專利名稱：：用于控制雙子葉植物花類型發(fā)育的遺傳系統(tǒng)以及在檢測和選擇過程中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及植物品種的選擇特別涉及植物性別類型(typesexuel)的選擇。其涉及通過分析基因A的多態(tài)性進(jìn)行植物性別的基因型檢測，以及用于實(shí)施這種檢測的手段和用于產(chǎn)生性別表型已經(jīng)被修飾的植物的方法。
背景技術(shù)：
：生產(chǎn)雜交植物在農(nóng)藝和農(nóng)業(yè)中是非常令人感興趣的。事實(shí)上，得益于稱為雜種優(yōu)勢的現(xiàn)象，雜交植物與親本雙方的平均值相比，在很多性狀上具有優(yōu)勢。這種優(yōu)勢可以用例如與其親本相比更強(qiáng)的活力、更高的收獲、對培養(yǎng)雜交株的環(huán)境更強(qiáng)的適應(yīng)性以及雜交株的高度一致性來說明。這種雜種優(yōu)勢在親本的遺傳學(xué)差異很大時(shí)更為明顯。產(chǎn)生作為雜交株的未來親本的純并且穩(wěn)定的植物品系是產(chǎn)生表達(dá)最大雜種優(yōu)勢的均一并且可再生的雜交品種的一個必要條件。因此需要產(chǎn)生純并且穩(wěn)定的植物品系，然后將這些品系進(jìn)行雜交以獲得雜交株。產(chǎn)生純植物品系涉及植物的自交以獲得具有共同基因遺傳物質(zhì)、確定的整體預(yù)期生產(chǎn)性狀、產(chǎn)量規(guī)律或疾病抗性的植物。為了產(chǎn)生純的植物品系，需要用允許自交的性別類型的植物，例如兩性植物。然而，許多雙子葉植物，特別是葫蘆科植物，可能是雌雄同體(monoi'que)、雄性兩性同體(andromonoi'que)、全雌性(gynoi'ques)或兩性(hermaphrodites)植物。用于產(chǎn)生純植物品系的第一種實(shí)施技術(shù)包括對植物進(jìn)行化學(xué)處理從而獲得具有自交能力的植物，例如兩性植物。例如對于瓜類(甜瓜(cwcwm/s附eto))，噴灑乙烯合成抑制劑例如硝酸銀或硫代硫酸銀使得雌花中短暫出現(xiàn)雄蕊(Rudiche^/.,1969;Risser"a/.,1979)。通過此方式，將全雌性植物轉(zhuǎn)變?yōu)閮尚灾参镆跃S持純品系。然而，用這種方法產(chǎn)生純品系受限于化學(xué)試劑的高成本及其持續(xù)性和植物毒性作用。另外，對于從花期持續(xù)很長的植物產(chǎn)生雜交體來說這些試劑可能是無效的，因?yàn)樵谔幚碇蟪霈F(xiàn)的新花可能不受所述化學(xué)處理影響。因此需要能夠控制雙子葉植物花類型發(fā)育的系統(tǒng)，并獲得具有確定花類型(typefloral)的植物。另外，從純品系開始，需要進(jìn)行很多步雜交育種以獲得感興趣的雜交株，并且在每一步雜交育種中，需要保留具有最有希望的表型的植物。當(dāng)在純品系間進(jìn)行育種時(shí)，必須能夠選擇實(shí)現(xiàn)育種的途徑，從而避免會導(dǎo)致植物喪失所希望的雜種優(yōu)勢的植物自花授粉。同樣地，由于雙子葉植物的性別類型多樣性，必須分離同一植物的雄花和雌花以避免自花授粉。第一種方法，特別是用于玉米的方法，包括使用機(jī)械裝置以實(shí)現(xiàn)植物去雄。然而，這種方法非常昂貴，因?yàn)槊恳淮坞s交育種都需要對每一株需要避免自花授粉的植物去雄。另一種方法包括對植物進(jìn)行化學(xué)去雄，阻止可育花粉的形成。因此，在瓜類(甜瓜)中，用乙烯利(乙烯前體)處理雌雄同體植物導(dǎo)致雄花暫時(shí)消失。這些用于引起暫時(shí)性雄性不育的化學(xué)試劑(稱為去雄劑)有一些缺點(diǎn)，例如高成本或高毒性，如前面已經(jīng)提到的。因此可以看到上文描述的用于控制花類型的機(jī)械或化學(xué)方法非常昂貴，與此對應(yīng)的是需要進(jìn)行非常大量雜交以獲得具有所期望特征并適于商業(yè)化的雜交植物。為了有助于產(chǎn)生純的雜交品系，因此需要能夠控制對雙子葉植物花類型發(fā)育的系統(tǒng)，從而獲得具有確定花類型的植物。另一種獲得能夠自花授粉并用于產(chǎn)生純品系植物或獲得不能自花授粉以產(chǎn)生雜交株植物的方法可以分別包括在一個物種中僅選擇兩性個體或僅選擇雌性個體。然而，這種方法同樣是非常昂貴的，因?yàn)槠湫枰囵B(yǎng)大量植物，直到可以確定其性別類型。另外，這種方法也是不確定的，因?yàn)榇_定花性別的機(jī)制特別依賴于環(huán)境因素。因此也需要能夠選擇雙子葉植物例如兩性植物或雌性植物，而不需要對其進(jìn)行培養(yǎng)的方法。這種方法應(yīng)當(dāng)能夠選擇植物，特別是選擇用于產(chǎn)生純的或雜交品系的植物，如上文所述。發(fā)明概述本發(fā)明提供了能夠控制雙子葉植物花類型發(fā)育的系統(tǒng)。本發(fā)明人示出兩個都具有至少兩個等位基因的遺傳控制元件(A/a)和(G/g)參與控制葫蘆科(cucurbitac^es)中的性別決定機(jī)制，其中(A)和(a)是第一遺傳元件，(G)和(g)是第二遺傳元件。本發(fā)明人還示出在生理水平上，兩個等位基因(A)和(a)通過一個新蛋白質(zhì)的不同比率而彼此區(qū)別。因此本發(fā)明的一個目的是提供用于控制雙子葉植物花類型發(fā)育的遺傳系統(tǒng)，所述系統(tǒng)包括兩個遺傳控制元件的組合，其分別為-以顯性等位基因(A)和隱性等位基因(a)的形式存在于雙子葉植物中的第一遺傳控制元件(A/a)，其中--所述顯性等位基因(A)由核酸(NA)組成，所述核酸包括(i)在雙子葉植物中發(fā)揮功能的調(diào)節(jié)多核苷酸(PA)，和(ii)表達(dá)被所述調(diào)節(jié)多核苷酸(PA)調(diào)節(jié)的核酸，所述核酸編碼序列SEQIDN。3所示的ACCS蛋白質(zhì)，-所述隱性等位基因(a)與所述顯性等位基因(A)通過如下區(qū)別-(i)在所述植物中不存在的核酸(NA)，或(ii)在雙子葉植物中非功能性的調(diào)節(jié)多核苷酸(Pa)，或(iii)編碼非活性ACCS蛋白質(zhì)的核酸，或(iv)在雙子葉植物中非功能性的調(diào)節(jié)多核苷酸(Pa)和編碼非活性ACCS蛋白質(zhì)的核酸，和-以顯性等位基因(G)和隱性等位基因(g)的形式存在于雙子葉植物中的第二遺傳控制元件(G/g)，其中-所述顯性等位基因(G)由核酸(NG)組成，所述核酸的表達(dá)引起雄性兩性同體或雌雄同體植物的發(fā)育，和-所述隱性等位基因(g)與所述顯性等位基因(G灘過如下區(qū)別(i)在所述植物中不存在的核酸(NG)，或(ii)在雙子葉植物中存在核酸(Ng)，所述核酸表達(dá)引起兩性或全雌性植物的發(fā)育，條件是所述第一遺傳控制元件已經(jīng)被人工插入進(jìn)所述雙子葉植物。本發(fā)明一個進(jìn)一步的目的是提供這種調(diào)節(jié)多核苷酸(PA)和(Pa)。本發(fā)明還涉及用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)化植物的方法，所述植物性表型和各個部分特別是其種子已經(jīng)被修飾。本發(fā)明另一個目的是提供在下文中詳細(xì)限定的ACCS蛋白質(zhì)或所述蛋白的片段，以及針對ACCS蛋白質(zhì)的抗體。本發(fā)明還涉及在樣品中檢測所述等位基因(A)和(a)存在的方法。發(fā)明詳述本發(fā)明人示出兩個都具有至少兩個等位基因的遺傳控制元件(A/a)和(G/g)參與控制葫蘆科中的性別決定機(jī)制，其中(A)和(a)是第一遺傳元件，(G)和(g)是第二遺傳元件。本發(fā)明人證明了等位基因(A)控制植物的雄性兩性同體性狀，等位基因(G)控制植物的全雌性性狀，如下表1所示。趙表型基因型花類型雌雄同體AAGG或AaGG雄性和雌性雄性兩性同體aaGG雄性和兩性兩性aagg兩性全雌性Aagg或Aagg雌性表1說明了雙子葉植物的基因型和花的性別表型之間存在的關(guān)系。本發(fā)明人還示出在生理水平上，兩個等位基因(A)和(a)通過一個新蛋白質(zhì)的不同濃度而彼此區(qū)別。特別地，本發(fā)明人示出在生理水平上，在甜瓜中，兩個等位基因(A)和(a)通過一個涉及乙烯代謝的ACCS類型的新蛋白質(zhì)的不同濃度而不同。同時(shí)，各種研究都示出葫蘆科的花生物學(xué)中的基因編碼涉及生物合成或乙烯調(diào)節(jié)途徑的蛋白質(zhì)(Kamachida/.,1997;Kahana""/.，2000)。本發(fā)明人示出，與具有等位基因(A)的植物相比，等位基因(a)在生理水平上通過植物中低ACCS蛋白質(zhì)水平而區(qū)別于等位基因(A)。從遺傳學(xué)角度來說，本發(fā)明人示出了等位基因(A)通過在編碼ACCS蛋白質(zhì)的序列的啟動子序列中的不同而區(qū)別于等位基因(a)。在發(fā)明人眼中，準(zhǔn)確地說，對于等位基因(A)和(a)來說這個區(qū)別誘導(dǎo)了截然不同的蛋白質(zhì)水平和截然不同的性別表型。本發(fā)明人還在實(shí)施例1中示出等位基因(A)也通過ACCS蛋白質(zhì)序列本身的不同而區(qū)別于等位基因(a)。事實(shí)上，等位基因(A)與編碼ACCS蛋白質(zhì)的序列中第57位的丙氨酸殘基的存在相關(guān)，而等位基因(a)與同一序列中第57位的纈氨酸殘基的存在相關(guān)。本發(fā)明人還在實(shí)施例2中示出對于這兩個等位基因來說在啟動子區(qū)和蛋白質(zhì)序列本身中的區(qū)別導(dǎo)致ACCS蛋白質(zhì)截然不同的時(shí)間和空間表達(dá)。不希望受限于任何特定理論，本發(fā)明人相信本發(fā)明的控制系統(tǒng)可推廣至任何如上所述性別決定依賴于乙烯濃度的雙子葉植物。事實(shí)上，本發(fā)明人在實(shí)施例3中示出在不屬于葫蘆科的雙子葉植物中表達(dá)等位基因(A)或等位基因(a)使得可能分別獲得全雌性或兩性表型。最后，本發(fā)明人確定了等位基因(A)相對于等位基因(a)是顯性的。因此本發(fā)明的一個目的是提供用于控制雙子葉植物花類型發(fā)育的遺傳系統(tǒng)，所述系統(tǒng)包括兩個遺傳控制元件的組合，分別是-以顯性等位基因(A)和隱性等位基因(a)的形式存在于雙子葉植物中的第一遺傳控制元件(A/a)，其中--所述顯性等位基因(A)由核酸(NA)組成，所述核酸包括(i)在雙子葉植物中發(fā)揮功能的調(diào)節(jié)多核苷酸(PA)，和(ii)表達(dá)被所述調(diào)節(jié)多核苷酸(PA)調(diào)節(jié)的核酸，所述核酸編碼SEQIDN°3所示的ACCS蛋白，-所述隱性等位基因(a)與所述顯性等位基因(A灘過如下區(qū)別(i)在所述植物中不存在的核酸(NA)，或(ii)在雙子葉植物中非功能性的調(diào)節(jié)多核苷酸(Pa)，或(iii)編碼非活性ACCS蛋白質(zhì)的核酸，或(iv)在雙子葉植物中非功能性的調(diào)節(jié)多核苷酸(Pa)和編碼非活性ACCS蛋白質(zhì)的核酸，和-以顯性等位基因(G)和隱性等位基因(g)的形式存在于雙子葉植物中的第二遺傳控制元件(G/g)，其中-所述顯性等位基因(G)由核酸(NG)組成，所述核酸的表達(dá)引起雄性兩性同體或雌雄同體植物的發(fā)育，和-所述隱性等位基因(g)與所述顯性等位基因(G)通過如下區(qū)別(i)在所述植物中不存在的核酸(NG)，或(ii)在雙子葉植物中存在核酸(Ng)，所述核酸表達(dá)引起兩性或全雌性植物的發(fā)育，條件是所述第一遺傳控制元件已經(jīng)被人工插入進(jìn)所述雙子葉植物。本發(fā)明人鑒別的遺傳控制系統(tǒng)使得雙子葉植物的花的性別可以被控制和/或修飾，并因此與發(fā)明簡介部分所描述的通常昂貴的機(jī)械控制系統(tǒng)或通常有毒的化學(xué)控制系統(tǒng)相比具有優(yōu)勢。如本文所用，"等位基因"是指位于一對同源染色體上一個位點(diǎn)或基因座的基因的形式之一。基因的等位基因與同一遺傳特征相關(guān)，但是它們可能決定不同的表型。顯性等位基因是一種等位基因，其表型表達(dá)水平比其同源等位基因(所謂隱性等位基因)的表型表達(dá)水平高得多。所述顯性可以是完全顯性或部分顯性。隱性等位基因是一種等位基因，其相應(yīng)的表型僅當(dāng)植物從其雙親中的每一個都得到相同等位基因時(shí)才會表達(dá)。相比，如果存在同源顯性等位基因，所述隱性等位基因的表達(dá)被掩蓋。因此，上文限定的系統(tǒng)以各種狀態(tài)的形式存在，每一種相應(yīng)于一種表型。當(dāng)雙子葉植物中存在的所述第一遺傳控制元件(A/a)呈等位基因(A)的形式時(shí)，所述植物是雌雄同體或全雌性表型。當(dāng)植物中存在的所述第一遺傳控制元件(A/a)呈等位基因(a)的形式時(shí)，所述植物是兩性或雄性兩性同體表型。當(dāng)雙子葉植物中存在的所述第二遺傳控制元件(G/g)呈等位基因(G)的形式時(shí)，所述植物是雌雄同體或雄性兩性同體表型。當(dāng)植物中存在的所述第二遺傳控制元件(G/a)呈等位基因(g)的形式時(shí)，所述植物是兩性或全雌性表型。等位基因和表型之間存在的關(guān)系總結(jié)于表1。本說明書下面的部分說明了屬于本發(fā)明控制系統(tǒng)的第一和第二遺傳控制元件的各種或優(yōu)選的實(shí)施方案。遺傳控制元件A/a,呈本發(fā)明系統(tǒng)的顯性等位基因fA)形式一般說來，在植物中以顯性等位基因(A)形式存在的遺傳控制元件A/a使得與當(dāng)所述等位基因(A)不存在于所述植物中時(shí)觀察到的量的水平相比可以獲得更大量水平的ACCS蛋白質(zhì)。在下面的描述中，"高水平的ACCS蛋白質(zhì)"相應(yīng)于在基因組中含有顯性等位基因(A)的植物中所測量的ACCS蛋白質(zhì)的平均量水平，"低水平的ACCS蛋白質(zhì)"相應(yīng)于在基因組中不含有顯性等位基因(A)的植物中觀察到的ACCS蛋白質(zhì)的平均量水平。所述顯性等位基因(A)由核酸(NA)組成，所述核酸包括(i)在雙子葉植物中發(fā)揮功能的調(diào)節(jié)多核苷酸(PA)，和(ii)表達(dá)被所述調(diào)節(jié)多核苷酸(PA)調(diào)節(jié)的核酸，所述核酸編碼SEQIDN。3所示的ACCS蛋白。本發(fā)明的功能性調(diào)節(jié)多核苷酸(PA)或啟動子由能夠使SEQIDN°3所示的ACCS蛋白質(zhì)在雙子葉植物中表達(dá)的核酸組成。例如，這種啟動子包括SEQIDN°l的核苷酸1至核苷酸5906的核苷酸序列。因此，本發(fā)明的一個目的是提供一種遺傳控制系統(tǒng)，其中調(diào)節(jié)多核苷酸(PA)包含SEQIDN°l的核苷酸1至核苷酸5906的核苷酸序列或由所述核苷酸序列組成。本發(fā)明一個進(jìn)一步的目的是提供如上述限定的調(diào)節(jié)多核苷酸(PA)以及這種核酸的片段，其將在"本發(fā)明的核酸"部分中得到更為詳細(xì)的描述。本發(fā)明的功能性調(diào)節(jié)多核苷酸(PA)也可以由已知用于以組成型方式(組成性地)或以組織特異性方式指導(dǎo)編碼ACCS蛋白質(zhì)的核酸序列表達(dá)的啟動子組成。因此本發(fā)明的功能性調(diào)節(jié)多核苷酸(PA)可以選自組織特異性啟動子例如得自如TheiJ3enetal.，2001所描述的"MADS盒(MADSbox)"基因家族(A、B、C、D和E類)的啟動子或任何其他同源異形基因啟動子。因此本發(fā)明的功能性調(diào)節(jié)多核苷酸(PA)可以選自-Kayetal.,1987所著文獻(xiàn)描述的花椰菜花葉病毒35S啟動子，或19S啟動子或有利地雙35S組成型啟動子(pd35S);-McElroyetal.,1991描述的包含在質(zhì)粒pActl-F4中的水稻肌動蛋白啟動子，其后跟隨水稻肌動蛋白內(nèi)含子(pAR-IAR);-PCT申請WO90/02172或AXELOSetal.(1989)所著文獻(xiàn)中描述的編碼植物延伸因子的基因的組成型啟動子EF-loc;—基于根瘤土壤桿菌(4^o6a"en'wmZwme^7c/era)章魚堿合酶基因啟動子的轉(zhuǎn)錄激活元件和根瘤土壤桿菌甘露堿合酶基因啟動子的三拷貝融合體的嵌合超級啟動子PSP(NIetal.,1995)，和；-向日葵泛素啟動子(BINETetal.，1991);_玉米泛素1啟動子(CHRISTENSENetal.，1996)。本發(fā)明的功能性調(diào)節(jié)多核苷酸(PA)也可以由誘導(dǎo)型啟動子組成。因此，本發(fā)明的一個目的是提供如上文限定的控制系統(tǒng)，其中所述調(diào)節(jié)多核苷酸(PA)對于誘導(dǎo)信號的作用敏感，并且優(yōu)選地，其中所述調(diào)節(jié)多核苷酸(PA)是可誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄或翻譯激活多核苷酸。當(dāng)所述轉(zhuǎn)錄或翻譯激活調(diào)節(jié)多核苷酸對于激活誘導(dǎo)信號直接或間接敏感時(shí)，其是本發(fā)明所限定的"可誘導(dǎo)激活"多核苷酸。根據(jù)本發(fā)明，所述"可誘導(dǎo)激活"類型的調(diào)節(jié)多核苷酸是僅在存在外部信號時(shí)被激活的調(diào)節(jié)序列。這種外部信號可以是轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合，其中所述轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合可被激活誘導(dǎo)信號誘導(dǎo)，所述調(diào)節(jié)多核苷酸對于所述激活誘導(dǎo)信號直接或間接敏感。當(dāng)在宿主細(xì)胞中使用這種核酸構(gòu)建體時(shí)，編碼本發(fā)明的ACCS蛋白質(zhì)的多核苷酸的表達(dá)可通過將所述被轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞與所述激活誘導(dǎo)信號接觸而被誘導(dǎo)，其中所述激活調(diào)節(jié)多核苷酸對于所述激活誘導(dǎo)信號直接或間接敏感。當(dāng)期望在被轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞中缺乏編碼ACCS蛋白質(zhì)的多核苷酸的表達(dá)時(shí)，僅需要簡單地消除或移除所述激活誘導(dǎo)信號的存在，其中所述轉(zhuǎn)錄或翻譯激活調(diào)節(jié)多核苷酸對于所述激活誘導(dǎo)信號敏感。根據(jù)本文上述實(shí)施方案中的定義，在調(diào)節(jié)多核苷酸領(lǐng)域特別是所述調(diào)節(jié)多核苷酸在植物中具有活性的調(diào)節(jié)多核苷酸領(lǐng)域的普通技術(shù)人員的一般技術(shù)知識的范圍內(nèi)限定所述構(gòu)建體。能夠控制編碼ACCS蛋白質(zhì)的核酸的調(diào)節(jié)序列可以是可由特定代謝物誘導(dǎo)的調(diào)節(jié)序列，例如_糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)性調(diào)節(jié)序列，例如AOYAMAetal.(1997)所述或例如McNELLYSetal.(1998)所述；-乙醇誘導(dǎo)性調(diào)節(jié)序列，例如SALTERetal.(1998)所述或例如CADDICKetal.(1998)所述；-四環(huán)素誘導(dǎo)性調(diào)節(jié)序列，例如CLONTECH公司銷售的；_可由病原性物質(zhì)或由病原性物質(zhì)產(chǎn)生的代謝物誘導(dǎo)的啟動子序列；_PR類型基因的水楊酸或BTH或aliette誘導(dǎo)性調(diào)節(jié)序列(Gorlachetal.，1996,Molinaetal"1998);-例如屬于二苯甲酰肼家族的蛻皮素受體類型的雙苯酰肼誘導(dǎo)性調(diào)節(jié)控序列(Martinezetal.，1999)(產(chǎn)品編號RH5992,ROHM&HAAS公司銷售)。-編礙JCCS翻廣微麼優(yōu)選地，編碼ACCS蛋白質(zhì)的核酸從5'末端到3'末端至少包含(i)與SEQIDN。l的核苷酸5907至核苷酸6086的多核苷酸具有至少95%相同性的一段序列，(ii)與SEQIDN。1的核苷酸6181至核苷酸6467的多核苷酸具有至少95%相同性的一段序列，和(iii)與SEQIDN°l的核苷酸7046至核苷酸7915的多核苷酸具有至少95%相同性的一段序列。遺傳控制元件A/a，呈本發(fā)明系統(tǒng)的隱性等位基因(a)形式一般說來，當(dāng)存在于基因組中不具有顯性等位基因(A)的植物中時(shí)，以隱性等位基因(a)形式存在的遺傳控制元件(A/a)不能獲得與當(dāng)?shù)任换?A)存在時(shí)同樣高的ACCS蛋白質(zhì)水平。因此，所述隱性等位基因(a)可以定義為相應(yīng)于等位基因(A)的基因型的任何變化，所述基因型不能獲得與等位基因(A)同樣高的ACCS蛋白質(zhì)水平。所述隱性等位基因(a)與所述顯性等位基因(A)通過如下區(qū)別(i)在所述植物中不存在的核酸(NA)，或(ii)在雙子葉植物中非功能性的調(diào)節(jié)多核苷酸(Pa)，或蛋白質(zhì)的核酸，或(iv)在雙子葉植物中非功能性的調(diào)節(jié)多核苷酸(Pa)和編碼非活性ACCS蛋白質(zhì)的核酸。謹(jǐn)孝勸瀠絲^貫^^^^7^本發(fā)明的非功能性調(diào)節(jié)多核苷酸(Pa)或啟動子是這樣的核酸(i)在宿主細(xì)胞中不允許SEQIDN。3所示的ACCS蛋白質(zhì)表達(dá)，或(ii)與在調(diào)節(jié)多核苷酸(PA)的情況中觀察到的水平相比，以低水平表達(dá)這個蛋白質(zhì)，或(iii)與在調(diào)節(jié)多核苷酸(PA)的情況中觀察到的表達(dá)時(shí)期相比，使得ACCS蛋白質(zhì)在植物生命周期中表達(dá)較短的時(shí)期。有一個簡單的方法對比幾個本領(lǐng)域技術(shù)人員己知的啟動子的表達(dá)水平，所述方法包括將一個可選擇標(biāo)記基因置于待測啟動子的控制之下?？蛇x擇標(biāo)記基因可以是例如本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的BASTA除草劑抗性基因。另一種方法可以包括當(dāng)編碼ACCS蛋白質(zhì)的序列處于各種啟動子的控制之下時(shí)通過使用針對此蛋白質(zhì)的抗體測定獲得的該蛋白質(zhì)水平，以及在標(biāo)題為"本發(fā)明的多肽"的部分中描述的方法。作為一個實(shí)施方案，非功能性調(diào)節(jié)多核苷酸(Pa)包含SEQIDN°2的核苷酸1至核苷酸3650的核苷酸序列。因此，在本發(fā)明的控制系統(tǒng)中，非功能性調(diào)節(jié)多核苷酸(Pa)可以包含SEQIDN。2的核苷酸1至核苷酸3650的核苷酸序列。本發(fā)明的另一個目的是提供上文限定的調(diào)節(jié)多核苷酸(Pa)本身。本發(fā)明的另一個目的是提供包含序列SEQIDN。2的核酸。這種核酸包含調(diào)節(jié)多核苷酸(Pa)和編碼SEQIDN。3所示的ACCS蛋白質(zhì)的核酸。非功能性多核苷酸(Pa)也可以由衍生自如上文限定的多核苷酸(PA)的任何多核苷酸組成，所述多核苷酸的核苷酸序列與調(diào)節(jié)多核苷酸的核苷酸序列相比包含一或多個核苷酸的插入、取代或缺失。因此，本發(fā)明的另一個目的是提供包含一種核苷酸序列的核酸，所述核苷酸序列與序列SEQIDN°l的核苷酸1至核苷酸5907的核酸相比包含至少一個選自突變、插入或缺失的改變，含有所述改變的核酸當(dāng)其控制ACCS蛋白質(zhì)的表達(dá)時(shí)導(dǎo)致所述蛋白質(zhì)與由序列SEQIDN。1的核苷酸1至核苷酸5907的核酸控制的ACCS蛋白質(zhì)的表達(dá)水平相比ACCS蛋白質(zhì)表達(dá)降低。本發(fā)明的另一個目的是提供如上文限定的控制系統(tǒng)，其中所述調(diào)節(jié)多核苷酸(Pa)對于誘導(dǎo)信號的作用敏感，并且優(yōu)選地，其中所述調(diào)節(jié)多核苷酸(Pa)是可誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄或翻譯阻抑多核苷酸。如本文所用，"阻抑(r郵resseur)"調(diào)節(jié)多核苷酸是指組成性活性可以被外部信號阻斷的調(diào)節(jié)序列。這種外部信號可以是缺乏被所述阻抑物調(diào)節(jié)多核苷酸識別的轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合。所述轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的缺乏可被阻抑物誘導(dǎo)信號的作用誘導(dǎo)，所述阻抑物調(diào)節(jié)多核苷酸對于所述阻抑物誘導(dǎo)信號敏感。在此第一特定實(shí)施方案中，編碼ACCS蛋白質(zhì)的序列在所選擇的宿主細(xì)胞中在缺乏所述阻抑物誘導(dǎo)信號的情況下組成型表達(dá)，其中所述阻抑物調(diào)節(jié)多核苷酸對于所述阻抑物誘導(dǎo)信號直接或間接敏感。將宿主細(xì)胞與所述阻抑物誘導(dǎo)信號接觸，通過對所述阻抑物調(diào)節(jié)多核苷酸的直接或間接作用，引起編碼ACCS蛋白質(zhì)的多核苷酸的表達(dá)被抑制和/或阻斷。為了獲得本發(fā)明的包含阻抑物調(diào)節(jié)多核苷酸的DNA構(gòu)建體，本領(lǐng)域技術(shù)人員會應(yīng)用其在植物基因表達(dá)領(lǐng)域的普通技術(shù)知識。用于產(chǎn)生應(yīng)用這種類型的調(diào)節(jié)多核苷酸的轉(zhuǎn)化植物的方法在標(biāo)題為"用于產(chǎn)生本發(fā)明的轉(zhuǎn)化植物的方法"部分中描述。腸編,雜爿ccs翻鄉(xiāng)微如本文所用，"編碼非活性ACCS蛋白質(zhì)的核酸"是指編碼一種蛋白質(zhì)的核酸，該蛋白質(zhì)與SEQIDN。3所示的ACCS蛋白質(zhì)通過一或多個氨基酸的取代、缺失、或插入而不同并且不具有SEQIDN。3所示的ACCS蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性。-赫絲爿ccs歪頗如本文所用，"非活性ACCS蛋白質(zhì)"是指與SEQIDN。3所示的ACCS蛋白質(zhì)通過一或多個氨基酸的取代、缺失、或插入而不同并且不具有SEQIDN°3所示的ACCS蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性的蛋白質(zhì)。一般說來，非活性ACCS蛋白質(zhì)是表達(dá)與雄性兩性同體或兩性表型相關(guān)的蛋白質(zhì)。例如，非活性ACCS蛋白質(zhì)可以是不允許將S-腺苷甲硫氨酸轉(zhuǎn)化為ACC(l-氮基環(huán)丙烷-l-羧酸)的蛋白質(zhì)。本發(fā)明人在實(shí)施例1中示出本發(fā)明的非活性ACCS蛋白質(zhì)例如是SEQIDN°3所示的ACCS蛋白質(zhì)，其中第57位丙氨酸殘基被纈氨酸殘基取代。遺傳控制元件G/g，呈本發(fā)明系統(tǒng)的隱性等位基因(g)形式一般說來，當(dāng)存在于植物中時(shí)，以隱性等位基因(g)形式存在的遺傳控制元件(G/g)導(dǎo)致兩性或全雌性植物的發(fā)育。本發(fā)明的核酸如前所述，根據(jù)本發(fā)明，鑒定了第一遺傳控制元件(A/a)的兩個等位基因變體(A)和(a)。本發(fā)明人鑒別了SEQIDN°l的核酸是相應(yīng)于處于基因(A/a)形式的第一遺傳控制元件的顯性等位基因(A)變體的核酸，而SEQIDN°2的核酸是相應(yīng)于隱性等位基因(a)變體的核酸。在本發(fā)明的控制系統(tǒng)中，兩種遺傳控制元件中的至少一種已經(jīng)被人工插入到植物中。如上文所述，這種插入導(dǎo)致所述植物的花的性別改變，這正是本發(fā)明尋求的目的之一。因此，序列SEQIDN。1和SEQIDN。2是本發(fā)明目的的一部分。因此本發(fā)明的一個目的是提供一種核酸，所述核酸包含與選自SEQIDN°l和SEQIDN°2的核苷酸序列或SEQIDN°l和SEQIDN°2之一的片段具有至少95%核苷酸相同性的多核苷酸，條件是這種核酸具有如上文限定的等位基因(A)或等位基因(a)的功能性特性。本發(fā)明一個進(jìn)一步的目的是提供一種核酸，所述核酸的序列與如上文限定的核酸互補(bǔ)。本發(fā)明另一個進(jìn)一步的目的是提供一種核酸，所述核酸由與選自SEQIDN°l和SEQIDN°2所示序列或SEQIDN°l和SEQIDN°2之一的片段具有至少95%核苷酸相同性的多核苷酸組成，或者提供具有與其互補(bǔ)的序列的核酸，條件是這種核酸具有如上文限定的等位基因(A)或等位基因(a)的功能性特性。本發(fā)明還涉及一種核酸，所述核酸包含SEQIDN°l或SEQIDN°2所示核酸的至少12個、優(yōu)選至少15個、最優(yōu)選至少20個連續(xù)核苷酸，應(yīng)當(dāng)理解這種核酸的定義包括如本說明書限定的本發(fā)明核酸的"片段"。本發(fā)明也涉及包含SEQIDN。1或2或由SEQIDN°l或2組成的核酸。本發(fā)明還涉及一種核酸，所述核酸包含SEQIDN°l或SEQIDN。2所示核酸的至少12個、優(yōu)選至少15個、最優(yōu)選至少20個連續(xù)核苷酸，應(yīng)當(dāng)理解這種核酸的定義包括如本說明書限定的本發(fā)明核酸的"片段"。SEQIDN°l限定的等位基因(A)從5'末端到3'末端分別包含a)非編碼序列，包括位于第一個外顯子上游的調(diào)節(jié)這個基因的轉(zhuǎn)錄和/或翻譯的元件，從SEQIDN°l的第1位核苷酸至第5906位核苷酸；b)所謂"編碼區(qū)"，包括基因(A/a)的三個外顯子和兩個內(nèi)含子，這個編碼區(qū)從SEQIDN°l的第5907位核苷酸至第7915位核苷酸；c)位于所述編碼區(qū)下游的非編碼區(qū)，從SEQIDN。1的第7915位核苷酸至第13380位核苷酸。SEQIDN。1限定的等位基因(a)從5'末端到3'末端分別包括a)非編碼序列，包括位于第一個外顯子上游的調(diào)節(jié)這個基因的轉(zhuǎn)錄和/或翻譯的元件，從SEQIDN°2的第1位核苷酸至第3650位核苷酸；所述非編碼序列與位于SEQIDN。1所示的核酸的5'的非編碼序列實(shí)質(zhì)上不同，b)所謂"編碼區(qū)"，包括基因(A/a)的三個外顯子和兩個內(nèi)含子，這個編碼區(qū)從SEQIDN°2的第3651位核苷酸至第5659位核苷酸，所述編碼區(qū)與SEQIDN°l所示的核酸的編碼序列差別不大，并且編碼SEQIDN°3所示的同一個ACCS蛋白質(zhì)，和c)位于所述編碼區(qū)下游的非編碼區(qū)，從SEQIDN。1的第5659位核苷酸至第11137位核苷酸，所述非編碼區(qū)與位于SEQIDN。1所示的核酸的3'的非編碼區(qū)差別不大。下表2詳細(xì)示出了基因A/a的三個外顯子和兩個內(nèi)含子的結(jié)構(gòu)特征。所述基因(A/a)的等位基因(A)和(a)的外顯子和內(nèi)含子的結(jié)構(gòu)特征非常相似，因此等位基因(A)和(a)的外顯子確實(shí)編碼SEQIDN°3所示的同一個蛋白質(zhì)。如上文已經(jīng)描述的，相應(yīng)于等位基因(A)和(a)的核苷酸序列之間的主要區(qū)別在于相應(yīng)于這兩個等位基因的上游調(diào)節(jié)序列。這兩個序列因此具有由3個外顯子和2個內(nèi)含子組成的共同區(qū)域，和包括不同調(diào)節(jié)區(qū)域的非共同區(qū)域。表2基因A/a的外顯子序列<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>本發(fā)明進(jìn)一步涉及一種核酸,所述核酸包含基因」/a的外顯子多核苷酸例如上文表1中所述的多核苷酸1至3的至少12個連續(xù)核苷酸，其包括在SEQIDN°l和SEQIDN°2所示的核酸中。這種核酸編碼ACCS蛋白質(zhì)的至少一部分，并且可以引人注目地插入重組載體中，所述重組載體期望在宿主細(xì)胞中或用所述重組載體轉(zhuǎn)化的植物中表達(dá)相應(yīng)翻譯產(chǎn)物以獲得具有基因型(A)的植物。這種核酸也可以用于合成核苷酸探針和引物，所述核苷酸探針和引物期望檢測或擴(kuò)增樣品中基因(A/a)中存在的核苷酸序列。如果需要，上文所述序列可以攜帶一或多個突變，優(yōu)選誘導(dǎo)非活性ACCS蛋白質(zhì)合成并修飾包含這種突變基因的植物的性別類型的一或多個突變。這些序列符合通常如上面所限定的編碼非活性ACCS蛋白質(zhì)的核酸的定義。表3基因(A/a)的內(nèi)含子序列<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>本發(fā)明進(jìn)一步涉及一種核酸，所述核酸包含基因(A/a)的內(nèi)含子多核苷酸例如上文表2中所描述的多核苷酸1和2的至少12個連續(xù)核苷酸，其包括在SEQIDN°l和SEQIDN°2所示的核酸中。這種核酸可以用作寡核苷酸探針或引物以在樣品中檢測至少一個拷貝的基因(A/a)的存在或擴(kuò)增基因(A/a)中的確定耙序列。這種核酸也可以用于擴(kuò)增基因(A/a)中的確定靶序列或用有義方法或共抑制方法或用雙鏈RNA(Wasseneggeretal.1996;Kooteretal.1999)進(jìn)行擾而抑制該靶序列。這種核酸也可以用于確定基因(A/a)的功能性等位基因變體，其用于選擇具有確定的性別類型的植物的方法。應(yīng)當(dāng)注意在其共同區(qū)域(即上文描述的3個外顯子和2個內(nèi)含子)內(nèi)，SEQIDN。l和SEQIDN°2具有高于95%的核苷酸相同性百分比，這個百分比事實(shí)上高于99%。鵬^CCS歪顏財(cái)發(fā)敏縱逾微本發(fā)明一個進(jìn)一步的目的是提供一種核酸，所述核酸包含與從SEQIDN°l的核苷酸5907開始至核苷酸7915終止的核苷酸序列具有至少95%核苷酸相同性的多核苷酸，以及具有與其互補(bǔ)的序列的核酸。本發(fā)明也涉及與從SEQIDN°l的核苷酸5907開始至核苷酸7915終止的核苷酸序列具有至少95°/。核苷酸相同性的核酸，以及具有與其互補(bǔ)的序列的核酸。本發(fā)明一個進(jìn)一步的目的是提供一種核酸，所述核酸包含從SEQIDN°l的核苷酸5907開始至核苷酸7915終止的核苷酸序列，或具有與其互補(bǔ)的序列的核酸。本發(fā)明進(jìn)一步涉及由從SEQIDN°l的核苷酸5907開始至核苷酸7915終止的核苷酸序列組成的核酸，或具有與其互補(bǔ)的序列的核酸。本發(fā)明另一個目的是提供一種核酸，所述核酸至少包含(i)與SEQIDN°l的核苷酸5907至核苷酸6086的多核苷酸具有至少95%相同性的一段序列，(ii)與SEQIDN°l的核苷酸6181至核苷酸6467的多核苷酸具有至少95%相同性的一段序列，和(iii)與SEQIDN°l的核苷酸7046至核苷酸7915的多核苷酸具有至少95%相同性的一段序列。本發(fā)明一個進(jìn)一步的目的是提供一種核酸，所述核酸從5'末端至3'末端包含(i)SEQIDN°l的核苷酸5907至核苷酸6086的一段序列，(ii)SEQIDN。1的核苷酸6181至核苷酸6467的一段序列，和(iii)SEQIDN。1的核苷酸7046至核苷酸7915的一段序列。編碼ACCS蛋白質(zhì)的核酸可以另外包含前導(dǎo)和終止序列，本領(lǐng)域技術(shù)人員常見所述序列?；?A/a)的轉(zhuǎn)錄和翻譯產(chǎn)物以及本發(fā)明的多肽因此本發(fā)明的另一個目的是提供包含氨基酸序列SEQIDN。3(在本說明書中也稱為"ACCS蛋白質(zhì)")的多肽，以及與SEQIDN。3具有至少95%氨基酸相同性的多肽或其片段或變體。本發(fā)明的ACCS蛋白質(zhì)的片段包含SEQIDN°3所示多肽的至少10、50、100、200、300、400、420、430、440或445個連續(xù)氨基酸。本發(fā)明進(jìn)一步涉及包含與SEQIDN°3所示ACCS蛋白質(zhì)序列具有至少95%氨基酸相同性的氨基酸序列的多肽。有利地，本發(fā)明還包括與SEQIDN°3所示多肽序列具有至少96%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%或99.9%氨基酸相同性的多肽，或SEQIDN。3所示多肽的肽片段。一般說來，本發(fā)明的多肽可以是分離的或純化的形式。本發(fā)明的多肽可以通過使用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法進(jìn)行的基因重組獲得，所述方法例如AUSUBELetal.(1989)所述方法。本發(fā)明的多肽也可以通過使用常規(guī)化學(xué)合成方法在均質(zhì)溶液中或在固相制備。例如，本發(fā)明的多肽可以通過HOUBENWEIL(1974)描述的均質(zhì)溶液方法或通過MERRIFIELD(1965a;1965b)描述的固相合成方法制備。優(yōu)選地，本發(fā)明多肽的多肽變體依然能夠被針對SEQIDN。3所示多肽的抗體識別。本發(fā)明的由基因(A/a)編碼的多肽例如氨基酸SEQIDN°3多肽或其變體或肽片段可特別用于制備期望檢測樣品中SEQIDN°3所示多肽或其肽片段的存在和/或表達(dá)的抗體。本發(fā)明一個進(jìn)一步的目的是提供如上文限定的SEQIDN°10所示多肽或這個序列的多肽片段。SEQIDN。10所示多肽編碼上文定義的"非活性"ACCS蛋白質(zhì)，并且與SEQIDN。3不同在于在第57位存在纈氨酸殘基。針對這些多肽的抗體不僅僅用于檢測樣品中由基因(A/a)編碼的多肽或這種多肽的肽片段的存在，還用于例如在植物細(xì)胞中量化SEQIDN°3或10所示多肽的合成，并從而用于確定所述植物的性別而無需培養(yǎng)所述植物如本文所用，"抗體"特別是指多克隆或單克隆抗體或片段(例如F(ab)'2、F(ab)片段)或任何含有識別本發(fā)明的靶多肽或靶多肽片段的起始抗體的結(jié)構(gòu)域的多肽。單克隆抗體可以根據(jù)KOHLERandMILSTEIN(1975)描述的方法由雜交瘤制備。本發(fā)明也涉及針對如上文描述的多肽或其片段或變體的抗體，例如在KOZBORetal.(1983)描述的三瘤(trioma)方法和雜交瘤方法中產(chǎn)生的。本發(fā)明進(jìn)一步涉及單鏈抗體片段Fv(ScFv)，例如在專利USN°4，946,778或MARTINEAUetal.(1998)中所描述的。本發(fā)明的抗體通常包括得自如RIDDERetal.(1995)所描述的噬菌體文庫或如REINMANNetal.(199乃和LEGERetal.(1997)所描述的人源化抗體的抗體片段。本發(fā)明的抗體制備物可用于期望在樣品中鑒別SEQIDN。3所示多肽或其肽片段的存在和/或量的免疫檢測。本發(fā)明的抗體可以另外包含可檢測標(biāo)記(其性質(zhì)是同位素或非同位素)，例如熒光標(biāo)簽，或可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法與分子例如生物素偶聯(lián)。因此，本發(fā)明一個進(jìn)一步的目的是提供用于檢測樣品中本發(fā)明多肽的存在的方法，所述方法包括如下步驟a)將測試樣品與如上文所描述的抗體接觸；b)檢測形成的抗原/抗體復(fù)合物。本發(fā)明進(jìn)一步涉及用于檢測樣品中本發(fā)明多肽的存在的診斷試劑盒，所述試劑盒包括-a)如上文限定的抗體；b)如果需要，一或多種用于檢測形成的抗原/抗體復(fù)合物所需要的試劑。本發(fā)明另一個目的是提供如上文限定的核酸或核酸等位基因變體在用于獲得花類型已經(jīng)被修飾的植物的植物選擇程序中的用途。包會勸虔絲錄夢多樣,MJM》游^^麼本發(fā)明的功能性調(diào)節(jié)多核苷酸(PA)或啟動子包括允許SEQIDN。3所示的ACCS蛋白質(zhì)在雙子葉植物中表達(dá)的核酸。因此這種功能性調(diào)節(jié)多核苷酸(PA)當(dāng)被人工導(dǎo)入植物中時(shí)，使得能夠修飾所述植物的花的性別，并且特別使得可能獲得不能自花授粉的雌性植物。因此本發(fā)明的另一個目的是提供包含與從SEQIDN。1的核苷酸1開始至核苷酸5906終止的核苷酸序列具有至少95%核苷酸相同性的多核苷酸的核酸，以及具有與其互補(bǔ)的序列的核酸。本發(fā)明也涉及與從SEQIDN°l的核苷酸1開始至核苷酸5906終止的核苷酸序列具有至少95%核苷酸相同性的核酸，以及具有互補(bǔ)序列的核酸。因此本發(fā)明一個進(jìn)一步的目的是提供包含從SEQIDN。1的核苷酸1開始至核苷酸5906終止的核苷酸序列的核酸，或具有互補(bǔ)序列的核酸。本發(fā)明進(jìn)一步涉及由從SEQIDN°l的核苷酸1開始至核苷酸5906終止的核苷酸序列組成的核酸，或具有互補(bǔ)序列的核酸。本發(fā)明進(jìn)一步涉及一種核酸，所述核酸包含如上文限定的調(diào)節(jié)多核苷酸的至少12個連續(xù)核苷酸。這種核酸可以用作寡核苷酸探針或引物以在樣品中檢測至少一個拷貝的基因(A/a)的等位基因(A)的存在、以擴(kuò)增基因(A/a)中的確定耙序列。這種核酸也可以用于尋找基因(A/a)的功能性變體等位基因，或用于選擇具有確定性別類型的植物的方法。應(yīng)用如上文描述的核酸的檢測方法描述于標(biāo)題為"本發(fā)明的選擇方法"的部分。這種核酸也可用于使用反義或共抑制方法或使用雙鏈RNA進(jìn)行干擾(Wasseneggeretal.1996;Kooteretal.1999)而抑制基因(A/a)中的確定耙序列。包診#勸虔絲激貫多凝^麼尸《游樣麼本發(fā)明的非功能性調(diào)節(jié)多核苷酸(Pa)或啟動子是一種核酸，所述核酸(i)在宿主細(xì)胞中不允許SEQIDN。3所示的ACCS蛋白質(zhì)表達(dá)，或(ii)與用調(diào)節(jié)多核苷酸(PA)觀察到的水平相比，允許這個蛋白質(zhì)以非常低的水平表達(dá)，或(iii)與用調(diào)節(jié)多核苷酸(PA)觀察到的表達(dá)時(shí)期相比，使得ACCS蛋白質(zhì)在植物生命周期中表達(dá)較短的時(shí)期。因此這種非功能性調(diào)節(jié)多核苷酸(Pa)當(dāng)被人工導(dǎo)入植物中時(shí)(例如當(dāng)取代多核苷酸(A)時(shí))，使得能夠修飾這種植物的花的性別，并且特別使得可能獲得能夠自花授粉的兩性植物。因此本發(fā)明的一個目的是提供包含與從SEQIDN。2的核苷酸1開始至核苷酸3650終止的核苷酸序列具有至少95%核苷酸相同性的多核苷酸的核酸，以及具有與其互補(bǔ)的序列的核酸。本發(fā)明也涉及與從SEQIDN°2的核苷酸1開始至核苷酸3650終止的核苷酸序列具有至少95°/。核苷酸相同性的核酸，以及具有與其互補(bǔ)的序列的核酸。本發(fā)明一個進(jìn)一步的目的是提供包含從SEQIDN°2的核苷酸1開始至核苷酸3650終止的核苷酸序列的核酸，或具有與其互補(bǔ)的序列的核酸。本發(fā)明進(jìn)一步涉及由從SEQIDN°2的核苷酸1開始至核苷酸3650終止的核苷酸序列組成的核酸，或具有與其互補(bǔ)的序列的核酸。這種核酸可以用作寡核苷酸探針或引物以在樣品中檢測至少一個拷貝的基因(A/a)的等位基因(a)的存在，或擴(kuò)增基因(A/a)中的確定耙序列。本發(fā)明也涉及包含一或多個如上文限定的核酸的組合的核酸，例如在(PA)或(Pa)類型啟動子控制之下的編碼功能性ACCS蛋白質(zhì)的核酸。一般定義根據(jù)本發(fā)明，可以使用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的任何常規(guī)分子生物學(xué)、微生物學(xué)和DNA重組方法。這些方法由例如SAMBROOKetal.(1989)、GLOVER(1985)、GAIT(1984)、HAMESandHIGGINS(1984)、BERBAL(1984)和AUSUBELetal.(1994)描述。優(yōu)選地，本發(fā)明任何核酸和任何多肽以分離的或純化的形式存在。如本文所用，"分離的"是指從其原始環(huán)境(即其天然所處的環(huán)境)移出的生物材料。例如，在植物中天然存在的多核苷酸不是分離的。從相鄰核酸分離出來的同一多核苷酸是分離的，其中所述多核苷酸在植物的基因組中天然插入在所述相鄰核酸內(nèi)。這種多核苷酸可被導(dǎo)入載體中和/或這種多核苷酸可摻入組合物中而保持分離的狀態(tài)，因?yàn)樗鲚d體或所述組合物不是其天然環(huán)境。如本文所用，"純化的"并不需要所述物質(zhì)以排除其他化合物的絕對純化的形式存在。其應(yīng)當(dāng)被解釋為一個相對概念。多核苷酸或多肽在粗材料或天然材料純化至少一個數(shù)量級、優(yōu)選至少2或3個數(shù)量級、優(yōu)選至少4或5個數(shù)量級后即為純化狀態(tài)。在本說明書中，"核苷酸序列"是指多核苷酸或核酸。"核苷酸序列"包括遺傳物質(zhì)本身并且不僅限于其序列的信息。"核酸"、"多核苷酸"、"寡核苷酸"或"核苷酸序列"包括單鏈或雙鏈形式的多于一個核苷酸的RNA、DNA、cDNA序列或RNA/DNA雜合序列。如本文所用，"核苷酸"是指天然核苷酸(A,T，GC)和包含至少一種修飾的修飾的核苷酸，例如(i)嘌呤類似物，(ii)嘧啶類似物，或(iii灘類似物，這些修飾的核苷酸例如描述于PCT申請WO95/04064。在本發(fā)明中，當(dāng)?shù)谝欢嗪塑账岬拿恳粋€堿基與具有相反方向的第二多核苷酸的互補(bǔ)堿基配對時(shí)，所述第一多核苷酸被認(rèn)為是與所述第二多核苷酸"互補(bǔ)的"?；パa(bǔ)堿基是A和T(或A和U)，以及C和G。根據(jù)本發(fā)明，與第二參考核酸具有至少95%相同性的第一核酸與這條第二參考多核苷酸具有至少95°/。、優(yōu)選至少96%、97%、98%、98.5%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.80/。或99.9%核苷酸相同性，兩條序列之間的相同性百分比如下文描述確定。如本文所用，所述兩條核酸序列之間的"相同性百分比"由通過對比窗對比兩條最佳排列的序列確定。在所述對比窗內(nèi)的核苷酸序列部分因此與參考序列相比可以包含添加或缺失(例如缺口)(所述參考序列不包含這些添加或缺失)，從而獲得所述兩條序列之間的最佳排列。所述相同性百分比通過確定在兩條對比序列中觀察到的相同核酸堿基的位置數(shù)目、之后用兩個核酸堿基之間存在相同性的位置的數(shù)目除以對比窗內(nèi)位置總數(shù)、最后用結(jié)果乘以一百得到兩條序列的核苷酸相同性百分比來計(jì)算。用于對比的最佳序列排列可以通過使用已知算法的計(jì)算機(jī)程序進(jìn)行計(jì)算。最優(yōu)選地，所述序列相同性百分比使用CLUSTALW軟件(1.82版)確定，參數(shù)設(shè)置如下(1)CPUMODE=ClustalWmp;(2)ALIGNMENT="foil";(3)OUTPUTFORMAT="alnw/numbers";(4)OUTPUTORDER="aligned";(5)COLORALIGNMENT="no";(6)KTUP(wordsize)="default";(7)WINDOWLENGTH="default";(8)SCORETYPE="percent";(9)TOPDIAG="default";(10)PAIRGAP-"default";(11)PHYLOGENETICTREE/TREETYPE="none";(12)MATRIX="default";(13)GAPOPEN="default";(14)ENDGAPS="default";(15)GAPEXTENSION="default";(16)GAPDISTANCES="default";(17)TREETYPE="cladogram"和(18)TREEGRAPDISTANCES="hide"與本發(fā)明的核酸具有至少95%核苷酸相同性的核酸包括所述本發(fā)明核酸"變體"。如本文所用，本發(fā)明的核酸"變體"是指與參考核酸相比，通過一或多個核苷酸的取代、添加或缺失而區(qū)別于所述參考核酸的核酸。本發(fā)明的核酸變體可以是天然來源的，例如天然存在于自然界的等位基因變體。這種變體核酸也可以是例如通過誘變方法獲得的非天然核酸。參考核酸和所述"變體"核酸之間的區(qū)別通常是很小的，因此所述參考核酸和所述變體核酸具有非常相似的核苷酸序列，在很多區(qū)域甚至是相同的。在變體核酸中發(fā)生的核苷酸突變可以是沉默突變，就是說不影響可能由此變體核酸編碼的氨基酸序列的突變。在變體核酸中的核苷酸改變也可能導(dǎo)致可能由此變體核酸編碼的多肽序列中一或多個氨基酸的取代、添加或缺失。最優(yōu)選地，包含開放讀框的本發(fā)明變體核酸編碼保留與由參考核酸編碼的多肽相同的生物學(xué)功能或活性的多肽。最優(yōu)選地，包含開放讀框的本發(fā)明變體核酸編碼仍舊能夠被針對由參考核酸編碼的多肽的抗體識別的多肽。所述編碼ACCS蛋白質(zhì)的核酸"變體"包括導(dǎo)入到植物基因組中并與編碼ACCS蛋白質(zhì)的核酸具有至少95%核苷酸相同性的ACCS蛋白質(zhì)直向同源基因的核酸。如本文所用，本發(fā)明核酸的"片段"是指與參考核酸相比長度減少的核苷酸序列，所述核酸片段與參考核酸在其共有部分具有相同核苷酸序列。本發(fā)明的這些核酸片段具有參考核酸的至少12、15、18、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、150、200、300、400、500、1000、2000或3000個連續(xù)核苷酸，其中本發(fā)明核酸的片段的最大核苷酸長度當(dāng)然受限于參考核酸的最大核苷酸長度。探針和引物本發(fā)明的核酸特別是SEQIDN。1和SEQIDN。2、它們的至少12個核苷酸的片段、調(diào)節(jié)多核苷酸(PA)和(Pa)、以及具有互補(bǔ)序列的核酸都可用于檢測樣品中至少一個拷貝的基因(A/a)或其片段或等位基因變體的的核苷酸序列的存在。特別地，衍生自SEQIDN。1、特別是衍生自調(diào)節(jié)多核苷酸(PA)的上述探針和引物可用于檢測雙子葉植物中等位基因(A)的存在。同樣地，衍生自SEQIDN。2、特別是衍生自非功能性調(diào)節(jié)多核苷酸(Pa)的上述探針和引物可用于檢測雙子葉植物中等位基因(a)的存在。本發(fā)明也包括在高度嚴(yán)格雜交條件下與選自SEQIDN°l和SEQIDN°2的核酸或與調(diào)節(jié)多核苷酸(PA)或(Pa)雜交的核苷酸探針和引物。因此本發(fā)明一個目的是提供用作探針或引物、特別是與如上文限定的核酸雜交的核酸。下文所述的雜交條件用于雜交20個堿基長的核酸、探針或引物。雜交程度和特異性依賴于各種參數(shù)，例如a)與探針或引物雜交的核酸制備物的純度；b)探針或引物的堿基組成，G-C堿基對具有比A-T或A-U堿基對更高的熱穩(wěn)定性；c)探針或引物與核酸之間的同源堿基序列的長度；d)離子強(qiáng)度雜交水平隨著離子強(qiáng)度和雜交時(shí)間的增加而提高；e)保溫溫度；f)與探針或引物雜交的核酸的濃度；g)提高雜交嚴(yán)格性的變性劑例如促進(jìn)氫鍵破壞的物質(zhì)如甲酰胺或尿素的存在；h)保溫時(shí)間，雜交水平隨保溫時(shí)間提高；0體積棑阻劑例如葡聚糖或硫酸葡聚糖的存在，所述體積排阻劑提高雜交水平，因?yàn)樗鼈冊谥苽湮镏刑岣咛结樆蛞镆约芭c其雜交的核酸的有效濃度。限定嚴(yán)格性條件的參數(shù)依賴于成對鏈的50M分離的溫度(Tm)。對于包含多于360個堿基的序列，Tm由如下關(guān)系限定Tm=81.5+0.41(%G+C)+16.6Log(陽離子濃度)一0.63(%甲酰胺)-(600/堿基數(shù))(SAMBROOKetal.,(1989)，9.54-9,62頁)。對于長度小于30個堿基的序列，Tm由如下關(guān)系限定Tm=4(G+C)+2(A+T)。在合適的嚴(yán)格性條件，即非特異性序列不會雜交的條件下，雜交溫度大約在Tm之下5至3(TC的范圍內(nèi)，優(yōu)選低于Tm5至10°C。如本文所用，本發(fā)明所述"高度嚴(yán)格雜交條件"是指雜交溫度如低于Tm之下5'C的雜交條件。上述雜交條件可以根據(jù)尋求雜交的核酸的長度和堿基組成或根據(jù)所選擇的標(biāo)記類型根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知方法進(jìn)行調(diào)整。合適的雜交條件可以例如根據(jù)從HAMES禾卩HIGGINS(1985)或AUSUBELetal.(1989)所著書籍中的教導(dǎo)進(jìn)行調(diào)整。作為示例，用于200個堿基長的核酸的雜交條件如下預(yù)雜交與用于雜交的條件相同時(shí)間1夜。雜交5xSSPE(0.9MNaCl,50mM磷酸鈉pH7.7,5mMEDTA)5xDenhardt，s(0.2%PVP，0.2%Ficoll，0.2o/oSAB)100lig/ml鮭魚精DNA0.1%SDS時(shí)間1夜。漂洗2xSSC,0.1%SDS10min65°C1xSSC,0.1%SDS10min65°C0.5xSSC,0.1%SDS10min65°C0.1xSSC，0.1%SDS10min65°C。本發(fā)明的核苷酸探針和引物包含本發(fā)明核酸特別是SEQIDN°1或SEQIDN°2的核酸或與其互補(bǔ)的序列的、與選自SEQIDN。l或2的序列具有95%核苷酸相同性的核酸或與其互補(bǔ)的序列的、或在高度嚴(yán)格雜交條件下與選自SEQIDN°l或2的序列或與其互補(bǔ)的序列雜交的核酸的至少12個連續(xù)核苷酸。優(yōu)選地，本發(fā)明的核苷酸探針和引物的長度為本發(fā)明核酸的至少12、15、18、20、25、30、35、40、45、50、60、100、150、200、300、400、500、1000、2000或3000個連續(xù)核苷酸。或者，本發(fā)明的核苷酸探針或引物由長度為本發(fā)明核酸的至少12、15、18、20、25、30、35、40、45、50、60、100、150、200、300、400、500、1000、2000或3000個連續(xù)核苷酸的片段組成和/或包含所述片段。例如，SEQIDN。7限定(相應(yīng)于有義引物)的引物對和SEQIDN。8限定(相應(yīng)于反義引物)的引物對使得能夠擴(kuò)增SEQIDN°l所示的核酸片段或SEQIDN°2所示的核酸片段。本發(fā)明的核苷酸探針或引物可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的任何合適的方法制備，包括通過克隆并使用限制性酶或通過根據(jù)例如得自NARANGetal.(1979)或得自BROWNetal.(1979)的磷酸二酯方法、得自BEAUCAGEetal.(1980)的二乙基亞磷酰胺方法或在歐洲專利n。EP0707592中描述的在固相支持物上的方法等方法直接化學(xué)合成制備。本發(fā)明的每一個核酸，包括上文描述的寡核苷酸探針和引物，如果需要，都可以通過摻入可檢測分子(也就是說可通過光譜、光化學(xué)、生物化學(xué)、免疫化學(xué)或化學(xué)手段檢測的可檢測標(biāo)記)進(jìn)行標(biāo)記。例如，這些標(biāo)記可以包括放射性同位素("P3H，35S)、熒光分子(5-溴脫氧尿苷、熒光素、乙酰氨基芴)或配體例如生物素。探針標(biāo)記優(yōu)選地通過將被標(biāo)記的分子通過引物延伸或通過添加至5'或3'末端而插入多核苷酸中實(shí)現(xiàn)。核酸片段非放射性標(biāo)記的實(shí)例特別描述于法國專利n。FR7810975或URDEAetal.(1988)或SANCHEZPESCADORetal.(1988)所寫的文章中。有利地，本發(fā)明的探針可以具有某些結(jié)構(gòu)特征，所述結(jié)構(gòu)特征使得可以由于其性質(zhì)而擴(kuò)增所述信號，例如URDEAetal;(1991)或在歐洲專利n。EP0225807(Chiron)中描述的探針。本發(fā)明的寡核苷酸探針可以特別用于與編碼ACCS蛋白質(zhì)的任何核酸，特別是SEQIDN°l或2所示核酸進(jìn)行Southern類型的雜交，或當(dāng)在樣品中需要分析相應(yīng)轉(zhuǎn)錄物的表達(dá)時(shí)用于RNA雜交。本發(fā)明的探針也可以用于檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物或用于檢測任何錯配。本發(fā)明的核苷酸探針和引物可以固定在固相支持物上。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知這些固相支持物，包括微滴定平板的孔表面、聚苯乙烯薄片、磁珠、硝酸纖維素條或微顆粒例如乳膠顆粒。因此，本發(fā)明一個進(jìn)一步的目的是提供用作核苷酸探針或引物的核酸，所述探針或引物的特征在于包含如上文限定的核酸、特別是SEQIDN。1和SEQIDN°2所示的核酸的至少12個連續(xù)核苷酸。本發(fā)明進(jìn)一步涉及用作核苷酸探針或引物的核酸，所述探針或引物的特征在于包含為本發(fā)明的核酸、最優(yōu)選地具有選自SEQIDN°l和SEQIDN°2的序列的核酸的至少12個連續(xù)核苷酸的多核苷酸。如上文所述，這種核酸可以具有另外的特征，即其用可檢測分子標(biāo)記。用作用于檢測或擴(kuò)增基因(A/a)的基因組序列、mRNA或cDNA的核苷酸探針或引物的核酸可以具有另外的特征，即其選自如下序列a)在高度嚴(yán)格雜交條件下與SEQIDN°l或SEQIDN°2所示核酸雜交的核苷酸序列；和b)包含SEQIDN°l或SEQIDN°2所示核酸的至少12個連續(xù)核苷酸的序列。本發(fā)明的載體、細(xì)胞和植物在本發(fā)明的控制系統(tǒng)中，為了確保至少一個所述遺傳控制元件被人工插入進(jìn)雙子葉植物，上文限定的核酸和調(diào)節(jié)多核苷酸應(yīng)當(dāng)被導(dǎo)入載體內(nèi)，之后導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)。因此，本發(fā)明一個進(jìn)一步的目的是提供包含如上文描述的調(diào)節(jié)多核苷斷PA)和(Pa)、編碼活性和非活性蛋白質(zhì)ACCS的核酸、以及相應(yīng)于等位基因(G)和(g)的核酸的載體、細(xì)胞和轉(zhuǎn)化的植物，以及上文限定的引物。載體如上文限定的核酸(下文中稱為"感興趣的核酸")可以被插入進(jìn)合適的載體內(nèi)。如本文所用，"載體"是指可以是單鏈或雙鏈的DNA或RNA環(huán)狀狀分子。本發(fā)明的重組載體優(yōu)選是表達(dá)載體，或更特別地是插入載體、轉(zhuǎn)化載體或整合載體。其可以特別地是細(xì)菌或病毒起源的載體。在任何情況中，所述感興趣的核酸被置于一或多個包含用于調(diào)控其在所考慮的植物中表達(dá)的信號的序列的控制之下，并且或者調(diào)控信號全部包含在所述感興趣的核酸中(如在上文部分中描述的核酸構(gòu)建體的情況)，或者它們中的一個、許多或全部調(diào)控信號包含在所述感興趣的核酸已經(jīng)被插入其中的接受載體(vecteurreceveur)中。本發(fā)明的重組載體有利地包含合適的轉(zhuǎn)錄起始和終止序列。另外，本發(fā)明的重組載體可以包括宿主細(xì)胞中的一或多個功能性復(fù)制起點(diǎn)，其中期望所述重組載體在所述宿主細(xì)胞中表達(dá)，并且如果需要，所述重組載體包括作為用于選擇的標(biāo)記的核苷酸序列。本發(fā)明的重組載體可以包括一或多個如本說明書上文限定的表達(dá)調(diào)節(jié)信號。本發(fā)明優(yōu)選的細(xì)菌載體包括例如載體pBR322(ATCCn°37017)或載體例如pAA223誦3(Pharmacia,Uppsala,Sweden)和pGEMl(PromegaBiotech,Madison,Wl,UnitedStates)也可以提及其他商業(yè)化載體例如載體pQE70、pQE60、pQE9(Quiagen)、psiX174、pBluescriptSA、p麗8A、p顧16A、pMH18A、pMH46A、pWLNEO、pSV2CAT、pOG44、pXTI和pSG(Stratagene)。也可以是桿狀病毒(萬"w/oWn^)類型的載體例如用于轉(zhuǎn)染衍生自草地貪夜蛾(5^^/c^era戶"g^m^)的Sf9細(xì)胞系(ATCCN。CRL1711)細(xì)胞的載體pVL1392/1393(Pharmingen)。優(yōu)選地，并且為了本發(fā)明載體的主要應(yīng)用(為了產(chǎn)生編碼ACCS蛋白質(zhì)的序列在植物中穩(wěn)定和優(yōu)選可誘導(dǎo)表達(dá))，將會使用特別適于在植物細(xì)胞中表達(dá)感興趣序列的載體，例如如下載體-載體pBIN19(BEVANetal.),由CLONTECH公司(PaloAlto，California,USA)銷售；-載體pBI101(JEFFERSON,1987),由CLONTECH公司銷售；-載體pBI121(JEFFERSON,1987),由CLONTECH公司銷售；32-載體pEGFP;Yangetal.(1996),由CLONTECH公司銷售；-載體pCAMBIA1302(HAJDUKIIEWICZetal.,1994)-衍生自JapanTobacco(EP672752andIshidaetal.，1996)描述的載體pSB12和pSBl的中間和超雙元載體(vecteursinterm6diairesetsuperbinaires)。例如，在本發(fā)明的控制系統(tǒng)中，呈等位基因(A)形式的基因(A/a)可以通過使用SEQIDN°9所示的核酸被人工導(dǎo)入雙子葉植物中，所述核酸從5'末端到3'末端包含-載體pEC2的部分序列，位于SEQIDN。9的第1位核苷酸和第633位核苷酸之間，-Notl限制位點(diǎn)的序列，位于SEQIDN。9的第634位核苷酸和第641位核苷酸之間，-包含呈等位基因(A)形式的基因(A/a)的核酸的序列，位于SEQIDN。9的第642位核苷酸和第14020位核苷酸之間，-Notl限制位點(diǎn)的序列，位于SEQIDN。9的第14021位核苷酸和第14028位核苷酸之間，-載體pEC2的部分序列，位于SEQIDN°9的第14029位核苷酸和第16177位核苷酸之間。因此，SEQIDN°9包含通過使用載體的Notl限制位點(diǎn)線性化的載體pEC2，其中插入了包含呈等位基因(A)形式的基因(A/a)的核酸的序列。細(xì)胞將核酸導(dǎo)入細(xì)菌細(xì)胞最常用的方法可以在本發(fā)明的框架內(nèi)使用，即通過將受體細(xì)胞與含有DNA的細(xì)菌原生質(zhì)體融合進(jìn)行，所述融合通過電穿孔、通過用彈丸進(jìn)行轟擊、通過病毒載體介導(dǎo)的感染等等進(jìn)行。細(xì)菌細(xì)胞經(jīng)常用于擴(kuò)增包含具有本發(fā)明核苷酸序列的構(gòu)建體的質(zhì)粒數(shù)。培養(yǎng)細(xì)菌并接下來使用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法(參見已經(jīng)提到的方法手冊)分離質(zhì)粒，所述方法包括可商購的質(zhì)粒純化試劑盒例如得自PharmaciaBiotech的EasyPrepl或得自Qiagen的QIAexpressExpressionSystem。接下來對如此分離并純化的質(zhì)粒進(jìn)行操作以產(chǎn)生其他將要用于轉(zhuǎn)染植物細(xì)胞的質(zhì)粒。為了確保置于合適調(diào)節(jié)序列控制下的本發(fā)明的感興趣核酸的表達(dá)，本說明書中限定的核酸或重組載體應(yīng)當(dāng)被導(dǎo)入宿主細(xì)胞中。將本發(fā)明的多核苷酸導(dǎo)入進(jìn)宿主細(xì)胞中可以根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法體外進(jìn)行。本發(fā)明一個進(jìn)一步的目的是提供用本發(fā)明的核酸或用如上文限定的重組載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。這種轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的來源優(yōu)選地是細(xì)菌、真菌或植物來源。因此，可以特別使用衍生自各種大腸桿菌(^^/2eWA/fl//)菌株或根瘤土壤桿菌菌株的細(xì)菌細(xì)胞。有利地，所述轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞是植物細(xì)胞或植物原生質(zhì)體?？梢愿鶕?jù)本發(fā)明的方法轉(zhuǎn)化的細(xì)胞例如包括雙子葉植物的細(xì)胞，優(yōu)選屬于葫蘆科的雙子葉植物的細(xì)胞，葫蘆科的成員在下面標(biāo)題為"本發(fā)明的植物"部分中詳細(xì)描述。通過對本發(fā)明的植物進(jìn)行雜交育種獲得的雜交植物也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。優(yōu)選地，其是屬于甜瓜物種的植物的細(xì)胞或原生質(zhì)體。本發(fā)明一個進(jìn)一步的目的是提供感興趣核酸在產(chǎn)生性別表型被修飾的轉(zhuǎn)化植物中的用途。本發(fā)明進(jìn)一步涉及如在本說明書中限定的重組載體在產(chǎn)生性別表型被修飾的轉(zhuǎn)化植物中的用途。本發(fā)明也涉及用感興趣核酸轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞在產(chǎn)生性別表型被修飾的轉(zhuǎn)化植物中的用途。本發(fā)明也涉及包含多個如上文限定的宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)化植物。本發(fā)明的轉(zhuǎn)化的植物本發(fā)明也涉及轉(zhuǎn)化的植物多細(xì)胞生物體(unorganismemulticellulaireWg6taltransform^其特征在于包含轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞或多個用至少一種上文限定的核酸或用包含這種核酸的重組載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。在尋求ACCS蛋白質(zhì)過表達(dá)的情況中，所述轉(zhuǎn)化的植物可以包含多個拷貝的編碼ACCS蛋白質(zhì)的核酸。當(dāng)期望產(chǎn)生不能自花授粉的雌性花的植物時(shí)，特別尋求ACCS蛋白質(zhì)的過表達(dá)。因此本發(fā)明也涉及如上文限定的花都是雌性花或兩性花的轉(zhuǎn)化植物。本發(fā)明的轉(zhuǎn)化植物全部包含被人工插入進(jìn)其基因組的至少一個選自核酸和上文限定的調(diào)節(jié)多核苷酸的元件。通過對本發(fā)明的轉(zhuǎn)化植物進(jìn)行雜交育種獲得的雜交植物也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。本發(fā)明也涉及如在本說明書中限定的轉(zhuǎn)化植物的任何一部分，例如根，以及地上部分如莖、葉、花和特別是種子或果實(shí)。本發(fā)明一個進(jìn)一步的目的是提供由如上文限定的轉(zhuǎn)化植物產(chǎn)生的種子(semence)或植物茅子粒(grainedeplante)。典型地，這種轉(zhuǎn)化的種子或籽粒包含一或多個在其基因組中包含一或多個拷貝的上文限定的第一和第二遺傳控制元件的細(xì)胞，所述遺傳控制元件被人工導(dǎo)入進(jìn)所述雙子葉植物使得能夠任選地以受控及可誘導(dǎo)方式以大量水平或小量水平合成ACCS蛋白質(zhì)。在本發(fā)明的轉(zhuǎn)化植物的一個優(yōu)選實(shí)施方案中，ACCS蛋白質(zhì)以受控方式表達(dá)，這涉及所述轉(zhuǎn)化植物僅包含編碼ACCS蛋白質(zhì)的多核苷酸的一個功能性拷貝，所述一或多個拷貝被人工導(dǎo)入所述轉(zhuǎn)化植物的細(xì)胞中，并且優(yōu)選導(dǎo)入其基因組中，而在野生型植物中天然存在的編碼ACCS的基因(A/a)的序列攜帶至少一個引起基因(A/a)缺陷表達(dá)的突變。本發(fā)明的轉(zhuǎn)化植物是雙子葉植物，優(yōu)選屬于葫蘆科，特別屬于選自如下的屬J6o6ra、爿c"涵os一os、盒子草屬(^4Wwosfemma)、爿/5:0m"ra、(Bew'"C(2Sfl)、三裂瓜屬(6&vvore")、假貝母屬(5o/6os&wma)、5rawafegea、C7za/ema、CVowo^qvYW、西瓜屬(C"nJ/ws)、紅瓜屬(Cocc/w.a)、Cogm.az￡da、Cora〃ocar/us、Oewoy鄉(xiāng)as、C加o/—■、Cwc謂e〃a、Cwcera戸'51、甜瓜屬(CW畫/力、南瓜屬(Cwcw/^/to)、Cwcw*Z)//e〃a、小雀瓜屬(Cyc/a威era)、毒瓜屬(Z)zJ9/oc^c/os)、Dqyerea、噴瓜屬(五cZ)函.騰)、五c/zz'"o，fe、5c/z/wo/epoM、三棱瓜屬(￡<igHa)、五/aten'o/w/s、五wre/a打c/ira、Fevz7/ea、(mwY/朋^/ws、錐形果屬(Go呼/zogy"e)、G^raw.a、(7wram'o戸's、金瓜屬(G_ymwo/e/<3/ww)、會交股藍(lán)屬(G少woWemma)、//a/os/qyos1、//a"6wrz'a、Z/e/mowZ/a、雪膽屬C&Wj/ey")、波棱瓜屬(//6/7&0>5:/7^附1^)、油渣果屬(i/odg^"/")、/6erW〃ea、藏瓜屬(/"c/oyfevz7/ea)、Xedrosris、葫戸屬(丄age"an.a)、丄e附wrosfc_yos、絲瓜屬(丄i(^)、Mara/;、Afe/a"c/謂、Me/o決r/a、Me/o決Wa"http://^、M/cms^c/w'讓、苦瓜屬(Mowoni/ca)、71fwe〃erargz.a、帽兒瓜屬(A/wh'fl)、A^r附ecow'cjas、棒錘瓜屬(jVeoa/s麵/fra)、A^/zoa/scw"ra、CWosz'qycw、Oeo，e、尸arasz'c;;as1、尸ewe/o戸'"、i^/ow'謂、尸e/7owopw》、戶—cto/zra、尸as"tfae"、尸rasc/frw〃us、i^ewcfoc;/c/(37^/2era、T^ew(icw/c;vvi/w附、尸w'gwn'a、戶fero/e/70"、/YeAYw/cyas、iap/z/c^oqyW&、iwf/za/z'c/a、iyhV/os(y/^、Sc/n.3ocaypww、裂瓜屬(tSc/z/3o/7e/ow)、5fec/z/o/w/s、佛手瓜屬(&c/n',)、iSe/戸'a、5"，扭(3、5Vc朋a、S—血附、S—as、S/cj/m/er附at、5Vo/附fl加、羅漢果屬(5Vra衍a)、茅瓜屬(5b/e"a)、reew"w附""/a、re^nWa、赤瓞屬(7Tz/"6/a"f/2")、栝樓屬(7Wc/zoraw決&s)、7Wc少c/a"6ra、7>oc/zowen'a、rroc/w附en'op57's、7"w附a附oca、raseyawf/zus、^7/6ra"(i/a、Jferas7'qyas、翅子瓜屬(za"ow/a)、馬瓞兒屬(ze/zwer/a)、zo附6z'加'a或27gO"S—as。優(yōu)選地，所述轉(zhuǎn)化植物屬于甜瓜屬并屬于甜瓜種。本發(fā)明的檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明人鑒別了花發(fā)育控制體系的事實(shí)使得可以開發(fā)非常簡單的用于檢測植物性別表型的方法，所述方法將在下文詳細(xì)描述。用于檢測等位基因(A)或(a)存在的方法，所述方法包括如下步驟1)使如上文限定的一個核苷酸探針或多個核苷酸探針與待測樣品接觸；禾B2)檢測在探針和樣品中存在的核酸之間最終形成的復(fù)合物。用于檢測等位基因(G)或(g)存在的方法，所述方法包括如下步驟1)使如上文限定的一個核苷酸探針或多個核苷酸探針與待測樣品接觸；禾口2)檢測在探針和樣品中存在的核酸之間最終形成的復(fù)合物。這兩種檢測方法使得可以選擇表1中總結(jié)的植物的表型和基因型。檢測核酸和探針之間形成的復(fù)合物可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方法進(jìn)行，特別是通過使用標(biāo)記的探針或引物進(jìn)行，如在"本發(fā)明的探針和引物"部分中所述。這些方法特別有利，因?yàn)樗鼈兪沟脽o需培養(yǎng)雙子葉植物以得知其性別表型。因此可以經(jīng)濟(jì)地從非常大量的植物樣品中檢測性別表型。另外，這些方法使得能夠選擇晚表達(dá)表型特征，例如植物花性別表型在非常早的發(fā)育階段(具有最早期葉的植物苗)出現(xiàn)。上文提到的應(yīng)用使得可以節(jié)省相當(dāng)多的時(shí)間和空間。本發(fā)明人示出了(實(shí)施例l)等位基因(A)和等位基因(a)與單核苷酸多態(tài)性(SNP)相關(guān)。因此，SEQIDn°l所示的等位基因(A)從第6074位至6077位包含一個序列AGCT，所述序列使得在SEQIDN。3所示的ACCS蛋白質(zhì)的第54位存在丙氨酸殘基。SEQIDn°2所示的等位基因(a)從第3817位至3820位包含一個序列AGTT，所述序列使得在ACCS蛋白質(zhì)的第54位存在纈氨酸殘基。本發(fā)明人示出了在上文鑒別的兩個序列中，只有在相應(yīng)于等位基因(A)并且在第6076位具有胞嘧啶殘基的SEQIDn°l的第6074位至6077位的序列AGCT示出用于Alul酶的限制位點(diǎn)。因此使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的所謂"分裂多態(tài)序歹(J禾示i己(CleavedAmplifiedPolymorphicSequenceMarkers,CAPS)"的消化方法可用于在植物中鑒別等位基因(A)或等位基因(a)的存在。在此方法中，通過使用滿足如下標(biāo)準(zhǔn)的一些特定引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增步驟-所述引物對在SNP區(qū)側(cè)翼，-所述引物對使得能夠擴(kuò)增等位基因(A)和等位基因(a)，-所述引物對使得能夠在AluI介導(dǎo)的酶消化之后觀察到一些限制性片段，所述片段基于等位基因(A)或等位基因(a)是否被擴(kuò)增而不同。例如，這種引物對包括SEQIDN°11和SEQIDN。12。在第二步中，將得自所述PCR的產(chǎn)物與限制酶AluI在適于切割的條件下接觸。之后使用常規(guī)方法(例如基于其大小)對根據(jù)其核苷酸序列被酶消化或未消化的得自所述PCR的產(chǎn)物進(jìn)行區(qū)分。通過實(shí)施此方法，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易地區(qū)別包含等位基因(A)的植物和包含等位基因(a)的植物，因?yàn)檠苌园任换?A)的植物的PCR產(chǎn)物可以被限制酶在所述SNP水平消化。這些PCR產(chǎn)物可以容易地與衍生自包含等位基因(a)的植物的PCR產(chǎn)物(在所述SNP水平不被限制酶消化)區(qū)別。因此本發(fā)明的另一個目的是提供用于檢測等位基因(A)或(a)存在的方法，所述方法包括如下步驟-通過使用引物SEQIDN°ll和SEQIDN。12PCR擴(kuò)增待分析樣品中的DNA，-用限制酶AluI消化得到的產(chǎn)物，禾口-檢測產(chǎn)生的限制性片段。為了檢測產(chǎn)生的限制性片段，本領(lǐng)域技術(shù)人員會進(jìn)行電泳以例如根據(jù)其大小檢測所述片段。對于包含等位基因(A)的植物，獲得4個限制性片段。它們的大小分別是327，197，137和116bp。對于包含等位基因(a)的植物，獲得3個限制性片段。它們的大小分別是524，137和116bp。因此這種方法使得可以容易地檢測植物的性別表型。本發(fā)明的選擇方法上述檢測方法可以在下文詳細(xì)描述的選擇方法中實(shí)施。本發(fā)明的一個目的是提供用于選擇屬于葫蘆科的屬的植物的花類型的方法，特征在于其包括如下步驟a)在屬于葫蘆科的感興趣的植物中例如通過使用如上文限定的核酸或針對ACCS蛋白質(zhì)的抗體確定等位基因(A)和(a)的存在，和b)對在基因組中包含等位基因(A)或等位基因(a)的植物進(jìn)行陽性選擇。本發(fā)明一個進(jìn)一步的目的是提供用于選擇屬于葫蘆科的屬的植物的花類型的方法，特征在于其包括如下步驟-a)在屬于葫蘆科的感興趣的植物中例如通過使用如上文限定的核酸確定等位基因(G)和(g)的存在，和b)對在基因組中包含等位基因(G)或等位基因(g)的植物進(jìn)行陽性選擇。確定等位基因(A)、(a)、(G)和(g)的存在可以有利地通過實(shí)施上述檢測方法進(jìn)行。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以通過參考說明基因型和表型之間的關(guān)系的表1容易地組合上文限定的選擇方法，例如以獲得僅具有雌性或兩性表型的植物。用于產(chǎn)生本發(fā)明的轉(zhuǎn)化的植物的方法本發(fā)明首先涉及用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)化植物的方法，所述方法的目的是將等位基因(A)插入不含有這個等位基因的植物中。因此本發(fā)明的一個目的是提供用于產(chǎn)生屬于萌蘆科并包含雌性花的轉(zhuǎn)化植物的方法，所述方法的特征在于包括如下步驟:a)用核苷酸序列(NA)或包含這個核酸的重組載體轉(zhuǎn)化在基因組內(nèi)不包含等位基因(A)的感興趣植物的至少一個植物細(xì)胞，b)選擇在步驟a)中獲得的具有整合進(jìn)基因組中的核酸(NA)的轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，c)從在步驟b)中獲得的轉(zhuǎn)化的細(xì)胞再生轉(zhuǎn)化的植物。這類方法特別有用，因?yàn)槠涫沟每梢詫⒌任换?A)插入進(jìn)植物基因組中，所述植物因此具有雌雄同體或全雌性表型。本發(fā)明一個進(jìn)一步的目的是提供用于轉(zhuǎn)化植物的方法，所述方法的目的是從植物中移除等位基因(A)，或用等位基因(a)取代等位基因(A)以獲得具有兩性表型的植物。因此本發(fā)明的一個目的是提供用于產(chǎn)生屬于葫蘆科并具有兩性花的轉(zhuǎn)化植物的方法，所述方法的特征在于包括如下步驟a)在植物中用等位基因(a)取代等位基因(A)，b)選擇在步驟a)中獲得的等位基因(a)整合進(jìn)基因組的轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，c)從在步驟b)中獲得的轉(zhuǎn)化的細(xì)胞再生轉(zhuǎn)化的植物，d)對步驟c)中獲得的植物進(jìn)行雜交育種以獲得不再含有等位基因(A)的植物。在上述方法的第一個實(shí)施方案中，步驟a)由用如上文限定的"反義"類型的核酸轉(zhuǎn)化在其基因組內(nèi)包含等位基因(A)的植物并選擇不再含有等位基因(A)的植物組成。可以通過使用同源重組技術(shù)獲得相同的結(jié)果，所述技術(shù)的目的是用使得不能獲得相應(yīng)于等位基因(A)的表型的具有受損結(jié)構(gòu)的核酸取代核酸(NA)的全部或部分。這種具有受損結(jié)構(gòu)的核酸可以是調(diào)節(jié)多核苷酸(Pa)或編碼改變的ACCS蛋白質(zhì)的核酸。因此本發(fā)明的一個目的是提供用于產(chǎn)生屬于葫蘆科并具有兩性花的轉(zhuǎn)化植物的方法，所述方法的特征在于包括如下步驟a)用調(diào)節(jié)多核苷酸(Pa)或用編碼改變的ACCS蛋白質(zhì)的核酸或包含這種核酸的重組載體轉(zhuǎn)化包含等位基因(A)的感興趣植物的至少一個植物細(xì)胞，b)選擇在步驟a)中獲得的在基因組內(nèi)整合了至少一個拷貝的調(diào)節(jié)多核苷酸(Pa)或編碼改變的ACCS蛋白質(zhì)的核酸的轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，c)從在步驟b)中獲得的的轉(zhuǎn)化的細(xì)胞再生轉(zhuǎn)化的植物，d)對步驟c)中獲得的植物進(jìn)行雜交育種以獲得不再含有等位基因(A)的植物。這類方法特別有用，因?yàn)槠涫沟每梢垣@得不再含有任何等位基因(A)的植物，并且所述植物是雄性兩性同體或兩性類型。本發(fā)明也涉及用于轉(zhuǎn)化植物的方法，所述方法的目的是插入等位基因(G)。因此本發(fā)明的一個目的是提供用于產(chǎn)生屬于葫蘆科并具有雌性花的轉(zhuǎn)化植物的方法，所述方法的特征在于包括如下步驟a)用核苷酸序列(NG)或包含這個核酸的重組載體轉(zhuǎn)化在其基因組內(nèi)不包含等位基因(G)的感興趣植物的至少一個植物細(xì)胞，b)選擇在步驟a)中獲得的具有整合進(jìn)基因組中的核酸(NG)的轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，c)從在步驟b)中獲得的轉(zhuǎn)化的細(xì)胞再生轉(zhuǎn)化的植物。本發(fā)明也涉及用于轉(zhuǎn)化植物的方法，所述方法的目的是用等位基因(g)取代等位基因(G)。因此本發(fā)明的一個目的是提供用于產(chǎn)生屬于葫蘆科并具有兩性花的轉(zhuǎn)化植物的方法，所述方法的特征在于包括如下步驟a)在植物中用等位基因(g)取代等位基因(G)，b)選擇在步驟a)中獲得的具有整合進(jìn)基因組中的等位基因(g)的轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，c)從在步驟b)中獲得的轉(zhuǎn)化的細(xì)胞再生轉(zhuǎn)化的植物，d)對步驟c)中獲得的植物進(jìn)行雜交育種以獲得不再含有任何等位基因(G)的植物。上述方法可以通過基于表1組合起來，以獲得僅具有雌性或僅具有兩性表型的植物，上文已經(jīng)討論過所述植物的工業(yè)用處。為了簡化用于產(chǎn)生僅具有雌性花或僅具有兩性的轉(zhuǎn)化植物的方法，可以在上文定義的方法中進(jìn)行一個預(yù)先步驟在所述步驟中進(jìn)行植物中天然存在的基因(A/a)和(G/g)的突變，所述突變例如通過將轉(zhuǎn)座子M"加or插入進(jìn)具有野生型表型的植物群，之后在得到的具有基因型(aagg)的突變株中進(jìn)行檢測進(jìn)行，所述檢測例如使用實(shí)施例中描述的核苷酸探針或引物進(jìn)行。在這個優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的轉(zhuǎn)化植物的特征在于其含有基因型(aagg)并僅具有兩性花。在用于產(chǎn)生如上文限定的轉(zhuǎn)化植物的方法的一個實(shí)施方案中，當(dāng)使用時(shí)，核苷酸(NA)包含可誘導(dǎo)激活調(diào)節(jié)多核苷酸(PA)。因此本發(fā)明的一個目的也是提供用于產(chǎn)生植物種子的方法，所述種子當(dāng)發(fā)育時(shí)產(chǎn)生具有雌性花的植物，所述方法包括如下步驟a)培養(yǎng)在其基因組中不包含如上限定的等位基因(A)的感興趣的植物，所述植物用包含可誘導(dǎo)激活調(diào)節(jié)多核苷酸(PA)的核苷酸序列(NA)或用包含這個核酸的重組載體轉(zhuǎn)化在不存在誘導(dǎo)信號(所述可誘導(dǎo)激活調(diào)節(jié)多核苷酸對其敏感)的情況下，b)將a)中限定的轉(zhuǎn)化植物與所述可誘導(dǎo)激活信號(所述可誘導(dǎo)激活多核苷酸對其敏感)接觸，c)回收成熟種子，所述種子當(dāng)發(fā)育時(shí)僅產(chǎn)生具有雌性花的植物。在一個進(jìn)一步的實(shí)施方案中，可誘導(dǎo)阻抑調(diào)節(jié)多核苷酸(Pa)用于取代植物中天然存在的調(diào)節(jié)多核苷酸，并且使得可以在預(yù)定時(shí)間降低ACCS蛋白質(zhì)水平。-舒產(chǎn)全鵬存微花離激游汰遂游灘最優(yōu)選地，本發(fā)明涉及用于產(chǎn)生僅具有雌性花的植物的方法，所述方法的特征在于由如下組成-通過進(jìn)行上述檢測方法檢測等位基因(A)、(a)、(G)和(g),禾口-通過進(jìn)行如上文限定的選擇方法或用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)化植物的方法獲得包含至少一個拷貝的等位基因(A)并且不包含等位基因(G)的拷貝的植物。通過上述方法獲得的植物僅具有雌性花，并且因此從工業(yè)角度看特別感興趣，因?yàn)樗鼈儾荒茏曰ㄊ诜?。這些植物因此可以用于選擇方法以獲得雜交植物。舒產(chǎn)做弒鄉(xiāng)花離麟汰遂游膽最優(yōu)選地，本發(fā)明涉及用于產(chǎn)生僅具有兩性花的植物的方法，所述方法的特征在于由如下組成--通過進(jìn)行上述限定的檢測方法檢測等位基因(A)、(a)、(G)和(g)，和-通過實(shí)施如上文限定的選擇方法或用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)化植物的方法獲得不包含等位基因(A)的拷貝并且不包含等位基因(G)的拷貝的植物。通過上述方法獲得的植物僅具有兩性花，并且因此從工業(yè)角度看特別感興趣，因?yàn)樗鼈儾荒茏曰ㄊ诜邸＿@些植物因此可以用于產(chǎn)生純植物品系的方法。用于轉(zhuǎn)化本發(fā)明的植物的方法用于將核酸導(dǎo)入植物細(xì)胞的最廣泛應(yīng)用的方法可以用于本發(fā)明中。轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞可以使用各種方法實(shí)現(xiàn)，所述方法例如通過在將植物原生質(zhì)體在存在二價(jià)陽離子(^3++)的情況下在聚乙二醇溶液中保溫之后將上文提到的載體轉(zhuǎn)移進(jìn)所述植物原生質(zhì)體、通過電穿孔(Frommetal.1985)、使用基因槍、或通過胞質(zhì)或核顯微注射(Neuhausetal，1987)進(jìn)行?？梢杂糜诒景l(fā)明的用于轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的一種方法包括用包含具有感興趣序列的載體的細(xì)菌宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)染植物細(xì)胞。所述宿主細(xì)胞可以是根瘤土壤桿菌(Anet1986)或發(fā)根土壤桿菌(Ar/n!zoge"as)(Guercheet1987)。優(yōu)選地，轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞通過使用雙元系統(tǒng)(Watsonetal.,1994)進(jìn)行的根瘤土壤桿菌的根癌誘導(dǎo)Ti染色體外環(huán)狀質(zhì)粒的T區(qū)轉(zhuǎn)移實(shí)現(xiàn)。為此目的，制備兩個載體。在其中一個載體中，通過缺失移除除了左右邊界之外的DNA-T區(qū)，在所述左右邊界之間插入基因標(biāo)記以使得能夠在植物細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行選擇。所述雙元系統(tǒng)的第二個成員是輔助Ti質(zhì)粒，其是不再含有任何DNA-T但是仍舊含有轉(zhuǎn)化所述植物細(xì)胞所必需的入侵基因Wr的修飾的質(zhì)粒。這個質(zhì)粒在土壤桿菌(^4grak^en'ww)內(nèi)維持。在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，可以將Ishidaetal.(1996)描述的方法用于轉(zhuǎn)化雙子葉植物。根據(jù)另一個方法，所述轉(zhuǎn)化通過Fineretal.(1992)描述的方法使用基因槍用鎢或金顆粒進(jìn)行。42實(shí)施例實(shí)施例l:鑒別單核苷酸多態(tài)性CNP)包含基因(A/a)區(qū)域的啟動子的DNA片段(起始密碼子上游2kb)的序列分析揭示了在5'調(diào)控區(qū)內(nèi)和在內(nèi)含子序列內(nèi)的高水平多態(tài)性，而在蛋白質(zhì)編碼序列內(nèi)僅鑒別出一個偶然突變(圖1A)。核酸上的這個偶然突變導(dǎo)致ACCS蛋白質(zhì)多肽序列在第57位的丙氨酸殘基被纈氨酸殘基取代(圖1B)。通過使用用于推斷氨基酸取代的方法(基于序列和物理性質(zhì)同源性)，已經(jīng)分析了在等位基因"中鑒別的偶然突變是否對于蛋白質(zhì)功能有害。SIFT軟件(NgPCandHenikoffS.,2001)確實(shí)推斷Ala57Val取代對功能A具有高度有害作用。另外蘋果和番茄中的ACC合酶的晶體結(jié)構(gòu)分析(Capitanietal.，2002;Huaietal.,2001)確實(shí)提示這個氨基酸的關(guān)鍵性作用。在鑒別了這個單核苷酸多態(tài)性(或SNP)之后，在30個瓜類種質(zhì)收集物中對單元型和關(guān)聯(lián)性分析揭示出這個SNP與性別表型完全相關(guān)。所有雌雄同體的查詢對象在第57位都攜帶丙氨酸，而所有雄性兩性同體的查詢對象都攜帶纈氨酸。未發(fā)現(xiàn)例外情況，并且在此位置也沒有任何其他類型的氨基酸改變。最后，分析這個單核苷酸多態(tài)性以鑒別可以用于開發(fā)基于所謂"分裂多態(tài)序列標(biāo)記"(CAPS)的消化方法的限制酶。已經(jīng)證明了核苷酸C被核苷酸T取代導(dǎo)致在等位基因"中失去限制位點(diǎn)AkiI。實(shí)施例2:遺傳控制元件(A/a〗的空間和時(shí)間表達(dá)為了分析遺傳控制元件」/"以等位基因^形式的表達(dá)，通過使用等位基因^特異性探針在基因型y!4G^、a"GG、A4gg和"flgg的植物內(nèi)，更特別地在雄性、雌性和兩性植物花分生組織內(nèi)進(jìn)行原位雜交。在花分生組織」中，所述表達(dá)呈現(xiàn)局部高水平，并且雜交信號特別在雌雄同體、雄性兩性同體、兩性花和兩性植物的雌性和兩性花的心皮原基中檢測到。參考對于黃瓜描述的各種花發(fā)育階段(Baietal.,2004)，在瓜類中顯示基因(J/")在花分生組織發(fā)育的早期階段(在雄性花和雌性花之間可能出現(xiàn)形態(tài)學(xué)區(qū)別之前)表達(dá)。在雄性花和兩性中，在花藥中檢測不到表達(dá)。這些結(jié)果提示等位基因(A)在雌性花心皮中的表達(dá)抑制雄蕊發(fā)育。由于兩性花中的隱性等位基因(fl)與雌性花中的等位基因(A)具有相同表達(dá)譜，因此可以得出結(jié)論基因」的功能依賴于其組織表達(dá)特異性和合成的ACCS蛋白質(zhì)的性質(zhì)。實(shí)施例3:在擬南芥64m6Wop^&"http://朋"〗中的轉(zhuǎn)基因基因A/"和ACCS蛋白質(zhì)在不屬于葫蘆科的植物中對花性別表型和花結(jié)構(gòu)的可能作用已經(jīng)通過用土壤桿菌轉(zhuǎn)化擬南芥進(jìn)行了研究。攜帶瓜類等位基因^或a的擬南芥(v4ra&Vfo;^》轉(zhuǎn)基因植物在花結(jié)構(gòu)和長角果水平具有表型(圖2A和2B)。事實(shí)上擬南芥轉(zhuǎn)化子的長角果比野生型擬南芥植物的長角果更短，并且擬南芥轉(zhuǎn)化子的花結(jié)構(gòu)受到高度影響。這些結(jié)果使得能夠?qū)⒐项惢?A/a)的用途擴(kuò)展到不屬于葫蘆科的雙子葉植物。參考文獻(xiàn)Anetal.,(1986)PlantPhysiol.81，86-91AoyamaTetal.,(1997)ThePlantJournal,vol.l1(3):605-612.Ausubeletal"(1997)CurrentprotocolsinmolecularbiologyBaietal.，2004Planta220:230-240Beaucageetal.(1981)，TetrahedronLett.，22:1859-1862.Berbal，1984.Bevanetal.，NucleicAcidsResearch,vol.12:8711-8721.Brownetal.(1979)，MethodsEnzymol"68:109-151.Causseetal.(1995)MolecularBreeding1:259-272.Capitanietal.，2002J.Biol.Chem51:49735-49742Christensenetal.(1996),Transgenic.Res.,5:213Fineretal,(1992)PlantCellReport,11,323-328FROMMM.etal.(1990),Biotechnology,8:833-839GAIT(ed.)，(1984).AnucleicacidHybridization.GORLACHJ,VOLRATHS，KNAUF-BEITERG，HENGYG,BECKHOVEU,KOGELKH,OOSTENDORPM,STAUBT,WARDE,KESSMANNH,RYALSJ.(1996)Benzothiadiazole,anovelclassofinducersofsystemicacquiredresistance,activatesgeneexpressionanddiseaseresistanceinwheat.PlantCell8:629-43GLOVER(ed.),1985.DNACloning:APracticalApproach，VolumesIandIIOligonucleotideSynthesis,MRLPress,Ltd.,Oxford,U.K.Guercheetal.(1987)，MolGen.Genet206,382HAMESandHIGGINS，1985.AnucleicacidHybridization:apracticalapproach,Hames&HigginsEd.IRLPress,Oxford.HAJDUK正WICZ，P.SVAB.Z.ANDMALIGAP.PlantMol.Biol.25(6),989-994(1994).Huaietal.,2001J;Biol.Chem41:38210-38216Ishidaetal.(1996)Naturebiotechnology14,745-750JEFFERSON,1987,PlantMolecularBiologyReporter,vol.5:387-405.Kayetal.,(1987)Science236,4805Kahana，A.,Silberstein,L.,Kessler,N.，Goldstein,R.S.andPerl-Treves，R.(2000)expressionofACCoxidasegenesdiffersamongsexgenotypesandsexphasesincucumber.PlantMolBiol.Nov;41(4):517-528.Kamachi,S.,Sekimoto，H.,Kondo，N.&Sakai，S.,(1997).CloningofacDNAfora1-aminocyclopropane-l-carboxylatesynthasethatisexpressedduringdevelopmentoffemaleflowersattheapicesofCucumissativusL.ThePlantCellPhysiol"38:1197-206.KohlerGandMilsteinC;，(1975),Nature,volume256:495KOOTER,JM.，MATZKE,MA"ANDMEYER,P.(1999)Listeningtothesilentgenes:transgenesilencing,generegulationandpathogencontrol.TrendsPlantSci.4,430-437Kozboretal.，(1983)，Hybridoma，vol.2(1):7曙16.LegerOJetal.，(1997),HumAntibodies,vol.8(1):3-16MartineauPetal.，(1998)，J.Mol.Biol,vol.280(l):l17-127.Martinez,A.,Sparks,C.，Hart，CA.,tompson,J.，andJepson，I.(1999)Ecdysoneagonistinducibletranscriptionintransgenictobaccoplants.Plant丄19:97-106McNELLISTW，1998,ThePlantJournal,vol.14(2):247-257MolinaA,HuntMD,RyalsJA(1998)Impairedflmgicideactivityinplantsblockedindiseaseresistancesignaltransduction.PlantCell10:1903-14NARANGetal.(1979),MethodsEnzymol"68:90-98.Neuhausetal.,(1987).Theor.Appl.Genet.75(1),30-36NgPCandHenikoffS.(2001)GenomeRes.11(5):863-874ReinmannKAetal.(1997),AidsRes.Humretroviruses,vol.13(11):933畫943.RidderR.etal.，(1995),Biotechnology(NY),vol.13(3):255國260.SALTERMGetal.，1998，vol.16(1):127-132Risser,G.andRode,J.C,，1979.Inductionparlenitrated，argentdefleursstamin6eschezdesplantesgynoi'quesdemelon(CucumismeloL.).Annalesde1，Am61iorationdesPlantes，29:349-352.Rudich,J.，Halevy，A.H.andKedar,N.,1969.IncreaseoffemalenessofthreecucurbitsbytreatmentwithEthrel,anethylene-releasingcompound.Planta,86:69-76.Sambrooketal"(2001)，MolecularCloningA-laboratorymanualSanchezPescador，(1988),J.Clin.Microbiol"26(10):1934-1938.Urdeaetal.(1988)，NucleicAcidsResearch,11:4937-4957.WASSENEGGER，M.，ANDP總LISSIER，T.(1998)AmodelforRNA-mediatedgenesilencinginhigherplantsPlantMol.Biol.37,349-362Watsonetal.(1994)ADNrecombinant,Ed.DeBoekUniversity273-292YANGF.MOSSLG,PHILIPSGNJR.Nat.Biotechnol.19%Oct.14(10):1246國51.YANGTT,CHENGL.KAINSR，NucleicacidsRes.1996,Novembre15;24(22):4592-3.權(quán)利要求1.用于控制雙子葉植物花類型發(fā)育的遺傳系統(tǒng)，所述系統(tǒng)包括兩個遺傳控制元件的組合，其分別是-以顯性等位基因(A)和隱性等位基因(a)的形式存在于雙子葉植物中的第一遺傳控制元件(A/a)，其中-所述顯性等位基因(A)由核酸(NA)組成，所述核酸包括(i)在雙了葉植物中發(fā)揮功能的調(diào)節(jié)多核苷酸(PA)，和(ii)表達(dá)被所述調(diào)節(jié)多核苷酸(PA)調(diào)節(jié)的核酸，所述核酸編碼序列SEQIDN°3所示的ACCS蛋白質(zhì)，-所述隱性等位基因(a)與所述顯性等位基因(A)通過如下區(qū)別(1)在所述植物中不存在的核酸(NA)，或(ii)在雙子葉植物中非功能性的調(diào)節(jié)多核苷酸(Pa)，或(iii)編碼非活性ACCS蛋白質(zhì)的核酸，或(iv)在雙子葉植物中非功能性的調(diào)節(jié)多核苷酸(Pa)，和編碼非活性ACCS蛋白質(zhì)的核酸，和-以顯性等位基因(G)和隱性等位基因(g)的形式存在于雙子葉植物中的第二遺傳控制元件(G/g)，其中-所述顯性等位基因(G)由核酸(NG)組成，所述核酸的表達(dá)引起雄性兩性同體或雌雄同體植物的發(fā)育，和-所述隱性等位基因(g)與所述顯性等位基因(G)通過如下區(qū)別(i)在所述植物中不存在的核酸(NG)，或(ii)在雙子葉植物中存在核酸(Ng)，所述核酸表達(dá)引起兩性或全雌性植物的發(fā)育，條件是所述第一遺傳控制元件已經(jīng)被人工插入進(jìn)所述雙子葉植物。2.權(quán)利要求1的系統(tǒng)，其特征在于所述遺傳控制元件(A/a)是以與等位基因(a)相比是顯性的等位基因(A)的形式存在的核酸，其中-所述等位基因(a)包含(i)在雙子葉植物中發(fā)揮功能的調(diào)節(jié)多核苷酸(PA)，和(ii)被所述調(diào)節(jié)多核苷酸(PA)調(diào)節(jié)的核酸，所述核酸編碼序列SEQIDN°3所示的ACCS蛋白質(zhì)，和-所述等位基因(a)與所述等位基因(A)的區(qū)別在于其包含(i)在雙子葉植物中非功能性的調(diào)節(jié)多核苷酸(Pa)，或(ii)編碼非活性ACCS蛋白質(zhì)的核酸，或(iii)在雙子葉植物中非功能性的調(diào)節(jié)多核苷酸(Pa)和編碼非活性ACCS蛋白質(zhì)的核酸。3.權(quán)利要求1或2的系統(tǒng)，其特征在于編碼ACCS蛋白質(zhì)的核酸從5'末端至3'末端至少包含(iv)與序列SEQIDN°l的核苷酸5907至核苷酸6086的多核苷酸具有至少95%相同性的序列，(v)與序列SEQIDN°l的核苷酸6181至核苷酸6467的多核苷酸具有至少95%相同性的序列，和(vi)與序列SEQIDN°l的核苷酸7046至核苷酸7915的多核苷酸具有至少95%相同性的序列。4.權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)的系統(tǒng)，其特征在于所述調(diào)節(jié)多核苷酸(PA)包含序列SEQIDN°1的核苷酸1至核苷酸5906的核苷酸序列。5.權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)的系統(tǒng)，其特征在于所述調(diào)節(jié)多核苷酸(Pa)包含序列SEQIDN°2的核苷酸1至核苷酸3650的核苷酸序列。6.權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)的系統(tǒng)，其特征在于所述調(diào)節(jié)多核苷酸(PA)和/或所述調(diào)節(jié)多核苷酸(Pa)對于誘導(dǎo)信號的作用敏感。7.權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)的系統(tǒng)，其特征在于所述調(diào)節(jié)多核苷酸(PA)是可誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄或翻譯激活多核苷酸。8.權(quán)利要求1-7任一項(xiàng)的系統(tǒng)，其特征在于所述調(diào)節(jié)多核苷酸(Pa)是可誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄或翻譯阻抑多核苷酸。9.一種核酸，從5'末端到3'末端至少包含(iv)與序列SEQIDN。1的核苷酸5907至核苷酸6086的多核苷酸具有至少95%相同性的序列，(v)與序列SEQIDN。1的核苷酸6181至核苷酸6467的多核苷酸具有至少95%相同性的序列，和(vi)與序列SEQIDN。1的核苷酸7046至核苷酸7915的多核苷酸具有至少95%相同性的序列。10.呈等位基因(A)形式的序列SEQIDN。1的核酸，例如如權(quán)利要求2中所限定的。11.呈等位基因(a)形式的序列SEQIDN。2的核酸，例如如權(quán)利要求2中所限定的。12.—種核酸，包含序列SEQIDN。1的核苷酸1至核苷酸5906的核苷酸序列。13.—種包含核苷酸序列的核酸，與序列SEQIDN°l的核苷酸1至核苷酸5907的核酸對比，所述核苷酸序列包含選自取代、插入或缺失的改變，與由序列SEQIDN°l的核苷酸1至核苷酸5907的核酸控制的ACCS蛋白質(zhì)的表達(dá)相比，所述改變的核酸當(dāng)控制序列SEQIDN。3所示的ACCS蛋白質(zhì)的表達(dá)時(shí)導(dǎo)致所述蛋白質(zhì)的改變的表達(dá)。14.權(quán)利要求13的核酸，包含序列SEQIDN°2的核苷酸1至核苷酸3650的序列。15.—種重組載體，包含如權(quán)利要求3至8任一項(xiàng)限定的核酸或權(quán)利要求9至14任一項(xiàng)的核酸。16.—種宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞用權(quán)利要求3至8任一項(xiàng)限定的核酸或用權(quán)利要求9至14任一項(xiàng)的核酸或用權(quán)利要求15的重組載體轉(zhuǎn)化。17.權(quán)利要求16的宿主細(xì)胞，其特征在于所述宿主細(xì)胞是屬于葫盧科(cwcw^toceae)優(yōu)選屬于甜瓜物種(cwcwm'sme/o)的植物細(xì)胞。18.屬于葫蘆科的植物，所述植物用權(quán)利要求3至8任一項(xiàng)限定的核酸或權(quán)利要求9至14任一項(xiàng)的核酸或用權(quán)利要求15的重組載體轉(zhuǎn)化。19.權(quán)利要求18的轉(zhuǎn)化的植物，其特征在于所述植物包含至少一個如權(quán)利要求1中限定的等位基因(A)。20.轉(zhuǎn)化的植物，所述植物包含多個權(quán)利要求16或17的宿主細(xì)胞。21.—種核酸，所述核酸用作探針或引物，其與如權(quán)利要求3至8任一項(xiàng)限定的核酸或權(quán)利要求9至14任一項(xiàng)的核酸特異地雜交。22.權(quán)利要求21的核酸，其與序列SEQIDN°l或SEQIDN°2所示的核酸或其互補(bǔ)序列核酸特異地雜交，其特征在于所述核酸分別選自SEQIDN。7和SEQIDN。8。23.用于檢測如權(quán)利要求1中限定的等位基因(A)或(a)的存在的方法，所述方法包括如下步驟1)使權(quán)利要求21的一個核苷酸探針或多個核苷酸探針與待測樣品接觸；2)檢測在所述探針和樣品中存在的核酸之間可能形成的復(fù)合物。24.用于檢測等位基因(A)或(a)的存在的方法，所述方法包括如下步驟-1)使用引物序列SEQIDN°ll和SEQIDN°12通過PCR擴(kuò)增待分析的樣品中的DNA，2)用限制酶AluI消化得到的產(chǎn)物，和3)檢測產(chǎn)生的限制性片段。25.用于選擇屬于葫蘆科的植物的花類型的方法，其特征在于所述方法包括如下步驟a)在屬于葫蘆科的感興趣的植物中確定如權(quán)利要求1所限定的等位基因(A)和(a)的存在，和b)對在基因組中包含等位基因(A)或等位基因(a)的植物進(jìn)行陽性選擇。26.用于產(chǎn)生屬于葫蘆科并包含雌花的轉(zhuǎn)化植物的方法，其特征在于所述方法包括如下步驟a)用如權(quán)利要求l中限定的核苷酸序列(NA)或包含這個核酸的重組載體轉(zhuǎn)化在基因組內(nèi)不包含如權(quán)利要求1中限定的等位基因(A)的感興趣的植物的至少一個植物細(xì)胞，b)選擇在步驟a)中獲得的具有整合進(jìn)基因組中的核酸(NA)的轉(zhuǎn)化細(xì)胞，c)從在步驟b)中獲得的轉(zhuǎn)化細(xì)胞再生轉(zhuǎn)化植物。27.用于產(chǎn)生屬于葫蘆科并具有兩性花的轉(zhuǎn)化植物的方法，其特征在于所述方法包括如下步驟a)在植物中用如權(quán)利要求1中限定的等位基因(a)取代如權(quán)利要求1中限定的等位基因(A)，b)選擇在步驟a)中獲得的具有整合進(jìn)基因組中的等位基因(a)的轉(zhuǎn)化細(xì)胞，c)從在步驟b)中獲得的轉(zhuǎn)化細(xì)胞再生轉(zhuǎn)化植物，d)對步驟c)中獲得的植物進(jìn)行雜交育種以獲得不再含有如權(quán)利要求1中限定的等位基因(A)的植物。全文摘要本發(fā)明涉及用于控制雙子葉植物花類型發(fā)育的遺傳系統(tǒng)，所述系統(tǒng)包括兩個遺傳控制元件的組合，分別是以顯性等位基因(A)和隱性等位基因(a)的形式存在于雙子葉植物中的第一遺傳控制元件(A/a)和以顯性等位基因(G)和隱性等位基因(g)的形式存在于雙子葉植物中的第二遺傳控制元件(G/g)，條件是所述第一遺傳控制元件已經(jīng)被人工插入進(jìn)所述雙子葉植物。上述系統(tǒng)使得雙子葉植物的花的性別能夠被控制和/或修飾。文檔編號A01H1/00GK101478869SQ200780023952公開日2009年7月8日申請日期2007年4月30日優(yōu)先權(quán)日2006年4月28日發(fā)明者A·不阿郎,A·本達(dá)馬內(nèi),C·多吉蒙,M·費(fèi)爾加尼申請人:國立農(nóng)業(yè)研究所-Inra