地或連續(xù)地進(jìn)行。為了形成包含細(xì)胞-基質(zhì)構(gòu)建體和其上的第二細(xì)胞層的雙層培養(yǎng)組織構(gòu)建體,該方法另外包括步驟(c)在形成的組織-構(gòu)建體的表面上培養(yǎng)笫二類型的細(xì)胞以產(chǎn)生雙層組織構(gòu)建體。分泌細(xì)胞外基質(zhì)組分并將細(xì)胞外基質(zhì)組分組構(gòu)形成細(xì)胞基質(zhì)構(gòu)建體的任何細(xì)胞類型??膳囵B(yǎng)超過一種的產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì)的細(xì)胞類型來形成細(xì)胞-基質(zhì)構(gòu)建體。不同細(xì)胞類型或組織來源的細(xì)胞可在一起進(jìn)行培養(yǎng)以產(chǎn)生與在自然組織中所發(fā)現(xiàn)的類似的互補(bǔ)組分和結(jié)構(gòu)。例如,產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì)的細(xì)胞類型可具有與其混合在一起的其它細(xì)胞類型以產(chǎn)生一定量的通常不能由第一細(xì)胞類型產(chǎn)生的那些細(xì)胞外基質(zhì)。作為替代,產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì)的細(xì)胞類型也可與其它的在組織中形成特化組織構(gòu)造但是實(shí)質(zhì)上不對(duì)細(xì)胞-基質(zhì)構(gòu)建體(諸如在本發(fā)明的某些皮膚構(gòu)建體中)的基質(zhì)方面的總體形成有貢獻(xiàn)的細(xì)胞類型。盡管根據(jù)本發(fā)明可使用任何的產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì)的細(xì)胞類型,但是本發(fā)明優(yōu)選使用的細(xì)胞類型來自間充質(zhì)。更優(yōu)選的細(xì)胞類型是成纖維細(xì)胞,基質(zhì)細(xì)胞,和其它支撐結(jié)締組織細(xì)胞,最優(yōu)選在人真皮中發(fā)現(xiàn)的人真皮成纖維細(xì)胞用于生產(chǎn)人真皮構(gòu)建體。成纖維細(xì)胞通常產(chǎn)生許多的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白質(zhì),主要是膠原蛋白。然而,成纖維細(xì)胞產(chǎn)生幾種類型的膠原蛋白,I型膠原蛋白在體內(nèi)最普遍。人成纖維細(xì)胞抹可以來自許多來源,包括但不限于男嬰包皮,真皮,腱,肺,臍帶,軟骨,尿道,角膜基質(zhì),口腔粘膜,和腸。人源細(xì)胞可包括但不限于成纖維細(xì)胞,可包括平滑肌細(xì)胞,軟骨細(xì)胞,和間質(zhì)來源的其它結(jié)締組織細(xì)胞。優(yōu)選地,但不要求在生產(chǎn)組織構(gòu)建體中使用的產(chǎn)生基質(zhì)的細(xì)胞的來源可來自在采用本發(fā)明的培養(yǎng)方法之后其要相似于或模仿的組織類型。例如,在其中生產(chǎn)皮膚-構(gòu)建體的實(shí)施方案中,優(yōu)選的產(chǎn)生基質(zhì)的細(xì)胞是成纖維細(xì)胞,優(yōu)選真皮來源。在另外的優(yōu)選實(shí)施方案中,通過顯微解剖從毛嚢的真皮乳頭分離的產(chǎn)角膜-構(gòu)建口體的實(shí)施5方一案中,產(chǎn)生基質(zhì)的細(xì)胞來自角膜i質(zhì)。細(xì);包供體可在發(fā)育和年齡方面不同。細(xì)胞可來自胚兒、嬰兒、和包括成人的老年個(gè)體的供體組織。胚胎祖細(xì)胞諸如間充質(zhì)干細(xì)胞可用于本發(fā)明中并;f皮誘導(dǎo)分化以發(fā)育成所需組織。盡管人細(xì)胞優(yōu)選用在本發(fā)明中,但是在本發(fā)明方法中使用的細(xì)胞不限于人由來的細(xì)胞??墒褂玫米云渌溉閯?dòng)物的細(xì)胞,其它哺乳動(dòng)物源包括但不限于馬屬動(dòng)物,犬科動(dòng)物,豬科動(dòng)物,牛類動(dòng)物,和羊來源動(dòng)物;或嚙齒動(dòng)物諸如小鼠或大鼠。另外,在本發(fā)明中也可使用自然產(chǎn)生的細(xì)胞,化學(xué)或病毒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞,或重組細(xì)胞或基因工程細(xì)胞。對(duì)于引入超過一種的細(xì)胞類型的實(shí)施方案,可使用來自兩種或多種來源的正常細(xì)胞的嵌合混合物;正常細(xì)胞和基因修飾或轉(zhuǎn)染細(xì)胞的混合物;或來自兩種或多種物種或組織來源的細(xì)J包的混合物。12在細(xì)胞-基質(zhì)構(gòu)建體的生產(chǎn)中可使用重組或基因工程細(xì)胞來產(chǎn)生組織構(gòu)建體,其用作藥物遞送移植物,用于需要增加天然細(xì)胞產(chǎn)物的水平或需要用治療劑進(jìn)行治療的患者??山柚浦参镏亟M細(xì)胞產(chǎn)物,生長(zhǎng)因子,激素,肽或蛋白質(zhì),或者根據(jù)需要當(dāng)由于患者體內(nèi)存在的狀況而受到生物學(xué)、化學(xué)或熱信號(hào)調(diào)劑時(shí),細(xì)胞可被生成并被遞送到患者達(dá)持續(xù)時(shí)間。根據(jù)培養(yǎng)組織構(gòu)建體的使用適應(yīng)癥,希望長(zhǎng)期或短期的基因產(chǎn)物表達(dá)。當(dāng)培養(yǎng)組織構(gòu)建體被植入以向患者遞送持續(xù)延長(zhǎng)時(shí)段的治療產(chǎn)物時(shí)希望長(zhǎng)期表達(dá)。相反地,在以下的情況中希望短期表達(dá)當(dāng)培養(yǎng)組織構(gòu)建體被移植到具有創(chuàng)傷的患者,在該創(chuàng)傷處,培養(yǎng)組織構(gòu)建體的細(xì)胞將促進(jìn)正常的或接近正常的痊愈或用于減少傷口部位的劃痕,一旦創(chuàng)傷愈合,得自培養(yǎng)組織構(gòu)建體的基因產(chǎn)物在創(chuàng)傷部位處將不再被需要或可能不再被需要。細(xì)胞也可進(jìn)行基因工程化以表達(dá)蛋白質(zhì)或不同類型的細(xì)胞外基質(zhì)組分,這些蛋白質(zhì)或不同類型的細(xì)胞外基質(zhì)組分是"正常,,的但以高水平表達(dá)或者以某種方式被改性,從而制造包括細(xì)胞外基質(zhì)和活細(xì)胞的移植物裝置,其具有用于改善傷口愈合,促進(jìn)或引導(dǎo)新血管生成,或使疤痕或瘢痕瘤形成最小化的治療學(xué)優(yōu)點(diǎn)。這些過程通常是本領(lǐng)域已知的,并且描述于Sambrook等,MolecularCloning,ALaboratoryManual,ColdSpringHarborPress,ColdSpringHarbor,NY(1989)中,該文獻(xiàn)作為參考并入本文。以上提到的所有類型的細(xì)胞都被包括在本文使用的"產(chǎn)生基質(zhì)的細(xì)胞"的定義中。由成纖維細(xì)胞產(chǎn)生的占優(yōu)勢(shì)的主要細(xì)胞外基質(zhì)組分是原纖維膠原蛋白,特別是I型膠原蛋白。原纖維膠原蛋白是細(xì)胞-基質(zhì)結(jié)構(gòu)中的關(guān)鍵組分;然而,本發(fā)明不限于僅僅由這種蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)類型組成的基質(zhì)。例如,其它的膠原蛋白,來自膠原蛋白家族的原纖維膠原蛋白和非原纖維月交原蛋白二者,諸如ii、m、iv、v、vi、vn、vin、ix、x、xi、XII、XIII、XIV、XV、XVI、XVII、XVIII、XIX型月交原蛋白可通過采用適當(dāng)?shù)募?xì)胞類型#:產(chǎn)生。類似地,使用本發(fā)明的方法可以產(chǎn)生和沉積的其它基質(zhì)蛋白質(zhì)包括但是不限于彈性蛋白;蛋白聚糖諸如核心蛋白聚糖或雙糖鏈蛋白聚糖;或糖蛋白諸如生腱蛋白;玻連蛋白;粘連蛋白;層粘連蛋白,凝血栓蛋白I和糖胺聚糖(GAG)諸如透明質(zhì)酸(HA)。產(chǎn)生基質(zhì)的細(xì)胞在適用于動(dòng)物細(xì)胞或組織培養(yǎng)的器皿中進(jìn)行培養(yǎng),所述器皿諸如培養(yǎng)皿,燒瓶,或轉(zhuǎn)瓶,它們?cè)试S形成三維組織樣結(jié)構(gòu)。細(xì)胞并為待形成的細(xì)胞-基質(zhì)構(gòu)建體提供錨定機(jī)構(gòu)的生物學(xué)相容材料。可使用諸如以下的材料作為細(xì)胞生長(zhǎng)表面玻璃;不銹鋼;聚合物,包括聚碳酸酯,聚苯乙烯,聚氯乙烯,聚乙二烯(polyvinylidene),聚二甲硅氧烷,含氟聚合物,和氟化乙烯丙烯;和硅底物,包括熔融二氧化硅,多晶硅,或硅晶體。細(xì)胞生長(zhǎng)表面材料可經(jīng)過化學(xué)處理或改性,帶靜電荷,或涂覆生物制品諸如聚-L-賴氨酸或肽。肽涂層的例子是RGD肽。盡管本發(fā)明的組織構(gòu)建體可在固體細(xì)胞生長(zhǎng)表面上生長(zhǎng),但是優(yōu)選使用帶有孔隙的細(xì)胞生長(zhǎng)表面,孔隙使膜的上表面和下表面二者相通以允許培養(yǎng)基雙側(cè)接觸正在發(fā)育的組織構(gòu)建體或用于僅僅從下表面接觸培養(yǎng)基。雙側(cè)接觸允許培養(yǎng)基接觸正在發(fā)育的構(gòu)建體的上表面和下表面,使得構(gòu)建體以最大表面面積暴露于培養(yǎng)基中所含的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)下。培養(yǎng)基也可僅僅接觸正在形成的培養(yǎng)組織構(gòu)建體的下表面,從而當(dāng)在培養(yǎng)皮膚構(gòu)建體發(fā)育過程中上表面可曝露在空氣中。優(yōu)選的培養(yǎng)容器是采用載體插入物、用培養(yǎng)基處理的可滲透件諸如在含有培養(yǎng)基的培養(yǎng)容器中懸浮的多孔膜的培養(yǎng)容器。通常,膜被固定到筒形構(gòu)件或骨架的一端,所述筒形構(gòu)件或骨架被插入并與底部相接,諸如可用蓋子覆蓋的培養(yǎng)皿。引入載體插入物和多孔膜的培養(yǎng)容器是本領(lǐng)域已知的并且優(yōu)選被用于實(shí)施本發(fā)明,并且在本領(lǐng)域的多個(gè)美國(guó)專利中被描述,其中一些已經(jīng)在市場(chǎng)上可買到,所述專利包括例如,5,766,937,5,466,602,5,366,893,5,358,871,5,215,920,5,026,649,4,871,674,4,608,342,其公開4皮并入本文。當(dāng)使用這類培養(yǎng)容器時(shí),在膜的一個(gè)表面上,優(yōu)選在頂部朝上的表面上產(chǎn)生組織-構(gòu)建體,并且培養(yǎng)物在上、下表面都與細(xì)胞培養(yǎng)基接觸。生長(zhǎng)表面內(nèi)的孔隙允許用于提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的培養(yǎng)基穿過膜通到培養(yǎng)物的下側(cè),/人而允許細(xì)胞從雙側(cè)或^叉從底側(cè)^皮供應(yīng)。優(yōu)選孔徑為足夠小從而不能使細(xì)胞的生長(zhǎng)穿過膜,但又足夠大從而允許培養(yǎng)基中所含的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)自由(諸如通過毛細(xì)管作用)通到細(xì)胞-基質(zhì)構(gòu)建體的底表面。優(yōu)選的孔徑為約低于3微米但是介于約0.1微米到約3微米的范圍中間,更優(yōu)選介于約0.2微米到約1微米的范圍中間,最優(yōu)選使用介于約0.4微米到約0.6微米范圍中間的尺寸孔隙。在人真皮成纖維細(xì)胞的14情況中,最優(yōu)選的材料是具有在約0.4微米到約0.6微米之間的孔徑的聚碳酸酯。最大孔徑不僅根據(jù)細(xì)胞大小而定,而且根據(jù)細(xì)胞改變其形狀并通過膜的能力而定。重要的是類似組織的構(gòu)建體附著于表面但是不結(jié)合或包封底物,從而諸如用最小的力剝離時(shí)可被取下。形成的組織構(gòu)建體的大小和形狀由其所生長(zhǎng)的容器表面或膜的大小決定。底物可以是圓形或角形的,或者具有圓角,或者具有不規(guī)則形狀。底物作為模具也可是平坦的或者具有波狀外形,從而生產(chǎn)與創(chuàng)傷相接或;f莫仿自然組織的物理結(jié)構(gòu)的成形構(gòu)建體。為了應(yīng)對(duì)生長(zhǎng)底物的更大的表面面積,按比例地向表面接種更多細(xì)胞,并且需要更大體積的培養(yǎng)基以充分地浸泡和滋養(yǎng)細(xì)胞。當(dāng)最終形成組織構(gòu)建體時(shí),無論其是單層細(xì)胞-基質(zhì)構(gòu)建體還是雙層構(gòu)建體,在將其移植到患者之前通過剝離從膜底物上被取下。本發(fā)明的培養(yǎng)組織構(gòu)建體不依賴合成的或可生物再吸收的部件諸如網(wǎng)部件用于形成組織構(gòu)建體。網(wǎng)部件作為機(jī)織材料、針織材料或氈制材料被組構(gòu)。在其中使用網(wǎng)部件的系統(tǒng)中,細(xì)胞在網(wǎng)部件上進(jìn)行培養(yǎng)并且在網(wǎng)的側(cè)邊上或縫隙內(nèi)生長(zhǎng)以將網(wǎng)包封和結(jié)合在培養(yǎng)組織構(gòu)建體內(nèi)。通過結(jié)合這種網(wǎng)的方法形成的最終的構(gòu)建體依賴網(wǎng)的物理支撐和體積。依賴合成的網(wǎng)部件的培養(yǎng)組織構(gòu)建體的例子在Naughton等的美國(guó)專利5,580,781,5,443,950,5,266,480,5,032,508,4,963,489中公開。用于生產(chǎn)細(xì)胞-基質(zhì)層的系統(tǒng)可以是靜態(tài)的或者可對(duì)培養(yǎng)基采用灌注手段。在靜態(tài)系統(tǒng)中,培養(yǎng)基是靜止的和相對(duì)不動(dòng)的,而在灌注系統(tǒng)中培養(yǎng)基是運(yùn)動(dòng)的。培養(yǎng)基的灌注影響細(xì)胞的存活力并加強(qiáng)基質(zhì)層的發(fā)育。灌注手段包括但是不限于在培養(yǎng)皿中在包含培養(yǎng)膜的底物阻擋件下方(以下)或其附近使用磁力攪拌棒或機(jī)動(dòng)化葉輪以攪拌培養(yǎng)基;在培養(yǎng)皿或培養(yǎng)室內(nèi)泵送培養(yǎng)基或泵送培養(yǎng)基通過培養(yǎng)皿或培養(yǎng)室;在振搖臺(tái)或轉(zhuǎn)動(dòng)臺(tái)上輕輕地?fù)u動(dòng)培養(yǎng)皿;或如果在轉(zhuǎn)瓶中產(chǎn)生時(shí)則進(jìn)行轉(zhuǎn)'適用于本發(fā)明的口培l(xiāng)基配方^基于待培養(yǎng)的細(xì)胞類型和待生產(chǎn)的組織構(gòu)造進(jìn)行選擇。使用的培養(yǎng)基和促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)、基質(zhì)合成和存活力所需的特定培養(yǎng)條件將根據(jù)生長(zhǎng)的細(xì)胞類型的不同而異。在有些情況下,諸如在制造本發(fā)明的生物工程化雙層皮膚構(gòu)建體時(shí),培養(yǎng)基的組成隨著制造的每個(gè)階段而變化,因?yàn)樾枰煌难a(bǔ)給以用于不同的目的。在優(yōu)選的方法中,細(xì)胞-基質(zhì)層在成分確定的條件下形成,也就是說,在化學(xué)上成分確定的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。在另外的優(yōu)選方法中,組織構(gòu)建體包括細(xì)胞-基質(zhì)層,該細(xì)胞-基質(zhì)層具有在其上布置和培養(yǎng)的第二細(xì)胞層,其中兩種細(xì)胞類型都在成分確定的培養(yǎng)基系統(tǒng)中進(jìn)行培養(yǎng)。作為替代,組織構(gòu)建體包括在成分確定的培養(yǎng)基條件下制造的細(xì)胞-基質(zhì)層,和在非成分確定的培養(yǎng)基條件下在所述細(xì)胞-基質(zhì)層上形成的第二層。在相反的情況下,組織構(gòu)建體包括可在非成分確定的培養(yǎng)基條件下制造的細(xì)胞-基質(zhì)層,和在成分確定的培養(yǎng)基條件下在所述細(xì)胞-基質(zhì)層上形成的第二層?;瘜W(xué)上成分確定的培養(yǎng)基的使用是優(yōu)選的,化學(xué)上成分確定的培養(yǎng)基是這樣的培養(yǎng)基,其不含非成分確定的動(dòng)物器官或組織提取物,例如血清,垂體提取物,下丘腦提取物,胎盤提取物,或胚胎提取物或蛋白質(zhì),以及由飼養(yǎng)細(xì)胞分泌的因子。在最優(yōu)選的實(shí)施方案中,培養(yǎng)基不含加非成分確定的組分不是優(yōu)選的,但是非成分確定的組分可以根據(jù)本文公開的方法在任何培養(yǎng)時(shí)間點(diǎn)被使用來成功地制造組織構(gòu)建體。當(dāng)采用實(shí)施本發(fā)明時(shí),得到的組織構(gòu)建體是成分確定的人組織構(gòu)建體。在供最功能等效物以補(bǔ)充化學(xué)上成分確定的培養(yǎng)基。通常,細(xì)胞培養(yǎng)領(lǐng)域的技術(shù)人員將能確定與通常已知的動(dòng)物組分相當(dāng)?shù)倪m宜天然人等價(jià)物、人重組等價(jià)物、或合成等價(jià)物來補(bǔ)充本發(fā)明的培養(yǎng)基而無需進(jìn)行不適當(dāng)?shù)难芯炕蛟囼?yàn)。在臨床中使用這種構(gòu)建體的優(yōu)點(diǎn)是對(duì)外來的動(dòng)物或交叉物種病毒污染和感染的擔(dān)心凈皮降4氐了。在試-瞼方案中,化學(xué)上成分確定的構(gòu)建體的優(yōu)點(diǎn)是當(dāng)試驗(yàn)時(shí),結(jié)果不存在由于非成分確定的組分的存在所導(dǎo)致的混淆。培養(yǎng)基由通常被進(jìn)一步補(bǔ)充了其它組分的營(yíng)養(yǎng)基礎(chǔ)物組成。在動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)領(lǐng)域,熟練技術(shù)人員可以確定有合理的期望值可以用于成功地生產(chǎn)本發(fā)明組織構(gòu)建體的確定適當(dāng)?shù)臓I(yíng)養(yǎng)基礎(chǔ)物。許多市場(chǎng)上可買到的營(yíng)養(yǎng)物來源可用于實(shí)施本發(fā)明。這些包括市場(chǎng)上可買到的提供無機(jī)鹽,能量來源氨基酸,和B族維生素的營(yíng)養(yǎng)物來源,諸如Dulbecco氏改進(jìn)的伊格爾培養(yǎng)基(DMEM);極限必需培養(yǎng)基(MEM);Ml";RPMI1M0;16Iscove氏改進(jìn)的Dulbecco培養(yǎng)基(EDMEM)。極限必需培養(yǎng)基(MEM)和M199要求另外補(bǔ)充磷脂前體和非必需氨基酸。市場(chǎng)上可買到的提供附加氨基酸,核酸,酶輔助因子,磷脂前體和無機(jī)鹽的富含維生素的混合物包括Ham'sF-12,Ham'sF-10,NCTC109,和NCTC135。雖然具有不同濃度,但是所有的基礎(chǔ)培養(yǎng)基都為細(xì)胞提供了基礎(chǔ)營(yíng)養(yǎng)物來源,這些基礎(chǔ)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)是葡萄糖、氨基酸、維生素和無機(jī)離子與其它基礎(chǔ)培養(yǎng)基組分在一起的形式。本發(fā)明的最優(yōu)選的基礎(chǔ)培養(yǎng)基分別包括以下的營(yíng)養(yǎng)基礎(chǔ)物不含鈣的或低鈣的Dulbecco氏改進(jìn)的伊格爾培養(yǎng)基(DMEM),或者,二者的比為3:1到1:3的DMEM和Ham'sF-12。該基礎(chǔ)培養(yǎng)基補(bǔ)充有諸如氨基酸,生長(zhǎng)因子和激素的組分。用于本發(fā)明細(xì)胞培養(yǎng)的成分確定的培養(yǎng)基在Parenteau的美國(guó)專利5,712,163中和在國(guó)際PCT公開WO95/31473中描述,所述公開作為參考并入本文。其它培養(yǎng)基是本領(lǐng)域已知的,諸如在Ham和McKeehan的MethodsinEnzymology,58:44-93(1979)中公開的培養(yǎng)基,或者,對(duì)于其它適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)上成分確定的培養(yǎng)基,在Bottenstein等的MethodsinEnzymology,58:94-109(1979)中7>開。在優(yōu)選實(shí)施方案中,基礎(chǔ)培養(yǎng)基補(bǔ)充有動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物領(lǐng)域熟練技術(shù)人員已知的以下組分胰島素,鐵傳遞蛋白,三碘曱腺原氨酸(T3),和乙醇胺和o-磷?;?乙醇胺之一或二者,其中用于補(bǔ)充的濃度和置換可由熟練的技術(shù)人員確定。胰島素是一種多肽激素,其促進(jìn)葡萄糖和氨基酸的攝取以通過多種途徑提供長(zhǎng)期益處。胰島素或胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGF)的補(bǔ)充對(duì)于長(zhǎng)期培養(yǎng)是必要的,因?yàn)樽罱K會(huì)發(fā)生細(xì)胞攝取葡萄糖和氨基酸的能力耗盡和細(xì)胞表型的可能降解。胰島素可來自動(dòng)物例如牛類動(dòng)物,人源,或通過重組手段得到的人重組胰島素形式。因此,人胰島素將有資格作為并非來自非人生物學(xué)來源的、化學(xué)上成分確定的組分。胰島素補(bǔ)充可用于連續(xù)培養(yǎng)并且在較寬的濃度范圍內(nèi)被提供給培養(yǎng)基。優(yōu)選的濃度范圍為約0.1|ug/ml到約500jug/ml,更優(yōu)選在約5|ig/ml到約400|ug/ml,和最優(yōu)選在約375pg/ml。對(duì)于被選擇用于培養(yǎng)的細(xì)胞類型,用于補(bǔ)充的胰島素樣生長(zhǎng)因子諸如IGF-1或IGF-2的適當(dāng)濃度可由本領(lǐng)域技術(shù)人員容易地確定。鐵傳遞蛋白是用于調(diào)節(jié)鐵運(yùn)輸?shù)倪f質(zhì),鐵是在血清中發(fā)現(xiàn)的必需微量元素。因?yàn)橛坞x形式的鐵對(duì)細(xì)胞具有毒性,在血清中,鐵以在優(yōu)選約0.05|ug/ml到約50|ag/ml,更優(yōu)選在約5jug/ml的濃度范圍內(nèi)與鐵傳遞蛋白結(jié)合的形式提供給細(xì)胞。三碘曱腺原氨酸(T3)是基本成分,并且是活性形式的甲狀腺激素,其被包含在培養(yǎng)基中以維持細(xì)胞代謝速率。三碘甲腺原氨酸以約0pM到約400pM的濃度范圍,更優(yōu)選約2pM到約200pM的濃度范圍,最優(yōu)選在約20pM下^f皮補(bǔ)充到培養(yǎng)基中。乙醇胺和o-磷?;?乙醇胺之一或二者作為磷脂被加入,其作用是在肌醇路徑和脂肪酸代謝中作為重要前體。在無血清培養(yǎng)基中補(bǔ)充通常在血清中被發(fā)現(xiàn)的脂質(zhì)是必要的。乙醇胺和o-磷?;?乙醇胺在約10—6到約10—2M的濃度范圍,更優(yōu)選在約lxl(T4M的濃度下被提供給培養(yǎng)基。在整個(gè)培養(yǎng)期間,基礎(chǔ)培養(yǎng)基另外補(bǔ)充有其它組分諸如氫化可的松,硒和L-谷氨酰胺以誘導(dǎo)合成或分化,或改善細(xì)力包生長(zhǎng)。強(qiáng)分化特征諸如內(nèi)披蛋白和角化細(xì)胞轉(zhuǎn)谷酰胺酶含量(Rubin等,J.CellPhysiol.,138:208-214(1986))。因此,氫化可的松是在其中這些特征是有益的情況下時(shí)所需的添加劑,諸如在形成角化細(xì)胞片狀移植物或皮膚構(gòu)建體時(shí)。氫化可的松可以約O.Olpg/ml到約4.0pg/ml,最優(yōu)選約0.4jng/ml到16jug/ml的濃度范圍被提供。硒被加入到無血清培養(yǎng)基中以再供給通常由血清提供的微量元素硒。硒可以在約10-9到約1(T7M的濃度范圍;最優(yōu)選在約5.3xl0-8M的濃度下被提供。L-谷氨酰胺這一氨基酸存在于一些營(yíng)養(yǎng)基礎(chǔ)物中,并且可在其中含量為零或含量不夠的情況中被添加。L-谷氨酰胺也可以穩(wěn)定形式被提供,諸如以商標(biāo)GlutaMAX-l(GibcoBRL,GrandIsland,NY)^皮出售的形式。GlutaMAX-lTM是穩(wěn)定的二肽形式的L-丙氨?;?L-谷氨酰胺,并且可與L-谷氨酰胺互換使用,并且作為L(zhǎng)-谷氨酰胺的替代物以等摩爾濃度被提供。該二肽為L(zhǎng)-谷氨酰胺在儲(chǔ)存和培養(yǎng)期間隨時(shí)間發(fā)生的降解提供了穩(wěn)定性,降解可導(dǎo)致培養(yǎng)基中L-谷氨酰胺的有效濃度變得不確定。通常,基礎(chǔ)培養(yǎng)基補(bǔ)充有優(yōu)選在約1mM到約6mM之間的,更優(yōu)選在約2mM到約5mM之間的,和最優(yōu)選4mM濃度的L-谷氨酰胺或GlutaMAX-lTM。生長(zhǎng)因子諸如表皮生長(zhǎng)因子(EGF)也可被加入到培養(yǎng)基中以通過細(xì)胞遞增和接種幫助形成培養(yǎng)物??墒褂米匀恍问降幕蛑亟M形式的EGF。當(dāng)制造不含非人的生物學(xué)組分的皮膚等效材料時(shí),人源形式(自然或重組)的EGF優(yōu)選用在培養(yǎng)基中。EGF是任選的組分并且可在約1到15ng/mL的濃度下,更優(yōu)選在約5到10ng/mL的濃度下被提供。上面描述的培養(yǎng)基通常如下制備。然而,應(yīng)當(dāng)了解的是,本發(fā)明的組分可采用不與其物理性質(zhì)相矛盾的常規(guī)方法制備和裝配。本領(lǐng)域公知可使用適當(dāng)?shù)念愃莆锘蚬δ艿韧饔梦锎婺承┙M分,用于利用率或經(jīng)濟(jì)的目的,并實(shí)現(xiàn)相似的結(jié)果。天然存在的生長(zhǎng)因子可被具有相似性質(zhì)并且在實(shí)施本發(fā)明時(shí)獲得相似結(jié)果的重組的或合成的生長(zhǎng)因子所替代。本發(fā)明的培養(yǎng)基是無菌的。無菌組分在購(gòu)買時(shí)是無菌的,或者在制備后通過常規(guī)方法諸如過濾處理而變成無菌的。適當(dāng)?shù)臏缇^程在以上的全部實(shí)施例中都祐使用。DMEM和F-12首先^皮合并,然后加入各個(gè)組分以得到培養(yǎng)基。所有組分的儲(chǔ)備溶液可以在-20。C儲(chǔ)存,例外是營(yíng)養(yǎng)物來源可以在4t:儲(chǔ)存。所有的上述儲(chǔ)備溶液被制備為500X的最終濃度。胰島素,鐵傳遞蛋白和三碘曱腺原氨酸(全部得自Sigma)的儲(chǔ)備溶液如下制備最初將三碘曱腺原氨酸溶于絕對(duì)乙醇與1N鹽酸(HC1)為2:1的溶液中。將胰島素溶于稀HC1(大約O.IN)并將鐵傳遞蛋白溶于水中。然后將三種溶液混合并在水中稀釋到500X濃度。將乙醇胺和o-磷?;?乙醇胺溶于水中到500X濃度并進(jìn)行過濾滅菌。將黃體酮溶于絕對(duì)乙醇中并用水稀釋。將氫化可的松溶于絕對(duì)乙醇中并在磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中稀釋。將勵(lì)溶于水中到500X濃度并進(jìn)行過濾滅菌。EGF購(gòu)買時(shí)是無菌的并一皮溶于PBS中。腺。票呤難溶解,但是可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的許多方法凈皮溶解。血清白蛋白可浮皮加入到某些組分中以使它們?cè)谌芤褐惺欠€(wěn)定的并且目前得自人或動(dòng)物來源。例如,可加入人血清白蛋白(HSA)或牛血清白蛋白(BSA)用于長(zhǎng)期儲(chǔ)存從而保持黃體酮和EGF儲(chǔ)備溶液的活性。培養(yǎng)基可以在制備后立即使用,或者儲(chǔ)存在4。C下。如果被儲(chǔ)存,則直到使用前才加入EGF。為了通過產(chǎn)生基質(zhì)的細(xì)胞的培養(yǎng)物形成細(xì)胞-基質(zhì)層,將培養(yǎng)基補(bǔ)充另外的促進(jìn)由細(xì)胞所進(jìn)行的基質(zhì)合成和沉積的試劑。這些補(bǔ)充試劑具有細(xì)胞相容性,被確定具有高純度并且未被污染。用于產(chǎn)生細(xì)胞-基質(zhì)層的培養(yǎng)基被稱作"基質(zhì)生成培養(yǎng)基"。19為了制備基質(zhì)生成培養(yǎng)基,將基礎(chǔ)培養(yǎng)基補(bǔ)充有抗壞血酸衍生物諸如抗壞血酸鈉,抗壞血酸,或其化學(xué)上更穩(wěn)定的衍生物之一,諸如L-抗壞血酸磷酸4美鹽n-水合物。加入抗壞血酸以促進(jìn)脯氨酸的羥基化和酸溶原膠原蛋白的分泌,酸溶原膠原蛋白是沉積的膠原蛋白分子的可溶性前體??箟难徇€是用于其它酶的翻譯后加工的重要輔因子以及作為I型和in型膠原蛋白合成的上調(diào)物。盡管不希望束縛于理論,但是向培養(yǎng)基中補(bǔ)充牽涉蛋白質(zhì)合成的氨基酸通過不要求細(xì)胞自己生成氨基酸而保存了細(xì)胞能量。脯氨酸和甘氨酸優(yōu)選被加入,因?yàn)樗鼈円约案彼岬牧u基化形式羥脯氨酸是構(gòu)成膠原蛋白結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)氨基酸。盡管不要求,但是基質(zhì)生成培養(yǎng)基選擇性地被補(bǔ)充有中性聚合物。本發(fā)明的細(xì)胞-基質(zhì)構(gòu)建體可不使用中性聚合物而被制造,但又不希望束的膠原蛋白加:《和沉積;二致。'丄個(gè)T尤選的中性。聚合物是聚乙二醇(PEG),其已顯示促進(jìn)由培養(yǎng)細(xì)胞產(chǎn)生的可溶性前體酸溶原膠原蛋白向基質(zhì)沉積膠原蛋白的體外加工過程。在本發(fā)明的培養(yǎng)基中,優(yōu)選組織培養(yǎng)級(jí)別的PEG的分子量為約1000到約4000MW,更優(yōu)選約3400到約3700MW。用于本發(fā)明方法的優(yōu)選的PEG濃度可為約5%w/v或更低,優(yōu)選約0.01%w/v到約0.5%w/v,更優(yōu)選約0.025%w/v到約0.2%w/v,最優(yōu)選約0.05%w/v。也可使用其它的培養(yǎng)級(jí)別的中性聚合物諸如右旋糖酐,優(yōu)選右旋糖酐T-40,或聚乙烯吡咯烷酮(PVP),優(yōu)選在30,000-40,000MW內(nèi),使用濃度為約5%w/v或更低,優(yōu)選約0.01%w/v到約0.5%w/v,更優(yōu)選約0.025%w/v到約0.2%w/v,最優(yōu)選約0.05%w/v。其它的增強(qiáng)膠原蛋白加工和沉積的細(xì)胞培養(yǎng)級(jí)別的和細(xì)胞相容的試劑可由哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)領(lǐng)域的熟練技術(shù)人員來確定。當(dāng)產(chǎn)生細(xì)胞的細(xì)胞鋪滿時(shí),并且當(dāng)培養(yǎng)基補(bǔ)充有幫助基質(zhì)合成、分泌或組構(gòu)的組分時(shí),據(jù)信細(xì)胞受到刺激以形成由細(xì)胞和通過這些細(xì)胞合成的基質(zhì)所組成的組織構(gòu)建體。因此,優(yōu)選的基質(zhì)生成培養(yǎng)基制劑包括Dulbecco氏改進(jìn)的伊格爾培養(yǎng)基(DMEM)(高葡萄糖制劑,沒有L-谷氨酰胺)和HamsF-12培養(yǎng)基的3:1的基礎(chǔ)混合物,補(bǔ)充有4mML-谷氨酰胺或等效材料,5ng/ml表皮生長(zhǎng)因子,0.4|ug/ml氬化可的松,lxlO"M乙醇胺,1x10—4]^0-磷酰20基-乙醇胺,5)ug/ml胰島素,5pg/ml鐵傳遞蛋白,20pM三碘甲腺原氨酸,6.78ng/ml礎(chǔ),50ng/mlL-抗壞血酸,0.2)ug/mlL-脯氨酸,和0.1iug/ml甘氨酸。向基質(zhì)生成培養(yǎng)基中,可向培養(yǎng)物中加入其它藥理學(xué)試劑以改變分泌的細(xì)胞外基質(zhì)的性質(zhì)、量或類型。這些試劑可包括多肽生長(zhǎng)因子,轉(zhuǎn)錄因子或無機(jī)鹽來上調(diào)膠原蛋白轉(zhuǎn)錄。多肽生長(zhǎng)因子的例子包括轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-(31(TGF-(31)和組織纖溶酶原激活物(TPA),二者都已知上調(diào)膠原蛋白合成。Raghow等,JournalofClinicalInvestigation,79:1285-1288(1987);Pardes等,JournalofInvestigativeDermatology,100:549(1993)。刺激膠原蛋白生成的無機(jī)鹽的例子是鈰。Shivakumar等,JournalofMolecularandCellularCardiology24:775-780(1992)。在培養(yǎng)箱中維持培養(yǎng)物以確保細(xì)胞培養(yǎng)的足夠環(huán)境條件受控溫度,濕度,和氣體混合物。優(yōu)選條件為溫度約34。C到約38°C,更優(yōu)選37士rC,約5-10±1。/oC02氣氛,和相對(duì)濕度(Rh)約80-90%。在優(yōu)選實(shí)施方案中,細(xì)胞-基質(zhì)構(gòu)建體是由真皮成纖維細(xì)胞和其所分泌的基質(zhì)形成的真皮構(gòu)建體。優(yōu)選地,使用人真皮成纖維細(xì)胞,其取得形式為得自真皮的初級(jí)細(xì)胞,或更優(yōu)選得自從建立細(xì)胞原液或細(xì)胞庫(kù)(其已經(jīng)針對(duì)病毒和細(xì)菌污染用于篩選并測(cè)試了純度)的連續(xù)傳代培養(yǎng)。細(xì)胞在生長(zhǎng)培養(yǎng)基中在足夠的條件下進(jìn)行培養(yǎng)以使它們?cè)鲋车竭m當(dāng)數(shù)量用于將細(xì)胞接種到在其上形成細(xì)胞-基質(zhì)構(gòu)建體的培養(yǎng)底物上。作為替代,得自冷凍細(xì)胞原液的細(xì)胞可直接被接種到培養(yǎng)底物上。一旦已經(jīng)獲得足夠的細(xì)胞數(shù)目,收獲細(xì)胞并將其接種到適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)表面上并在適當(dāng)?shù)纳L(zhǎng)條件下進(jìn)行培養(yǎng)以形成細(xì)胞的鋪滿片。在優(yōu)選實(shí)施方案中,將細(xì)胞接種到多孔膜上,所述多孔膜被浸沒以允許從培養(yǎng)物的下側(cè)通過孔隙進(jìn)行培養(yǎng)基接觸并且直接從上側(cè)進(jìn)行培養(yǎng)基接觸。優(yōu)選地,將細(xì)胞懸浮在基礎(chǔ)培養(yǎng)基或生長(zhǎng)培養(yǎng)基中,并接種到細(xì)胞培養(yǎng)表面上,接種濃度為約1><105個(gè)細(xì)胞/(^12到約6.6xl()S個(gè)細(xì)胞/cm2,更優(yōu)選約3xl(^個(gè)細(xì)胞/cm2到約6.6xl()S個(gè)細(xì)胞/cm2,和最優(yōu)選約6.6x105個(gè)細(xì)胞/cm、每平方厘米細(xì)胞培養(yǎng)表面的細(xì)胞數(shù))。將培養(yǎng)物在生長(zhǎng)培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)以建立培養(yǎng)物并且一皮培養(yǎng)達(dá)到約80%到100%的鋪滿率,此時(shí)通過將培養(yǎng)基換成基質(zhì)生成培養(yǎng)基以對(duì)培養(yǎng)物進(jìn)行化學(xué)誘導(dǎo),目的是上調(diào)細(xì)胞外基質(zhì)的合成和分泌。在可供選擇的方法中,將細(xì)胞直接接種在基質(zhì)生成培養(yǎng)基內(nèi),從而無需將基礎(chǔ)培養(yǎng)基換成基質(zhì)生成培養(yǎng)基,但是該方法是一種要求接種密度更高的方法。在培養(yǎng)期間,成纖維細(xì)胞組構(gòu)被分泌的基質(zhì)分子以形成三維的組織樣結(jié)構(gòu),但是不表現(xiàn)出顯著的導(dǎo)致正在形成的細(xì)胞-基質(zhì)構(gòu)建體收縮并從培養(yǎng)底物上自身剝離的收縮力。使用新鮮的基質(zhì)生成培養(yǎng)基每2-3天進(jìn)行培養(yǎng)基交換,并且分泌的基質(zhì)的厚度和實(shí)體隨著時(shí)間而增加。制造細(xì)胞-基質(zhì)構(gòu)建體所需的時(shí)間根據(jù)初始接種密度,細(xì)胞類型,細(xì)胞系的年齡,和細(xì)胞系合成和分泌基質(zhì)的能力的不同而異。當(dāng)完全形成時(shí),本發(fā)明的構(gòu)建體具有由于通過細(xì)胞所產(chǎn)生和組構(gòu)的纖維狀基質(zhì)而導(dǎo)致的松散厚度;它們不是正常鋪滿或者過度鋪滿細(xì)胞培養(yǎng)物,其中細(xì)胞可松散地彼此附著。纖維狀性質(zhì)賦予構(gòu)建體以類似內(nèi)聚性組織的性質(zhì),其與普通培養(yǎng)基不同,因?yàn)樗鼈兊挚刮锢砥茐模T如在臨床環(huán)境中采用常規(guī)操縱時(shí)的撕扯或破裂。在制造培養(yǎng)真皮構(gòu)建體期間,細(xì)胞將在細(xì)胞培養(yǎng)表面上在它們自身周圍形成組構(gòu)基質(zhì),優(yōu)選跨越膜表面的厚度為至少約30微米或更大,更優(yōu)選約60到約120微米;然而,已經(jīng)獲得了超過120微米的厚度并且該厚度適用于其中需要這種更大厚度的試驗(yàn)或臨床應(yīng)用中。在更優(yōu)選的方法中,將上皮細(xì)胞層施用于細(xì)胞-基質(zhì)構(gòu)建體的一個(gè)表面上,優(yōu)選頂部的朝上表面上??蓪⑸掀ぜ?xì)胞接種到細(xì)胞-基質(zhì)構(gòu)建體上并在其上進(jìn)行培養(yǎng)以形成多層組織構(gòu)建體。在最優(yōu)選的方法中,皮膚由來的角化細(xì)胞在細(xì)胞構(gòu)建體上生長(zhǎng)以形成皮膚構(gòu)建體。在其它優(yōu)選實(shí)施方案中,角膜上皮細(xì)胞(也稱作角膜角化細(xì)胞)可以被接種到細(xì)胞-基質(zhì)構(gòu)建體上以形成角膜構(gòu)建體??蓪⒌米钥谇徽衬さ纳掀ぜ?xì)胞在細(xì)胞-基質(zhì)構(gòu)建體上生長(zhǎng)以形成口腔粘膜構(gòu)建體??蓪⒌米允彻艿纳掀ぜ?xì)胞在細(xì)胞-基質(zhì)構(gòu)建體上接種以形成食管組織的構(gòu)建體??蓪⒌米悦谀蛏车赖哪虻郎掀ぜ?xì)胞在細(xì)胞-基質(zhì)構(gòu)建體上接種以形成尿道上皮的構(gòu)建體。其它上'^真皮底i提供表皮細(xì)胞的方法,及其培養(yǎng)方法,、:括誘導(dǎo)分化和角質(zhì)化以形成分化的角化細(xì)胞層是本領(lǐng)域已知的,并且在Parenteau等的美國(guó)專利5,712,163和Kemp等的美國(guó)專利5,536,656中描述,所述公開以全文并入本文作為參考。通常,為了進(jìn)行細(xì)胞-基質(zhì)構(gòu)建體的表皮形成,將角化細(xì)胞接種到細(xì)胞-基質(zhì)構(gòu)建體上并在其上培養(yǎng)直到該層達(dá)到約1-3個(gè)細(xì)胞層厚度。然后角化細(xì)胞被誘導(dǎo)分化以形成多層表皮,然后誘22在形成分化的表皮層的方法中,傳代培養(yǎng)角化細(xì)胞取自細(xì)胞原液并且它們的細(xì)胞數(shù)目被擴(kuò)增。當(dāng)已經(jīng)獲得必要的細(xì)胞數(shù)目時(shí),將其從培養(yǎng)底物中取出,進(jìn)行懸浮,計(jì)數(shù),稀釋并然后接種到細(xì)胞-基質(zhì)構(gòu)建體的上表面上,接種濃度為約4.5xl(^個(gè)細(xì)胞/cm2到約5.0xl()S個(gè)細(xì)胞/cm2,更優(yōu)選約1.0xl(^個(gè)細(xì)胞/cn^到約1.0xl()S個(gè)細(xì)胞/cm2,最優(yōu)選約4.5x104個(gè)細(xì)胞/cm2。然后將構(gòu)建體在37士rC,10%032下培養(yǎng)約60到約90分鐘以允許角化細(xì)胞附著。在培養(yǎng)后,將構(gòu)建體浸沒在表皮形成培養(yǎng)基中。在足夠長(zhǎng)的培養(yǎng)時(shí)間后,角化細(xì)胞增殖并蔓延形成跨越細(xì)胞-基質(zhì)構(gòu)建體的鋪滿的單層。一旦鋪滿,將細(xì)胞培養(yǎng)基制劑換成分化培養(yǎng)基以誘導(dǎo)細(xì)胞分化。當(dāng)形成多層上皮時(shí),然后使用角質(zhì)化培養(yǎng)基并且使得培養(yǎng)在氣-液界面進(jìn)行。為了角化細(xì)胞的分化和角質(zhì)化,將細(xì)胞暴露在干燥或低濕度的氣-液界面下。干燥或低濕度的界面可以表現(xiàn)試圖模仿皮膚的低水分水平的特征。隨時(shí)間的進(jìn)行,角化細(xì)胞將表達(dá)大部分的或全部的角蛋白和其它的當(dāng)暴露在這些條件下時(shí)在自然皮膚中被發(fā)現(xiàn)的特征。如上所述,用于制造細(xì)胞-基質(zhì)構(gòu)建體的系統(tǒng)可用在角膜構(gòu)建體的形成中。角膜上皮細(xì)胞可以來自許多哺乳動(dòng)物來源。優(yōu)選的上皮細(xì)胞是兔或人的角膜上皮細(xì)胞(角膜角化細(xì)胞),但是可使用任何哺乳動(dòng)物的角膜角化細(xì)胞。其它上皮角化細(xì)胞諸如來自眼睛的鞏膜(外側(cè)白色不透明部分)或表皮的角化細(xì)胞可以作為替代物,但是優(yōu)選角膜角化細(xì)胞。在形成角膜構(gòu)建體的方法中,將培養(yǎng)基從培養(yǎng)插入物(包含細(xì)胞-基質(zhì)構(gòu)建體)及其周圍取出。正常的兔角膜上皮細(xì)胞通過傳代培養(yǎng)進(jìn)行擴(kuò)增,胰蛋白酶化以將其從培養(yǎng)底物中取出,并被懸浮在培養(yǎng)基中,并以約7.2xl(f到約1.4xl()S個(gè)細(xì)胞/cn^的密度接種到膜的上表面上。然后將構(gòu)建體在無培養(yǎng)基下在37士rC,10%(302條件下培養(yǎng)約4小時(shí),以允許上皮細(xì)胞附著。在培養(yǎng)后,將構(gòu)建體浸沒在角膜維持培養(yǎng)基(CMM)中(Johnson等,1992),上皮細(xì)胞被培養(yǎng)直到細(xì)胞-基質(zhì)構(gòu)建體被上皮細(xì)胞覆蓋。上皮覆蓋的完成可以通過許多方法確定,例如,通過用尼羅藍(lán)溶液(1:10,000,在磷酸鹽緩沖鹽水中)對(duì)培養(yǎng)物進(jìn)行染色。一旦細(xì)胞-基質(zhì)構(gòu)建體被覆蓋,在大約七天后,將構(gòu)建體無菌地轉(zhuǎn)移到新的具有足夠的角膜維持培養(yǎng)基(CMM)的培養(yǎng)托盤中以實(shí)現(xiàn)液面僅僅達(dá)到構(gòu)建體的表面以維持潮濕的界面而不浸沒上皮層。構(gòu)建體在37土rC,10%032和大于60%濕度的條23件下使用CMM進(jìn)行培養(yǎng),并且根據(jù)需要通常每周進(jìn)行3次培養(yǎng)基交換。對(duì)于分化,而不是上皮細(xì)胞層的角質(zhì)化,根據(jù)需要,在制造角膜構(gòu)建體期間,將上皮細(xì)胞表面暴露在潮濕的氣-液界面下。提供潮濕的氣-液界面的方法在Parenteau的美國(guó)專利5,374,515中描述。本文使用的術(shù)語"潮濕的界面"是指經(jīng)過調(diào)節(jié)從而使得構(gòu)建體的表面是潮濕的,具有較大濕度,但不是干燥的或被浸沒的培養(yǎng)環(huán)境。在培養(yǎng)環(huán)境中精確的水分量和濕度不是決定性的,但是其應(yīng)當(dāng)足夠潮濕以避免形成角質(zhì)化細(xì)胞。潮濕的界面可以表現(xiàn)試圖模仿人眼的相似含水量的特性。在可供選擇的優(yōu)選實(shí)施方案中,可在第一形成的細(xì)胞-基質(zhì)構(gòu)建體上進(jìn)行第二產(chǎn)基質(zhì)細(xì)胞的接種,從而獲得更厚的細(xì)胞-基質(zhì)構(gòu)建體或雙層細(xì)胞-基質(zhì)構(gòu)建體。第二接種可使用相同的細(xì)胞類型或細(xì)胞抹進(jìn)行或使用不同的細(xì)胞類型或細(xì)胞抹進(jìn)行,根據(jù)所需結(jié)果的不同而異。第二接種采用生成第一層采用的過程和基質(zhì)生成培養(yǎng)基相同條件下進(jìn)行。在使用不同的細(xì)胞類型進(jìn)行第二接種中的一個(gè)結(jié)果是形成的基質(zhì)具有不同的基質(zhì)組分特性或基質(zhì)堆積密度,從而當(dāng)該構(gòu)建體被移植到患者時(shí)可影響傷口愈合。第一細(xì)胞接種產(chǎn)生的基質(zhì)類似于真皮網(wǎng)狀層,是I型膠原蛋白和構(gòu)成型細(xì)胞外基質(zhì)組分的更致密堆積層。第二細(xì)胞接種將產(chǎn)生與真皮乳頭層類似的基質(zhì),其以較松散的膠原纖維和細(xì)胞外基質(zhì)為特征。采用第二細(xì)胞類型的另一個(gè)結(jié)果是產(chǎn)生治療物質(zhì),其也將影響傷口愈合,諸如改善移植物同化或移植物整合或者使瘢痕形成最小化或防止瘢痕形成。在另外的優(yōu)選實(shí)施方案中,可在形成細(xì)胞-基質(zhì)構(gòu)建體期間將兩種或多種細(xì)胞類型的混合細(xì)胞群一起培養(yǎng),條件是所用至少一種細(xì)胞類型能夠合成細(xì)胞外基質(zhì)。第二細(xì)胞類型可以是實(shí)施其它組織功能所需的細(xì)胞類型或發(fā)展成組織構(gòu)建體的特定結(jié)構(gòu)特征的細(xì)胞類型。例如,在制造皮胞4養(yǎng),從而k許開;成上;附器或其ia分。i皮附器諸:汗腺;皮脂腺結(jié)構(gòu)或組分或毛嚢結(jié)構(gòu)或組分可在與產(chǎn)生基質(zhì)的細(xì)胞一起培養(yǎng)時(shí)形成。上皮細(xì)胞可得自位于深部真皮內(nèi)的腺體和毛發(fā)的附器結(jié)構(gòu),諸如通過顯微解剖獲得,并且包括外分泌細(xì)胞,肌上皮細(xì)胞,腺性分泌細(xì)胞,毛嚢干細(xì)胞。在皮膚中通常被發(fā)現(xiàn)的構(gòu)成皮膚的其它細(xì)胞類型諸如黑素細(xì)胞,郎格罕氏細(xì)胞和默克爾細(xì)胞(Merkelcells)也可被加入。類似地,可與血管內(nèi)皮細(xì)胞一起培養(yǎng)以產(chǎn)生用于新脈管系統(tǒng)形成的基本組分。脂肪細(xì)胞也可與產(chǎn)生基質(zhì)的細(xì)胞一起培養(yǎng),從而形成用于重建外科的構(gòu)建體。作為這種第二細(xì)胞類型的可供選擇的遞送方式,細(xì)胞可作為斑點(diǎn)或作為任何數(shù)目的斑點(diǎn)的陣列^皮定位接種到正在形成的或完全形成的細(xì)胞-組織基質(zhì)上或內(nèi),用于這些結(jié)構(gòu)的定位發(fā)展。為了將細(xì)胞接種到細(xì)胞-基質(zhì)構(gòu)建體內(nèi),可在上表面和下表面之間在細(xì)胞-基質(zhì)內(nèi)注射細(xì)胞用于細(xì)胞生長(zhǎng),形成特化結(jié)構(gòu)并實(shí)施它們的特異性功能。為了產(chǎn)生三層結(jié)構(gòu)的組織構(gòu)建體,第一細(xì)胞接種包括將產(chǎn)生基質(zhì)的細(xì)胞類型或不產(chǎn)生基質(zhì)的細(xì)胞類型接種到培養(yǎng)底物上持續(xù)足夠產(chǎn)生細(xì)胞-基質(zhì)構(gòu)建體或細(xì)胞層的時(shí)間。一旦笫一細(xì)胞-基質(zhì)構(gòu)建體或細(xì)胞層形成,第二細(xì)胞接種包括將產(chǎn)生基質(zhì)的細(xì)胞類型接種到第一細(xì)胞-基質(zhì)構(gòu)建體或細(xì)胞層的上表面上持續(xù)足夠在第一構(gòu)建體上形成第二細(xì)胞-基質(zhì)構(gòu)建體的時(shí)間。在第二細(xì)胞-基質(zhì)構(gòu)建體上,進(jìn)行第三細(xì)胞類型的第三接種和在足夠產(chǎn)生第三層的條件下培養(yǎng)。例如,為了制造三層角膜構(gòu)建體,第一細(xì)胞類型的細(xì)胞可由內(nèi)皮來源細(xì)胞諸如角膜內(nèi)皮細(xì)胞組成;第二細(xì)胞類型可以包括結(jié)締組織來源的細(xì)胞諸如角膜的角膜細(xì)胞;和第三細(xì)胞類型可以包括上皮來源的細(xì)胞諸如角膜上皮細(xì)胞。作為皮膚的三層構(gòu)建體的另一個(gè)例子,第一接種的細(xì)胞可以是血管由來的以提供用于血管形成的組分,第二接種的細(xì)胞可以包括真皮成纖維細(xì)胞以形成細(xì)胞-基質(zhì)構(gòu)建體作為真皮構(gòu)建體,和第三接種的細(xì)胞可以是表皮角化細(xì)胞以形成表皮層。當(dāng)使用玻璃化冷凍法或深低溫保藏法時(shí)本發(fā)明的組織構(gòu)建體可以在深冷溫度下儲(chǔ)存。組織構(gòu)建體的玻璃化冷凍法在美國(guó)專利5,518,878中描述,深低溫保藏法在美國(guó)專利5,689,961和5,891,617以及國(guó)際PCT公開WO96/24018中描述,所述公開作為參考并入本文。C:包括膠原蛋白溶液與收縮劑的凝膠混合物的培養(yǎng)組織構(gòu)建體在本發(fā)明的另外的實(shí)施方案中,培養(yǎng)組織構(gòu)建體包括凝膠混合物,該凝膠混合物包含膠原蛋白溶液和收縮劑。該培養(yǎng)組織構(gòu)建體通過體外形成水合膠原蛋白網(wǎng)格制造,諸如在Bell的美國(guó)專利4,485,096中公開,該公開全文并入本文作為參考。該網(wǎng)格采用結(jié)合到其中的收縮劑被收縮形成培養(yǎng)組織構(gòu)建體。收縮劑的例子是成纖維細(xì)胞和血小板??赏ㄟ^在該活的連接組織底物上鋪4反角化細(xì)力包細(xì)胞并為它們的生長(zhǎng)作準(zhǔn)備而從該活的連接組織底物制造皮膚等效材料。這一皮膚等效材料特別地不同于前述的人造皮膚,因?yàn)槠浠A(chǔ)組構(gòu)與皮膚的基礎(chǔ)組構(gòu)相同,但是其活的構(gòu)成細(xì)胞甚至可通過可能的移植物接受者捐獻(xiàn)。腺體/器官等效材料或小脈管等效材料可從本文所述的收縮的水合膠原蛋白網(wǎng)格形成。因此,能夠看出,根據(jù)本發(fā)明制造的培養(yǎng)組織構(gòu)建體提供了產(chǎn)生許多類型和功能的活組織、腺體和器官等效材料的可能性。這些等效材料甚至可被制造和作為存貨保存,直到有了使用它們的需要。這種培養(yǎng)組織構(gòu)建體的主要優(yōu)點(diǎn)之一是它們可用在與培養(yǎng)組織構(gòu)建體制造所用細(xì)胞的供體不同的宿主中,而不經(jīng)歷可能預(yù)期到的嚴(yán)重排斥問題。這是因?yàn)?,?dāng)用于制造該活組織的細(xì)胞根據(jù)本發(fā)明進(jìn)行擴(kuò)增時(shí),通過接受者的免疫系統(tǒng)發(fā)生了對(duì)負(fù)責(zé)排斥的細(xì)胞的選擇性對(duì)抗。另外,當(dāng)根據(jù)新近研究報(bào)告在某些條件下在組織培養(yǎng)物中保存時(shí),某些細(xì)胞喪失了其刺激排斥的能力。水合膠原蛋白網(wǎng)格可以采用得自大鼠尾腱的膠原蛋白和小牛皮膠原蛋白制備。已經(jīng)使用了包含人胎兒皮膚的其它膠原蛋白來源,并且其它來源應(yīng)當(dāng)是適當(dāng)?shù)?。膠原蛋白溶液在弱酸性條件下被制備和保持。通過加入成纖維細(xì)胞與營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基和足夠提高pH以使膠原原纖維從溶液中沉淀的堿形成網(wǎng)格。水合膠原蛋白網(wǎng)格的制備在以下的參考文獻(xiàn)中詳細(xì)描述,其教導(dǎo)作為參考并入本文Elsdale,T.和Bard,J.,"CollagenSubstrataForStudiesOnCellBehavior,"J.CellBiol.54,626-637(1972);Ehrmann,R.L.和Gey,G.O.,"TheGrowthofCellsonATransparentGelofReconstitutedRat-TailCollagen,"J.Natl.CancerInst,16,1375-1403(1956);Emermann,J.T.和Pitelka,D.R.,"HormonalEffectsonIntracellularandSecretedCaseininCulturesofMouseMammaryEpithelialCellsonFloatingCollagenMembranes,"InVitro,13,316-328(1977);Michalopoulous,G.和Pitot,H.C,"PrimaryCultureofParenchymalLiverCellsonCollagenMembranes,"Exp.CellRes.94,70-78(1975);Gey,G.O.Svotelis,M.,Foard,M.和Bang,F.B.,"Long-TermGrowthofChickenFibroblastsOnACollagenSubstrate,"Exp.CellRes.,84,63-71(1974);以及Hillis,W.D.和Band,F.B.,"TheCultivationofHumanEmbryonicLiverCells,"Exp.CellRes.,26,9-36(1962)。26纖維細(xì)胞和豚鼠真皮成纖維細(xì)胞。也可使用得自其它來源的成纖維細(xì)胞,并且據(jù)信,事實(shí)上,得自任何脊推動(dòng)物的成纖維細(xì)胞可適用于收縮水合膠原蛋白網(wǎng)格。用于同時(shí)形成網(wǎng)格和在其中進(jìn)行細(xì)胞鋪板的便利技術(shù)包括使用含有成纖維細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中和在培養(yǎng)皿中被保持的酸性膠原蛋白溶液。當(dāng)中和時(shí),膠原原纖維從溶液中沉淀形成其中成纖維細(xì)胞均勻分散的網(wǎng)格。細(xì)胞和膠原蛋白網(wǎng)格然后在允許細(xì)胞附著于膠原蛋白網(wǎng)格的條件下被保持,然后使其收縮形成其原始大小的一部分,從而提供活組織。將成纖維細(xì)胞結(jié)合進(jìn)水合膠原蛋白網(wǎng)格導(dǎo)致當(dāng)截留水被擠出時(shí)網(wǎng)格收縮。如果在其上形成網(wǎng)格的表面不是濕潤(rùn)的,例如,疏水板,則得到的組織具有規(guī)則的幾何結(jié)構(gòu)。在組織培養(yǎng)板上,一些細(xì)胞從網(wǎng)才各移動(dòng)到板表面,并且網(wǎng)格的收縮并不總是規(guī)則的。當(dāng)使用不濕潤(rùn)的表面諸如細(xì)菌學(xué)培養(yǎng)皿時(shí),當(dāng)其半徑被細(xì)胞所減小時(shí)網(wǎng)格幾乎保留成完美的圓盤形。發(fā)現(xiàn)成纖維細(xì)胞均一分散在整個(gè)膠原蛋白網(wǎng)格內(nèi)并且不僅僅存在于網(wǎng)格的表面上。那么這模擬了人和其它哺乳動(dòng)物的真皮層。在缺乏細(xì)胞時(shí),網(wǎng)格的半徑不經(jīng)歷變化。例如,通過在營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中生長(zhǎng)lxl(^個(gè)人包皮成纖維細(xì)胞持續(xù)5天而制備的條件培養(yǎng)基當(dāng)缺乏細(xì)胞時(shí)不引起收縮。含有細(xì)胞的收縮的膠原蛋白網(wǎng)格類似于皮膚或真皮;即使部分地收縮,它們也具有適當(dāng)?shù)奈坛矶炔⑶铱扇菀椎剡M(jìn)行操縱。當(dāng)首先用細(xì)胞制備時(shí),網(wǎng)格幾乎是透明的但是當(dāng)被水排出時(shí)網(wǎng)格逐漸變得不透明并且直徑減小。在網(wǎng)格面積縮小20-30倍后,它們具有穩(wěn)固的橡膠狀黏稠度,呈帶白色的淺粉紅色,并且可被稍微拉伸而無撕破或變形。網(wǎng)格的初始直徑由所用材料的數(shù)量和網(wǎng)格在上面形成的板來決定。因此,最大收縮是任意的測(cè)量值,但是與細(xì)胞數(shù)目和蛋白質(zhì)濃度有關(guān)。盡管大部分的收縮的水合膠原蛋白網(wǎng)格形成為片狀,但是可形成其它形狀。例如,可通過在環(huán)形模具中收縮網(wǎng)格形成管形,或者可在適當(dāng)?shù)哪>咧兄瞥善つw手套。在活組織中獲得的人皮膚角化細(xì)胞已經(jīng)沉積在收縮的水合膠原蛋白網(wǎng)格上。已經(jīng)對(duì)體外培養(yǎng)的角化細(xì)胞進(jìn)行了相同的沉積。角化細(xì)胞的27鋪板可以在基質(zhì)形成時(shí)進(jìn)行,在網(wǎng)格收縮期間的任何時(shí)候進(jìn)行,或者在已經(jīng)完成收縮后的任何時(shí)候進(jìn)行。在鋪板分離的角化細(xì)胞的懸浮液后3天內(nèi),細(xì)胞在網(wǎng)格表面上形成鋪滿層,并且角質(zhì)化過程開始導(dǎo)致形成防止組織液損失的角化層。除了成纖維細(xì)胞之外還有其它的細(xì)胞收縮劑。在這些收縮劑中,有平滑肌細(xì)胞,橫紋肌細(xì)胞和心肌細(xì)胞。通過收縮劑諸如成纖維細(xì)胞或血小板的網(wǎng)格收縮將膠原蛋白網(wǎng)格變成組織等效材料,該組織等效材料與沒有使用收縮劑被鑄造而成的膠原蛋白網(wǎng)格相比,當(dāng)兩者都保持在100%的相對(duì)濕度條件下時(shí),前者具有較高的拉伸強(qiáng)度。在無收縮劑條件下鑄造的膠原蛋白網(wǎng)格具有類似于新鮮明膠的黏稠度并且在操作時(shí)瓦解。通過血小板或成纖維細(xì)胞收縮的網(wǎng)格可進(jìn)行操縱、拉伸和縫合而無損壞。通過測(cè)定可懸浮在收縮網(wǎng)格上的最大重量持續(xù)給定天數(shù)來試驗(yàn)拉伸強(qiáng)度。在一個(gè)實(shí)施例中,在5.3厘米直徑的皿中形成5毫升體積的網(wǎng)格并通過成纖維細(xì)胞收縮為2厘米直徑,支持3.5克重量持續(xù)7分鐘。另外一份在5.3厘米直徑的皿中形成5毫升體積的網(wǎng)格并且通過血小板從0.23厘米的高度收縮到0.09厘米的高度而未發(fā)生直徑變化,其支撐11克重量持續(xù)IO分鐘。值得注意的是,拉伸強(qiáng)度和其它性質(zhì)是許多參數(shù)(包括使用的膠原蛋白和收縮劑和使用的其它添加劑的類型和量)的函數(shù)。本文描述的研究使用例如I型膠原蛋白。然而,已知III型膠原蛋白賦予皮膚和血管以額外的拉伸強(qiáng)度,因此可預(yù)料在本文所述的膠原蛋白網(wǎng)格中使用III型膠原蛋白會(huì)增加其拉伸強(qiáng)度。類似地,已經(jīng)發(fā)現(xiàn)糖胺聚糖諸如透明質(zhì)酸軟骨素4-硫酸酯和硫酸皮膚素的加入改善了拉伸強(qiáng)度和水潴留性質(zhì)。如果希望,也可加入抗生素諸如青霉素,鏈霉素和兩性霉素B,防止微生物感染。盡管本文描述的大部分工作涉及通過在收縮的膠原蛋白網(wǎng)格上生長(zhǎng)角化細(xì)胞而形成皮膚等效材料,但是其它細(xì)胞類型也可在網(wǎng)格上或內(nèi)生長(zhǎng)。其它細(xì)胞的例子是平滑肌和^f黃紋肌細(xì)胞,軟骨,骨細(xì)胞,胰腺細(xì)胞,肝細(xì)胞等等。已經(jīng)開發(fā)了一些方法和裝置來幫助將收縮的膠原蛋白網(wǎng)格鑄造形成具有可控尺寸和/或多種形狀的片材。使用成纖維細(xì)胞作為收縮劑時(shí),未收縮的膠原蛋白網(wǎng)格通常是所有的尺寸都經(jīng)歷收縮。然而,當(dāng)邊界保持被固定的片材僅僅在厚度上收縮。適用于收縮邊界的裝置可從具有任何形狀的不銹鋼網(wǎng)的片材制備。從不銹鋼網(wǎng)的中心切割出要鑄造的所需形狀,之后,將過量的片材剪掉,在所需形狀周圍留下約二分之一英寸的網(wǎng)邊緣。這形成了不銹鋼網(wǎng)的框架,其被置于涂有防粘材料諸如Teflon⑧聚四氟乙烯的鍋內(nèi),之后,引入用于形成網(wǎng)格的組分。當(dāng)組分被傾入并形成網(wǎng)格時(shí),其填充了其被錨定的鋼網(wǎng)的空隙。當(dāng)網(wǎng)格的細(xì)胞組分通過與膠原原纖維一起牽拉而壓緊網(wǎng)格時(shí),網(wǎng)格體積縮小,但是因?yàn)橹荛L(zhǎng)保持固定,因此縮小的尺寸是厚度。在該過程中,網(wǎng)格喪失流體。鋼框架的特別優(yōu)點(diǎn)是組織等效材料的最終尺寸正好是框架的內(nèi)部尺寸大小,并且特別地,網(wǎng)格由于通過拘束框架所施加的細(xì)胞取向而獲得附加強(qiáng)度。另外,因?yàn)榫W(wǎng)格尺寸在寬度或長(zhǎng)度方面沒有改變,如果其在矩形框架內(nèi)鑄造,即使在其被從框架中切掉之后,有可能在鑄造真皮等效材料之后的第一天就施加皮膚等效材料的表皮組分到真皮等效材料上,因此從患者提供的活體解剖制備皮膚等效材料移植物所需的時(shí)間中節(jié)省了至少4天的時(shí)間。網(wǎng)格的組分可被傾入到附層鍋內(nèi)以覆蓋約束網(wǎng)。當(dāng)網(wǎng)格凝固時(shí),其錨定在鋼網(wǎng)上,從而當(dāng)收縮時(shí)長(zhǎng)度和寬度保持不變。只有厚度縮小。最終的厚度尺寸是以下的函數(shù)(l)網(wǎng)格的初始體積,(2)細(xì)胞濃度和(3)膠原蛋白含量。蛋白多糖諸如透明質(zhì)酸和硫酸軟骨素的存在導(dǎo)致收縮增加和網(wǎng)格厚度縮小。保持網(wǎng)格或真皮等效材料(其上接種有表皮細(xì)胞)的矩形網(wǎng)可原封不動(dòng)地被施用于需要皮膚的傷口。盡管在適當(dāng)位置上,其可立即或在以后的某一時(shí)間從鋼網(wǎng)的內(nèi)部周長(zhǎng)中被切掉,因?yàn)槠浯嬖诳蓭椭S持移植物的完整。另外的幫助錨定表皮到皮膚等效材料制劑的真皮等效材料上的技術(shù)和方法如下。真皮等效材料首先被鑄造,將塑料片例如Teflon㊣聚四氟乙烯(其中已經(jīng)穿過有針尖并以規(guī)則圖形保持)覆蓋在新鮮鑄造物上。在l-4天后,當(dāng)鑄造物被接種表皮細(xì)胞時(shí),將塑料片和針尖除去。這導(dǎo)致形成凹點(diǎn),表皮細(xì)胞流入凹點(diǎn)內(nèi)從而提供表皮與真皮等效材料之間的更大的表面接觸??梢酝ㄟ^酶拆分技術(shù)分離的毛嚢細(xì)胞和腺細(xì)胞可使用表皮細(xì)胞的懸浮液接種以占據(jù)這種凹點(diǎn)。本文所述的活組織的主要優(yōu)點(diǎn)是當(dāng)接受者與在制造組織等效材料中所用細(xì)胞的供體不同時(shí)不存在排斥問題。例如,使用與移植物接受者的細(xì)胞不同的細(xì)胞制造的皮膚等效材料移植物目前已被用于動(dòng)物寄主。如上所述被制造但是使用從Sprague-Dawley品系大鼠的雌性大鼠中獲得的細(xì)胞裝配的皮膚等效材料移植物已經(jīng)被移植到雄性Fischer大鼠宿主中并使其保留在位持續(xù)多個(gè)周期。可以概括為任何類型的被制造而沒有在自然組織中普遍存在的特化免疫細(xì)胞的等效材料移植物不會(huì)被排斥,因?yàn)樨?fù)責(zé)移植排斥的抗原決定簇不在被引入到等效材料組織內(nèi)的細(xì)胞的表面上表達(dá)。它們的不存在使得宿主的免疫細(xì)胞不可能判別外來細(xì)胞。這提供了置換或附加接受者所需的類型的細(xì)胞,組織或器官的機(jī)會(huì),因?yàn)槠渥陨硎侨睋p的或不存在的。D:包含在膠原蛋白凝膠上成層的膠原蛋白凝膠的培養(yǎng)組織構(gòu)建體本實(shí)施方案的培養(yǎng)組織構(gòu)建體盡管在制備方法和用途兩方面與包含水合膠原蛋白網(wǎng)格的培養(yǎng)組織構(gòu)建體相似,但是其進(jìn)一步包含膠原蛋白層。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在與可滲透件接觸的非細(xì)胞的水合膠原蛋白凝膠上鑄造的膠原蛋白網(wǎng)格不經(jīng)歷實(shí)質(zhì)上的半徑收縮或橫向收縮,盡管厚度尺寸收縮,因此無需在例如不銹鋼框架上錨定膠原蛋白網(wǎng)格來控制半徑收縮或橫向收縮。例如,如上所述的24毫米直徑的膠原蛋白網(wǎng)格但是沒有錨定手段,將徑向收縮到5毫米或更低的直徑。相比之下,在與可滲透件接觸的非細(xì)胞的水合膠原蛋白凝膠上鑄造的24毫米直徑的膠原蛋白網(wǎng)格通常徑向收縮到約15毫米的直徑。不需要用來控制橫向/半徑收縮的錨定手段在成本降低和組織等效材料制造的容易性方面提供了優(yōu)點(diǎn)。可以理解,如果需要,這種錨定手段可被用于連接水合膠原蛋白凝膠(其與可滲透件接觸)。獲得本發(fā)明的組織等效材料的一個(gè)方法包括(a)形成包含膠原蛋白和至少一種收縮劑的混合物,和(b)將步驟(a)中獲得的混合物施加到與可滲透件接觸的非細(xì)胞的水合膠原蛋白凝膠上,并在允許形成組織等效材料的條件下保持該混合物和凝膠。30在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中,如上所述,一個(gè)或多個(gè)吸收件,包括但不限于纖維墊,棉花墊,和凝膠,瓊脂糖,用于連接上述的膠原蛋白凝膠。這種吸收件已被發(fā)現(xiàn)提供了始終如一的和均勻的物理支撐并且促進(jìn)在組織等效材料和細(xì)胞培養(yǎng)基之間的均勻接觸。通常,吸收件與膠原蛋白凝膠的與水合膠原蛋白網(wǎng)格相對(duì)的表面鄰接。當(dāng)吸收件自身是凝膠例如瓊脂糖時(shí),凝膠可與營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基一起為組織等效材料提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。在皮膚組織等效材料發(fā)育的不同階段期間,在有和無水合膠原蛋白凝膠和/或吸收件的條件下被保持的組織等效材料中監(jiān)測(cè)了以下的實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)1.葡萄糖利用;2.表皮層化和角質(zhì)化的程度和性質(zhì);3.培養(yǎng)基的pH。從用吸收件被保持的組織等效材料中獲得的培養(yǎng)基的pH觀察值一貫地高于在沒有這些吸收件條件下被保持的組織等效材料的pH,并且接近生理學(xué)pH。另外,在用吸收劑元件保持的組織等效材料中觀察到葡萄糖利用通常較低。已經(jīng)意外地發(fā)現(xiàn)在使用吸收件制造的皮膚組織等效材料中,與未用這種吸收件制造的對(duì)照皮膚等效材料相比,成熟角質(zhì)化在前者中被促進(jìn)。盡管這些吸收件影響表皮分化的機(jī)制尚不清楚,但是假定這種吸收件可以擔(dān)當(dāng)擴(kuò)散屏障例如滲透屏障,并且可過濾培養(yǎng)基和/或保留分泌的細(xì)胞產(chǎn)物極其接近組織等效材料。本發(fā)明的活皮膚等效材料如上所述被制造,不同之處在于,根據(jù)本實(shí)施方案,水合膠原蛋白網(wǎng)格被鑄造在非細(xì)胞的水合膠原蛋白凝膠上。根據(jù)本發(fā)明制造皮膚組織等效材料的一個(gè)方法包括(a)形成包含膠原蛋白和至少一種收縮劑的混合物;(b)將在步驟(a)中獲得的混合物施加到與可滲透件接觸的非細(xì)胞的水合膠原蛋白上,并在允許形成組織等效材料的條件下保持該混合物和凝膠;和(c)將在步驟(b)中獲得的組織等效材料用角化細(xì)胞接種。作為背景,用于鑄造本發(fā)明的組織等效材料的一個(gè)方便的方法包括將pH為約3到4的膠原蛋白酸性溶液與營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基迅速地混合在31一起,如果必要,將得到的溶液的pH調(diào)節(jié)到約pH6.6到pH7.8,加入成纖維細(xì)胞,將得到的混合物("鑄造混合物")轉(zhuǎn)移到適當(dāng)?shù)腲t具或鑄造裝置中(其中布置有非細(xì)胞的水合膠原蛋白凝膠),然后在優(yōu)選的約35。C-38。C的溫度下培養(yǎng)。最方便的是同時(shí)進(jìn)行pH調(diào)節(jié)和將鑄造混合物的各成分混合的步驟。然而,這些步驟可以任何所需順序進(jìn)行,條件是這些步驟完成從而鑄造混合物可被轉(zhuǎn)移到用于適當(dāng)凝固的模具中。由于將溶液溫?zé)岷驮黾觩H,膠原原纖維從鑄造混合物中沉淀形成水合膠原蛋白凝膠,其通過收縮劑被收縮并置于水合膠原蛋白凝膠上。盡管由本實(shí)施方案提供的制造活組織的方法通常適用于制造組織等效材料,但是這些方法可與供皮膚移植應(yīng)用和引入皮膚等效材料的試驗(yàn)系統(tǒng)之用的皮膚等效材料的制造結(jié)合進(jìn)行說明。參見附圖,圖13-15說明了采用本發(fā)明的皮膚組織等效材料用于確定皮膚和一種或多種試劑之間的相互作用的裝置的一個(gè)實(shí)施方案,其中多個(gè)容器10,22在其中布置有本發(fā)明的組織等效材料,并且多個(gè)容器10,22被提供在基座或支架上。圖13-15中所示的裝置也裝配有覆蓋手段2。在一些實(shí)施方案中,為每個(gè)容器10和20提供了覆蓋件(未示出)。覆蓋件選擇任何生物相容的材料,其在容器上保持密封??山邮艿母采w材料包括箔和阻擋膜,其可借助于粘附或熱而密封裝置??蔁崦芊獾木埘ケ∧ぬ貏e用于本發(fā)明的實(shí)踐中。用于組織等效材料的容器包含外容器10和內(nèi)容器20。內(nèi)容器20裝備有邊50以提供將內(nèi)容器20在外容器10內(nèi)定位的手段,從而限定了外區(qū)域14和內(nèi)區(qū)域22。內(nèi)容器20裝備有皮膚組織等效材料26,28,其布置在水合膠原蛋白凝膠25上,水合膠原蛋白凝膠25又與可滲透件24相鄰。可滲透件密封附著于內(nèi)容器20以形成內(nèi)容器20的下表面。皮膚組織等效材料包含兩層26,28,層28包含表皮層,層26包含真皮層。在一些實(shí)施方案中,密封件30提供了在內(nèi)容器20的內(nèi)壁與皮膚等效材料26,28之間的密封,并且在組織等效材料26,28的外緣位于水合膠原蛋白凝膠25以內(nèi)的情況下覆蓋水合膠原蛋白凝膠25的周長(zhǎng)。在附圖所示的實(shí)施方案中,容器IO裝備有開口21,其提供了向外區(qū)域14的出cr。圖15所示的裝置進(jìn)一步裝備有吸收件32。在其它實(shí)施方案中,外室14可在其中布置有凝膠(未示出)。圖16-18說明了通過利用本發(fā)明的組織等效材料確定組織和一種或多種試劑之間的相互作用的裝置的另一個(gè)實(shí)施方案。與在其它所述實(shí)施方案中的部件相似的部件用相同數(shù)字表示。在本實(shí)施方案中,外側(cè)井10是正方形的并且在底部裝備有提高部分60,在該提高部分60上可布置內(nèi)容器20。外側(cè)井10形成從裝置頂部的兜,而不是從裝置底部朝上凸出。外側(cè)井10裝備有用于組織等效材料的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基。這種培養(yǎng)基是本領(lǐng)域已知的。優(yōu)選的無血清營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基在待審美國(guó)專利申請(qǐng)361,041中公開。培養(yǎng)基的體積必須被選擇為填充外容器14到適當(dāng)水平,從而形成較大壓力,該壓力將迫使培養(yǎng)基通過可滲透件24、水合膠原蛋白凝膠25、組織等效材料26,28,進(jìn)入內(nèi)容器20。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中,外容器10裝備有吸收件32,其布置在外容器10內(nèi)從而與可滲透件24的外表面接觸。吸收件32必需與活組織等效材料相容。用于吸收件的優(yōu)選材料包括棉花,聚酯和人造絲。特別優(yōu)選的材料是脫脂棉。通常,優(yōu)選吸收件不含添加劑諸如清洗劑。在本發(fā)明的其它實(shí)施方案中,外側(cè)井IO裝備有凝膠(未示出),諸如瓊脂糖,其用于截留培養(yǎng)基。因?yàn)榄傊悄z可以被加入到最多為剛好低于開口21的水平,組織等效材料可獲得更大量的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基,對(duì)組織等效材料26,28的營(yíng)養(yǎng)物供應(yīng)不能迅速地耗盡。使用這種凝膠在本發(fā)明裝置的儲(chǔ)存和運(yùn)輸期間,就培養(yǎng)基滲漏和由此發(fā)生的組織等效材料的潛在污染最小化方面提供了益處。外容器10和內(nèi)容器20可由任何所需材料制成,所述材料不與試驗(yàn)中的組分包括組織等效材料反應(yīng),或?qū)ζ溆胁幌M挠绊?。例如,用于活組織等效材料的鑄造混合物在收縮期間必須不附著于內(nèi)容器的壁上,從而不干擾組織等效材料的形成。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)對(duì)內(nèi)容器20滅菌的方法可影響組織等效材料的粘附。例如,當(dāng)聚苯乙烯通過電子束進(jìn)行滅菌時(shí)而不是通過環(huán)氧乙烷進(jìn)行滅菌時(shí),正在形成的組織將附著于聚苯乙烯,聚苯乙烯是一種用于內(nèi)容器的優(yōu)選材料。相比之下,K-RESIN⑧丁二烯-聚苯乙烯,是聚苯乙烯和丁二烯的共聚物,并且是用于內(nèi)容器的特別優(yōu)選的材料,可通過電子束進(jìn)行滅菌而不引起正在形成的組織等效材沖+發(fā)生粘附。(K-RESIN丁二烯-聚苯乙烯聚合物,是PhillipsPetroleum的商標(biāo))。在一些實(shí)施方案中,希望容器被制造為使得組織等效材料可通過容器是可視的,例如,通過容器壁或通過容器內(nèi)的窗口。用于容器10的優(yōu)選材料包括聚苯乙烯和PETG。內(nèi)容器20可以具有將容納所需組織等效材料的大小和形狀的任何形狀和體積。容器的尺寸還將根據(jù)所需組織等效材料的尺寸和形狀以及所需的試驗(yàn)體積的不同而異。例如,外徑約25毫米和體積約5毫升的容器可用于本發(fā)明的實(shí)踐中。在圖13-15所示的實(shí)施方案中,多個(gè)容器被提供在基座或支架內(nèi)。可滲透件24必需具有足夠的強(qiáng)度來支撐非細(xì)胞的水合膠原蛋白凝膠25和組織等效材料26,28。多孔膜可用于本發(fā)明的實(shí)踐中。這種膜的孔徑被選擇為向非細(xì)胞的水合膠原蛋白凝膠25提供連接。優(yōu)選的膜是親水的,具有約1到10毫米的厚度,和約1到約IO微米的孔隙直徑。用于可滲透件24的優(yōu)選材料包括聚碳酸酯。特別優(yōu)選的可滲透件是聚碳酸酯膜,優(yōu)選不含潤(rùn)濕劑,可購(gòu)自Nuclepore,具有約3到10微米的孔徑。密封件30可以由任何對(duì)試驗(yàn)條件和使用的組織等效材料是惰性的材料制成,以及在內(nèi)容器20和組織等效材料之間提供良好密封。優(yōu)選的材料包括聚乙烯,TEFLON⑧PTFE聚四氟乙烯,E丄DuPontdeNemoursandCompany的商標(biāo),聚碳酸酯和尼龍。該密封件可特別用于其中希望保持外容器的內(nèi)容物與施加于表皮25的任何溶液或物質(zhì)分開的情況,例如當(dāng)測(cè)量物質(zhì)通過組織等效材料的擴(kuò)散或滲透時(shí)。本發(fā)明的組織等效材料和非細(xì)胞的水合膠原蛋白凝膠二者可使用得自皮膚和腱(包括大鼠尾腱,小牛皮,和小牛伸肌腱)的膠原蛋白制備。其它的膠原蛋白來源也是適當(dāng)?shù)?。得自小牛普通伸肌腱的特別優(yōu)選的膠原蛋白組合物和獲得這種膠原蛋白組合物的方法在02/09/1994提交的待審美國(guó)專利申請(qǐng)07/407,465中公開,其全文并入本文作為參考。在本發(fā)明的一個(gè)方法中,非細(xì)胞的水合膠原蛋白凝膠25從包含約0.5到2.0毫克/毫升、優(yōu)選約0.9到1.1毫克/毫升的膠原蛋白和營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基的膠原蛋白組合物制備。該膠原蛋白組合物被加入到內(nèi)容器20中并在允許膠原蛋白組合物凝固并形成適當(dāng)?shù)某叽?通常約1到5毫米厚度,優(yōu)選厚度范圍為約2到約3毫米)的非細(xì)胞的水合膠原蛋白凝膠的條件下被保持。非細(xì)胞的水合膠原蛋白凝膠25優(yōu)選具有足夠的厚度從而使34得當(dāng)細(xì)胞從組織等效材料移動(dòng)進(jìn)入非細(xì)胞的水合膠原蛋白凝膠中時(shí)一部分仍保持是非細(xì)胞的,并且足夠薄從而使得組織等效材料不從在外容器10中提供的營(yíng)養(yǎng)物來源中被不希望地除去。然后使用專利所述過程并且如下文所述在非細(xì)胞的水合膠原蛋白凝膠上鑄造真皮等效材料。包含膠原蛋白和成纖維細(xì)胞的鑄造混合物被加入到內(nèi)容器20中的非細(xì)胞的水合膠原蛋白凝膠25上并在啟動(dòng)組織等效材料形成的條件下被保持。因?yàn)榻M織等效材料在非細(xì)胞的水合膠原蛋白凝膠25上形成,其徑向收縮。然而,非細(xì)胞的水合膠原蛋白凝膠25防止組織等效材料的過度半徑收縮而無需機(jī)械的約束手段諸如織構(gòu)化金屬和塑料或VELCRO⑧鉤-環(huán)緊固件(VelcroCorporation的商標(biāo))。通常,組織等效材料26的側(cè)邊向水合膠原蛋白凝膠25的外周邊傾斜,形成如圖15和6所示的臺(tái)地52。組織等效材料26目前用上皮細(xì)胞接種以形成表皮層28。表皮細(xì)胞以約0.3《106到3(^106個(gè)細(xì)胞/毫升的濃度接種在培養(yǎng)基中。接種的表皮細(xì)胞的體積將根據(jù)臺(tái)地的尺寸的不同而異??煽刂颇z原蛋白的濃度,細(xì)胞的數(shù)目和鑄造混合物的體積以優(yōu)化活組織等效材料的直徑和厚度。鑄造混合物在營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中包含濃度約1.25-5xl(^個(gè)細(xì)胞/毫升的細(xì)胞和約0.5到2.0毫克/毫升的膠原蛋白。優(yōu)選的細(xì)胞濃度為約2.5xl(^個(gè)細(xì)胞/毫升。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)用于組織等效材料的鑄造混合物的體積與用于非細(xì)胞的水合膠原蛋白凝膠的鑄造混合物的體積的比可對(duì)細(xì)胞生活力和分化有影響。組織等效材料鑄造混合物與膠原蛋白凝膠鑄造混合物的有用的體積比(v/v)為約3:1到1:3。其中在膠原蛋白網(wǎng)格中細(xì)胞濃度為約2.5xl(^個(gè)細(xì)胞/毫升的優(yōu)選比是3:l。本發(fā)明進(jìn)一步參考以下實(shí)施例被理解,所述實(shí)施例實(shí)質(zhì)上僅僅是示例性的,不意在用于限制本發(fā)明的范圍。在以下實(shí)施例中使用的材料得自實(shí)施例中所指明的來源或者根據(jù)所指明的公開制備。整個(gè)實(shí)施例使用了滅菌過程。組織等效材料在培養(yǎng)箱中在10。/oC02下被保持并且整個(gè)過程使用無菌過程。提供以下實(shí)施例用于更好地說明本發(fā)明的實(shí)踐,并且這些實(shí)施例不以任何方式#:解釋為對(duì)本發(fā)明的范圍構(gòu)成限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員可意識(shí)到可對(duì)本文所述方法進(jìn)行改變而不脫離本發(fā)明的精神和范圍。35實(shí)施例實(shí)施例1:通過人新生兒包皮成纖維細(xì)胞形成膠原基質(zhì)將人新生兒包皮成纖維細(xì)胞(得自O(shè)rganogenesis,Inc.Canton,MA)以5xl()5個(gè)細(xì)胞/162cm2組織培養(yǎng)處理燒瓶(CostarCorp.,Cambridge,MA,cat#3150)在生長(zhǎng)培養(yǎng)基中接種并生長(zhǎng)。生長(zhǎng)培養(yǎng)基的組成如下Dulbecco氏改進(jìn)的伊格爾培養(yǎng)基(DMEM)(高葡萄糖制劑,不含L-谷氨酰胺,BioWhittaker,Walkersville,MD),補(bǔ)充有10%新生小牛血清(NBCS)(HyCloneLaboratories,Inc.,Logan,Utah)和4mML-谷氨酰胺(BioWhittaker,Walkersville,MD)。細(xì)胞在培養(yǎng)箱中在37士1。C和10±1%C02氣氛下被保持。每2-3天將培養(yǎng)基更換為新制備的培養(yǎng)基。在培養(yǎng)8天后,細(xì)胞逐漸鋪滿,也就是說,細(xì)胞已經(jīng)沿著組織培養(yǎng)燒瓶的底部形成單堆積層,將培養(yǎng)基從培養(yǎng)瓶中吸出。為了漂洗單層,向每個(gè)培養(yǎng)瓶的底部加入經(jīng)無菌過濾的磷酸鹽緩沖鹽水,然后從燒瓶中吸出。通過向每個(gè)燒瓶中加入5mL的胰蛋白酶-乙二胺四乙酸谷氨酰胺(BioWhittaker,Walkersville,MD)并溫和地?fù)u動(dòng)以確保該單層面積的完整,將細(xì)胞釋放。將培養(yǎng)物送返回培養(yǎng)箱,當(dāng)細(xì)胞一經(jīng)釋放,向每個(gè)燒瓶加入5ml的SBTI(大豆胰蛋白酶抑制劑)并與懸浮液混合從而使胰蛋白酶-乙二胺四乙酸的作用停止。將細(xì)胞懸浮液從燒瓶中取出并且平均分配在無菌的圓錐形離心管。通過在大約800-1000xg下離心5分鐘收集纟田月包。使用新鮮的培養(yǎng)基將細(xì)胞再懸浮達(dá)到3.0x106個(gè)細(xì)胞/毫升的濃度,并以3.0xl0S個(gè)細(xì)胞/插入物(6.6xl()S個(gè)細(xì)胞/cm勺的密度接種到在六孔托盤中的0.4微米孔徑、24毫米直徑的組織培養(yǎng)處理插入物(TRANSWELL,CorningCostar)上。細(xì)胞在培養(yǎng)箱中在37士1。C和10±1%C02氣氛下被保持并且每2-3天供應(yīng)新鮮的基質(zhì)生成培養(yǎng)基持續(xù)21天?;|(zhì)生成培養(yǎng)基組成如下DMEM和HamsF-12培養(yǎng)基的3:1的基礎(chǔ)混合物(QualityBiologiesGaithersburg,MD),4mMGlutaMAX-lTM(GibcoBRL,GrandIsland,NY)和達(dá)以下濃度的添加劑5ng/ml人重組表皮生長(zhǎng)因子(UpstateBiotechnologyLakePlacid,NY),2%新生小牛血清(Hyclone:Logan,Utah),0.4|ug/ml氫化可的木〉(SigmaSt.Louis,MO),lxl0-4M乙醇胺(Fluka,Ronkonkoma,NYACS級(jí)),lxl(T4Mo-磷?;?乙醇胺(Sigma:St.Louis,),5pg/ml胰島素(Sigma,StLouis,MO),5|ug/ml鐵傳遞蛋白(Sigma,St.Louis,MO),20pM三橫曱腺原氨酸(Sigma,St.Louis,MO),和6.78ng/ml硒(SigmaAldrichFineChemicalsCo.,Milwaukee,WI),50ng/mlL-抗壞血酸(WAKOChemicalsUSA,Inc.#013-12061),0.2pg/mlL-脯氨酸(Sigma,St.Louis,MO),0.1|ug/ml甘氨酸(Sigma,St.Louis,MO)和0.05%聚乙二醇(PEG)3400-3700MW(細(xì)胞培養(yǎng)級(jí)別)(Sigma,St.Louis,MO)。在第7、14和21天取得樣品用于組織分析,并固定在福爾馬林中,然后包埋在石蠟中。福爾馬林固定樣品被包埋在石蠟中,并且5微米切片根據(jù)本領(lǐng)域已知過程用蘇木精-曙紅(H&E)染色。使用H&E染色載玻片,采用裝載有10毫米/100微米十字線的10X目鏡對(duì)十個(gè)隨機(jī)挑選的顯微鏡視野測(cè)量厚度。人真皮成纖維細(xì)胞的兩個(gè)不同細(xì)胞抹的結(jié)果在表1中概括,其表示當(dāng)其發(fā)育成細(xì)胞-基質(zhì)構(gòu)建體時(shí)的厚度。厚度(微米)第0天第7天第14天笫21天B119平均數(shù)(n=3)030.33±2.6163.33±4.4084.00±4.67B156平均數(shù)(n=4)042.00±5.1463.85±4.5076.25±8.84還提交了在第7、14和21天的樣品用于膠原蛋白濃度分析。通過使用本領(lǐng)域已知的用于羥脯氨酸含量的比色定量(Woessner,1961)測(cè)定膠原蛋白含量。還確定了在這些相同時(shí)間點(diǎn)下的細(xì)胞數(shù)目。表2概括了膠原蛋白濃度,表3概括了使用上面所述的過程從兩個(gè)不同的細(xì)胞抹(B156和B119)制造的細(xì)胞-基質(zhì)構(gòu)建體的細(xì)胞數(shù)據(jù)。37表2:膠原蛋白(|ng/cm2)第0天第7天第14天第21天B119平均值(n=3)093.69±22.73241.66±21.08396.30±29.38B156平均值(n=3)0107.14±17.16301.93±23.91457.51士25.00表3:細(xì)胞數(shù)(細(xì)胞數(shù)/cm2)第0天第7天第14天第21天B119平均值(n=3)6.6xl0511.8士4.4xl0511.4士1.7xl0513.9±1.2x105B156平均值(n=3)6.6xl0513.1士0.5xl0514.0士2.1xl0517.1士1.7x105得自第7、14和21天的人細(xì)胞由來的真皮基質(zhì)樣品通過延遲還原SDS-PAGE,以測(cè)定揭示在樣品中的I型和III型膠原蛋白a帶的膠原蛋白組成。使用免疫組織化學(xué)法測(cè)定了真皮基質(zhì)的生物化學(xué)特性。在石蠟固定切片上使用ZymedHistostain鏈霉抗生物素-生物素系統(tǒng)(ZymedLaboratoriesInc.,SouthSanFrancisco,CA)鑒定粘連蛋白。通過^刀級(jí)^t生腱蛋白抗體著色(Dako,Carpintheria,CA)然后是作為二級(jí)抗體的抗小鼠辣根過氧化酶標(biāo)記抗體(Calbiochem)測(cè)定生腱蛋白的存在。通過施用二氨基苯炔(SigmaSt.Louis,MO)并用核堅(jiān)牢紅進(jìn)行對(duì)比染色使樣品可視。使用前述方法(Farndale,1986)定量檢測(cè)第21天樣品的糖胺聚糖(GAG)。該檢測(cè)表明在接種后第21天取得的人細(xì)胞由來真皮基質(zhì)的樣品中每平方厘米存在0.44克的GAG。實(shí)施例2:全厚度皮膚構(gòu)建體使用根據(jù)實(shí)施例1所述方法形成的真皮構(gòu)建體,將正常人新生兒包皮表皮角化細(xì)胞(得自O(shè)rganogenesis,Inc.Canton,MA)鋪板在細(xì)胞-基質(zhì)38層。從培養(yǎng)插入物及其周圍無菌地除去培養(yǎng)基。正常人表皮角化細(xì)胞從冷凍傳代培養(yǎng)細(xì)胞原液擴(kuò)大到第4代達(dá)到鋪滿。然后使用胰蛋白酶-乙二胺四乙酸使細(xì)胞從培養(yǎng)皿被釋放,匯集,離心形成細(xì)胞小球,將其再懸浮在表皮形成培養(yǎng)基中,計(jì)數(shù)并以4.5xl0"個(gè)細(xì)胞/cn^的密度接種到膜的上表面上。然后將構(gòu)建體在37士rC,10%CO2下培養(yǎng)90分鐘以允許角化細(xì)胞附著。在培養(yǎng)后,將構(gòu)建體浸沒在表皮形成培養(yǎng)基中。表皮形成培養(yǎng)基組成如下Dulbecco氏改進(jìn)的伊格爾培養(yǎng)基(DMEM)(高葡萄糖制劑,不含L-谷氨酰胺(BioWhittaker,Walkersville,MD)和HamsF-12培養(yǎng)基(QualityBiologiesGaithersburg,MD)的3:1的基礎(chǔ)混合物,補(bǔ)充有0.4|ug/ml氪化可的松(SigmaStLouis,MO),lxl(T4M乙醇胺(Fluka,Ronkonkoma,NY),lxl(T4MO-磷?;?乙醇胺(Sigma,St.Louis,MO),5|ug/ml胰島素(Sigma,St.Louis,MO),5|ug/ml鐵傳遞蛋白(Sigma,St.Louis,MO),20pM三碘曱腺原氨酸(Sigma,St.Louis,MO),6.78ng/ml勵(lì)(Aldrich),24.4)ug/ml腺噪呤(SigmaAldrichFineChemicalsCompany,Milwaukee,WI),4mML-谷氨酰胺(BioWhittaker,Walkersville,MD),0.3%螯合的新生小牛血清(Hyclone,Logan,Utah),0.628ng/ml黃體酮(AmershamArlingtonHeights,IL),50|ug/mlL-抗壞血酸鈉鹽(SigmaAldrichFineChemicalsCompany,Milwaukee,WI),10ng/ml表皮生長(zhǎng)因子(LifeTechnologiesInc.,MD),和50pg/ml石克酸慶大霉素(Amersham,ArlingtonHeights,IL)。構(gòu)建體在表皮形成培養(yǎng)基中在37±1°C,10%C〇2條件下培養(yǎng)2天。2天后,將構(gòu)建體浸沒在組成如下的培養(yǎng)基中Dulbecco氏改進(jìn)的伊格爾培養(yǎng)基(DMEM)(高葡萄糖制劑,不含L-谷氨酰胺,BioWhittaker,Walkersville,MD)牙口HamsF-12培養(yǎng)基(QualityBiologies,Gaithersburg,MD)的3:1混合物,補(bǔ)充有0.4|ug/ml氬化可的松(Sigma,St.Louis,MO),lxl(T4乙醇胺(Fluka,Ronkonkoma,NY),lxl(T4o-磷酰基-乙醇胺(Sigma,St.Louis,MO),5|ug/ml胰島素(Sigma,StLouis,MO),5|ug/ml鐵傳遞蛋白(Sigma,StLouis,MO),20pM三碘曱腺原氨酸(Sigma,StLouis,MO),和6.78ng/ml石西(SigmaAldrichFineChemicalsCompany,Milwaukee,WI),24.4|ug/ml腺噤呤(SigmaAldrichFineChemicalsCompany),4mML國(guó)谷氨酰胺(BioWhittaker,Walkersville,MD),0.3%螯合新生小牛血清(BioWhittaker,Walkersville,MD),0.628ng/ml黃體酮(Amersham,ArlingtonHeights,IL),50jag/ml抗壞血酸鈉,265|ug/ml氯化釣(Mallinckrodt,Chesterfield,MO),和50|ug/ml硫酸慶大霉素(Amersham,ArlingtonHeights,IL)。再次將構(gòu)建體在37±1°C,10%C02條件下培養(yǎng)2天。2天后,將含有構(gòu)建體的載體無菌地轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)托盤中,該托盤具有足夠量的角質(zhì)化培養(yǎng)基(9mL),從而實(shí)現(xiàn)液面剛好達(dá)到載體膜的表面,從而保持干燥界面,從而允許上皮層的層化。構(gòu)建體在37±1°C,10%C02和低濕度條件下在培養(yǎng)基中培養(yǎng)7天,每2-3天更換培養(yǎng)基。該培養(yǎng)基組成如下Dulbecco氏改進(jìn)的伊格爾培養(yǎng)基(DMEM)(高葡萄糖制劑,不含L-谷氨酰胺BioWhittaker,Walkersville,MD)和HamsF-12培養(yǎng)基(QualityBiologies,Gaithersburg,MD)的1:1混合物,補(bǔ)充有0.4|ug/ml氬化可的+〉(Sigma,St.Loms,MO),lxl(T4M乙醇胺(Fluka,Ronkonkoma,NY),lxl(T4Mo-磷?;?乙醇胺(Sigma,St.Louis,MO),5pg/ml胰島素(Sigma,StLouis,MO),5pg/ml鐵傳遞蛋白(Sigma,St.Loms,MO),20pM三碘曱腺原氨酸(Sigma,StLoms,MO),6.78ng/ml石西(Aldrich),24.4|ug/mlA泉噪p令(SigmaAldrichFineChemicalsCompany),4mML-谷氨酰胺(BioWhittaker,Walkersville,MD),2%新生小牛血清(BioWhittaker,Walkersville,MD),50|ug/ml抗壞血酸鈉,和50|ug/ml硫酸慶大霉素(Amersham,ArlingtonHeights,IL)。7天后,對(duì)構(gòu)建體再供料10天,每2-3天用維持培養(yǎng)基更換培養(yǎng)基。該維持培養(yǎng)基組成如下Dulbecco氏改進(jìn)的伊格爾培養(yǎng)基(DMEM)(高葡萄糖制劑,不含L-谷氨酰胺,BioWhittaker,Walkersville,MD)和HamsF-12培養(yǎng)基(QualityBiologiesGaithersburg,MD)的1:1混合物,補(bǔ)充有0.4|ug/ml氬化可的木〉(SigmaSt.Louis,MO),lxl0-4M乙醇胺(Fluka,Ronkonkoma,NY),lxl(T4Mo國(guó)磷?;?乙醇胺(Sigma,St.Louis,MO),5)ug/ml胰島素(Sigma,St.Louis,MO),5|ig/ml鐵傳遞蛋白(Sigma,StLouis,MO),20pM三碘甲腺原氨酸(Sigma,St.Louis,MO),和6.78ng/ml勵(lì)(SigmaAldrichFineChemicalsCompany,Milwaukee,WI),24.4|ug/ml腺口票呤(SigmaAldrichFineChemicalsCompany,Milwaukee,WI),4mML-谷氨酰胺(BioWhittaker,Walkersville,MD),1%新生小牛血清(BioWhittaker,Walkersville,MD),和50(ig/ml硫酸慶大霉素(Amersham,ArlingtonHeights,IL)。提交最終樣品用于如實(shí)施例1所述的蘇木精和曙紅染色,以在光學(xué)顯微術(shù)下確定大體外觀。得到的構(gòu)建體由具有如實(shí)施例1所述特征的基質(zhì)包圍的成纖維細(xì)胞組成的較低(真皮)層構(gòu)成,并且完全被多層的、層狀的和充分分化的角化細(xì)胞層覆蓋,該角化細(xì)胞層顯示有與原地皮膚類似的基底層,基底上層,顆粒層和角質(zhì)層。通過透射電子顯微鏡(TEM)顯示,皮膚構(gòu)建體在真皮-表皮接合處具有發(fā)育良好的基底膜。通過TEM可觀察到,基底膜在半橋粒周圍周圍最厚,這通過由VII型膠原蛋白組成的錨定原纖維標(biāo)記。正如所料,可容易地觀察到這些錨定原纖維離開基底膜并截留膠原原纖維。層粘連蛋白(基底膜糖蛋白)的存在使用前述的-生物素免疫酶技術(shù)(Guesdon,1979)被顯現(xiàn)。實(shí)施例3:通過人新生兒包皮成纖維細(xì)胞在化學(xué)上成分確定的培養(yǎng)基中體外形成膠原基質(zhì)使用實(shí)施例1所述過程將人新生兒包皮成纖維細(xì)胞擴(kuò)增。然后將細(xì)胞再懸浮達(dá)到3xl06個(gè)細(xì)胞/毫升的濃度,并以3.0x106個(gè)細(xì)胞/總重量(6.6xl()S個(gè)細(xì)胞/cm"的密度接種到在六孔托盤中的0.4微米孔徑、24毫米直徑的組織培養(yǎng)處理膜插入物上。然后這些細(xì)胞根據(jù)實(shí)施例1被保持,只是在整個(gè)培養(yǎng)基中省略掉新生小牛血清。更具體地說,培養(yǎng)基包含DMEM和HamsF畫12培養(yǎng)基(QualityBiologies,Gaithersburg,MD)的3:1基礎(chǔ)混合物,補(bǔ)充有4mMGlutaMAX(GibcoBRL,GrandIsland,NY)和如下添力口劑5ng/ml人重組表皮生長(zhǎng)因子(UpstateBiotechnology,LakePlacid,NY),0.4|ug/ml氬化可的松(Sigma,St.Louis,MO),lxl(T4M乙醇胺(Fluka,Ronkonkoma,NYcat.#02400ACS級(jí)),1x10—4Mo畫磷?;鶉?guó)乙醇胺(Sigma,St.Louis,MO),5(ig/ml胰島素(Sigma,St.Louis,MO),5|ug/ml4失傳遞蛋白(Sigma,St.Loms,MO),20pM三石輿甲腺原氨酸(Sigma,St.Louis,MO),和6.78ng/ml勵(lì)(SigmaAldrichFineChemicalsCompany,Milwaukee,WI),50ng/mlL-抗壞血酸(WAKOChemicalsUSA,Inc.),0.2|ug/mlL-脯氨酸(Sigma,StLouis,MO),0.1|iig/ml甘氨酸(SigmaSt.Louis,MO)和0.05%聚乙二醇(PEG)(Sigma,St.Louis,MO)。使用前述過程在第7、14和21天檢查樣品的膠原蛋白濃度和細(xì)胞數(shù)目。結(jié)果總結(jié)在表4(細(xì)胞數(shù)目)和5(膠原蛋白)中。樣品也根據(jù)實(shí)施例1所述用紅染色以進(jìn)行光學(xué)顯微鏡分析。組織學(xué)評(píng)價(jià)證明了在成分確定的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的構(gòu)建體類似于在2%新生小牛血清存在條件下生長(zhǎng)的構(gòu)建體。使用實(shí)施例l所述過程,樣品也對(duì)粘連蛋白染色呈陽(yáng)性。表4:膠原蛋白(iug/cm2)<table>tableseeoriginaldocumentpage42</column></row><table>除了內(nèi)源性產(chǎn)生原纖維膠原蛋白之外,核心蛋白聚糖和糖胺聚糖也存在于細(xì)胞-基質(zhì)構(gòu)建體中。實(shí)施例4:使用化學(xué)上成分確定的培養(yǎng)基形成的全厚度皮膚構(gòu)建體在與實(shí)施例3所述方法類似的化學(xué)上成分確定的條件下從人真皮成纖維細(xì)胞形成25天的真皮構(gòu)建體,將正常人新生兒包皮表皮角化細(xì)胞接種到細(xì)胞-基質(zhì)構(gòu)建體的上表面上,形成皮膚構(gòu)建體的表皮層。從培養(yǎng)插入物及其周圍無菌地除去培養(yǎng)基。正常人表皮角化細(xì)胞從冷凍傳代培養(yǎng)細(xì)胞原液擴(kuò)大到第4代達(dá)到鋪滿。然后使用胰蛋白酶-乙二胺四乙酸使細(xì)胞從培養(yǎng)皿^皮釋放,匯集,離心形成細(xì)胞小球,將其再懸浮在表皮形成培養(yǎng)基中,計(jì)數(shù)并以4.5xl(^個(gè)細(xì)胞/cm2的密度接種到膜的上表面上。然后將構(gòu)建體在37±1°C,10%CO2的條件下培養(yǎng)90分鐘以允許角化細(xì)胞附著。在培養(yǎng)后,將構(gòu)建體浸沒在表皮形成培養(yǎng)基中。表皮形成培養(yǎng)基組成如下Dulbecco氏改進(jìn)的伊才各爾培養(yǎng)基(DMEM)(不含葡萄糖和鈣,BioWhittaker,Walkersville,MD)和HamsF-12培養(yǎng)基(QualityBiologiesGaithersburg,MD)的3:1的基礎(chǔ)混合物,補(bǔ)充有0.4|ug/ml氫化可的松(SigmaSt.Louis,MO),lxl(T4M乙醇胺(Fluka,Ronkonkoma,NY),lxl(T4Mo-磷?;?乙醇胺(Sigma,St.Louis,MO),5|ug/ml胰島素(Sigma,St.Louis,MO),5|iig/ml鐵傳遞蛋白(Sigma,StLouis,MO),20pM三碘曱腺原氨酸(Sigma,StLouis,MO),6.78ng/ml勵(lì)(Aldrich),24.4|ug/ml!^嘌呤(SigmaAldrichFineChemicalsCompany,Milwaukee,WI),4mML-谷氨酰胺(BioWhittaker,Walkersville,MD),50|ug/mlL-抗壞血酸鈉鹽(SigmaAldrichFineChemicalsCompany,Milwaukee,WI),16|uM亞油酸(Sigma,St.Louis,MO),1|tiM乙酸生育酚(Sigma,St.Louis,MO)和50]ug/ml辟^S臾慶大霉素(Amersham,ArlingtonHeights,IL)。將構(gòu)建體在表皮形成培養(yǎng)基中在37±1°C,10±1%C02條件下培養(yǎng)2天。2天后,如上所述用新鮮的培養(yǎng)基更換培養(yǎng)基,并將其送返回在37±1°C,10±1%C02條件下的培養(yǎng)箱中放置2天。2天后,將含有構(gòu)建體的載體無菌地轉(zhuǎn)移到具有足夠培養(yǎng)基的新的培養(yǎng)托盤中,實(shí)現(xiàn)液面剛好達(dá)到載體膜的表面以保持構(gòu)建體在氣-液界面處發(fā)育。正在形成的表皮層的上表面的空氣接觸允許上皮層的層化。構(gòu)建體在37士rC,10%CO2和低濕度條件下在培養(yǎng)基中培養(yǎng)7天,每2-3天更換培養(yǎng)基。該培養(yǎng)基含有Dulbecco氏改進(jìn)的伊格爾培養(yǎng)基(DMEM)(不含葡萄糖和4丐,BioWhittaker,Walkersville,MD)和HamsF-12培養(yǎng)基(QualityBiologies,Gaithersburg,MD)的1:1混合物,補(bǔ)充有0.4|Lig/ml氬化可的松(Sigma,St.Louis,MO),5xl(T4M乙醇胺(Fluka,Ronkonkoma,NY),5xl0-4Mo-磷?;?乙醇胺(Sigma,St.Louis,MO),5pg/ml胰島素(Sigma,St.Louis,MO),5|ug/ml鐵傳遞蛋白(Sigma,St.Louis,MO),20pM三碘曱腺原氨酸(Sigma,StLouis,MO),6.78ng/ml石西(SigmaAldrichFineChemicalsCompany),24.4|ug/ml腺口票呤(SigmaAldrichFineChemicalsCompany),4mML-谷氨酰胺(BioWhittaker,Walkersville,MD),2.65jag/ml氯化鉀(Mallinckrodt,Chesterfield,MO),16|uM亞油酸(Sigma,St.Louis,MO),1|uM乙酸生育酚(Sigma,St.Louis,MO),1.25mM絲氨酸(Sigma,St.Louis,MO),0.64mM氯化膽石咸(Sigma,St.Louis,MO)和50|ug/ml硫酸慶大霉素(Amersham,ArlingtonHeights,IL)。對(duì)培養(yǎng)物每2-3天供料,43持續(xù)14天。在構(gòu)建體被升高到氣-液界面后的第10、12和14天將樣品一式三份如實(shí)施例1所述進(jìn)行加工用于蘇木精和曙紅染色,以根據(jù)光學(xué)顯微術(shù)確定大體外觀。得到的構(gòu)建體由具有如實(shí)施例3所述特征的基質(zhì)包圍的成纖維細(xì)胞組成,并且被層化和分化的角化細(xì)胞層覆蓋。實(shí)施例5:通過人跟腱成纖維細(xì)胞體外形成膠原基質(zhì)使用與實(shí)施例1所述相同的方法,用人跟腱成纖維細(xì)胞(HATF)代替人新生兒包皮成纖維細(xì)胞,形成細(xì)胞-基質(zhì)構(gòu)建體。在生成培養(yǎng)基中21天后,也提交樣品用于H&E染色,并使用實(shí)施例1所述過程測(cè)定厚度。得到的構(gòu)建體經(jīng)過觀察,是厚度為75.00±27.58微米(n=2)的細(xì)胞基質(zhì)樣構(gòu)建體。內(nèi)源性產(chǎn)生的原纖維膠原蛋白,核心蛋白聚糖和糖胺聚糖也存在于該構(gòu)建體中。實(shí)施例6:通過轉(zhuǎn)染的人新生兒包皮成纖維細(xì)胞體外形成膠原基質(zhì)使用以下過程產(chǎn)生轉(zhuǎn)染的人真皮成纖維細(xì)胞。將一瓶jCRIP-43血小板由來生長(zhǎng)因子(PDGF)病毒發(fā)生器(Morgan,J等)解凍,將細(xì)胞以2xl06個(gè)細(xì)胞/162cm2燒瓶(CorningCostar,Cambridge,MA)接種。向這些燒瓶提供生長(zhǎng)培養(yǎng)基,在培養(yǎng)箱中在37士rC和10±1%C02氣氛中被保持。生長(zhǎng)培養(yǎng)基組成如下Dulbecco氏改進(jìn)的伊格爾培養(yǎng)基(DMEM)(高葡萄糖制劑,不含L-谷氨酰胺,BioWhittaker,Walkersville,MD),補(bǔ)充有10%新生小牛血清(HyCloneLaboratories,Inc.,Logan,Utah)和4mML陽(yáng)谷氨酰胺(BioWhittaker,Walkersville,MD)。在同一天,將1小瓶人新生兒包皮成纖維細(xì)胞(HDFB156)也解凍并以1.5xl06個(gè)細(xì)胞/162cm2燒瓶(CorningCostar,Cambridge,MA)鋪板。三天后,向jCRIPPDGF-43病毒發(fā)生器提供新鮮的生長(zhǎng)培養(yǎng)基。用上述生長(zhǎng)培養(yǎng)基+8|iig/ml聚凝胺(Sigma,StLouis,MO)供應(yīng)HDFB156。第二天,將HDFB156細(xì)胞進(jìn)行如下轉(zhuǎn)染。將得自jCRIPPDGF-43病毒發(fā)生器的用過的培養(yǎng)基收集并過濾通過0.45微孔過濾器。將8pg/ml聚凝胺加入到該經(jīng)過過濾的用過的培養(yǎng)基中。然后將用過的培養(yǎng)基置于HDF上。在后兩天,對(duì)HDF供應(yīng)新鮮的生長(zhǎng)培養(yǎng)基。第二天,HDF從p5傳代培養(yǎng)達(dá)到p6,并以2.5xl06個(gè)細(xì)胞/162cm2燒瓶(CorningCostar,Cambridge,MA)的密度接種。將細(xì)44胞傳代培養(yǎng)如下吸出除去用過的培養(yǎng)基,然后燒瓶用磷酸鹽緩沖鹽水漂洗以除去任何剩余的新生小牛血清。通過向每個(gè)燒瓶中加入5mL的胰蛋白酶-乙二胺四乙酸并溫和地?fù)u動(dòng)以確保單層的面積完整,將細(xì)胞釋放。將培養(yǎng)物送返回培養(yǎng)箱,當(dāng)細(xì)胞一經(jīng)釋放,向每個(gè)燒瓶加入5ml的SBTI(大豆胰蛋白酶抑制劑)并與懸浮液混合從而使胰蛋白酶-乙二胺四乙酸的作用停止。將細(xì)胞/胰蛋白酶/SBTI懸浮液從燒瓶中放出并且平均分配在無菌的圓錐形離心管。通過在大約800-1000xg下離心5分鐘收集細(xì)胞。將細(xì)胞再懸浮在生長(zhǎng)培養(yǎng)基中用于以上述密度接種。二天后細(xì)胞被供應(yīng)新鮮的生長(zhǎng)培養(yǎng)基。第二天,如上所述收獲細(xì)胞,并在含有100/o新生小牛血清(NBCS)和10%二甲基亞砜(DMSO)(Sigma,St.Louis,MO)的生長(zhǎng)培養(yǎng)基中稀釋到1.5xl(^個(gè)細(xì)胞/毫升的密度。然后將細(xì)胞在約-80。C下冷動(dòng),每冷凍小瓶為1毫升。用于該實(shí)施例的膠原基質(zhì)的生成采用與實(shí)施例1和3所述相同的過程,但是使用如上所述經(jīng)過轉(zhuǎn)化以產(chǎn)生高水平的血小板由來生長(zhǎng)因子(PDGF)的人新生兒包皮成纖維細(xì)胞替換人新生兒包皮成纖維細(xì)胞。在接種后第18天如上所述提交樣品用于H&E染色。還使用了抗生物素蛋白-生物素方法對(duì)樣品染色以檢查如實(shí)施例10所示的纖連蛋白的存在。在接種后第18天取得樣品并如實(shí)施例1所述進(jìn)行H&E染色,并且表現(xiàn)出與實(shí)施例1所述的相似的細(xì)胞-基質(zhì)大體外觀,測(cè)量的厚度為123.6微米(N=1)。通過ELISA在細(xì)胞-基質(zhì)構(gòu)建體中測(cè)量的在整個(gè)培養(yǎng)(18天)期間轉(zhuǎn)染細(xì)胞的PDGF輸出為100ng/mL,而對(duì)照的PDGF輸出是不能被檢測(cè)到的。實(shí)施例7:真皮構(gòu)建體作為移植物材料的應(yīng)用根據(jù)實(shí)施例1的方法,使用得自嬰兒包皮的人真皮成纖維細(xì)胞制造細(xì)胞-基質(zhì)構(gòu)建體,并將其移植到在無胸腺棵鼠上產(chǎn)生的完全切除傷口上。根據(jù)Parenteau等(1996)所述方法對(duì)小鼠進(jìn)行移植,所述公開被并入本文。在第14、28和56天檢查移植物與傷口床的附著跡象,傷口收縮證據(jù),移植物消失區(qū)域,和血管形成的存在(有色)。移植區(qū)域通過攝影檢查同時(shí)在小鼠上保持原封不動(dòng)。在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)處死許多小鼠,并且切除移植區(qū)域及其周圍區(qū)域,連同鼠皮周圍邊緣至少到肉膜。移植物和鼠皮之間的接合處保存在每個(gè)樣品中。然后將移出的組織樣品在磷酸鹽緩沖的10%福爾馬林中固定,并在甲醇中固定。用福爾馬林固定的樣品根據(jù)實(shí)施例1所述過程被加工用于H&E染色。移植物能夠與鼠皮成一體,具有最小的可注意到的收縮。在移植14天內(nèi),小鼠表皮已經(jīng)完全移到移植物上。使用H&E染色樣品,在第14天在移植物內(nèi)血管是顯而易見的,并且貫穿整個(gè)實(shí)-險(xiǎn)過程。通過大體觀測(cè)和通過H&E染色樣品,貫穿整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間,可確定移植物存留并保留健康的外觀,含有活細(xì)胞,沒有大體的基質(zhì)異常等。實(shí)施例8:全厚度皮膚構(gòu)建體作為皮膚移植物的應(yīng)用在真皮層中使用得自新生兒包皮的人真皮成纖維細(xì)胞和在表皮層中使用得自不同的新生兒包皮的人角化細(xì)胞,如實(shí)施例2所述制備雙層皮膚構(gòu)建體。皮膚構(gòu)建體能用手從膜上剝離,不用載體制成即可被操作,并且置于移植部位上。根據(jù)Parenteau等(1996)所述的方法將該雙層皮膚構(gòu)建體移植到在無胸腺棵鼠上制造的全切除傷口上,該公開被并入本文。取樣時(shí)間點(diǎn)為移植后的第7、14、28、56和184天。移植區(qū)域被攝影同時(shí)保持在小鼠上原封不動(dòng)。在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)處死許多小鼠,并且切除移植區(qū)域及其周圍區(qū)域,連同鼠皮周圍邊緣至少到肉膜。在移植物和鼠皮之間的接合處保存在每個(gè)樣品中。然后將取得的組織樣品在磷酸鹽緩沖的10%福爾馬林中固定,并在曱醇中固定。用福爾馬林固定的樣品根據(jù)實(shí)施例1所述過程-波加工用于H&E染色。通過大體,見測(cè)以及通過組織學(xué)外觀,移才直物在7天內(nèi)與宿主組織成一體。通過H&E染色,在移植7天內(nèi)可觀察到血管逐漸從宿主組織生長(zhǎng)進(jìn)入移植物。移植物在整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間仍然保持健康和被存留,具有最小的可被注意的收縮。采用抗人內(nèi)披蛋白著色,人表皮細(xì)胞的持久存在顯示于整個(gè)移植期間。實(shí)施例9:通過人角膜的角膜細(xì)胞體外形成基質(zhì)在制造角膜的基質(zhì)構(gòu)建體中使用人角膜的角膜細(xì)胞(得自O(shè)rganogenesis,Inc.Canton,MA)。使用胰蛋白酶-乙二胺四乙酸將人角膜細(xì)胞的鋪滿培養(yǎng)物從它們的培養(yǎng)底物中釋放。當(dāng)被釋放后,使用大豆胰蛋白酶抑制劑中和胰蛋白酶-乙二胺四乙酸,將細(xì)胞懸浮液離心處理,棄去上清液,然后將細(xì)胞再懸浮在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中達(dá)3\106個(gè)細(xì)胞/毫升的濃度。將細(xì)胞以3.0xl0S個(gè)細(xì)胞/總重量(6.6xl()S個(gè)細(xì)胞/cm勺的密度接種到在六孔托盤中的0.4微米孔徑、24毫米直徑的組織培養(yǎng)處理插入物上。這些培養(yǎng)在接種培養(yǎng)基中保持過夜。接種培養(yǎng)基組成如下Dulbecco氏改進(jìn)的伊格爾培養(yǎng)基(DMEM)和HamsF-12培養(yǎng)基(QualityBiologiesGaithersburg,MDcat.)的3:1的基礎(chǔ)混合物,補(bǔ)充有4mMGlutaMAX(GibcoBRL,GrandIsland,NY)和添加劑5ng/ml人重組表皮生長(zhǎng)因子(EGF)(UpstateBiotechnologyLakePlacid,NY),0.4|ug/ml氫化可的松(SigmaStLouis,MO),lx10-4M乙醇胺(Fluka,Ronkonkoma,NY),lxlO-4Mo-磷?;?乙醇胺(Sigma,St.Louis,MO),5pg/ml胰島素(Sigma,StLouis,MO),5pg/ml4失傳遞蛋白(Sigma,St.Louis,MO),20pM三碘甲腺原氨酸(Sigma,St.Louis,MO),和6.78ng/ml竭(SigmaAldrichFineChemicalsCompany,Milwaukee,WI)。之后,向培養(yǎng)物供應(yīng)新鮮的生成培養(yǎng)基。生成培養(yǎng)基組成如下DMEM和HamsF-12培養(yǎng)基(QualityBiologiesGaithersburg,MD)的3:1的基礎(chǔ)混合物,補(bǔ)充有4mMGlutaMAX(GibcoBRL.,GrandIsland,NY)和添加劑5ng/ml人重組表皮生長(zhǎng)因子(UpstateBiotechnologyLakePlacid,NY),2%新生小牛血清(Hyclone,Logan,Utah),0.4|iig/ml氫化可的松(Sigma,StLouis,MO),lxicr4M乙醇胺(Fluka,Ronkonkoma,NYACS級(jí)),lxl(T4Mo-磷?;?乙醇胺(Sigma,St.Louis,),5pg/ml胰島素(Sigma,St.Louis,MO),5|ug/ml鐵傳遞蛋白(Sigma,St.Louis,MO),20pM三碘曱腺原氨酸(Sigma,St.Louis,MO),和6.78ng/ml硒(SigmaAldrichFineChemicalsCo.,Milwaukee,WI),50ng/mlL-抗壞血酸(WAKOpurechemicalcompany),0.2|ug/mlL曙脯氨酸(Sigma,StLouis,MO),0.1|iig/ml甘氨酸(Sigma,StLouis,MO)和0.050/0聚乙二醇(PEG)(Sigma,St.Louis,MO,細(xì)胞培養(yǎng)級(jí)別)。將細(xì)胞在培養(yǎng)箱中在37士1。C和10%士1%C02氣氛下被保持,并每2-3天被供應(yīng)新鮮的生成培養(yǎng)基持續(xù)20天(總共培養(yǎng)21天)。在培養(yǎng)21天后,角膜細(xì)胞已經(jīng)沉積成厚度為約40微米的基質(zhì)層,通過實(shí)施例1所述方法測(cè)得。內(nèi)源性產(chǎn)生的原纖維膠原蛋白、核心蛋白聚糖和糖胺聚糖也存在于細(xì)胞-基質(zhì)構(gòu)建體中。實(shí)施例10:通過在生成培養(yǎng)基中接種的人新生兒包皮成纖維細(xì)胞體外形成膠原基質(zhì)人新生兒包皮成纖維細(xì)胞(得自O(shè)rganogenesis,Inc.Canton,MA)在六孔托盤(TRANSWELL⑧,CostarCorp.Cambridge,MA)中以1"05個(gè)細(xì)胞/0.4微米孔徑、24毫米直徑組織培養(yǎng)處理載體在生長(zhǎng)培養(yǎng)基中被接種和培養(yǎng)。生長(zhǎng)培養(yǎng)基組成如下Dulbecco氏改進(jìn)的伊格爾培養(yǎng)基(DMEM)(高葡萄糖制劑,不含L-谷氨酰胺,BioWhittaker,Walkersville,MD),補(bǔ)充有10%新生小牛血清(HyCloneLaboratories,Inc.,Logan,Utah)和4mML-谷氨酰胺(BioWhittaker,Walkersville,MD)。細(xì)胞在培養(yǎng)箱中在37士1。C和10士l。/。CO2氣氛中被保持。每2-3天將更換培養(yǎng)基。在培養(yǎng)9天后,從培養(yǎng)皿吸出培養(yǎng)基,并用生成培養(yǎng)基替換。細(xì)胞在培養(yǎng)箱中在37±1°C和10±1%C02氣氛中被保持并每2-3天供應(yīng)新鮮的生成培養(yǎng)基持續(xù)21天。生成培養(yǎng)基組成如下DMEM和HamsF-12培養(yǎng)基(QualityBiologies,Gaithersburg,MD)的3:1的基礎(chǔ)混合物,4mMGlutaMAX(GibcoBRL,GrandIsland,NY)和添加劑5ng/ml人重組表皮生長(zhǎng)因子(UpstateBiotechnology,LakePlacid,NY),2%新生小牛血清(Hyclone,Logan,Utah),0.4pg/ml氬化可的木〉(SigmaSt.Louis,MO),"lCT4M乙醇胺(Fluka,Ronkonkoma,NYACS級(jí)),lxl(T4Mo-磷?;?乙醇胺(Sigma,St.Louis,),5|ug/ml胰島素(Sigma,St.Louis,MO),5|ug/ml鐵傳遞蛋白(Sigma,St.Louis,MO),20pM三碘曱腺原氨酸(Sigma,StLouis,MO),和6.78ng/ml石西(SigmaAldrichFineChemicalsCo.,Milwaukee,WI),50ng/mlL-抗壞血酸(WAKOPureChemicalCompany),0.2|ug/mlL-月甫氨酸(Sigma,St.Louis,MO),0.1jug/ml甘氨酸(Sigma,St.Louis,MO)和0.05%聚乙二醇(PEG)(Sigma,St.Louis,MO,細(xì)胞培養(yǎng)級(jí)別)。在第21天取得樣品并固定在福爾馬林中,然后包埋在石蠟中。福爾馬林固定樣品被包埋在石蠟中,并且5微米切片根據(jù)本領(lǐng)域已知過程用蘇木精-曙紅(H&E)染色。使用H&E染色載玻片,采用裝載有10毫米/100微米十字線(OlympusAmericaInc.,Melville,NY)的10X目鏡(OlympusAmericaInc.,Melville,NY)對(duì)十個(gè)隨沖幾選擇的顯樣i鏡一見野進(jìn)4亍測(cè)量。使用該方法生產(chǎn)的構(gòu)建體在結(jié)構(gòu)和生物化學(xué)組成方面與根據(jù)實(shí)施例1生產(chǎn)的那些相似,并具有82.00士7.64微米的厚度。實(shí)施例11:通過豬真皮成纖維細(xì)胞體外形成膠原基質(zhì)48將豬真皮成纖維細(xì)胞(得自O(shè)rganogenesis,Inc.Canton,MA)以5><105個(gè)細(xì)胞/162cm2組織培養(yǎng)處理燒瓶(CostarCorp.,Cambridge,MA,cat#3150)在生長(zhǎng)培養(yǎng)基中接種并生長(zhǎng),過程如下。生長(zhǎng)培養(yǎng)基組成如下Dulbecco氏改進(jìn)的伊格爾培養(yǎng)基(DMEM)(高葡萄糖制劑,不含L-谷氨酰胺,BioWhittaker,Walkersville,MD),補(bǔ)充有10%胎牛血清(HyCloneLaboratories,Inc.,Logan,Utah)和4mML-谷氨酰胺(BioWhittaker,Walkersville,MD)。細(xì)胞在培養(yǎng)箱中在37士1。C和10%士1%C02氣氛中被保持。每2-3天將更換培養(yǎng)基。當(dāng)鋪滿時(shí),也就是細(xì)胞已經(jīng)在組織培養(yǎng)燒瓶的底部形成堆積層時(shí),從培養(yǎng)皿吸出培養(yǎng)基。為了漂洗單層,向每個(gè)單層加入經(jīng)無菌過濾的磷酸鹽緩沖鹽水,然后從培養(yǎng)皿中吸出。通過向每個(gè)燒瓶中加入5mL的胰蛋白酶-乙二胺四乙酸谷氨酰胺(BioWhittaker,Walkersville,MD)并溫和地?fù)u動(dòng)以確保單層的面積完整,將細(xì)胞從燒瓶釋放。然后將培養(yǎng)物送返回培養(yǎng)箱。當(dāng)細(xì)胞一經(jīng)釋放,向每個(gè)燒瓶加入5ml的SBTI(大豆胰蛋白酶抑制劑)并與細(xì)胞懸浮液混合從而使胰蛋白酶-乙二胺四乙酸的作用停止。將細(xì)胞懸浮液從燒瓶中取出并且平均分配在無菌的圓錐形離心管。通過在大約800-1000xg下離心5分鐘收集細(xì)胞。然后將細(xì)胞再懸浮和稀釋達(dá)到3xl()S個(gè)細(xì)胞/毫升的濃度,并以3xl(^個(gè)細(xì)胞/總重量(6.6xl()S個(gè)細(xì)胞/cm"的密度接種到在六孔托盤中的0.4微米孔徑、24毫米直徑的組織培養(yǎng)處理TRANSWELLS上。細(xì)胞在接種培養(yǎng)基中保持過夜。接種培養(yǎng)基組成如下DMEM和HamsF-12培養(yǎng)基(QualityBiologies,Gaithersburg,MD)的3:1的基礎(chǔ)混合物,補(bǔ)充有4mMGlutaMAX(GibcoBRL,GrandIsland,NY)和添加劑5ng/ml人重組表皮生長(zhǎng)因子(UpstateBiotechnologyLakePlacid,NY),0.4|ug/ml氬化可的松(SigmaStLouis,MO),lx10-4M乙醇胺(Fluka,Ronkonkoma,NYACS級(jí)),lxl(T4Mo-磷?;?乙醇胺(Sigma,St.Louis,),5|tig/ml胰島素(Sigma,St.Louis,MO),5(ig/ml鐵傳遞蛋白(Sigma,St.Louis,MO),20pM三碘曱腺原氨酸(Sigma,St.Louis,MO),和6.78ng/ml硒(SigmaAldrichFineChemicalsCo.,Milwaukee,WI),50ng/mlL-抗壞血酸(WAKOPureChemicalCompany),0.2|ug/mlL誦脯氨酸(Sigma,St.Louis,MO),和0.1(ag/ml甘氨酸(Sigma,StLouis,MO)。細(xì)胞在培養(yǎng)箱中在37±1°C和10±1%C02氣氛中祐:保持并每2-3天供應(yīng)新鮮的生成培養(yǎng)基持續(xù)7天。生成培養(yǎng)基組成如下DMEM和HamsF-12培養(yǎng)基(Quality49Biologies,Gaithersburg,MD)的3:1的基礎(chǔ)混合物,補(bǔ)充有4mMGlutaMAX(GibcoBRL,GrandIsland,NY)和添加劑5ng/ml人重組表皮生長(zhǎng)因子(UpstateBiotechnology,LakePlacid,NY),2%新生小牛血清(Hydone,Logan,Utah),0.4pg/ml氪化可的松(SigmaStLouis,MO),WO-4M乙醇胺(Fluka,Ronkonkoma,NYACS級(jí)),lx104Mo國(guó)磷?;?乙醇胺(Sigma,St.Louis,),5|iig/ml胰島素(Sigma,St.Louis,MO),5pg/ml鐵傳遞蛋白(Sigma,St.Louis,MO),20pM三碘甲腺原氨酸(Sigma,St.Louis,MO),和6.78ng/ml石西(SigmaAldrichFineChemicalsCo.,Milwaukee,WI),50ng/mlL畫抗壞血酸(WAKOPureChemicalCompany),0.2|ug/mlL-脯氨酸(Sigma,St.Louis,MO),0.1|ug/ml甘氨酸(Sigma,StLouis,MO)和0.05%聚乙二醇(PEG)(Sigma,StLouis,MO)細(xì)胞培養(yǎng)級(jí)別。7天后用不含新生小牛血清的生成培養(yǎng)基更換培養(yǎng)基。每2-3天將該新鮮的培養(yǎng)基提供給細(xì)胞持續(xù)20多天,總共培養(yǎng)28天。在第21天取得樣品并固定在福爾馬林中,然后包埋在石蠟中。福爾馬林固定的樣品被包埋在石蠟中,并且5微米切片根據(jù)本領(lǐng)域已知過程用蘇木精-曙紅(H&E)染色。使用H&E染色載玻片,采用裝載有10毫米/100微米十字線(OlympusAmericaInc.,Melville,NY)的10X目鏡(OlympusAmericaInc.,Melville,NY)對(duì)十個(gè)隨機(jī)選擇的顯孩"竟碎見野進(jìn)行測(cè)量。樣品表現(xiàn)出的構(gòu)建體由細(xì)胞和基質(zhì)組成,測(cè)量的厚度為71.20±9.57微米。除了內(nèi)源性產(chǎn)生的原纖維膠原蛋白之外,核心蛋白聚糖和糖胺聚糖也存在于細(xì)胞-基質(zhì)構(gòu)建體中。實(shí)施例12:包含真皮乳頭細(xì)胞的雙層皮膚構(gòu)建體的體外形成根據(jù)實(shí)施例1方法,使用人新生兒包皮成纖維細(xì)胞作為第一產(chǎn)生基質(zhì)的細(xì)胞類型制造細(xì)胞-基質(zhì)。將細(xì)胞-基質(zhì)用作為笫二細(xì)胞群體的真皮乳頭細(xì)胞進(jìn)行點(diǎn)樣局部接種,第二細(xì)胞群體用作為第三細(xì)胞群體的角化細(xì)胞進(jìn)行接種,以在細(xì)胞-基質(zhì)和真皮乳頭細(xì)胞上形成連續(xù)的表皮層。首先,使用得自新生兒包皮的人真皮成纖維細(xì)胞(HDF)形成細(xì)胞-基質(zhì)構(gòu)建體,通過將HDF以5xl05個(gè)細(xì)胞/162cn^組織培養(yǎng)處理燒瓶^(CostarCorp.,Cambridge,MA)在生長(zhǎng)培養(yǎng)基中接種并按比例增加,所述生長(zhǎng)培養(yǎng)基組成如下Dulbecco氏改進(jìn)的伊格爾培養(yǎng)基(DMEM)(高葡萄糖制劑,不含L-谷氨酰胺,BioWhittaker,Walkersville,MD),補(bǔ)充有10%新生小牛血清(NBCS)(HyCloneLaboratories,Inc.,Logan,Utah)和4mML-谷氨酰胺(BioWhittaker,Walkersville,MD)。當(dāng)鋪滿時(shí),使用胰蛋白酶-乙二胺四乙酸使HDF從板釋放,并使用新鮮的培養(yǎng)基再懸浮達(dá)到3.0xl()S個(gè)細(xì)胞/毫升的濃度,并以3.0xl0S個(gè)細(xì)胞/插入物(6.6xl()S個(gè)細(xì)胞/cm"的密度接種到在六孔托盤內(nèi)的0.4微米孔徑、24毫米直徑組織培養(yǎng)處理插入物(TRANSWELL,CorningCostar)上。將HDF培養(yǎng)物在培養(yǎng)箱中在37士rC和10±1%。02氣氛中保持并根據(jù)實(shí)施例1所述方法每2-3天供應(yīng)新鮮的生成培養(yǎng)基持續(xù)23天。已經(jīng)形成細(xì)胞-基質(zhì)構(gòu)建體后,將其用作為第二細(xì)胞群體的真皮乳頭細(xì)胞的進(jìn)行點(diǎn)樣接種。真皮乳頭細(xì)胞是被毛嚢的毛球所包圍的離散的特化成纖維細(xì)胞群體,從而在毛發(fā)生長(zhǎng)中起到支撐作用。真皮乳頭可以使用先前Messenger,A.G.所述方法(TheCultureofDermalPapillaCellsfromHumanHairFollicles.Br.J.Dermatol.110:685-9(1984))通過纖維解剖毛嚢被分離并進(jìn)行體外培養(yǎng),該方法并入本文。當(dāng)真皮乳頭細(xì)胞的培養(yǎng)物達(dá)到鋪滿時(shí)它們形成聚集體,其可以重新被鋪板在培養(yǎng)瓶中以重新形成新的聚集體。從4周大的豬的皮膚活體組織中分離真皮乳頭。將得自真皮乳頭(PDP)的細(xì)胞連續(xù)地在包含20。/。NBCS的DMEM中傳代培養(yǎng)到第8代。在培養(yǎng)3周后,PDP細(xì)胞重新組成真皮乳頭樣結(jié)構(gòu)或聚集體,它們各自的直徑為約90到210孩£米。然后通過對(duì)著培養(yǎng)基有力地移液將聚集體從培養(yǎng)板中取出,然后以200個(gè)聚集體/cm2的密度接種到人膠原基質(zhì)上。將聚集體在DMEM20%NBCS中浸沒培養(yǎng)另外15天,每2-3天用新鮮的培養(yǎng)基更換用過的培養(yǎng)基。將其上含有真皮乳頭細(xì)胞的細(xì)胞-基質(zhì)培養(yǎng)物用角化細(xì)胞接種并培養(yǎng),以在細(xì)胞-基質(zhì)和真皮乳頭上形成連續(xù)的表皮層。制造了兩個(gè)不同的構(gòu)建體用人角化細(xì)胞制造的第一構(gòu)建體,和用豬角化細(xì)胞制造的第二構(gòu)建體。使用移植長(zhǎng)出從人新生兒包皮(HEP)或豬角化細(xì)胞(PEP)分離正常的表皮角化細(xì)胞,以建立原代培養(yǎng)物。然后將這些細(xì)胞培養(yǎng)和擴(kuò)增,對(duì)于豬細(xì)胞抹傳代培養(yǎng)直到第3代,或?qū)τ谌思?xì)胞林傳代培養(yǎng)直到第4代。培養(yǎng)約5到6天后,然后使用胰蛋白酶-乙二胺四乙酸使細(xì)胞從培養(yǎng)皿釋放,匯集,離心以形成細(xì)胞小球,再懸浮在表皮形成培養(yǎng)基中,計(jì)數(shù),對(duì)于HEP細(xì)胞以4.5xl(^個(gè)細(xì)胞/cm2的密度接種到膜的上表面上,對(duì)于PEP細(xì)胞以1.6xl()S個(gè)細(xì)胞/cm2的密度接種到膜的上表面上。表皮51形成培養(yǎng)物如先前實(shí)施例2中所述培養(yǎng)12天。提供最終樣品經(jīng)過加工用于蘇木精和曙紅染色,用于光學(xué)顯微術(shù)。得到的皮膚構(gòu)建體表現(xiàn)出類似于皮膚的基礎(chǔ)形態(tài)學(xué)組織由被內(nèi)源性產(chǎn)生的基質(zhì)(包括內(nèi)源性產(chǎn)生的原纖維膠原蛋白,核心蛋白聚糖,和糖胺聚糖)包圍的成纖維細(xì)胞組成的真皮層,局部的真皮乳頭細(xì)胞區(qū)域,和橫跨細(xì)胞-基質(zhì)構(gòu)建體和真皮乳頭的層狀的角化細(xì)胞層。在被人或者豬角化細(xì)胞覆蓋的兩個(gè)組織構(gòu)建體中,真皮乳頭保持了堆積結(jié)構(gòu),該堆積結(jié)構(gòu)誘導(dǎo)覆蓋上皮的小起伏。分化的上皮細(xì)胞通常接近真皮乳頭細(xì)胞存在。實(shí)施例13:通過夾心ELISA進(jìn)行透明質(zhì)酸測(cè)量分別根據(jù)實(shí)施例1和3的方法在含血清的培養(yǎng)基和化學(xué)上成分確定的培養(yǎng)基中由真皮成纖維細(xì)胞形成的細(xì)胞-基質(zhì)構(gòu)建體中測(cè)量透明質(zhì)酸(HA)。在引入多孔膜(TRANSWELL⑧,CorningCostar)的環(huán)形75毫米直徑載體上形成細(xì)胞-基質(zhì)構(gòu)建體。通過向含有細(xì)胞-基質(zhì)構(gòu)建體的試管中加入10毫升的乙酸銨緩沖液和0.5mg/mL的蛋白酶K制備得自細(xì)胞-基質(zhì)構(gòu)建體的提取物。將混合物在6(TC培養(yǎng)過夜。在消解完成后,將混合物旋轉(zhuǎn)分離并將上清液提取物轉(zhuǎn)移到用于透明質(zhì)酸測(cè)定的分離試管中。將96-孔板用50iuL在0.1MNaHC03溶液中的20|ug/mLHA結(jié)合蛋白涂覆,并在4。C保存過夜。然后用含0.05%吐溫20的0.85%NaCl將板洗滌三次。然后向每個(gè)孔加入250|uL阻斷溶液(石舞酸鈉纟爰沖液,10mmol,pH=7.4,包含3。/。BSA和0.9%NaCl,PBS+3%BSA),將板在室溫下培養(yǎng)2小時(shí)。然后用包含0.05%吐溫20的0.85%NaCl將板洗滌三次。然后向板中加入50fi1的標(biāo)準(zhǔn)HA溶液,并且在兩個(gè)實(shí)^驗(yàn)條件下提取,包括在這些條件下的多種稀釋度。板在室溫(約20。C)培養(yǎng)2小時(shí)。然后將板用包含0.05%吐溫20的0.85%NaCl洗滌三次,并向每個(gè)孔加入50|uL的生物素化HA(1:2000稀釋度),然后在室溫培養(yǎng)2小時(shí)。然后將板用包含0.05%吐溫20的0.85%NaCl洗滌三次,然后向每個(gè)孔加入50|uL的HRP陽(yáng)抗生物素蛋白D(1:3000稀釋度)。然后將板在室溫下培養(yǎng)45分鐘。然后將板用含有0.05%吐溫20的0.85%NaCl洗滌三次,并向每個(gè)孔中加入100|uL的鄰苯二胺底物溶液。將板在37。C培養(yǎng)10分鐘,通過添加50|iiL的1MHC1使反應(yīng)停止。最后,使用讀板器,在492nm讀取吸光度并記錄。將吸光度測(cè)量值平均化并轉(zhuǎn)化為數(shù)量測(cè)量值。在含有血清的培養(yǎng)基中形成的環(huán)形細(xì)胞-基質(zhì)構(gòu)建體(75毫米直徑)經(jīng)過測(cè)定,各自含有約200pg的透明質(zhì)酸,盡管那些在化學(xué)上成分確定的培養(yǎng)基中形成的構(gòu)建體各自含有約1.5毫克的透明質(zhì)酸。實(shí)施例14:生成的細(xì)胞-基質(zhì)構(gòu)建體的物理試驗(yàn)和機(jī)械性質(zhì)通過膜膨脹試驗(yàn)定量測(cè)量了實(shí)施例1的組織構(gòu)建體(細(xì)胞-基質(zhì)構(gòu)建體),實(shí)施例2的組織構(gòu)建體(其上具有角化細(xì)胞層的細(xì)胞-基質(zhì)構(gòu)建體)和實(shí)施例3的組織構(gòu)建體(在成分確定的培養(yǎng)基中形成的細(xì)胞-基質(zhì)構(gòu)建體)的機(jī)械性質(zhì)。這些試驗(yàn)類似于臨床中所述的試驗(yàn)(例如,Dermaflex,CyberdermInc.,Media,PA,和Cutameter,CourageKhazaka,Cologne,Germany)但是牽涉較高的壓力,包括能使膜破裂的壓力。將樣品細(xì)胞-基質(zhì)構(gòu)建體平放到聚碳酸酯塊上,該聚碳酸酯塊位于直徑為10毫米的裝滿正常張力的鹽水的圓筒形井的中心。將具有與圓筒形井的直徑對(duì)應(yīng)的圓孔的金屬板放置到樣片上并被夾緊到聚碳酸酯塊上。然后通過用注射器泵將另外的鹽水注入到孔內(nèi)使樣品膨脹。使用壓力傳感器測(cè)量最終壓力。增大壓力直到裝置破壞,根據(jù)實(shí)施例1所迷過程制造的細(xì)胞-基質(zhì)構(gòu)建體的脹裂強(qiáng)度平均為439.02毫米汞柱;根據(jù)實(shí)施例2所述過程制造的具有角化細(xì)胞層的細(xì)胞-基質(zhì)構(gòu)建體樣品的脹裂強(qiáng)度平均為998.52毫米汞柱;和根據(jù)實(shí)施例3所述方法在成分確定的培養(yǎng)基中形成的細(xì)胞-基質(zhì)構(gòu)建體樣品的脹裂強(qiáng)度平均為1542.26毫米汞柱。為了測(cè)定真皮基質(zhì)的熱熔點(diǎn),根據(jù)實(shí)施例1所述過程制造并在第21天取得樣品(細(xì)胞-基質(zhì)構(gòu)建體)。使用MettlerToledo(Highston,NJ)差示掃描量熱計(jì)(DSC產(chǎn)品存DSC12E)進(jìn)行分析,測(cè)定樣品的變性溫度。對(duì)于此目的,通過從45°C到80°C以每分鐘1°C的速率加熱樣品測(cè)定熔融溫度。樣品的平均變性溫度是60.8±1.2°C(n=3)。測(cè)量了使用實(shí)施例1制造的表皮形成基質(zhì)(細(xì)胞-基質(zhì)構(gòu)建體)和使用實(shí)施例3的過程制造的表皮形成基質(zhì)(在成分確定的培養(yǎng)基中形成的細(xì)胞-基質(zhì)構(gòu)建體)的縫合保留強(qiáng)度和拉拔強(qiáng)度,以測(cè)定構(gòu)建體在某些臨床位置內(nèi)的縫合性。使用用于血管移植假體的美國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)出版物(Instruments,1986)中所述方法,使用Mini-Bionex858測(cè)試系統(tǒng)(MTSsystemsCorporation,Minneapolis,Minn.)效'J量笫21天取得的人真皮基質(zhì)的縫合保留強(qiáng)度。對(duì)于實(shí)施例1的樣片(細(xì)胞-基質(zhì)構(gòu)建體),測(cè)得的拉伸強(qiáng)度為365N/m;根據(jù)實(shí)施例2制備的樣品(具有角化細(xì)胞層的細(xì)胞-基質(zhì)構(gòu)建體),拉伸強(qiáng)度為2720N/m。根據(jù)實(shí)施例1制備的樣品的縫合保留強(qiáng)度為0.14N;根據(jù)實(shí)施例2制備的樣品的縫合保留強(qiáng)度為0.22N。已經(jīng)根據(jù)實(shí)施例1、2和3所述制造了直徑為24毫米和75毫米的構(gòu)建體。通過所有三種方法的培養(yǎng)技術(shù)制造的構(gòu)建體是內(nèi)聚性的組織樣結(jié)構(gòu),其使用最小的力即可從膜上被容易地剝離,因此是"可剝離的",并且能夠經(jīng)歷使用所需的物理操作和操縱而不發(fā)生損壞。實(shí)施例15:在化學(xué)上成分確定的培養(yǎng)基中通過人新生兒包皮成纖維細(xì)胞體外形成膠原基質(zhì)使用實(shí)施例1所述過程將人新生兒包皮成纖維細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增。然后將細(xì)胞懸浮達(dá)到3xl()S個(gè)細(xì)胞/毫升的濃度,并以3.0xl()S個(gè)細(xì)胞/總重量(6.6xl()S個(gè)細(xì)胞/cm"的密度接種到在六孔托盤內(nèi)的0.4微米孔徑、24毫米直徑的組織培養(yǎng)治療膜插入物上。在本實(shí)施例中的細(xì)胞自始自終都在化學(xué)上成分確定的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。培養(yǎng)基組成如下DMEM和HamsF-12培養(yǎng)基(QualityBiologies,Gaithersburg,MD)的3:1的基礎(chǔ)混合物,補(bǔ)充有4mMGlutaMAX(GibcoBRL,GrandIsland,NY)和添加劑5ng/ml人重組表皮生長(zhǎng)因子(UpstateBiotechnology,LakePlacid,NY),lx10—4M乙醇胺(Fluka,Ronkonkoma,NYcat.#02400ACS級(jí)),1x10—4Mo-磷?;?乙醇胺(Sigma,St.Louis,MO),5|ug/ml鐵傳遞蛋白(Sigma,St.Louis,MO),20pM三碘曱腺原氨酸(Sigma,St.Louis,MO),和6.78ng/ml石西(SigmaAldrichFineChemicalsCompany,Milwaukee,WI),50ng/mlL國(guó)抗壞血酸(WAKOChemicalsUSA,Inc.),0.2pg/mlL-脯氨酸(Sigma,St.Louis,MO),0.1|ug/ml甘氨酸(Sigma:St.Louis,MO)。在各不相同的條件下向上述的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入其它組分1.5|ug/ml胰島素(Sigma,StLouis,MO),0.4|ug/ml氫化可的松(Sigma,StLouis,MO),0.05%聚乙二醇(PEG)(Sigma,St.Louis,54MO)。2.5|Lig/ml胰島素(Sigma,St.Louis,MO),0.4|ug/ml氫化可的松(Sigma,St.Louis,MO)。3.375jag/ml胰島素(Sigma,StLouis,MO),6|ug/ml氫化可的松(Sigma,St.Louis,MO)。樣片用福爾馬林固定并加工用于蘇木精和曙紅染色,用于光學(xué)顯微鏡分析。可視組織學(xué)評(píng)價(jià)證明了缺乏PEG的條件2表現(xiàn)出與含有PEG的條件l相似的基質(zhì)。測(cè)量構(gòu)建體的膠原蛋白含量的生化分析表明在條件1和條件2下具有幾乎相同量的膠原蛋白對(duì)于含有PEG的條件1為168.7±7.98|ug/cm2,對(duì)于不含PEG的條件2為170.88±9.07)iig/cm2。含有高水平的胰島素和氬化可的松的條件3表現(xiàn)出基質(zhì)(包括膠原蛋白)的更高表達(dá),在比其它兩種條件更早的時(shí)間點(diǎn)發(fā)生。除了內(nèi)源性產(chǎn)生的原纖維膠原蛋白之外,核心蛋白聚糖和糖胺聚糖也存在于所有條件下的細(xì)胞-基質(zhì)構(gòu)建體中。通過本實(shí)施例的條件2的方法形成的培養(yǎng)真皮構(gòu)建體如圖2所示。圖2表示在化學(xué)上成分確定的培養(yǎng)基內(nèi)從培養(yǎng)的人真皮成纖維細(xì)胞形成的第21天的細(xì)胞-基質(zhì)構(gòu)建體的被固定并用石蠟包埋的蘇木精-曙紅染色切片的顯微照片。多孔膜作為構(gòu)建體下方的薄的半透明帶出現(xiàn),并且能夠看出細(xì)胞在該膜的表面上生長(zhǎng),并且未4皮基質(zhì)包封從而與膜成一體。圖3表示通過本實(shí)施例的條件2的方法形成的第21天的培養(yǎng)真皮構(gòu)建體的兩個(gè)放大倍數(shù)下的透射電子顯微鏡(TEM)圖象。圖3A是表示在成纖維細(xì)胞之間內(nèi)源性膠原纖維的校準(zhǔn)的7600X放大倍數(shù)。圖3B是表明原纖維排列和組裝的完全形成的內(nèi)源性膠原纖維的19000X放大倍數(shù)。在本實(shí)施例的所有條件下,形成的培養(yǎng)真皮構(gòu)建體包括真皮成纖維細(xì)胞和內(nèi)源性產(chǎn)生的基質(zhì)。所有都在細(xì)胞之間排列的堆積基體組成中具有完全形成的膠原原纖維。它們的纖維性品質(zhì)、厚度和內(nèi)聚一體性賦予構(gòu)建體以顯著的強(qiáng)度,從而允許其可按照原樣從培養(yǎng)膜被剝離取下和進(jìn)行處理,被轉(zhuǎn)移到要用構(gòu)建體治療的患者中,諸如在移植或植入時(shí)。實(shí)施例16:全厚度皮膚構(gòu)建體使用根據(jù)上述實(shí)施例15中所述的條件2(無PEG)的方法在化學(xué)上成分確定的條件下從人真皮成纖維細(xì)胞形成的第21天的真皮構(gòu)建體,在形成皮膚構(gòu)建體的表皮層。從培養(yǎng)插入物及其周圍無菌地除去培養(yǎng)基。正常人表皮角化細(xì)胞從冷凍傳代培養(yǎng)細(xì)胞原液經(jīng)過擴(kuò)大到第4代達(dá)到鋪滿。然后使用胰蛋白酶-乙二胺四乙酸使細(xì)胞從培養(yǎng)皿中釋放,匯集,離心以形成細(xì)胞小球,將其再懸浮在表皮形成培養(yǎng)基中,計(jì)數(shù),并以4.5xl(^個(gè)細(xì)胞/cm2的密度接種到膜的上表明上。然后將構(gòu)建體在37士rC,10%C02條件下培養(yǎng)90分鐘以允許角化細(xì)胞附著。培養(yǎng)后,將構(gòu)建體浸沒在表皮形成培養(yǎng)基中。表皮形成培養(yǎng)基組成為Dulbecco氏改進(jìn)的伊格爾培養(yǎng)基(DMEM)(不含葡萄糖和4丐,BioWhittaker,Walkersville,MD)和HamsF-12培養(yǎng)基(QualityBiologiesGaithersburg,MD)的3:1的基礎(chǔ)混合物,補(bǔ)充有0.4|ug/ml氫化可的松(SigmaSt.Louis,MO),lxl(T4M乙醇胺(Fluka,Ronkonkoma,NY),lxl0國(guó)4Mo-磷酰基-乙醇胺(Sigma,St.Louis,MO),5|ug/ml胰島素(Sigma,St.Louis,MO),5|iig/ml鐵傳遞蛋白(Sigma,St.Louis,MO),20pM三碘曱腺原氨酸(Sigma,StLouis,MO),6.78ng/ml竭(Aldrich),24.4)ug/ml腺嘌p令(SigmaAldrichFineChemicalsCompany,Milwaukee,WI),4mML-谷氨酰胺(BioWhittaker,Walkersville,MD),50|ug/mlL-抗壞血酸鈉鹽(SigmaAldrichFineChemicalsCompany,Milwaukee,WI),16亞油酸(Sigma,St.Louis,MO),1|uM乙酸生育酚(Sigma,St.Louis,MO)和50jug/ml硫酸慶大霉素(Amersham,ArlingtonHeights,IL)。構(gòu)建體在表皮形成培養(yǎng)基中在37±1°C,10±1%C02條件下培養(yǎng)2天。2天后,使用具有如上所述組成的新鮮的培養(yǎng)基更換培養(yǎng)基,并且送返回設(shè)定在37土1。C,10±1%。02的培養(yǎng)箱中持續(xù)2天。2天后,將含有構(gòu)建體的載體無菌地轉(zhuǎn)移到具有足夠培養(yǎng)基以實(shí)現(xiàn)液面剛好達(dá)到載體膜的表面的新的培養(yǎng)托盤中以保持在氣-液界面發(fā)育。在正在形成的表皮層上表面的空氣接觸允許上皮層的分層。構(gòu)建體在37士rC,10%CO2和低濕度條件下在培養(yǎng)基中培養(yǎng)持續(xù)7天,每2-3天更換培養(yǎng)基。該培養(yǎng)基含有Dulbecco氏改進(jìn)的伊格爾培養(yǎng)基(DMEM)(不含葡萄糖和鈣,BioWhittaker,Walkersville,MD)和HamsF-12培養(yǎng)基(QualityBiologies,Gaithersburg,MD)的1:1的混合物,補(bǔ)充有0.4jig/ml氬化可的松(Sigma,St.Louis,MO),5xl0-4M乙醇胺(Fluka,Ronkonkoma,NY),5><10-4Mo-磷?;?yáng)乙醇胺(Sigma,St.Louis,MO),5|ug/ml胰島素(Sigma,StLouis,MO),5|ug/ml鐵傳遞蛋白(Sigma,StLouis,MO),20pM三碘甲腺原氨酸(Sigma,StLouis,MO),6.78ng/ml硒(SigmaAldrichFineChemicalsCompany),24.4jug/ml腺噪呤(SigmaAldrichFineChemicalsCompany),4mML畫谷氨酰胺(BioWhittaker,Walkersville,MD),2.65|ug/ml氯化鈣(Mallinckrodt,Chesterfield,MO),16亞油酉交(Sigma,St.Louis,MO),1|uM乙酸生育酚(Sigma,St.Louis,MO),1.25mM絲氨酸(Sigma,St.Louis,MO),0.64mM氯化膽堿(Sigma,St.Louis,MO)和50|ug/ml硫酸慶大霉素(Amersham,ArlingtonHeights,IL)。培養(yǎng)物每2-3天被供應(yīng),持續(xù)14天。在構(gòu)建體被提高到氣-液界面后提交在第10、12和14天的一式三份的樣品用于如實(shí)施例1所述的蘇木精和曙紅染色,以通過光學(xué)顯微術(shù)確定大體外觀。得到的構(gòu)建體是雙層皮膚構(gòu)建體,其由^皮基質(zhì)包圍的真皮成纖維細(xì)胞形成的下層真皮層和其上覆蓋的分層和分化的角化細(xì)胞的上層表皮層組成。本實(shí)施例的雙層皮膚構(gòu)建體如圖4所示。圖4是在不含外源性基質(zhì)組分的條件下在化學(xué)上成分確定的培養(yǎng)基中形成的培養(yǎng)皮膚構(gòu)建體的被固定并用石蠟包埋的蘇木精-曙紅染色切片的顯微照片,成纖維細(xì)力形成的細(xì)胞-基質(zhì)構(gòu)建體,其具有在化I上1分確定的培養(yǎng)基中從培養(yǎng)人角化細(xì)胞形成的多層的分化表皮。實(shí)施例17:通過人面頰成纖維細(xì)胞形成膠原基質(zhì)本實(shí)驗(yàn)的目的是從人頰組織分離的面頰成纖維細(xì)胞制造細(xì)胞-基質(zhì)構(gòu)建體。頰細(xì)胞在T-150燒瓶?jī)?nèi)在含10%NBCS的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)。7天后,為了進(jìn)一步擴(kuò)增細(xì)胞數(shù)目,收獲頰細(xì)胞并以4.0xl()S個(gè)細(xì)胞在含10%NBCS的DMEM培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)到9個(gè)T-150燒瓶中并進(jìn)行培養(yǎng)直到在收獲細(xì)胞時(shí)達(dá)到鋪滿。為了收獲細(xì)胞,從培養(yǎng)瓶吸出培養(yǎng)基。為了漂洗單層,向每個(gè)培養(yǎng)瓶的底部加入經(jīng)過無菌過濾的磷酸鹽緩沖鹽水,然后從燒瓶中吸出該磷酸鹽緩沖鹽水。通過向每個(gè)燒瓶中加入5mL的胰蛋白酶-乙二胺四乙酸谷氨酰胺(BioWhittaker,Walkersville,MD)并溫和地?fù)u動(dòng)以確保該單層57面積的完整使細(xì)胞釋放。將培養(yǎng)物送返回培養(yǎng)箱。當(dāng)細(xì)胞一經(jīng)釋放,向每個(gè)燒瓶加入5ml的SBTI(大豆胰蛋白酶抑制劑)并與懸浮液混合從而使胰蛋白酶-乙二胺四乙酸的作用停止。將細(xì)胞懸浮液從燒瓶中取出并且平均分配在無菌的圓錐形離心管。通過在大約800-1000xg下離心5分鐘收集細(xì)月包。使用新鮮的培養(yǎng)基將細(xì)胞再懸浮達(dá)到3.0x106個(gè)細(xì)胞/毫升的濃度,并以3.0xl(^個(gè)細(xì)胞/插入物(6.6xl0S個(gè)細(xì)胞/cm"的密度接種到在六孔托盤中的0.4微米孔徑、24毫米直徑的組織培養(yǎng)處理插入物(TRANSWELL,CorningCostar)上。細(xì)胞在培養(yǎng)箱中在37土1。C和10±1%C02氣氛下被保持并且供應(yīng)培養(yǎng)基,所述培養(yǎng)基含有DMEM和HamsF-12培養(yǎng)基(QualityBiologies,Gaithersburg,MD)的3:1的基礎(chǔ)混合物,補(bǔ)充有4mMGlutaMAX(GibcoBRL,GrandIsland,NY)和添力。劑5ng/ml人重組表皮生長(zhǎng)因子(UpstateBiotechnology,LakePlacid,NY),0.4|ug/ml氬化可的松(Sigma,St.Louis,MO),Ixl0-4M乙醇胺(Fluka,Ronkonkoma,NYcat.#02400ACS級(jí)),lx10-4Mo-磷?;?乙醇胺(Sigma,St.Louis,MO),5|ug/ml胰島素(Sigma,St.Louis,MO),5fag/ml鐵傳遞蛋白(Sigma,St.Louis,MO),20pM三碘曱腺原氨酸(Sigma,St.Louis,MO),和6.78ng/ml石西(SigmaAldrichFineChemicalsCompany,Milwaukee,WI),50ng/mlL-抗壞血酸(WAKOChemicalsUSA,Inc.),0.2|ug/mlL-脯氨酸(Sigma,St.Louis,MO),0.1|ug/ml甘氨酸(Sigma,St.Louis,MO)和0.05%聚乙二醇(PEG)(Sigma,St.Louis,MO)。接種后第l天,用無血清的生成培養(yǎng)基更換培養(yǎng)基,每2-3天更換培養(yǎng)基,持續(xù)21天。在21天后,將樣品固定在福爾馬林中用于組織學(xué)檢查。三個(gè)樣品用于蛋白質(zhì)和膠原蛋白生成分析。對(duì)于24毫米直徑的構(gòu)建體,在培養(yǎng)21天后每個(gè)構(gòu)建體中的膠原蛋白生成平均為519|ug。對(duì)于24毫米直徑的構(gòu)建體,在培養(yǎng)21天后每個(gè)構(gòu)建體的總蛋白生成平均為210pg。在形態(tài)學(xué)上,頰成纖維細(xì)胞-基質(zhì)構(gòu)建體,作為口腔結(jié)締組織的培養(yǎng)組織構(gòu)建體,表現(xiàn)為物理上祐i質(zhì)包圍的頰成纖維細(xì)胞,該構(gòu)建體具有物理體積和完整性。實(shí)施例18:通過使接種有成纖維細(xì)胞的膠原蛋白網(wǎng)格收縮來制造組織等效材料58粗品膠原蛋白溶液如下制備。將得自450克大鼠的冷凍大鼠尾在70%EtOH中解凍持續(xù)20分鐘。在層流凈化罩中在70%EtOH中切除腱束。將每個(gè)腱從腱鞘中拉出,切碎并置于稀乙酸(1:1,000)中,每個(gè)尾巴使用250毫升稀乙酸。該溶液在4。C放置48小時(shí)。此時(shí),切碎的腱已經(jīng)膨脹以占據(jù)整個(gè)體積。該粘稠溶液在BeckmanL超離心機(jī)中在SW25轉(zhuǎn)子下以23krpm下離心1小時(shí)。抽出上清液并在4。C儲(chǔ)存,作為粗品膠原蛋白溶液(蛋白質(zhì)"C")。精制膠原蛋白溶液如下制備。將粗品膠原蛋白溶液與0.1M的NaOH以6:1的比混合以中和乙酸,此時(shí)膠原蛋白沉淀。該溶液在臨床離心機(jī)中以1500rpm離心5分鐘。棄去上清液,并將等體積的新制備的乙酸(1:1,000)引入以使膠原蛋白再溶解。該溶液在4"C儲(chǔ)存,作為精制膠原蛋白溶液(蛋白質(zhì)"R")。蛋白質(zhì)濃度通過Lowry等的方法測(cè)定。參見,Lowry,O.H.,Rosebrough,N.J.,Farr,N.J.和Randall,R.J.,J.Biol.Chem.,193,265-275(1951),和Waddel,W.丄,J.LabandClin.Med.48,311-314(1956)。在60毫米Falcon細(xì)菌皿中制備蛋白質(zhì)網(wǎng)才各,成纖維細(xì)胞對(duì)該細(xì)菌皿的粘附差。每個(gè)皿含有1.0ml5XMcCoy氏5a培養(yǎng)基,1.0ml胎牛血清,0.25ml0.1MNaOH,1.5ml膠原蛋白溶液,和1.0ml懸浮在IXMcCoy氏培養(yǎng)基的成纖維細(xì)胞。該亞首先用上述體積的McCoy氏培養(yǎng)基、血清和NaOH裝滿,然后放置一邊直到形成了成纖維細(xì)胞混懸液。在同時(shí)加入月交原蛋白溶液和成纖維細(xì)胞時(shí)速度是重要的,以為凝月交立刻開始凝固。將皿置于37。C,5%。02氣氛和100%濕度的培養(yǎng)箱中。結(jié)合成纖維細(xì)胞的凝月交在10分鐘后完全凝固。使用的成纖維細(xì)胞是人包皮成纖維細(xì)胞,1519株,得自N.J的Camden的用于醫(yī)學(xué)研究結(jié)構(gòu)的人基因細(xì)胞保藏中心。這些細(xì)胞在含有20%血清、青霉素和鏈霉素的McCoy氏5a改進(jìn)培養(yǎng)基中生長(zhǎng)和保持。培養(yǎng)物不含枝原體。制備了M.I.T.細(xì)胞培養(yǎng)物核心并冷凍了每十個(gè)的群體倍增水平(PDL)的細(xì)胞。為了測(cè)量網(wǎng)格直徑,將皿置于以黑暗作背景的透明公尺的頂端。通過用白光對(duì)著皿的邊緣照射獲得凝膠邊緣的最佳可見度。收縮的凝膠是充分形成的碟形物;它們?cè)诓煌c(diǎn)的直徑有極微小的差別。取長(zhǎng)軸和短軸的平均值作為直徑。實(shí)施例19:測(cè)量通過成纖維細(xì)胞導(dǎo)致的水合膠原蛋白網(wǎng)格的收縮測(cè)定了根據(jù)實(shí)施例18的過程并含有570)ug/ml的蛋白質(zhì)"C"由7.5><106個(gè)人包皮成纖維細(xì)胞的第19PDL(19thPDL)的1519抹制造的水合膠原蛋白網(wǎng)格的收縮。在第1、4和8天更換該皿內(nèi)的培養(yǎng)基。將獲得的數(shù)據(jù)繪制成圖3,圖2表示在七天內(nèi)網(wǎng)格區(qū)域縮小112倍。在1天內(nèi),區(qū)域收縮7^f咅。實(shí)施例20:具有不同蛋白質(zhì)濃度的水合膠原蛋白網(wǎng)格的收縮在水合膠原蛋白網(wǎng)格中蛋白質(zhì)濃度對(duì)網(wǎng)格收縮的作用如下測(cè)定。根據(jù)實(shí)施例18的過程制備了三個(gè)水合膠原蛋白網(wǎng)格,不同之處在于各自含有不同濃度的蛋白質(zhì)"R"。使用人包皮成纖維細(xì)胞株1519(第19PDL),并且在第4天更換培養(yǎng)基。將得到的數(shù)據(jù)繪制成圖4,在圖4中能夠看出網(wǎng)格收縮率與凝膠蛋白質(zhì)濃度成反比。網(wǎng)格區(qū)域隨著時(shí)間的推移而縮小。實(shí)施例21:細(xì)胞數(shù)目對(duì)水合膠原蛋白網(wǎng)格收縮的作用細(xì)胞數(shù)目對(duì)水合膠原蛋白網(wǎng)格收縮的作用如下測(cè)定。根據(jù)實(shí)施例18的過程制備了許多含有720pg/ml的蛋白質(zhì)"R"的水合膠原蛋白網(wǎng)格。使用了人包皮成纖維細(xì)胞抹1519,并且在第3、7和10天更換每個(gè)培養(yǎng)物中的培養(yǎng)基。使用沒有加入細(xì)胞的對(duì)照。另外,進(jìn)行了四個(gè)系列的實(shí)驗(yàn),其中加入不同數(shù)目的細(xì)胞。將得到的數(shù)據(jù)繪制成圖5,在圖5中每個(gè)點(diǎn)表示三個(gè)或四個(gè)網(wǎng)格收縮的平均值。偏差未顯示,因?yàn)樗鼈兌挤浅P?(<.+-丄0mm)??梢钥闯?,細(xì)胞數(shù)目確實(shí)對(duì)基質(zhì)收縮率有影響,但是這種收縮差異作為時(shí)間的函數(shù)變得不那么顯著。對(duì)于高于一些最小值的濃度而言,網(wǎng)格直徑接近共同的較小值。在最小值以下,基質(zhì)收縮率和細(xì)胞數(shù)目之間的關(guān)系明顯是非線性的。具有8.1xl(^個(gè)細(xì)胞的基質(zhì)在24小時(shí)內(nèi)不發(fā)生收縮。在整個(gè)試驗(yàn)期間,這些細(xì)胞稀少的基質(zhì)比細(xì)胞較稠密的網(wǎng)格滯后很多。60實(shí)施例22:具有不同PDL的細(xì)胞的水合膠原蛋白網(wǎng)格的收縮能力如下測(cè)定了具有不同的群體倍增水平(PDL)的細(xì)胞(經(jīng)歷不同的細(xì)胞分裂次數(shù)的細(xì)胞)的水合膠原蛋白網(wǎng)格的收縮能力。制備了培養(yǎng)物,其從根據(jù)實(shí)施例18的過程并且含有720lug/ml蛋白質(zhì)"R"制備的由水合膠原蛋白網(wǎng)格形成。在第3、7和10天更換培養(yǎng)基。對(duì)照培養(yǎng)物不含細(xì)胞。另外,進(jìn)行了一系列使用具有不同PDL的細(xì)胞的試驗(yàn)。將收集的數(shù)據(jù)繪制成圖5,在圖5中每個(gè)點(diǎn)表示三個(gè)或四個(gè)基質(zhì)收縮的平均值。偏差〈.十-.1.0mm。能夠看出,第35PDL(35thPDL)的細(xì)胞與第19PDL的細(xì)胞相似,但是第50PDL(50thPDL)的細(xì)胞不能以相稱的速率使網(wǎng)格收縮。實(shí)施例23:細(xì)胞松弛素B對(duì)細(xì)胞收縮水合膠原蛋白網(wǎng)格的能力的作用如下測(cè)定抑制劑細(xì)胞松弛素B對(duì)細(xì)胞收縮水合膠原蛋白網(wǎng)格的能力的作用。根據(jù)實(shí)施例18制備水合膠原蛋白網(wǎng)格,其含有含量為570pg/ml的蛋白質(zhì)"C"。在培養(yǎng)物中的成纖維細(xì)胞(人包皮,1519抹,第19PDL)細(xì)胞濃度是5.0x105。向每個(gè)培養(yǎng)物中加入10.0|ug/ml的細(xì)胞松弛素B,并且在第4和8天更換培養(yǎng)基。將得到的數(shù)據(jù)繪制成圖6,并且可以看出,這一濃度的細(xì)胞松弛素B完全阻斷基質(zhì)收縮,即使在使用比較高的細(xì)胞濃度條件下也是如此。實(shí)施例24:秋水仙酰胺對(duì)膠原蛋白網(wǎng)4M史縮的作用抑制劑秋水仙酰胺對(duì)蛋白質(zhì)基質(zhì)收縮的作用如下測(cè)定。根據(jù)實(shí)施例18的過程并含有570貼/ml的蛋白質(zhì)"C"制備了含有水合膠原蛋白網(wǎng)格的培養(yǎng)物。向每個(gè)培養(yǎng)物中加入0.36|ug/ml的秋水仙酰胺,除了對(duì)照不含秋水仙酰胺之外。向試-瞼培養(yǎng)物和對(duì)照培養(yǎng)物中都加入相同數(shù)目的細(xì)胞,將得到的數(shù)據(jù)繪制成圖7??梢钥闯?,第45PDL(45thPDL)細(xì)胞優(yōu)于第19PDL細(xì)胞的性能,而第45PDL的未經(jīng)處理的細(xì)胞落后于第19PDL未經(jīng)處理的細(xì)胞。顯然秋水仙酰胺可用于調(diào)節(jié)基質(zhì)的收縮率和收縮程度。實(shí)施例25:阿糖月包苦對(duì)由不同PDL的細(xì)胞引起的61膠原蛋白基質(zhì)收縮的作用。如下檢測(cè)1.0ng/ml的阿糖胞苷對(duì)不同PDL水平的細(xì)胞的蛋白質(zhì)基質(zhì)收縮作用。制備了含有濃度為570pg/ml的蛋白質(zhì)"C"的水合膠原蛋白網(wǎng)格的培養(yǎng)物。將第19PDL和第47PDL(47thPDL)的人包皮成纖維細(xì)胞林1519加入到不含阿糖胞苷的對(duì)照培養(yǎng)物和包含阿糖胞苷的試驗(yàn)對(duì)照培養(yǎng)物中。將得到的數(shù)據(jù)繪制成圖8,在圖8中能夠看出第47PDL細(xì)胞優(yōu)于較低PDL的細(xì)胞,即使它們總數(shù)較少。在這些實(shí)驗(yàn)中,阿糖胞苷用來阻斷DNA合成并從而保持網(wǎng)格中的細(xì)胞數(shù)目恒定。實(shí)施例26:采用人包皮成纖維細(xì)胞和角化細(xì)胞形成皮膚等效材料根據(jù)實(shí)施例18的過程并含有500pg/ml的蛋白質(zhì)"C"制備水合膠原蛋白網(wǎng)格。用EDTA和胰蛋白酶的溶液將在活體中獲得的人包皮成纖維細(xì)胞從培養(yǎng)板上取下。將單細(xì)胞懸浮液離心形成細(xì)胞小球,之后將細(xì)胞再懸浮在培養(yǎng)基中,然后在已經(jīng)引入成纖維細(xì)胞后將其沉積到水合膠原蛋白基質(zhì)的上表面上持續(xù)7天。3天內(nèi),角化細(xì)胞已經(jīng)附著于網(wǎng)格底物上,并且角質(zhì)化過程開始導(dǎo)致形成不透性的膠質(zhì)層。通過電子顯微鏡檢查進(jìn)行組織學(xué)觀察。實(shí)施例27:采用豚鼠皮膚成纖維細(xì)胞和角化細(xì)胞的皮膚等效材料的體內(nèi)研究從豚鼠取得皮膚活組織并且手術(shù)從表皮上分離出真皮。將真皮酶促分解成構(gòu)成型細(xì)胞,將其鋪板在組織培養(yǎng)皿上并使其經(jīng)歷增殖。將得自各實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的細(xì)胞在單獨(dú)的培養(yǎng)皿中生長(zhǎng),使得它們的同一性得以保持。根據(jù)實(shí)施例18的過程但是不使用得自豚鼠的成纖維細(xì)胞形成收縮的水合膠原蛋白網(wǎng)格制造組織。一些網(wǎng)格在收縮后根據(jù)實(shí)施例26用得自第二活體解剖的表皮細(xì)胞或者角化細(xì)胞鋪板,從而使得在每個(gè)移植物中的角化細(xì)胞以及成纖維細(xì)胞來自將變?yōu)橐浦参锝邮苷叩膭?dòng)物。將這些皮膚等效材料移植到實(shí)驗(yàn)動(dòng)物(豚鼠)的背部,并且發(fā)現(xiàn)這種移植物在1周內(nèi)在所有水平下都完全一體化。之后,它們出現(xiàn)新血管形成;在真皮水平,移植物的膠原原纖維與圍繞宿主組織的膠原原纖維混雜。在組織切片中,移植物的區(qū)別之處在于,通過偏光顯微鏡觀察,與其周圍皮膚相比,移植物具有高的成纖維細(xì)胞密度并且雙折射程度降蓋,許多細(xì)胞深入。該層與鄰接的宿主皮膚層相連。還很清楚的是皮膚傷口收縮通過皮膚等效材料的存在被移植,與當(dāng)進(jìn)行自體移植時(shí)的一樣。實(shí)施例28:采用大鼠皮膚成纖維細(xì)胞、真皮和表皮細(xì)胞的皮膚等效材料的體內(nèi)研究皮膚等效材料的形成將得自潛在的移植接受者的小型活體解剖物切割成1.0mm2的碎片。從碎片中得到成纖維細(xì)胞并且在Lux組織培養(yǎng)皿上繁殖,在4-7天后,除去碎片并棄去或被轉(zhuǎn)移到新板中。在一個(gè)或多個(gè)板上的細(xì)胞被允許繁殖直到它們幾乎鋪滿,此時(shí),通過用胰蛋白酶處理取得細(xì)胞,洗滌,并在組織培養(yǎng)瓶中繁殖。每平方厘米皮膚等效材料需要約5xl(^個(gè)細(xì)胞,并且通過使用胰蛋白酶使其從底物中釋放而獲得適當(dāng)數(shù)目的細(xì)胞,之后,將它們懸浮并與膠原蛋白溶液、大鼠血清和組織培養(yǎng)基結(jié)合。通過在0.02M乙酸中提取大鼠尾腱并離心純化獲得膠原蛋白。當(dāng)在酸性pH和1.5mg/ml蛋白質(zhì)濃度下保持時(shí),膠原蛋白是粘性的微乳白色溶液。其只由I型膠原蛋白組成,通過SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)不到污染蛋白質(zhì)。此時(shí),月交原蛋白與細(xì)胞及其他成分組合,用NaOH調(diào)節(jié)pH到7.2,這引起膠原蛋白從溶液中以原纖維形式析出。當(dāng)發(fā)生這種現(xiàn)象時(shí),形成了其中截留有液體的凝膠或網(wǎng)格。網(wǎng)格中的細(xì)胞在不同程度上均勻分布在其中。通過細(xì)胞的膠原原纖維的活性壓實(shí)過程,網(wǎng)格變成牢固性一致的組織。結(jié)果是喪失截留液體,并且原始網(wǎng)格的體積縮小多倍。得到了構(gòu)成皮膚等效材料(DE)的組織。附加的表皮通過胰蛋白酶從活體解剖碎片中解離出表皮細(xì)胞,將其作為懸浮液形式分配到皮膚等效材料上。2-4天內(nèi),表皮細(xì)胞形成覆蓋皮膚底層的連續(xù)片狀物。在此期間,鋪滿的細(xì)胞片狀物開始分化。細(xì)胞橋粒連接、張力絲和透明角質(zhì)粒是明顯的,并且進(jìn)行的角質(zhì)化過程導(dǎo)致形成不透水的底部角質(zhì)層。如果允許可在DE上體外進(jìn)行整個(gè)過程。然而,在本研究中,認(rèn)為一旦表皮細(xì)胞形成鋪滿片狀物(其充當(dāng)皮膚等效材料(SE))時(shí)活的雙層組織即可用于移植。將皮膚等效材料移植到許多大鼠上,得到以下結(jié)果。首先,在移植后3-5天,移植物開始發(fā)生血管形成并且迅速地進(jìn)行,沒有發(fā)生壞死或者缺血。其次,極少例外地,被抑制的移植物將收縮。當(dāng)制造移植物時(shí),與移植物鄰接的正常皮膚的周邊^(qū)L刺紋(tatoo)以標(biāo)記移植物的界限,其是能夠隨著時(shí)間檢測(cè)移植物大小的過程。傷口收縮被抑制的例外情況應(yīng)歸于皮膚等效材料被表皮最初覆蓋不充分,使得移植物由于動(dòng)物的原因而發(fā)生移位,或者應(yīng)歸于形成了不適當(dāng)?shù)木W(wǎng)格,其隨使用的collen制劑的質(zhì)量而變。在繃帶被取下(9-14天)時(shí)檢查31個(gè)這種移植物的研究中,7個(gè)完全抑制傷口收縮,15個(gè)阻斷收縮達(dá)75%以上,23個(gè)阻斷達(dá)50%以上。在關(guān)于52個(gè)移植物的另一個(gè)研究中,在移植物的至少75-80%中阻斷傷口收縮。盡管許多移植物顯示了隨著時(shí)間其尺寸縮小,但是大部分經(jīng)過第60天時(shí)仍是穩(wěn)定的并且沒有排斥發(fā)生。具有良好表皮覆蓋的大尺寸(約8xl2cm)的移植物有效阻斷傷口收縮(75%以上)并且當(dāng)置換燒傷皮膚時(shí)可良好地纟皮取得。移植物長(zhǎng)久保持,最長(zhǎng)在位時(shí)間超過2年。除了血管形成充分之外,皮膚等效材料的基質(zhì)在移植后的頭幾個(gè)月經(jīng)歷顯著的重塑。其結(jié)構(gòu)變化通過檢查組織切片的雙折射程度進(jìn)行研究,從組織切片的雙折射明顯可見,基質(zhì)在移植后一周表現(xiàn)出雙折射,該現(xiàn)象在相比時(shí)期內(nèi)的肉芽組織中觀察不到。盡管雙折射的強(qiáng)度隨時(shí)間而增加,但是其^^各局通常不是正常真皮的方平組織構(gòu)造特點(diǎn)之一。然而,到達(dá)10周時(shí),在移才直物與正常組織相遇的漸變區(qū)域內(nèi),方平組織才各局開始形成。在體內(nèi),表皮過度生長(zhǎng),并且,甚至在移植后十周,顯著厚于鄰近的正常組織??梢娚酄钗锘蛘咚钗?pegs)或者表皮穿透皮膚等效材料。外表上,經(jīng)過幾個(gè)月時(shí)間,表皮稍微呈鱗狀,并且移植物具有略帶紅色的淺粉色。經(jīng)過大約三個(gè)月,移植物變得光滑并且呈粉紅色,在顏色方面類似于大白鼠的正常皮膚的顏色,但是沒有毛發(fā)。多鱗程度持續(xù)甚至達(dá)七個(gè)月,這可歸因于皮脂腺的缺乏。64實(shí)施例29:膠原蛋白網(wǎng)格通過血小板而收縮制造組織等效材料過時(shí)血小板濃縮物得自Mass.的Boston的紅十字血液中心。大鼠和豬的尾腱膠原蛋白根據(jù)實(shí)施例18所述被提??;豬皮膠原蛋白由波士頓的Shriners'BumsInstitute的PaulEhrlich博士提供;telogen,一種牛膠原蛋白,得自加利福尼亞州的PaloAlto的CollagenCorporation膠原蛋白濃度測(cè)定使用Waddel的方法的改進(jìn)法進(jìn)行。參見,Waddel,W.J.,J.LabandClin.Med.48,311-14(1956)。使用下式|ig/ml=0.D.215-O.D.225/64.6。將得自RedCross的血小板濃縮物濃縮到60x,并通過以500rpm在使用253轉(zhuǎn)子的IECPR-2離心機(jī)中在4°C離心50分鐘被進(jìn)一步濃縮以除去紅細(xì)胞。然后使用相同的轉(zhuǎn)子將上清液以1500rpm離心另外的50分鐘以濃縮血小板。取出上清液并用于將獲得的血小板小球再懸浮。絕對(duì)血小板濃度根據(jù)供體血液中血小板濃度的不同而在實(shí)驗(yàn)之間有差別,品或合并的樣本。lx的血小板濃度等于在1.0毫升血液中的血小板濃度。通過按次序合并以下物質(zhì)而鑄造血小板網(wǎng)格2.3mlDMEM1.76x培養(yǎng)基(FlowLaboratories),1.5ml大鼠尾腱膠原蛋白,0.25ml0.1NNaOH(中和膠原蛋白所需的NaOH的濃度根據(jù)所使用的膠原蛋白制劑的酸性多少不同),和0.45mlFBS(FlowLabomtories)。將該混合物傾入到60毫米的Falcon0007培養(yǎng)亞中,該培養(yǎng)皿已經(jīng)在其表面上滴加了幾滴0.5ml的5x血小板濃縮物。作為替代,將所有成分在單獨(dú)的容器中混合并傾入到空的培養(yǎng)皿中。得到的網(wǎng)格在37。C,90%空氣/10%(:02氣氛和100%濕度下培養(yǎng)。網(wǎng)格厚度通過增加或減少鑄造的總網(wǎng)格體積來控制。在作為鑄造過程的函數(shù)的網(wǎng)格收縮速率方面沒有觀察到差異。首先將被網(wǎng)格釋放的液體汲取到1毫升移液管中,之后汲取到更大的移液管中,然后記錄汲取液體的體積,之后將汲取的液體送返回皿中測(cè)定收縮率。每小時(shí)重復(fù)進(jìn)行這些測(cè)量,直到網(wǎng)格最大限度地收縮。在這些具有l(wèi)x或更低的血小板濃度的網(wǎng)格中,首先使用精細(xì)解剖刀使網(wǎng)格邊緣先離開亞,從而釋放在網(wǎng)格下方被截留的液體用于測(cè)量。因?yàn)榫W(wǎng)格當(dāng)被撕破時(shí)將釋放另外的液體,小心地防止網(wǎng)格被破壞,從而獲得僅僅通過血小板收縮而被釋放的液體的測(cè)量值。還進(jìn)行了旨在測(cè)定添加凝血酶(SigmaChemicals)的效果的實(shí)驗(yàn),通過在加入混合的DMEM膠原蛋65白、NaOH和FBS之前在培養(yǎng)亞上以不連續(xù)的小滴點(diǎn)樣凝血酶和血小板濃縮物進(jìn)行。圖9是獲得的數(shù)據(jù)的圖表,其說明了凝血酶對(duì)血小板導(dǎo)致的膠原蛋白網(wǎng)格收縮的作用,凝血酶濃度是4.0單位/毫升。圖10是說明網(wǎng)格收縮-血小板濃度的曲線,凝血酶的存在濃度是4.0單位/ml。能夠看出,反應(yīng)非常迅速。在lx的血小板濃度下,在鑄造網(wǎng)格后的三小時(shí)釋放總液體的80-90%。經(jīng)過六個(gè)小時(shí),反應(yīng)基本上完成并且獲得平衡;也就是說,在100%的濕度條件下不再觀察到液體釋放。此時(shí),最初液體體積的20-80%已從網(wǎng)格被排出,精確的量根據(jù)血小板和膠原蛋白濃度以及其它的鑄造培養(yǎng)基變量的不同而異。血小板網(wǎng)格收縮過程導(dǎo)致形成的組織等效材料同在沒有血小板條件下鑄造的膠原蛋白網(wǎng)格的組織等效材料相比具有比較高的拉伸強(qiáng)度。當(dāng)將凝血酶引入到具有足夠數(shù)目的血小板的鑄造混合物中時(shí),組織等效材料更迅速地形成,如圖2所示。含有凝血酶的組織等效材料具有的性質(zhì)多少不同于在沒有凝血酶條件下鑄造的組織等效材料的性質(zhì),其拉伸強(qiáng)度稍微低并且其流體含量較低。通過在鑄造后將克重系在組織等效材料上并煩'J量斷裂時(shí)間來測(cè)量拉伸強(qiáng)度。血小板網(wǎng)格的收縮率與血小板濃度有關(guān)。血小板濃度的增加加速了網(wǎng);^各收縮率,并導(dǎo)致網(wǎng)才各成比例地具有更少的液體,這可參見圖10。實(shí)施例30:蛋白質(zhì)的濃度和類型對(duì)血小板引起的收縮的影響蛋白質(zhì)的濃度和來源對(duì)血小板引起的網(wǎng)格收縮的作用通過采用得自不同來源的膠原蛋白以不同濃度測(cè)定,但是在別的方面遵循實(shí)施例29的過程。得到的數(shù)據(jù)繪制成圖11A-11D。能夠看出,鑄造培養(yǎng)基的膠原蛋白含量的增加會(huì)降低收縮率和液體排出量。這些結(jié)果通常與當(dāng)使用成纖維細(xì)胞作為收縮劑時(shí)獲得的那些相對(duì)應(yīng)。采用的得自四個(gè)不同來源的膠原蛋白的作用相似,只是telogen表現(xiàn)出比來自其它三個(gè)來源的膠原蛋白顯著更低的抗收縮性。實(shí)施例31:抑制劑細(xì)胞松弛素B和秋水仙酰胺對(duì)血小板引起的膠原蛋白網(wǎng)格收縮的影響抑制劑細(xì)胞松弛素B和秋水仙酰胺對(duì)血小板收縮水合膠原蛋白網(wǎng)格的能力的影響根據(jù)實(shí)施例29的一般過程進(jìn)行,除了以下不同將細(xì)胞松弛素B(SigmaChemicals)和秋水仙酰胺(CIBAPharmaceuticalCompany)直接加入到濃的DMEM培養(yǎng)基中,得到的最終濃度分別為在5毫升網(wǎng)格中為10|ug/ml和0.5|iig/ml。將得到的數(shù)據(jù)繪制成圖12。能夠看出,在細(xì)胞松弛素B存在條件下用血小板鑄造的網(wǎng)格不能收縮。另一方面,秋水仙酰胺對(duì)網(wǎng)格收縮無明顯影響;這是可被預(yù)料的,因?yàn)橐阎锼甚0穼?duì)人血小板使纖維蛋白凝塊收縮的能力沒有影響。另一方面,細(xì)胞松弛素B使血小板的盤形狀穩(wěn)定并防止形成變形足。實(shí)施例32:兔移植物通過血小板收縮從水合膠原蛋白網(wǎng)格形成的并適于移植到兔耳上的組織等效材料如下制備。通過耳刺扎從潛在的移植接受者取得的10毫升的兔血中收集血小板,并如實(shí)施例29所述通過差速離心進(jìn)行濃縮。也根據(jù)實(shí)施例29的過程鑄造兔血小板凝膠。收縮后,根據(jù)實(shí)施例28的過程,用得自相同兔的活體的表皮細(xì)胞對(duì)網(wǎng)格接種。通過剪去被麻醉兔的移植部位的毛發(fā)用于準(zhǔn)備移植。畫出移植床的輪廓,將刺紋標(biāo)記置于剛剛位于輪廓周邊的外側(cè)。該部位用70%的乙醇洗滌,并且除去下方所有的組織直到覆蓋軟骨的筋膜。從皿中取得組織等效材料并置于移植床上,移植物的邊緣稍微重疊移植床的邊緣。移植物用公認(rèn)安全的薄紗覆蓋,所述薄紗通過用凡士林浸漬Telfa墊制得。將浸泡在Earle氏鹽溶液中的Telfa墊置于公認(rèn)安全的薄紗上方。在耳朵包扎。為了預(yù)防兔使繃帶發(fā)生移動(dòng),、將兩只耳用三英寸;性塑料綁在二起。移植七天后除去繃帶。為兔配備Elizabethan領(lǐng)以防止擦傷持續(xù)另外兩天。從兔耳切除作為一整片的移植區(qū)和正常皮膚邊緣,并浸沒在位于0.03M磷酸鹽緩沖液中的10%福爾馬林中。將皮膚固定過夜,用蒸餾水漂洗,用乙醇脫水,在醋酸戊酯中清洗,然后用曱苯清洗,并包埋到Pamplastt中。使用輪轉(zhuǎn)切片機(jī)切割出七微米的切片,并將這些切片用蘇木精和曙紅染色。在所有的實(shí)驗(yàn)中移植物被接受并且抑制了傷口收縮。大體上,移植物比周圍皮膚更蒼白,表面略微呈鱗狀并且沒有毛發(fā)。甚至在6周后,在中心還殘留有小痂。對(duì)布置在位達(dá)六周的移植物部分地進(jìn)行了組織學(xué)檢查,以確定移植物被周圍組織的成纖維細(xì)胞滲透的程度。移植物中成纖維細(xì)胞的密度顯著大于鄰近組織中成纖維細(xì)胞的密度。通過在光學(xué)顯微鏡下觀察到雙折射水平降低而使移植物與周圍組織區(qū)別開來。移植物中的血管形成似乎高于鄰近組織中的血管形成。通過缺少繼發(fā)衍生物即毛嚢和皮脂腺而使移植物與周圍組織進(jìn)一步區(qū)別開來。移植物的表皮覆蓋物顯著過度生長(zhǎng)。實(shí)施例33:在大鼠中皮膚等效材料的排斥的體內(nèi)試驗(yàn)皮膚等效材料的形成從雌性Fischer-344大鼠(CharlesRiverBreedingLabs)的背面除去小塊皮膚。將這些活組織用外來組織平^f,切成2-3mn^的片,并在Lux組織培養(yǎng)亞的表面上干燥。將得自該活組織的成纖維細(xì)胞在Dulbecco氏改進(jìn)的伊格爾極限必需培養(yǎng)基(DMEM)中在10%C02氣氛中在37°C培養(yǎng),所述培養(yǎng)基補(bǔ)充有10%的胎牛血清,青霉素,鏈霉素和兩性霉素B(FlowLaboratories)。膠原蛋白網(wǎng)^^各根據(jù)實(shí)施例28的過程制備。簡(jiǎn)要地講,在100毫米塑料皿中將2-8xl()S個(gè)成纖維細(xì)胞與補(bǔ)充有10%的胎牛血清、抗生素的濃DMEM和6mg的鼠尾膠原蛋白在以1:1000稀釋的乙酸-水中混合。一周之內(nèi),成纖維細(xì)胞已經(jīng)使膠原蛋白網(wǎng)格收縮,并且將從新鮮的活組織分離的表皮細(xì)胞懸浮液在網(wǎng)格的表面上成層。將10,M的霍亂菌毒素,20|ug/ml的表皮生長(zhǎng)因子和0.4|ug/ml的氫化可的松加入到培養(yǎng)基中以促進(jìn)表皮細(xì)胞的生長(zhǎng),并將皿移到5。/。C02的空氣中。一周之內(nèi),表皮細(xì)胞在膠原蛋白網(wǎng)格的表面上形成鋪滿的片,該皮膚等效材料準(zhǔn)備好可用于移植。為了試驗(yàn)異源移植,從得自雌性SpragueDawley大鼠的細(xì)胞制備網(wǎng)才各并移植到雄性Fisher大鼠。68移植過程將重約350-400g的雄性Fischer大鼠用苯巴比妥鈉麻醉。通過從每只動(dòng)物的后背除去全厚度皮膚而準(zhǔn)備出與網(wǎng)格大小約一樣大的移植床。將網(wǎng)^f各置于傷口中并用浸漬有凡士林的Telfa墊和浸泡在Earle氏鹽溶液中的Telfa墊覆蓋。通過使用幾個(gè)彈性塑料層包扎軀體而覆蓋這些繃帶。在最初進(jìn)行移植后,以9天到13個(gè)月的不等時(shí)間間隔,將動(dòng)物再次麻醉,并且切割整個(gè)移植物。將一半移植物固定在用磷酸鹽緩沖的福爾馬林中,在乙醇中脫水,并包埋到石蠟中。將另一半移植物的中心部分修剪去下方的脂肪組織,切成2-3mm3的片并置于組織培養(yǎng)物中以允許存在的成纖維細(xì)胞長(zhǎng)出。染色體組型的準(zhǔn)備將從移植物長(zhǎng)出的成纖維細(xì)胞群傳代培養(yǎng)以獲得3-6個(gè)T-150燒瓶的迅速分裂細(xì)胞。將成纖維細(xì)胞用2|ug/ml的秋水仙堿處理四小時(shí),擺脫燒瓶,在低滲培養(yǎng)基(1份DMEM對(duì)3份蒸餾水)中溶脹,在載玻片上空氣干燥,并用乙酸地衣紅染色。在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)拍攝20-30個(gè)完整的染色體伸展(chromosomalspread),并準(zhǔn)備染色體組型用來測(cè)定在總成纖維細(xì)胞群中母細(xì)月包的比例。雄性Fisher宿主接受并保持含有Sprague-Dawley母細(xì)胞的移植物,這根據(jù)在之后1-2個(gè)月中在移植物中母細(xì)胞的存在來確定。實(shí)施例34:皮膚組織等效材料試驗(yàn)系統(tǒng)的準(zhǔn)備A.使用如圖17所示裝置進(jìn)行如下所述的操作。除去蓋子用于操作,否則蓋子被保持在位以維持無菌。關(guān)于該儀器的相關(guān)信息如下所列外容器10:直徑38毫米容量35毫升內(nèi)容器20:直徑24毫米容量4毫升可滲透件24:聚碳酸酯膜得自Nuclepore,孔徑大小3jum,厚度5jumB.在可滲透件24上如下形成非細(xì)胞的水合膠原蛋白凝膠:(1)預(yù)混合料10XMEM16.2mlL-谷氨酰胺(200mM)1.6ml慶大霉素(50mg/ml)0.2ml胎牛血清18.0ml碳酸氬鈉(71.2mg/ml)5.0ml在50毫升管(未通氣)中將儲(chǔ)備溶液以上述順序在37。C混合,并在4。C儲(chǔ)存約30分鐘。(2)將27.8g的在0.05%v/v乙酸中的1mg/ml膠原蛋白溶液(從小牛普通足趾伸肌腱中提取的)稱重到50毫升管中并在4。C儲(chǔ)存30分鐘。(3)加入8.2毫升的上面描述的預(yù)混合料和4毫升的完全DMEM(含有10%FBS,4mML-谷氨酰胺,50|ug/ml慶大霉素),并將1毫升小份移液到內(nèi)容器20中并使其在遮蓋下膠凝。C.如下所述使用人真皮成纖維細(xì)胞鑄造組織等效材料并用人表皮(上皮)細(xì)胞接種。過程和試劑的一般說明也可在所述專利和1989年6月5日提交的共同待審申請(qǐng)07/361,041中發(fā)現(xiàn)。(1)鑄造混合物將8.2毫升的上面描述的預(yù)混合料加入到如上面步驟A(2)所述的7027.8g的在0.05%v/v乙酸中的1mg/ml膠原蛋白溶液中,并混合4毫升的人真皮成纖維細(xì)胞(2.5xl()S個(gè)細(xì)胞每毫升)。將3毫升小份移液到容器20中并置于在上面步驟B(2)中形成的非細(xì)胞的水合物膠原蛋白凝膠上并允許膠凝。將4.5毫升的DMEM完全加入到外容器20中,然后在36°C/10%CO2中培養(yǎng),典型地培養(yǎng)4-8天。<table>tableseeoriginaldocumentpage71</column></row><table>在有些情況下,將1.8mM的氯化鈣加入到培養(yǎng)基中,這表示為培養(yǎng)基+鈣,例如mSBM+鈣。D.在鑄造組織等效材料后6天開始表皮形成。(1)表皮形成將上面步驟C的培養(yǎng)基從內(nèi)容器20和外容器10中除去。將50)ul的人表皮細(xì)胞的懸浮液(3.33><106個(gè)細(xì)胞/毫升)置于在上述步驟C中形成的組織等效材料上。然后將容器在36。C和10%CO2中培養(yǎng)24小時(shí)。然后向外容器中加入12.0毫升的mSBM并向井中加入4毫升的mSBM,然后將容器送返回相同的培養(yǎng)箱中。(2)分化在表皮形成后的第2天,除去培養(yǎng)基并用mSBM+鈣置換培養(yǎng)基。(3)空氣接觸在表皮形成后5天,進(jìn)行以下過程/人外容器和內(nèi)容器中除去培養(yǎng)基。將內(nèi)容器20取出并將兩體積的浸漬有cSBM+鈣的棉花墊置于外容器10的底部并加入9.0毫升的cSBM+鈣。然后內(nèi)容器20被重置,并將裝置在35.5。C和10%C02中培養(yǎng)。(4)保持每4天除去培養(yǎng)基并用新鮮的mainSBM+鈣置換培養(yǎng)基。實(shí)施例35:引入瓊脂糖的檢測(cè)系統(tǒng)的制備將2%的瓊脂糖水溶液經(jīng)過高壓蒸汽滅菌,冷卻到40。C,并與等體積的濃縮的mainSBM混合。除去脫脂棉墊并將13毫升的混合物傾入到外區(qū)域14中,允許設(shè)定在36。C(10%C02),并將容器送返回培養(yǎng)箱中,用于在運(yùn)輸前儲(chǔ)存??衫斫獾氖?,本文所述的實(shí)施例和實(shí)施方案僅僅用于說明性的目的,并且對(duì)其進(jìn)行的多種修改和改變可有所屬
      技術(shù)領(lǐng)域
      的專業(yè)人員推導(dǎo)并且屬于本申請(qǐng)的精神和范圍以及權(quán)利要求的保護(hù)范圍。實(shí)施例36:培養(yǎng)組織構(gòu)建體用于治療口腔齒齦退縮的效力。主要目的是確定是否培養(yǎng)組織構(gòu)建體可以提供與游離自體移植物相比的附著齦功能區(qū)。在該研究期間,登記了多達(dá)25個(gè)受試者。受試者的年齡至少為18-70歲。前三個(gè)受試者用于測(cè)定手術(shù)和材料操作技術(shù),因此不被包含在統(tǒng)計(jì)分析中。直到這三個(gè)患者完全跟蹤4周后對(duì)后來的患者進(jìn)行登記。登記的受試者具有至少兩個(gè)不相鄰的具有不充分的附著齦區(qū)域的牙齒,需要組織移植。兩個(gè)^皮選牙齒必需已經(jīng)位于對(duì)側(cè)的四分之一圓內(nèi)。在移植期間未注明或無需牙根覆蓋。受試者用本發(fā)明的培養(yǎng)組織構(gòu)建體處理或用72游離自體移植物處理。臨床上評(píng)價(jià)移植物以確定附著齦的改變,并且在至少3個(gè)受試者中,取得小份活組織用于組織學(xué)評(píng)價(jià)和兩種移植物的比較。輔助效力變量是基線在角質(zhì)化組織寬度方向上、退縮深度、炎癥痕跡、移植組織與周圍組織的顏色或紋理匹配、對(duì)口腔肌肉拉伸的抗性、臨床附著水平,探針深度和受試者的不適度方面的改變。研究采用了隨機(jī)的在受試者之間的對(duì)照處理。評(píng)價(jià)通過培養(yǎng)組織構(gòu)建體產(chǎn)生的附著齦的量和性質(zhì),并且在術(shù)后一周和在1、3和6個(gè)月發(fā)生游離的自體移植。在第6個(gè)月發(fā)生主要的終點(diǎn)。所有的術(shù)后評(píng)估通過對(duì)實(shí)施的手術(shù)過程不知情的研究協(xié)調(diào)員進(jìn)行。顏色、紋理、炎癥和抗肌肉拉伸性通過標(biāo)定研究協(xié)調(diào)員獨(dú)立地打分。盡管已經(jīng)通過說明和用于清楚和理解目的的實(shí)施例詳細(xì)地描述了本發(fā)明,但是本領(lǐng)域技術(shù)人員顯然可在權(quán)利要求的保護(hù)范圍內(nèi)進(jìn)行改變和{奮飾。權(quán)利要求1.治療受試者的口腔病況的方法,所述方法包括向受試者的口腔組織移植培養(yǎng)組織構(gòu)建體,其中所述培養(yǎng)組織構(gòu)建體包括細(xì)胞外基質(zhì)層并且所述細(xì)胞外基質(zhì)包括培養(yǎng)成纖維細(xì)胞而不存在外源性基質(zhì)組分或支架支撐件。2.權(quán)利要求l的方法,其中口腔病況選自口腔齒齦退縮,牙間乳頭缺失,牙槽嵴缺陷,口腔植入失敗,牙齒分叉缺陷,和頜面部腫瘤切除。3.權(quán)利要求l的方法,其中細(xì)胞外基質(zhì)包括(i)顯示有原纖維和原纖維束的堆積組構(gòu)并表現(xiàn)有四分之一交錯(cuò)的67nm帶型的原纖維膠原蛋白;(ii)核心蛋白聚糖;和(iii)糖胺聚糖。4.權(quán)利要求l的方法,其中培養(yǎng)成纖維細(xì)胞得自選自以下的組織新生雄性包皮,真皮,腱,肺,尿道,臍帶,角膜基質(zhì),口腔粘膜,和腸。5.權(quán)利要求l的方法,其中培養(yǎng)成纖維細(xì)胞是真皮成纖維細(xì)胞。6.權(quán)利要求l的方法,其中培養(yǎng)成纖維細(xì)胞來自人組織。7.治療受試者的口腔病況的方法,所述方法包括向受試者的口腔組織移植培養(yǎng)組織構(gòu)建體,其中所述培養(yǎng)組織構(gòu)建體包括第一細(xì)胞外基質(zhì)層和位于所述笫一層上的第二細(xì)胞層,所述細(xì)胞外基質(zhì)包括培養(yǎng)成纖維細(xì)胞而不存在外源性基質(zhì)組分和支架支撐件,并且所述第二細(xì)胞層包括上皮細(xì)胞。8.權(quán)利要求7的方法,其中口腔病況選自口腔齒齦退縮,牙間乳頭缺失,牙槽嵴缺陷,口腔植入失敗,牙齒分叉缺陷,和頜面部腫瘤切除。9.權(quán)利要求7的方法,其中細(xì)胞外基質(zhì)包括(i)顯示有原纖維和原纖維束的堆積組構(gòu)并表現(xiàn)有四分之一交錯(cuò)的67nm帶型的原纖維膠原蛋白;(ii)核心蛋白聚糖;和(iii)糖胺聚糖。10.權(quán)利要求7的方法,其中上皮細(xì)胞選自角化細(xì)胞,角膜上皮細(xì)胞,來自口腔粘膜的上皮細(xì)胞,食道上皮細(xì)胞,和尿道上皮細(xì)胞。11.權(quán)利要求7的方法,其中包含在所述第一層內(nèi)的所述培養(yǎng)成纖維細(xì)胞得自選自以下的組織新生雄性包皮,真皮,腱,肺,軟骨,尿道,角膜基質(zhì),口腔粘膜,和腸。12.權(quán)利要求7的方法,其中包含在所述第一層內(nèi)的所述培養(yǎng)成纖維細(xì)胞是真皮成纖維細(xì)胞。13.權(quán)利要求12的方法,其中細(xì)胞外基質(zhì)進(jìn)一步包含粘連蛋白和生腱蛋白。14.權(quán)利要求7的方法,其中培養(yǎng)成纖維細(xì)胞和上皮細(xì)胞來自人組織。15.權(quán)利要求7的方法,其中培養(yǎng)組織構(gòu)建體包括位于第一層上用于形成表皮細(xì)胞層的第二角化細(xì)胞層。16.權(quán)利要求15的方法,其中表皮細(xì)胞層是多層的、層狀的、分化的并且表現(xiàn)出基底層、基底上層、顆粒層和角質(zhì)層;并且其中雙層培養(yǎng)皮膚構(gòu)建體具有在第一層和第二層的連接處存在的基底膜。17.治療受試者的口腔病況的方法,所述方法包括向受試者的口腔組織移植培養(yǎng)組織構(gòu)建體,其中所述培養(yǎng)組織構(gòu)建體包括膠原蛋白溶液和收縮劑的凝膠混合物。18.權(quán)利要求17的方法,其中口腔病況選自口腔齒齦退縮,牙間乳頭缺失,牙槽嵴缺陷,口腔植入失敗,牙齒分叉缺陷,和頜面部腫瘤切除。19.權(quán)利要求17的方法,其中所述收縮劑包括成纖維細(xì)胞。20.權(quán)利要求19的方法,其中成纖維細(xì)胞來自人組織。21.權(quán)利要求19的方法,其中成纖維細(xì)胞得自選自以下的組織新生雄性包皮,真皮,腱,肺,尿道,臍帶,角膜基質(zhì),口腔粘膜,和腸。22.治療受試者的口腔病況的方法,所述方法包括向受試者的口腔組織移植培養(yǎng)組織構(gòu)建體,其中所述培養(yǎng)組織構(gòu)建體包括第一層,和位于第一層上的第二層,所述第一層包括膠原蛋白凝膠而不存在細(xì)胞,所述第二層包括第二膠原蛋白凝膠,第二膠原蛋白凝膠包含膠原蛋白和收縮劑。23.權(quán)利要求22的方法,其中口腔病況選自口腔齒齦退縮,牙間乳頭缺失,牙槽嵴缺陷,口腔植入失敗,牙齒分叉缺陷,和頜面部肺瘤切除。24.權(quán)利要求22的方法,其中所述收縮劑包括成纖維細(xì)胞。25.權(quán)利要求24的方法,其中成纖維細(xì)胞得自選自以下的組織新生雄性包皮,真皮,腱,肺,尿道,臍帶,角膜基質(zhì),口腔粘膜,和腸。26.權(quán)利要求22的方法,其中第二層包括人表皮細(xì)胞。27.權(quán)利要求24的方法,其中成纖維細(xì)胞來自人組織。28.權(quán)利要求l、7、17和22中任一項(xiàng)的方法,其中成纖維細(xì)胞經(jīng)過基因修飾以產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì)組分。29.權(quán)利要求28的方法,其中成纖維細(xì)胞經(jīng)過基因修飾以產(chǎn)生生長(zhǎng)因素、激素、肽或蛋白質(zhì)。全文摘要本發(fā)明公開了通過對(duì)受試者的口腔組織移植培養(yǎng)組織構(gòu)建體治療口腔病況的方法。該培養(yǎng)組織構(gòu)建體包括培養(yǎng)的細(xì)胞和內(nèi)源性產(chǎn)生的細(xì)胞外基質(zhì)組分,而無需外源性基質(zhì)組分或者網(wǎng)絡(luò)支撐件或支架部件。本發(fā)明的一些組織構(gòu)建體包含多個(gè)細(xì)胞層或超過一種的細(xì)胞類型。本發(fā)明的組織構(gòu)建體具有與其細(xì)胞由來的組織相似的形態(tài)特征和功能,并且它們的強(qiáng)度使得其容易操作。本發(fā)明的優(yōu)選的培養(yǎng)組織構(gòu)建體包括人組織由來的細(xì)胞。文檔編號(hào)A01N63/00GK101489395SQ200780015826公開日2009年7月22日申請(qǐng)日期2007年3月5日優(yōu)先權(quán)日2006年3月3日發(fā)明者D·C·埃克隆德申請(qǐng)人:器官發(fā)生有限公司
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