專利名稱：：脂肪酸的合成的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及具有去飽和酶、結(jié)合酶、環(huán)氧化酶和/或羥化酶活性的酶，所述的酶可用于合成脂肪酸的方法中。
背景技術(shù)：
：絕大多數(shù)生物體內(nèi)的脂肪酸生物合成的初級產(chǎn)物是16-碳和18-碳化合物。不過，不同物種之間的這些脂肪酸的鏈長度和不飽和程度的相對比例差別很大。例如，哺乳動物和昆蟲主要產(chǎn)生飽和脂肪酸和單不飽和脂肪酸，而絕大多數(shù)高等植物產(chǎn)生具有一個(gè)、兩個(gè)或3個(gè)雙鍵的脂肪酸，后兩者包含多不飽和脂肪酸(PUFA)。PUPA的兩個(gè)主要家族是co-3脂肪酸(也表示為"n-3"脂肪酸)，其代表性實(shí)例為二十碳五烯酸(EPA,20:5，n-3);以及Q)-6脂肪酸(也表示為"n-6"脂肪酸)，其代表性實(shí)例為花生四烯酸(ARA，20:4,n-6)。PUFA是細(xì)胞質(zhì)膜(主要為酯化的磷脂形式)以及脂肪組織甘油三酯的重要組分。細(xì)胞調(diào)節(jié)其膜中的不飽和程度的能力主要取決于脂肪酸去飽和酶的作用。去飽和酶這類酶在其脂肪?；湹孜锏奶囟ㄎ恢锰幰氩伙柡玩I。去飽和酶這類酶通常對底物的鏈長度和脂肪?；溨幸延须p鍵的位置均顯示出相當(dāng)大的選擇性(ShanklinandCahoon，1998)，并可基于此點(diǎn)對其進(jìn)行分類。對脂肪酸去飽和酶的另一種分類基于其底物的烴鏈與哪種部分發(fā)生?；?。去飽和酶識別與?；d體蛋白、與輔酶A、或與脂質(zhì)分子如磷脂相結(jié)合的底物(MurataandWada，1995;ShanklinandCahoon，1998》甘油脂中的脂肪酸去飽和作用對生物膜的正常功能至關(guān)重要。在棕櫚酸或硬脂酸的A9位引入不飽和性給膜脂質(zhì)提供了流動性，因此A9去飽和酶在活的系統(tǒng)中是普遍存在的。亞油酸(LA;18:2，A9,2)是通過A12-去飽和酶從油酸(18:1，A9)產(chǎn)生的，而oc-亞麻酸(ALA;18:3)是通過A15-去飽和酶從LA酸產(chǎn)生的。十八碳四烯酸(18:4，A6,9,12,15)和，亞麻酸(18:3，A6,9，12)是通過A6-去飽和酶分別從ALA和LA產(chǎn)生的。不過，哺乳動物不能在A9位之外去飽和，因此不能將油酸轉(zhuǎn)換為LA。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)14種昆蟲物種(deRenobales，1987)可自"C-乙酸酯從頭產(chǎn)生亞油酸，提示存在天然的A12-去飽和酶活性。家蟋美洲蟋蟀04c/zetoAm^^w)的A12-去飽和酶活性是第一種被報(bào)道可利用油酰-輔酶A的此類酶(Cripps,1990)。不過，盡管付出了廣泛的努力，仍沒有鑒定到昆蟲的負(fù)責(zé)將油酸轉(zhuǎn)化為LA的基因。類似地，哺乳動物不能合成ALA。因此，動物的主要多不飽和脂肪酸是通過對膳食中的LA和ALA進(jìn)行去飽和并延長而自膳食中得到的。其他的真核細(xì)胞，包括真菌、線蟲和植物，具有在碳12和碳15位置處去飽和的酶。擬南芥0^06^/0;71^sp.)和大豆的膜相關(guān)性A12去飽和酶利用酰基脂質(zhì)底物。較為少見地，可利用具有少見型特異性的去飽和酶首先在9位之外的其他位置對飽和脂肪酸迸行不飽和化。傘狀花科(傘形科)、五加科和絞木科(Ganyaceae灘物的種子油中富含巖芹酸(順式-6沖八碳烯酸)，可達(dá)到總脂質(zhì)脂肪酸的85%(KleimanandSpencer,1982)。已經(jīng)表征了來自芫荽子(芫荽(Cbn'a"&M附ra"vwm))的去飽和酶，其產(chǎn)生這種少見型脂質(zhì)。一種定位于質(zhì)體的?；??；d體蛋白(ACP)A4去飽和酶作用于ACP-棕櫚酸以產(chǎn)生順式-4-十六碳烯酸，后者被從質(zhì)體轉(zhuǎn)移至發(fā)育的種子，并在種子內(nèi)延長為順式-6-十八碳烯酸(Cahoon等1992)。從英國常青藤(7/^/ra&//xL.)中得到了一種具有83%序列相同性的有關(guān)的去飽和酶，當(dāng)在擬南芥中表達(dá)時(shí)，其產(chǎn)生順式-4-十六碳烯酸和順式-6-十八碳烯酸(WWttle等2005)。順式-5-二十碳烯酸(C20:lA5)是白芒花(丄/w"朋/;^/6")和有關(guān)丄/w""Aas物種的種子油的主要成分。在荷包蛋花(丄.Awg/"w7)中負(fù)責(zé)產(chǎn)生這種少見型油的酶已經(jīng)被鑒定為是?；o酶A-A5去飽和酶，其底物偏向性是花生酸(Cahoon等，2000)。在大豆胚芽中表達(dá)荷包蛋花A5去飽和酶和脂肪酸鏈延長酶(elongase)基因?qū)е庐a(chǎn)生順式-5畫二十碳烯酸(C20:lA5)和順式-5-二十二碳烯酸(C22:lA5)。Sayanova等(2007)已經(jīng)鑒定了一種酰基輔酶A-A5去飽和酶，其與Zim"W/^sp.去飽和酶有關(guān)但其利用飽和脂肪酸(C16:0，C18:0)和不飽和脂肪酸(LA,ALA)來產(chǎn)生A5一烯酸和多不飽和脂肪酸。在動物中沒有克隆到如昆蟲中的編碼類似的酶的基因。作為產(chǎn)生多種蛾性信息素過程的一個(gè)步驟，一些鱗翅目昆蟲對與?；o酶A酯化的飽和脂肪酸(C16:0，C18:0)進(jìn)行All去飽和作用(Rodriguez等2004)。在釀酒酵母CSacc/wraw^cescereWw'ae)中表達(dá)來自?；页嵋苟闏^^/o/tera/故0/^//》的去飽和酶，使得當(dāng)給該酵母細(xì)胞提供額外的飽和脂肪酸時(shí)，產(chǎn)生了C14:0、C16:0和C18:0的順式-A11單不飽和產(chǎn)物(Rodriguez等2004)。此外，從提供給該酵母的豆蔻酸(C14:0)形成了反式-A11十四碳烯酸。All去飽和作用的一種次要的副產(chǎn)品是形成11-羥基十六垸酸或硬脂酸(高達(dá)總脂肪酸的0.1%)(Serra等，2006)。Moto等(2004)從蠶蛾的信息素腺中鑒定了一種雙官能?；o酶A去飽和酶，其負(fù)責(zé)信息素前體分子的生物合成。該去飽和酶首先利用棕櫚酸產(chǎn)生順式-ll-十六碳烯酸，然后作用于該分子以除去烯丙型2H并形成共軛二烯脂肪酸(反式-A10,順式-A12-十六碳二烯酸(trans-A10,cis-A12-hexadecendienoicacid)和一些反式-A10,反式12-十六碳二烯酸)，因此其同時(shí)具有順式-All和結(jié)合酶去飽和酶活性。在新西蘭巻葉螟CP/^o/oWAo"o)中，鑒定了來自信息素腺的去飽和酶，其在A10位置使得棕櫚酸去飽和以形成順式-A10-十六碳烯酸(Hao等2002)?，F(xiàn)在廣泛認(rèn)為co-3LC-PUFA是對于人和動物健康十分重要的化合物，在人類膳食中添加co-3LC-PUFA例如EPA和DHA可帶來多種與健康有關(guān)的益處。這些包括預(yù)防或減輕冠心病，高血壓，2型糖尿病，腎病，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎,潰瘍性結(jié)腸炎，慢性阻塞性肺病，多種精神疾病例如精神分裂癥，注意力缺陷多動癥和阿爾茨海默氏病，并有助于腦的發(fā)育和生長(Simopoulos,2000)。這些脂肪酸可得自膳食來源或通過轉(zhuǎn)化亞油酸(LA，co-6)或oc-亞麻酸(ALA,co-3)等脂肪酸人獲得，亞油酸(LA,co-6)或ot-亞麻酸(ALA,co-3)均被認(rèn)為是人類膳食的必需脂肪酸。盡管人類和許多其他脊椎動物能夠?qū)碜灾参锏腖A或ALA轉(zhuǎn)化為LC-PUFA，但該轉(zhuǎn)化作用的速度極低。此外，大多數(shù)現(xiàn)代社會的膳食失衡，其中至少90%的多不飽和脂肪酸是0)-6脂肪酸，而不是4:1或更低的理想的to-6池-3脂肪酸比例(Trautwein，2001)。人類的LC-PUFA例如二十碳五烯酸(EPA，20:5)和二十二碳六烯酸(DHA，22:6)的直接膳食來源最主要的是魚類或魚油。健康專家因此建議將含有高水平LC-PUFA的魚類規(guī)律納入人類膳食。來自魚類的LC-PUFA油越來越多地被加入到食品和嬰兒配方中。不過，由于全球和國家水產(chǎn)業(yè)的下滑，因此需要給這些有益健康的油類找到替代性來源。脂肪酸也可以是羥化的，例如蓖麻油斷12-羥基沖八碳-順式-9-烯酸)，其在來自蓖麻("c/m^commwm》的蓖麻油的脂肪酸中占到高達(dá)卯％，并且是重要的農(nóng)業(yè)商品油。植物油中的其他有關(guān)羥化脂肪酸包括12-羥基-十八碳-順式-9，順式-15-二烯酸(densipolicacid)和14-羥基-二十-順式-11,順式-17-二烯酸(auricolicacid)。蓖麻屬A12羥化酶作用于油酸脂質(zhì)底物以產(chǎn)生蓖麻油酸；負(fù)責(zé)這一轉(zhuǎn)化作用的去飽和酶基因與植物膜A12?；|(zhì)去飽和酶關(guān)系最為密切，但有不同(vandeLoo等1995)。Z^weW/a物種的種子油中存在高水平的與14-羥基-二十-順式-ll-烯酸(lesquerolicacid)同源的C20羥化脂肪酸(Gunstone等，1994)。L/e"d/m'羥化酶基因己經(jīng)被克隆并表達(dá)于擬南芥FAD2突變體，該突變體的種子中積聚了蓖麻油酸、lesquerolicacid和densipolicadd(Broun等1998)。植物和動物的鞘脂中存在可感知量的2-羥基脂肪酸，但它們同樣作為較小的成分存在于種子油中，例如來自百里香(77^/m^v"/g"n》種子的2-羥基-十八碳-9,12，15-三烯酯，而2-羥基-油酸和亞油酸見于Sa/Wam7ofca(Smith,1971;BadamiandPatil，1981)。脂肪酸也可包含環(huán)氧基。最熟知的環(huán)氧脂肪酸是來自斑鳩菊屬(F^"oWa)物種和五w;^orZ^/ag^cae的種子油的斑鳩菊酸(vemolicacid)(12，13-環(huán)氧基-十八碳-順式-9-烯酸)(CuperusandDerksen，1996)。C.;^/a"""a的環(huán)氧化物酶基因與植物膜A12-油酸去飽和酶相關(guān)但有不同，該基因已經(jīng)被功能性表征，并發(fā)現(xiàn)其利用亞油酸作為底物(Lee等1998)。在一些生物體中，通過結(jié)合酶產(chǎn)生了共軛脂肪酸(Crombie等，1984;Crombie等，1985;Fritsche等,1999;Cahoon等，2001;Qiu等，2001)。共軛脂肪酸如calendulicacid、桐油酸或石榴酸的生物合成如下進(jìn)行，通過A12-去飽和酶將油酸去飽和為亞油酸，并通過特異性形成共軛三烯(conjutriene)的去飽和酶(結(jié)合酶)進(jìn)一步去飽并結(jié)合Z9-或Z12-雙鍵重排產(chǎn)生共軛三烯脂肪酸(conjutrienicfattyacid)。仍需要在重組細(xì)胞中產(chǎn)生脂肪酸以及更加高效產(chǎn)生脂肪酸的其他方法或產(chǎn)生新脂肪酸的方法。本說明書中對文獻(xiàn)、法案、材料、裝置、物品等等的任何討論的目的僅在于提供本發(fā)明的背景。不應(yīng)理解為承認(rèn)它們的任何或全部如同在本申請各項(xiàng)權(quán)利要求的優(yōu)先權(quán)日之前已經(jīng)存在一樣構(gòu)成了現(xiàn)有技術(shù)基礎(chǔ)或者是本發(fā)明所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
的公知常識
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明人已經(jīng)從鞘翅目和直翅目昆蟲中鑒定到了一些新的酶，它們具有去飽和酶、結(jié)合酶、環(huán)氧化物酶、和/或羥化酶活性。因此，本發(fā)明提供真核細(xì)胞，其包含編碼多肽的外源核酸，所述多肽是(i)包含SEQIDNO:16至30、73至78、80和134中任一氨基酸序列的多肽，(ii)包含與SEQIDNO:16至30、73至78、80和/或134中的一或多個(gè)序列具有至少50%相同性的氨基酸序列的多肽，和/或(iii)i)或ii)的生物學(xué)活性片段，其中所述多肽具有選自去飽和酶、結(jié)合酶、環(huán)氧化酶和羥化酶活性中的一或多種活性。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述多肽可分離自鞘翅目或直翅目昆蟲?？蓮闹蟹蛛x到所述多肽的昆蟲物種包括，但不限于，擬谷盜屬(7W&^m)、花螢屬((^^//0^7^/21^)或蟋蟀(^￡^她)。在一個(gè)實(shí)施方式中，由所述外源核酸編碼的多肽是(i)包含SEQIDNO:28、73和/或134中任一氨基酸序列的多肽，(ii)包含與SEQIDNO:28、73禾卩/或134中的一或多個(gè)序列具有至少50%相同性的氨基酸序列的多肽，和/或(iii)i)或ii)的生物學(xué)活性片段，其中所述多肽具有?；o酶AA12去飽和酶活性。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述多肽是(i)包含SEQIDNO:18或SEQIDNO:19的氨基酸序列的多肽，(ii)包含與SEQIDNO:18或SEQIDNO:19的序列具有至少50°/。相同性的氨基酸序列的多肽，和域(iii)i)或ii)的生物學(xué)活性片段，其中所述多肽具有?；o酶AA5去飽和酶活性。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述多肽是-(i)包含SEQIDNO:17、22、23、27、29、74、75和/或76中任一氨基酸序列的多肽，(ii)包含與SEQIDNO:17、22、23、27、29、74、75和/或76中的一或多個(gè)序列具有至少50%相同性的氨基酸序列的多肽，和/或14(iii)i)或ii)的生物學(xué)活性片段，其中所述多肽具有?；o酶AA9去飽和酶活性。是本發(fā)明人首次鑒定了編碼的酰基輔酶AA12去飽和酶的核酸。因此，本發(fā)明提供真核細(xì)胞，其包含編碼酰基輔酶AA12去飽和酶的外源核酸。在一個(gè)實(shí)施方式中，?；o酶AA12去飽和酶包含(i)SEQIDNO:28、73和/或134中任一氨基酸序列，(ii)與SEQIDNO:28、73禾卩/或134中的一或多個(gè)序列具有至少50%相同性的氨基酸序列，和/或(iii)i)或ii)的生物學(xué)活性片段。在一個(gè)實(shí)施方式中，相對于缺乏所述外源核酸的相應(yīng)真核細(xì)胞而言，所述真核細(xì)胞含有水平升高的16:2卑12和/或18:2鄭12脂肪酸。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述真核細(xì)胞含有水平升高的與輔酶A酯化的16:2A，2和/或18:2A，2脂肪酸。本發(fā)明人還首次鑒定到了這樣的酰基輔酶AA5去飽和酶，與多種其他底物相比，所述的酶對18:0和/或16:0脂肪酸底物具有偏向性。因此，在另一方面本發(fā)明提供真核細(xì)胞，其包含編碼?；o酶AA5去飽和酶的外源核酸，其中所述去飽和酶對18:0和/或16:0底物的活性高于其對與輔酶A酯化的脂肪酸底物的活性，其中所述脂肪酸是18:1A9、16:1A9、20:0和20:2A11A"中的任意一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)或全部。在一個(gè)實(shí)施方式中，酰基輔酶AA5去飽和酶包含(i)SEQIDNO:18或SEQIDNO:19的氨基酸序列，(ii)與SEQIDNO:18或SEQIDNO:19具有至少50%相同性的氨基酸序列，和/或(iii)i)或ii)的生物學(xué)活性片段。在另一個(gè)實(shí)施方式中，相對于缺乏所述外源核酸的相應(yīng)真核細(xì)胞而言，所述真核細(xì)胞含有水平升高的16:lAS和/或18:lAS脂肪酸。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述真核細(xì)胞含有水平升高的與輔酶A酯化的16:lAs和/或18:lAs脂肪酸。本發(fā)明人還首次鑒定到了這樣的酰基輔酶AA9去飽和酶，其對14:0底物的活性高于其對與輔酶A酯化的某些脂肪酸底物的活性。因此，在另一方面本發(fā)明提供真核細(xì)胞，其包含編碼?；o酶A八9去飽和酶的外源核酸，其中所述去飽和酶對14:0底物的活性高于其對與輔酶A酯化的脂肪酸底物的活性，其中所述脂肪酸是16:0和/或18:0。在一個(gè)實(shí)施方式中，?；o酶AA9去飽和酶包含(i)SEQIDNO:23或SEQIDNO:74的氨基酸序列，(ii)與SEQIDNO:23或SEQIDNO:74具有至少50%相同性的氨基酸序列，和/或(iii)i)或ii)的生物學(xué)活性片段。在一個(gè)具體的實(shí)施方式中，相對于缺乏所述外源核酸的相應(yīng)真核細(xì)胞，所述真核細(xì)胞含有水平升高的14:1A9。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述真核細(xì)胞含有水平升高的與輔酶A酯化的14:1A9。優(yōu)選地，包含所述外源核酸的真核細(xì)胞是植物細(xì)胞、哺乳動物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞、真菌細(xì)胞或酵母細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述真核細(xì)胞位于植物或植物種子內(nèi)。優(yōu)選地，所述植物或植物種子分別是油料種子植物或油料種子。本發(fā)明的一個(gè)方面提供了用于鑒定參與改變脂肪酸的核酸分子的方法，其包括(i)獲得可操縱地連接于啟動子的核酸分子，所述核酸分子編碼一包含氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列與SEQIDNO:28的關(guān)聯(lián)比其與SEQIDNO:135的關(guān)聯(lián)更密切，(ii)將所述核酸分子導(dǎo)入所述啟動子在其中具有活性的細(xì)胞或無細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)，(iii)確定脂肪酸組成相對于導(dǎo)入所述核酸分子之前的該細(xì)胞或無細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)是否被改變，以及(iv)任選地，選擇改變所述脂肪酸組成的核酸分子。在另一方面本發(fā)明提供用于鑒定參與改變脂肪酸的核酸分子的方法，其包括(i)獲得可操縱地連接于啟動子的核酸分子，所述核酸分子編碼一包含氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列與SEQIDNO:28、73、和域134中的一或多個(gè)序列具有至少50%的相同性，(ii)將所述核酸分子導(dǎo)入所述啟動子在其中具有活性的細(xì)胞或無細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)，(iii)確定脂肪酸組成相對于導(dǎo)入所述核酸分子之前的該細(xì)胞或無細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)是否被改變，以及(iv)任選地，選擇改變所述脂肪酸組成的核酸分子。在一個(gè)實(shí)施方式中，步驟(iv)包括選擇一種核酸分子，其編碼?；o酶AA12去飽和酶。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述改變的脂肪酸組成包含水平升高的16:2A9'A'2和/或18:2A9'A12。本發(fā)明還提供用于鑒定參與改變脂肪酸的核酸分子的方法，其包括(i)獲得可操縱地連接于啟動子的核酸分子，所述核酸分子編碼一包含氮基酸序列的多肽，所述氨基酸序列與SEQIDNO:18和/或19中的一或多個(gè)序列具有至少50%的相同性，(ii)將所述核酸分子導(dǎo)入所述啟動子在其中具有活性的細(xì)胞或無細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)，(iii)確定脂肪酸組成相對于導(dǎo)入所述核酸之前的所述細(xì)胞或無細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)是否被改變，和(iv)任選地，選擇改變所述脂肪酸組成的核酸分子。在一個(gè)實(shí)施方式中，步驟(iv)包括選擇一種核酸分子，其編碼?；o酶AA5去飽和酶，其中所述去飽和酶對18:0禾口/或16:0底物的活性高于其對與輔酶A酯化的脂肪酸底物的活性，其中所述脂肪酸是18:1A9、16:1A9、20:0和20:2MiA"中的任意一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)或全部。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述改變的脂肪酸組成包含水平升高的16:1^和/或18:"5脂肪酸。本發(fā)明還提供用于鑒定參與改變脂肪酸的核酸分子的方法，其包括(i)獲得可操縱地連接于啟動子的核酸分子，所述核酸分子編碼一包含氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列與SEQIDNO:17、22、23、27、29、74、75和/或76中的一或多個(gè)序列具有至少50%的相同性，(ii)將所述核酸分子導(dǎo)入所述啟動子在其中具有活性的細(xì)胞或無細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)，(iii)確定脂肪酸組成相對于導(dǎo)入所述核酸之前的所述細(xì)胞或無細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)是否被改變，和17(iv)任選地，選擇改變所述脂肪酸組成的核酸分子。在一個(gè)實(shí)施方式中，步驟(iv)包括選擇一種核酸分子，其編碼?；o酶AA9去飽和酶，其中所述去飽和酶對14:0底物的活性高于其對與輔酶A酯化的脂肪酸底物的活性，其中所述脂肪酸是16:0禾口/或18:0。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述改變的脂肪酸組成包含水平升高的14:1A9。在另一個(gè)實(shí)施方式中，由所述核酸分子編碼的多肽是昆蟲多肽或其突變體。本發(fā)明還提供基本上純化的多肽或重組多肽，其是?；o酶AA12去飽和酶。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述多肽是(i)包含SEQIDNO:28、73和/或134中任一氨基酸序列的多肽，(ii)包含與SEQIDNO:28、73和/或134中的一或多個(gè)序列具有至少50%相同性的氨基酸序列的多肽，和域(iii)i)或ii)的生物學(xué)活性片段。本發(fā)明還提供基本上純化的多肽或重組多肽，其是?；o酶AA5去飽和酶，其中所述去飽和酶對18:0和/或16:0底物的活性高于其對與輔酶A酯化的脂肪酸底物的活性，其中所述脂肪酸是18:1A9、16:1A9、20:0和20:2A11A14中的任意一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)或全部。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述多肽是(i)包含SEQIDNO:18或SEQIDNO:19的氨基酸序列的多肽，(ii)包含與SEQIDNO:18和/或SEQIDNO:19具有至少50%相同性的氨基酸序列的多肽，和域(iii)i)或ii)的生物學(xué)活性片段。本發(fā)明還提供基本上純化的多肽或重組多肽，其是酰基輔酶AA9去飽和酶，其中所述去飽和酶對14:0底物的活性高于其對與輔酶A酯化的脂肪酸底物的活性，其中所述脂肪酸是16:0和域18:0。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述多肽是(i)包含具有SEQIDNO:17或SEQIDNO:74的氨基酸序列的多肽，(ii)包含與SEQIDNO:17和/或SEQIDNO:74中的一或多個(gè)序列具有至少50%相同性的氨基酸序列的多肽，和/或(iii)i)或ii)的生物學(xué)活性片段。本發(fā)明還提供基本上純化的多肽或重組多肽，其是(i)包含SEQIDN0:16至30、73至78、80和134中任一氨基酸序列的多肽，(ii)包含與SEQIDNO:16至30、73至78、80和/或134中的一或多個(gè)序列具有至少50%相同性的氨基酸序列的多肽，和域(iii)i)或ii)的生物學(xué)活性片段，其中所述多肽具有選自去飽和酶、結(jié)合酶、環(huán)氧化酶和/或羥化酶活性的一或多種活性。優(yōu)選地，所述多肽包含與SEQIDNO:16至30、73至78、80禾H/或134中的一或多個(gè)序列具有至少90%相同性的氨基酸序列。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述多肽可分離自鞘翅目或直翅目昆蟲。優(yōu)選地，所述多肽對脂肪酸的A2至A15位之任一位置處的碳-碳鍵具有去飽和酶活性。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述多肽對C16或C18脂肪酸具有去飽和酶活性。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述多肽是還包含至少一種其他多肽序列的融合蛋白。本發(fā)明還提供分離的和/或外源多核苷酸，其包含-(i)選自SEQIDNO:l至15、67至72、79和133中的任一核苷酸序列，(ii)編碼本發(fā)明多肽的核苷酸序列，(iii)與SEQIDNO:l至15、67至72、79和/或133中的一或多個(gè)序列具有至少50°/。相同性的核苷酸序列，和域(iv)在嚴(yán)格性條件下與(i)至(iii)之任一序列雜交的序列。還提供了包含本發(fā)明的多核苷酸的載體。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述多核苷酸可操縱地連接于啟動子。本發(fā)明還提供一種細(xì)胞，其包含本發(fā)明的重組多肽、本發(fā)明的外源多核苷酸和/或本發(fā)明的載體。優(yōu)選地，細(xì)胞是植物、真菌、酵母、細(xì)菌或動物細(xì)胞。更優(yōu)選地，細(xì)胞是真核細(xì)胞。本發(fā)明還提供產(chǎn)生本發(fā)明的多肽的方法，所述方法包括在細(xì)胞或無細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)本發(fā)明的多核苷酸。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述方法還包括分離所述多肽。本發(fā)明還提供轉(zhuǎn)基因非人類生物體，其包含本發(fā)明的細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方式中，生物體是轉(zhuǎn)基因植物。本發(fā)明還提供包含本發(fā)明的細(xì)胞的種子。本發(fā)明還提供一種油，其產(chǎn)自或得自本發(fā)明的細(xì)胞、本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因非人類生物體、或本發(fā)明的種子。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述油包含脂肪酸16:0、16:1A5、18:0和18:1^，其中所述油中的18:1^的總量與18:0的總量之比在100:1和1:2之間，且其中所述油的脂肪酸包含低于10%或低于5c/。(w/w)的20:1A5。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述油的(:18脂肪酸有至少43%、或至少50%、或至少60%是18:^5。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述油的脂肪酸包含占所述油的總脂肪酸的百分比為至少3.0%(w/w)、或至少5Q/o(w/w)或至少10。/q(w/w)的18:1A5。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述油包含占所述油中的總脂肪酸的百分比為低于10°/。(w/w)、或低于5。/。(w/w)的18:3A9，A12'A15(ALA)。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述油是通過從油料種子中提取油而得到的。本發(fā)明還提供一種油，其包含脂肪酸16:0、16:1A5、18:0和18:1"，其中所述油中的18:1^的總量與18:0的總量之比在100:1和1:2之間，且其中所述油的脂肪酸包含低于10%或低于5。/。(w/w)的20:1A5。本發(fā)明還提供一種油，其包含脂肪酸，其中所述油的C18脂肪酸有至少43%、或至少50%、或至少60%是18:1A5。本發(fā)明還提供一種油，其包含脂肪酸，所述脂肪酸包含占所述油的總脂肪酸的百分比為至少3.0%(w/w)、或至少5Q/。(w/w)或至少10。/。(w/w)的18:1A5。在一個(gè)實(shí)施方式中，油包含占所述油中的總脂肪酸的百分比為低于10%(w/w)、或低于5。/。(w/w)的18:3A9'A12，A15(ALA)。本發(fā)明還提供脂肪酸，其產(chǎn)自或得自本發(fā)明的細(xì)胞、本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因非人類生物體、或本發(fā)明的種子。本發(fā)明還提供產(chǎn)生含不飽和脂肪酸的油的方法，所述方法包括從本發(fā)明的細(xì)胞、本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因非人類生物體、或本發(fā)明的種子中提取油。本發(fā)明還提供一種組合物，其包含本發(fā)明的細(xì)胞、本發(fā)明的多肽、本發(fā)明的多核苷酸、本發(fā)明的載體、本發(fā)明的油或本發(fā)明的脂肪酸。20本發(fā)明還提供包含本發(fā)明的油或本發(fā)明的脂肪酸的詞料(Feedstuffs)、化妝品或化學(xué)制品。本發(fā)明還提供進(jìn)行去飽和酶反應(yīng)的方法，所述方法包括使與輔酶A酯化的飽和脂肪酸、單不飽和脂肪酸或多不飽和脂肪酸底物接觸本發(fā)明的多肽。本發(fā)明還提供基本上純化的抗體或其片段，其特異性結(jié)合本發(fā)明的多肽。本發(fā)明還提供治療或預(yù)防能從PUFA中獲益的疾病的方法，所述方法包括給對象施用本發(fā)明的細(xì)胞、本發(fā)明的多肽、本發(fā)明的多核苷酸、本發(fā)明的載體、本發(fā)明的油、本發(fā)明的脂肪酸和/或本發(fā)明的飼料。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述疾病是心律失常、血管成形術(shù)、炎癥、哮喘、銀屑病、骨質(zhì)疏松、腎結(jié)石、AIDS、多發(fā)性硬化、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、克羅恩氏病、精神分裂癥、癌癥、胎兒酒精綜合征、注意力缺陷多動癥、囊性纖維化、苯丙酮尿癥、單相抑郁癥、攻擊性敵意(aggressivehostility)、腎上腺腦白質(zhì)營養(yǎng)不良、冠心病、高血壓、糖尿病、肥胖、阿爾茨海默氏病、慢性阻塞性肺病、潰瘍性結(jié)腸炎、血管成形術(shù)后再狹窄、濕疹、高血壓、血小板聚集、消化道出血、子宮內(nèi)膜異位、經(jīng)期前綜合征、肌痛腦脊髓炎、病毒感染后慢性疲勞或眼病。本發(fā)明還提供本發(fā)明的細(xì)胞、本發(fā)明的多肽、本發(fā)明的多核苷酸、本發(fā)明的載體、本發(fā)明的油或本發(fā)明的脂肪酸和/或本發(fā)明的飼料在制備用于治療或預(yù)防能從PUFA中獲益的疾病的藥物中的用途。顯而易見的是，本發(fā)明的一個(gè)方面的優(yōu)選特征也適用于本發(fā)明的許多其他方面。在本說明書中，"包含"一詞或其變化形式例如"包括"應(yīng)理解為旨在納入所提及的元件、整數(shù)或步驟或是元件、整數(shù)或步驟的組，但不排除任何其他的元件、整數(shù)或步驟或是元件、整數(shù)或步驟的組。下面通過以下非限制性實(shí)施例并結(jié)合附圖進(jìn)一步闡述本發(fā)明。圖1.比較Tribdesat2b的由基因預(yù)測程序得到的核酸序列與其高保真RT-PCR產(chǎn)物的核酸序列。點(diǎn)表示序列相同，同時(shí)指出了不同的核苷酸。圖2.比較Tribdesat3的由基因預(yù)測程序得到的核酸序列與其高保真RT-PCR產(chǎn)物的核酸序列。點(diǎn)表示序列相同，同時(shí)指出了不同的核苷酸。圖3.比較Tribdesat6b的由基因預(yù)測程序得到的核酸序列與其高保真RT-PCR產(chǎn)物的核酸序列。點(diǎn)表示序列相同，同時(shí)指出了不同的核苷酸。圖4.比較Tribdesat10的由基因預(yù)測程序得到的核酸序列與其高保真RT-PCR產(chǎn)物的核酸序列。點(diǎn)表示序列相同，同時(shí)指出了不同的核苷酸。圖5.比較Tribdesat11的由基因預(yù)測程序得到的核酸序列與其高保真RT-PCR產(chǎn)物的核酸序列。點(diǎn)表示序列相同，同時(shí)指出了不同的核苷酸。圖6.GC/MS痕量和色譜顯示，Tribdesat10在擬南芥中產(chǎn)生亞油酸(18:2A9，A12)，以擬南芥Fadl/Fae2為對照。圖7.A.來自表達(dá)A/D"DM的釀酒酵母的酵母脂肪酸甲酯的氣相色譜(GC)。B.來自僅含載體的釀酒酵母的酵母脂肪酸甲酯的氣相色譜(GC)。C.GC質(zhì)譜法確認(rèn)C16:2和C18:2產(chǎn)物的雙鍵位置。圖8.給予C14:0和C15:0的混合物后，對僅表達(dá)pYES2載體的酵母o/e/細(xì)胞(A)或表達(dá)存在于pXZP282中的美洲蟋蟀A12-去飽和酶的酵母o/e7細(xì)胞(B)進(jìn)行GC分析。圖9.代表性酰基輔酶A或?；|(zhì)去飽和酶蛋白質(zhì)序列的系統(tǒng)發(fā)生分析。圖10.代表性?；o酶A或酰基脂質(zhì)去飽和酶蛋白質(zhì)序列的系統(tǒng)發(fā)生分析。序列表說明SEQIDNO:l-擬谷盜屬去飽和酶1的編碼序列SEQIDNO:2"以谷盜屬去飽和酶2a的編碼序列SEQIDNO:3-擬谷盜屬去飽和酶2b的編碼序列SEQIDNO:4-擬谷盜屬去飽和酶2c的編碼序列SEQIDNO:5-擬谷盜屬去飽和酶3的編碼序列SEQIDNO:6-擬谷盜屬去飽和酶4的編碼序列SEQIDNO:7-擬谷盜屬去飽和酶5的編碼序列SEQIDNO:8-擬谷盜屬去飽和酶6a的編碼序列SEQIDNO:9-擬谷盜屬去飽和酶6b的編碼序列SEQIDNO:10"^谷盜屬去飽和酶7a的編碼序列22SEQIDNO:l1-擬谷盜屬去飽和酶7b的編碼序列SEQIDNO:12-擬谷盜屬去飽和酶8的編碼序列SEQIDNO:13-擬谷盜屬去飽和酶10的編碼序列SEQIDNO:14-擬谷盜屬去飽和酶11的編碼序列SEQIDNO:15-擬谷盜屬去飽和酶12的編碼序列SEQIDNO:16-擬谷盜屬去飽和酶1的氨基酸序列SEQIDNO:17-擬谷盜屬去飽和酶2a的氨基酸序列SEQIDNO:18-擬谷盜屬去飽和酶2b的氨基酸序列SEQIDNO:19-擬谷盜屬去飽和酶2c的氨基酸序列SEQIDNO:20-擬谷盜屬去飽和酶3的氨基酸序列SEQIDNO:21-擬谷盜屬去飽和酶4的氨基酸序列SEQIDN022-擬谷盜屬去飽和酶5的氨基酸序列SEQIDNO:23-擬谷盜屬去飽和酶6a的氨基酸序列SEQIDNO:24-擬谷盜屬去飽和酶6b的氨基酸序列SEQIDNO:25-擬谷盜屬去飽和酶7a的氨基酸序列SEQIDNO:26-擬谷盜屬去飽和酶7b的氨基酸序列SEQIDNO:27-擬谷盜屬去飽和酶8的氨基酸序列SEQIDNO:28-擬谷盜屬去飽和酶10的氨基酸序列SEQIDNO:29-擬谷盜屬去飽和酶11的氨基酸序列SEQIDNO:30-擬谷盜屬去飽和酶12的氨基酸序列SEQIDNO:31-保守性昆蟲去飽和酶序列SEQIDNO:32至66-寡核苷酸引物SEQIDNO:67-花螢屬去飽和酶CL1的編碼序列SEQIDNO:68-花螢屬去飽和酶CL3的編碼序列SEQIDNO:69-花螢屬去飽和酶CL6的部分編碼序列SEQIDNO:70-花螢屬去飽和酶CL7的部分編碼序列SEQIDNO:71-花螢屬去飽和酶CL8的部分編碼序列SEQIDNO:72-花螢屬去飽和酶CL9的部分編碼序列SEQIDNO:73-花螢屬去飽和酶CL1的氨基酸序列SEQIDNO:74-花螢屬去飽和酶CL3的氨基酸序列SEQIDNO:75-花螢屬去飽和酶CL6的部分氨基酸序列SEQIDNO:76-花螢屬去飽和酶CL7的部分氨基酸序列SEQIDNO:77—花螢屬去飽和酶CL8的部分氨基酸序列SEQIDNO:78-花螢屬去飽和酶CL9的部分氨基酸序列SEQIDNO:79-花螢屬去飽和酶CN1的編碼序列SEQIDNO:80-花螢屬去飽和酶CN1的氨基酸序列SEQIDNO:81至103-寡核苷酸引物SEQIDNO:104至111-保守性去飽和酶基序SEQIDNO:112至122-去飽和酶序列內(nèi)的組氮酸盒SEQIDNO:123至126—特征性基序SEQIDNO:127至130-寡核苷酸SEQIDNO:131和132—保守區(qū)SEQIDNO:133-美洲蟋蟀去飽和酶AdD12Des的編碼序列SEQIDNO:134-美洲蟋蟀去飽和酶AdD12Des的氨基酸序列SEQIDNO:1354以南芥(Jra6Wop^Aa//a"a)FAD2A12去飽和酶發(fā)明詳述通用技術(shù)除非另有說明，否則本說明書中所使用的科技術(shù)語均具有與本領(lǐng)域(例如細(xì)胞培養(yǎng)、分子遺傳學(xué)、免疫學(xué)、免疫組織化學(xué)、蛋白質(zhì)化學(xué)和生物化學(xué)等領(lǐng)域)普通技術(shù)人員通常所理解的含義相同的含義。除非另有說明，本發(fā)明所采用的重組蛋白質(zhì)、細(xì)胞培養(yǎng)和免疫學(xué)技術(shù)均為本領(lǐng)域人員所熟知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)。此類技術(shù)在文獻(xiàn)中有充分的描述和解釋，例如參見J.Perbal，APracticalGuidetoMolecularCloning,JohnWileyandSons(1984);J.Sambrook等，MolecularCloning:ALaboratoryManual,ColdSpringHarbourLaboratoryPress(1989);T.A.Brown(編輯)，EssentialMolecularBiology:APracticalApproach,Volumes1and2，IRLPress(1991);D.M.GloverandB.D.Hames(編輯)，DNACloning:APracticalApproach,Volumes1-4,IRLPress(1995and1996);和F.M.Ausubel等(編輯)，CurrentProtocolsinMolecularBiology,GreenePub.AssociatesandWiley-Interscience(1988，包括迄今所有的更新版)；EdHarlowandDavidLane(編輯)Antibodies:ALaboratoryManual,ColdSpringHarbourLaboratory,(1988);禾口J.E.Coligan等(編輯)CurrentProtocolsinImmunology,JohnWiley&Sons(包括迄今所有的更新版)，通過引用將上述文獻(xiàn)并入本申請。選定的定義在本文中，術(shù)語"脂肪酸"指的是羧酸(有機(jī)酸)，通常具有長的脂肪族尾部，可以是飽和的或不飽和的。典型地，脂肪酸具有碳-碳鍵連接的鏈，其長度為至少8個(gè)碳原子，更優(yōu)選地長度為至少12個(gè)碳。絕大多數(shù)天然存在的脂肪酸具有偶數(shù)個(gè)碳原子，因?yàn)樗鼈兊纳锖铣缮婕熬哂?個(gè)碳原子的乙酸酯。脂肪酸可以是游離狀態(tài)的(非酯化的)或者是酯化的形式，例如作為甘油三酯、甘油二酯、單?；视王サ牟糠帧Ⅴ；o酶A(硫酯)結(jié)合型或其他結(jié)合形式。脂肪酸可酯化為磷脂，例如磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰絲氨酸、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇或二磷脂酰甘油的形式。"飽和脂肪酸"在其鏈上不含有任何雙鍵或其他官能團(tuán)。術(shù)語"飽和"指的是氫，其中所有的碳(除羧基[-COOH]之外)均含有盡可能多的氫。換言之，o)端含有3個(gè)氫(CH3-)而鏈內(nèi)的各個(gè)碳含有2個(gè)氫(-CH2-)。"不飽和脂肪酸"與飽和脂肪酸形式相似，不同之處為沿著鏈存在一或多個(gè)烯烴官能團(tuán)，每一烯烴將鏈中的單鍵的"-CH2-CH2-"部分置換為雙鍵的"-CH:CH-"部分(g卩，與另一碳雙鍵連接的碳)。鏈中連接于該雙鍵任一側(cè)的2個(gè)相鄰碳原子可以順式或反式構(gòu)型存在。在本文中，術(shù)語"單不飽和脂肪酸"指的是這樣的脂肪酸，其碳鏈中包含至少12個(gè)碳原子且鏈中僅有一個(gè)烯烴基。在本文中，術(shù)語"多不飽和脂肪酸"或TUFA"指的是這樣的脂肪酸，其碳鏈中包含至少12個(gè)碳原子和至少2個(gè)烯烴基(碳-碳雙鍵)。通常，脂肪酸碳鏈的碳原子數(shù)涉及的是非分支碳鏈。如果碳鏈?zhǔn)欠种У?，則碳原子數(shù)不包括側(cè)基碳原子。在一個(gè)實(shí)施方式中，長鏈多不飽和脂肪酸是co3脂肪酸，即脂肪酸自甲基端開始的第三個(gè)碳-碳鍵發(fā)生去飽和(碳-碳雙鍵)。在另一個(gè)實(shí)施方式中，長鏈多不飽和脂肪酸是co6脂肪酸，即脂肪酸自甲基端開始的第六個(gè)碳-碳鍵發(fā)生去飽和(碳-碳雙鍵)。在本文中，術(shù)語"長鏈多不飽和脂肪酸"或"LC-PUFA"指的是這樣的脂肪酸，其碳鏈中包含至少20個(gè)碳原子和至少2個(gè)碳-碳雙鍵。在本文中，術(shù)語"去飽和酶"指的是這樣的酶，其能夠在脂肪酸底物的?；幸胩?碳雙鍵，所述脂肪酸底物典型地是酯化的形式，例如是脂肪酸輔酶A酉旨。?；膳c磷脂例如磷脂酰膽堿發(fā)生酯化，或與?；d體蛋白(ACP)發(fā)生酯化，或在優(yōu)選的實(shí)施方式中與輔酶A發(fā)生酯化。相應(yīng)地，去飽和酶通?？煞譃?類。在本文中，術(shù)語"A12去飽和酶"指的是這樣的蛋白質(zhì)，其所進(jìn)行的去飽和酶反應(yīng)導(dǎo)致在自羧基端起的第12位鍵處引入碳-碳雙鍵，并且其在該位置處的去飽和作用強(qiáng)于任何其他位置。在一個(gè)實(shí)施方式中，A12去飽和酶活性包括油酰-輔酶AA12去飽和酶活性。在另一個(gè)實(shí)施方式中，A12去飽和酶活性包括棕櫚油酰-輔酶AA12去飽和酶活性。這些脂肪酸可以是酯化的形式，例如作為磷脂的一部分。A12去飽和酶的實(shí)例包括包含SEQIDNO:28、78和134所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)。存在兩種A12去飽和酶?；o酶AA12去飽和酶和?；?PCA12去飽和酶，分別主要對連接于酰基輔酶A和?；?PC的18:1底物有活性。不過，A9去飽和酶也對?；?ACP(?；d體蛋白)有活性。在本文中，術(shù)語"?；o酶AA12去飽和酶活性"或"?；o酶AA12去飽和酶"指的是這樣的去飽和酶，其對?；o酶A底物的活性高于酰基-脂質(zhì)(例如?；?PC)禾tV或酰基-ACP底物。在一個(gè)實(shí)施方式中，活性至少高兩倍。在本文中，"A5去飽和酶"指的是這樣的蛋白質(zhì)，其所進(jìn)行的去飽和酶反應(yīng)導(dǎo)致在自羧基端起的第5位鍵處引入碳-碳雙鍵，并且其在該位置處的去飽和作用強(qiáng)于任何其他位置。在一個(gè)實(shí)施方式中，A5去飽和酶具有?；o酶A-硬脂酰A5去飽和酶活性。在另一個(gè)實(shí)施方式中，A5去飽和酶具有酰基輔酶A-棕櫚酰A5去飽和酶活性。在一個(gè)實(shí)施方式中，A5去飽和酶催化對C20LC-PUFA的去飽和作用，將雙高-Y-亞油酸DGLA轉(zhuǎn)化為花生四烯酸(ARA，20:4co6)以及將ETA轉(zhuǎn)化為EPA(20:5co3)。在本文中，術(shù)語"?；o酶AA5去飽和酶活性"或"?；o酶AA5去飽和酶"指的是這樣的去飽和酶，其對?；o酶A底物的活性高于?；?脂質(zhì)(例如?；?PC)和/或?；?ACP底物。在一個(gè)實(shí)施方式中，活性至少高兩倍。在本文中，"A9去飽和酶"指的是這樣的蛋白質(zhì)，其所進(jìn)行的去飽和酶反應(yīng)導(dǎo)致在自羧基端起的第9位鍵處引入碳-碳雙鍵，并且其在該位置處的去飽和作用強(qiáng)于任何其他位置。A9去飽和酶活性的實(shí)例包括豆蔻酰-輔酶AA9去飽和酶活性、硬脂酰-輔酶AA9去飽和酶活性、棕櫚酰-輔酶AA9去飽和酶活性、二十四酰-輔酶AA9去飽和酶活性和二十二酰-輔酶AA9去飽和酶活性。在本文中，術(shù)語"?；o酶AA9去飽和酶活性"或"?；o酶AA9去飽和酶"指的是這樣的去飽和酶，其對酰基輔酶A底物的活性高于?；?脂質(zhì)(例如?；?PC)和/或?；?ACP底物。在一個(gè)實(shí)施方式中，活性至少高兩倍。在本文中，術(shù)語"結(jié)合酶"指的是形成共軛三烯的去飽和酶。術(shù)語"環(huán)氧化酶"在本文中指的是這樣的酶，其在脂肪酸中引入環(huán)氧基，產(chǎn)生環(huán)氧脂肪酸。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，環(huán)氧基被引入至脂肪酸鏈特別是C16或C18脂肪酸鏈的第2位和/或第12位碳。在本文中，"羥化酶"指的是這樣的酶，其在脂肪酸中引入羥基，產(chǎn)生羥化脂肪酸。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，羥基被引入至C18脂肪酸鏈的第2位、第12位和/或第17位碳。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，羥基被引入至C16脂肪酸鏈的第15位碳。術(shù)語"植物"包括整個(gè)植物、植物的結(jié)構(gòu)(例如，葉、莖)、根、花等器官/組織、種子(包括胚、胚乳和種皮)、植物組織(例如，維管組織、基本組織等等)、細(xì)胞和植物的子代。"轉(zhuǎn)基因植物"、"遺傳學(xué)修飾的植物"或其變體指的是這樣的植物，其含有基因構(gòu)建體("轉(zhuǎn)基因")，該基因構(gòu)建體在同樣物種、品種或栽培變種的野生型植物中是不存在的。"轉(zhuǎn)基因"在此具有生物
技術(shù)領(lǐng)域：
的通常含義，并包括通過重組DNA或RNA技術(shù)而產(chǎn)生或改變并被引入至植物細(xì)胞內(nèi)的遺傳學(xué)序列。轉(zhuǎn)基因可包括源自植物細(xì)胞的遺傳學(xué)序列。典型地，轉(zhuǎn)基因已經(jīng)通過人為操作而引入植物，例如通過轉(zhuǎn)化，但也可采樣本領(lǐng)域人員所知的任何方法。術(shù)語"種子"和"籽粒"在此可互換使用。"籽粒"通常指的是成熟的收獲的籽粒，但根據(jù)上下文也可指吸漲或萌芽后的籽粒。成熟籽粒具有的含水量通常低于大約18-20%。"可操縱地連接"在本文中指的是兩個(gè)或多個(gè)核酸(例如DNA)節(jié)段之間的功能性關(guān)系。典型地，其指的是轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件(啟動子)與被轉(zhuǎn)錄序列的功能性關(guān)系。例如，啟動子可操縱地連接于編碼序列，例如在此所述的多核苷酸，條件是其在合適的細(xì)胞內(nèi)刺激或調(diào)變編碼序列的轉(zhuǎn)錄。通常，可操縱地連接于被轉(zhuǎn)錄序列的啟動子轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件與被轉(zhuǎn)錄序列在物理上是連續(xù)的，27即，它們具有順式作用。不過，某些轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件，例如增強(qiáng)子，不需要與被增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄的編碼序列在物理上連續(xù)或位于與之十分接近的位置。在本文中，術(shù)語"基因"取其最廣泛的含義，并包括脫氧核糖核苷酸序列，后者包含結(jié)構(gòu)基因的蛋白質(zhì)編碼區(qū)、并包括鄰近所述編碼區(qū)且位于距所述編碼區(qū)5'和3'端之任一端至少大約2kb距離處的序列，所述序列參與該基因的表達(dá)。位于編碼區(qū)5'端且存在于mRNA上的序列稱為5'非翻譯序列。位于編碼區(qū)3'端或下游且存在于mRNA上的序列稱為3'非翻譯序列。術(shù)語"基因"涵蓋cDNA和基因組形式的基因。基因的基因組形式或克隆含有被非編碼序列中斷的編碼區(qū)，這些非編碼序列稱為"內(nèi)含子"或"干擾區(qū)"或"干擾序列"。內(nèi)含子是被轉(zhuǎn)錄至核RNA(hnRNA)內(nèi)的基因節(jié)段；內(nèi)含子可含有調(diào)控元件例如增強(qiáng)子。內(nèi)含子要自核轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物或初級轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物去除或"剪切掉"，因此信使RNA(mRNA)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物內(nèi)沒有內(nèi)含子。mRNA的功能是在翻譯過程中確定新生多肽內(nèi)的氨基酸序列或次序。術(shù)語"基因"包括編碼全部或部分在此所述的蛋白質(zhì)的合成分子或融合分子以及上述任一的互補(bǔ)核苷酸序列。在本文中，術(shù)語"可自...分離"指的是該多核苷酸或被編碼的多肽是由生物體、特別是昆蟲天然產(chǎn)生的。多肽服"基本上純化的多肽"或"純化的多肽"指的是這樣的多肽，其通常已經(jīng)與天然狀態(tài)下與之結(jié)合的那些脂質(zhì)、核酸、其他的肽以及其他污染分子分離。優(yōu)選地，基本上純化的多肽至少60%、更優(yōu)選地至少75%、且更優(yōu)選地至少90%不含與之天然結(jié)合的其他成分。術(shù)語"重組"當(dāng)涉及多肽時(shí)指的是，當(dāng)所述多肽由細(xì)胞或者無細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)產(chǎn)生時(shí)，與其天然狀態(tài)相比，所述多肽產(chǎn)生的量或速度發(fā)生改變。在一個(gè)實(shí)施方式中，細(xì)胞在天然狀態(tài)下不產(chǎn)生所述多肽。不過，細(xì)胞可包含使得產(chǎn)生的所述多肽的量發(fā)生改變的非內(nèi)源性基因。本發(fā)明的重組多肽包括尚未自產(chǎn)生它們的轉(zhuǎn)基因(重組)細(xì)胞或無細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)中分離的多肽，也包括在此類細(xì)胞或無細(xì)胞系統(tǒng)中產(chǎn)生并隨后自至少某些其他成分中純化出來的多肽。術(shù)語"多肽"和"蛋白質(zhì)"通?？苫Q使用。多肽的百分比相同性通過GAP(NeedlemanandWunsch,1970)分析(GCG程序)確定，其中缺口創(chuàng)建罰分=5，而缺口延伸罰分=0.3。查詢序列長度為至少15個(gè)氨基酸，且GAP分析在至少15個(gè)氨基酸的區(qū)域比對兩個(gè)序列。更優(yōu)選地，查詢序列長度為至少50個(gè)氨基酸，且GAP分析在至少50個(gè)氨基酸的區(qū)域比對兩個(gè)序列。更優(yōu)選地，査詢序列長度為至少IOO個(gè)氨基酸，且GAP分析在至少100個(gè)氨基酸的區(qū)域比對兩個(gè)序列。甚至更優(yōu)選地，查詢序列長度為至少250個(gè)氨基酸，且GAP分析在至少250個(gè)氨基酸的區(qū)域比對兩個(gè)序列。甚至更優(yōu)選地，GAP分析比對兩個(gè)序列的全長。在此，"生物學(xué)活性"片段是本發(fā)明的多肽的一部分，其保持該全長多肽的所定義的活性，即具有去飽和酶、結(jié)合酶、環(huán)氧化酶和/或羥化酶活性。生物學(xué)活性片段可以是任何長度，條件是它們保持所定義的活性。優(yōu)選地，生物學(xué)活性片段保持全長蛋白質(zhì)活性的至少10%。就所定義的多肽/酶而言，可以理解高于上述數(shù)值的百分比相同性是優(yōu)選的實(shí)施方式。因此，在適用的情況下，就最小的百分比相同性數(shù)值而言，優(yōu)選地所述多肽/酶包含這樣的氨基酸序列，其與相應(yīng)的指定SEQIDNO具有至少60%、更優(yōu)選地至少65%、更優(yōu)選地至少70%、更優(yōu)選地至少75%、更優(yōu)選地至少76%、更優(yōu)選地至少80%、更優(yōu)選地至少85%、更優(yōu)選地至少90°/。、更優(yōu)選地至少91%、更優(yōu)選地至少92%、更優(yōu)選地至少93%、更優(yōu)選地至少94%、更優(yōu)選地至少95%、更優(yōu)選地至少96%、更優(yōu)選地至少97%、更優(yōu)選地至少98%、更優(yōu)選地至少99%、更優(yōu)選地至少99.1%、更優(yōu)選地至少99.2%、更優(yōu)選地至少99.3%、更優(yōu)選地至少99.4%、更優(yōu)選地至少99.5%、更優(yōu)選地至少99.6%、更優(yōu)選地至少99.7%、更優(yōu)選地至少99.8%、且甚至更優(yōu)選地至少99.9%的相同性。就本發(fā)明的?；o酶AA5去飽和酶而言，這是首次證實(shí)動物的去飽和酶可產(chǎn)生5-十六碳烯酸和5-十八碳烯酸并以酰基輔酶A脂肪酸作為底物。就本發(fā)明的?；o酶AA12去飽和酶而言，這是首次通過動物天然產(chǎn)生的酶證實(shí)了A12去飽和酶活性。此外，這是首次證實(shí)去飽和酶可產(chǎn)生亞油酸并以酰基輔酶A脂肪酸作為底物。本發(fā)明的多肽的氨基酸序列突變體可通過在本發(fā)明的核酸內(nèi)引入合適的核苷酸改變或通過體外合成所需多肽而制備。此類突變包括，例如，氨基酸序列內(nèi)殘基的缺失、插入或取代?？赏ㄟ^缺失、插入和取代的組合而獲得最終的構(gòu)建體，條件是最終的肽產(chǎn)物具有所需的特征。29可通過本領(lǐng)域所知的任何技術(shù)制備突變的(改變的)肽。例如，可對本發(fā)明的多核苷酸進(jìn)行體外誘變。此類體外誘變技術(shù)包括將多核苷酸亞克隆到合適的載體內(nèi)，將載體轉(zhuǎn)化到"增變株(mutator)"菌株如大腸桿菌(五.XL-1red(Stmtagene)內(nèi)并將轉(zhuǎn)化的細(xì)菌增殖合適的代數(shù)。在另一個(gè)實(shí)例中，對本發(fā)明的多核苷酸進(jìn)行DNA重排，參見Harayama(1998)?？刹捎迷诖怂龅募夹g(shù)容易地篩選源自突變的/改變的DNA的產(chǎn)物以確定它們是否具有去飽和酶、結(jié)合酶、環(huán)氧化酶和/或羥化酶活性。在設(shè)計(jì)氨基酸序列突變體時(shí)，突變的位置和突變的性質(zhì)取決于要修飾的特征?？蓡蝹€(gè)地或系列地修飾突變位點(diǎn)，例如通過(l)先選擇保守性氨基酸進(jìn)行取代，然后根據(jù)所得結(jié)果進(jìn)行更加激進(jìn)的選擇，(2)缺失靶殘基，或(3)在鄰近被定位的位點(diǎn)處插入其他殘基。氨基酸序列缺失通常為大約1至15個(gè)殘基，更優(yōu)選地大約1至10個(gè)殘基，且典型地為大約1至5個(gè)連續(xù)的殘基。取代突變是去除多肽分子內(nèi)的至少一個(gè)氨基酸殘基并在該處插入一個(gè)不同的殘基。取代誘變的最感興趣的位點(diǎn)包括那些被鑒定為是活性位點(diǎn)的位點(diǎn)。感興趣的其他位點(diǎn)是那些在各種菌株或物種之間均相同的特定殘基。這些位置可能對生物學(xué)活性十分重要。這些位點(diǎn)，特別是那些具有至少3個(gè)其他同等保守的位點(diǎn)的序列內(nèi)的位點(diǎn)，優(yōu)選地以相對保守的方式進(jìn)行取代。表1在"示例性取代"一欄給出了此類保守性取代。表h示例性取代<table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table>在優(yōu)選的實(shí)施方式中，與天然存在的多肽相比，突變體/變體多肽具有1或2或3或4個(gè)保守性氨基酸改變。表1給出了保守性氨基酸改變的詳情。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述的改變不出現(xiàn)于以下一或多個(gè)基序中AGAHRLW、SETDAD、FFFSHVG、QKKY、NSAAH、GEGWHNYHH、PWDY和GWAY。在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，以下每一個(gè)基序中均不出現(xiàn)所述改變AGAHRLW、SETDAD、FFFSHVG、QKKY、NSAAH、GEGWHNYHH、PWDY和GWAY。本領(lǐng)域人員能夠理解，可以合理地預(yù)期此類少數(shù)的改變不會改變在重組細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的所述多肽的活性。此外，如果需要，可以取代或添加的形式將非天然氨基酸或化學(xué)氨基酸類似物引入本發(fā)明的多肽。此類氨基酸包括，但不限于，普通氨基酸的D-異構(gòu)體、2，4-二氨基丁酸、ct-氨基異丁酸、4-氨基丁酸、2-氨基丁酸、6-氨基己酸、2-氨基異丁酸、3-氨基丙酸、鳥氨酸、正亮氨酸、正纈氨酸、羥脯氨酸、肌氨酸、瓜氨酸、高瓜氨酸、磺基丙氨酸、叔丁基甘氨酸、叔丁基丙氨酸、苯基甘氨酸、環(huán)己基丙氨酸、J3-丙氨酸、氟代氨基酸、設(shè)計(jì)者氨基酸例如卩-甲基氨基酸、Ccx-甲基氨基酸、Not-甲基氨基酸和一般的氨基酸類似物。本發(fā)明也包括在合成過程中或合成之后被差異性修飾的本發(fā)明的多肽，例如通過生物素化、芐化作用、糖基化、乙酰化、磷酸化、酰胺化、通過已知的保護(hù)/阻斷基團(tuán)進(jìn)行衍生作用、蛋白裂解、連接于抗體分子或其他細(xì)胞配體等等。這些修飾可提高本發(fā)明的多肽的穩(wěn)定性和/或生物活性。可以多種形式產(chǎn)生本發(fā)明的多肽，包括產(chǎn)生和回收天然多肽、產(chǎn)生和回收重組多肽以及化學(xué)合成所述多肽。在一個(gè)實(shí)施方式中，如下產(chǎn)生分離的本發(fā)明的多肽，在有效產(chǎn)生所述多肽的條件下培養(yǎng)能夠表達(dá)所述多肽的細(xì)胞，并回收所述多肽。用于培養(yǎng)的優(yōu)選的細(xì)胞是本發(fā)明的重組細(xì)胞。有效的培養(yǎng)條件包括，但不限于，允許多肽產(chǎn)生的有效的培養(yǎng)基、生物反應(yīng)器、溫度、pH和氧條件。有效的培養(yǎng)基指的是可將細(xì)胞培養(yǎng)于其中以產(chǎn)生本發(fā)明的多肽的任何培養(yǎng)基。該培養(yǎng)基典型地包含具有可同化的碳源、氮源和磷酸源以及合適的鹽、礦物質(zhì)、金屬和其他營養(yǎng)物如維生素的水性培養(yǎng)基。本發(fā)明的細(xì)胞可培養(yǎng)于常規(guī)的發(fā)酵生物反應(yīng)器、搖瓶、試管、微滴定板和培養(yǎng)皿中?？稍谶m合于重組細(xì)胞的溫度、pH和氧含量進(jìn)行培養(yǎng)。此類培養(yǎng)條件是本領(lǐng)域人員熟知的。多核苷酸"分離的多核苷酸"指的是這樣的多核苷酸，其通常已經(jīng)與天然狀態(tài)下與之結(jié)合或連接的那些多核苷酸序列分離。優(yōu)選地，分離的多核苷酸至少60%、更優(yōu)選地至少75%、且更優(yōu)選地至少90%不含與之天然結(jié)合的其他成分。此外，術(shù)語"多核苷酸"在此與術(shù)語"核酸分子"、"基因"和"mRNA"互換使用。術(shù)語"外源性"當(dāng)涉及多核苷酸時(shí)指的是，當(dāng)所述多核苷酸存在于細(xì)胞或者無細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)中時(shí)，與其天然狀態(tài)相比，所述多核苷酸的量發(fā)生改變。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述細(xì)胞天然條件下不包含所述多核苷酸。不過，所述細(xì)胞可包含導(dǎo)致所編碼的多肽產(chǎn)生的量發(fā)生改變的非內(nèi)源性多核苷酸。本發(fā)明的外源多核苷酸包括尚未與它們存在于其中的轉(zhuǎn)基因(重組)細(xì)胞或無細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)中的其他成分分離的多核苷酸，也包括在此類細(xì)胞或無細(xì)胞系統(tǒng)中產(chǎn)生并隨后自至少某些其他成分中純化出來的多核苷酸。外源多核苷酸(核酸)可以是天然存在的一段連續(xù)的核苷酸，或是包含由來自不同來源的(天然存在的和/或合成的)兩或多段連續(xù)的核苷酸連接形成的單一多核苷酸。典型地，此類嵌合多核苷酸至少包含編碼本發(fā)明的多肽的開放讀框，該開放讀框可操縱地連接于適合在感興趣的細(xì)胞中驅(qū)動所述開放讀框轉(zhuǎn)錄的啟動子。"多核苷酸"指的是寡核苷酸、多核苷酸或或任何片段。其可以是基因組來源的或合成的DNA或RNA、雙鏈的或單鏈的、并可與糖類、脂質(zhì)、蛋白質(zhì)或其他物質(zhì)組合以行使在此所述的特定活性。多核苷酸的百分比相同性通過GAP(NeedlemanandWunsch，1970)分析(GCG程序)確定，其中缺口創(chuàng)建罰分=5，而缺口延伸罰分=0.3。查詢序列長度為至少45個(gè)核苷酸，且GAP分析在至少45個(gè)核苷酸的區(qū)域比對兩個(gè)序列。優(yōu)選地，查詢序列長度為至少150個(gè)核苷酸，且GAP分析在至少150個(gè)核苷酸的區(qū)域比對兩個(gè)序列。甚至更優(yōu)選地，查詢序列長度為至少300個(gè)核苷酸，且GAP分析在至少300個(gè)核苷酸的區(qū)域比對兩個(gè)序列。甚至更優(yōu)選地，GAP分析比對兩個(gè)序列的全長。就所定義的多核苷酸而言，可以理解高于上述數(shù)值的百分比相同性是優(yōu)選的實(shí)施方式。因此，在適用的情況下，就最小的百分比相同性數(shù)值而言，優(yōu)選地所述多核苷酸包含這樣的多核苷酸序列，其與相應(yīng)的指定SEQIDNO具有至少60%、更優(yōu)選地至少65%、更優(yōu)選地至少70%、更優(yōu)選地至少75%、更優(yōu)選地至少80%、更優(yōu)選地至少85%、更優(yōu)選地至少90%、更優(yōu)選地至少91%、更優(yōu)選地至少92%、更優(yōu)選地至少93%、更優(yōu)選地至少94%、更優(yōu)選地至少95%、更優(yōu)選地至少96%、更優(yōu)選地至少97%、更優(yōu)選地至少98%、更優(yōu)選地至少99%、更優(yōu)選地至少99.1%、更優(yōu)選地至少99.2%、更優(yōu)選地至少99.3%、更優(yōu)選地至少99.4%、更優(yōu)選地至少99.5%、更優(yōu)選地至少99.6%、更優(yōu)選地至少99.7%、更優(yōu)選地至少99.8%、且甚至更優(yōu)選地至少99.9%的相同性。本發(fā)明的多核苷酸可在嚴(yán)格性條件下與編碼本發(fā)明的多肽的多核苷酸選擇性雜交。在本文中，在嚴(yán)格性條件下指的是(l)采用低離子強(qiáng)度和高洗滌溫度，例如，0.015MNaCl/0.0015M擰檬酸鈉/0.1%NaDodS04，500C;(2)雜交過程中采用變性劑例如甲酰胺，例如，50。/。(vol/vol)甲酰胺含0.1%牛血清白蛋白，0.1%Ficoll，0.1%聚乙烯吡咯垸酮，50mM磷酸鈉緩沖液(pH6.5)含750mMNaCl，75mM擰檬酸鈉，42GC;或(3)采用50%甲酰胺，5xSSC(0.75MNaCl，0.075M擰檬酸鈉)，50mM磷酸鈉(pH6.8)，0.1%焦磷酸鈉，5x登哈特溶液，超聲處理的鮭精DNA(50g/ml)，0.P/。SDS和10。/。硫酸葡聚糖，42QC，在0.2xSSC和0.1。/。SDS中。與天然存在的分子相比，本發(fā)明的多核苷酸可具有一或多個(gè)突變，其可以是核苷酸殘基的缺失、插入、或取代。突變體可以是天然存在的(即分離自天然來源)或合成的(例如，通過在上述核酸上進(jìn)行定點(diǎn)誘變或DNA重排)。因此，本發(fā)明的多核苷酸顯然可以是天然存在的或重組的。本發(fā)明的寡核苷酸可以是RNA、DNA或其中任一的衍生物。所述寡核苷酸的最小長度是寡核苷酸與本發(fā)明的多核苷酸的互補(bǔ)序列之間形成穩(wěn)定雜交體所需的長度。優(yōu)選地，寡核苷酸的長度為至少15個(gè)核苷酸、更優(yōu)選地至少18個(gè)核苷酸、更優(yōu)選地至少19個(gè)核苷酸、更優(yōu)選地至少20個(gè)核苷酸、甚至更優(yōu)選地至少25個(gè)核苷酸。本發(fā)明的寡核苷酸可用作，例如，鑒定核酸分子的探針，或產(chǎn)生核酸分子的引物。用作探針的本發(fā)明的寡核苷酸典型地綴合于標(biāo)記物，例如放射性同位素、酶、生物素、熒光分子或化學(xué)發(fā)光分子。重組載體本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式包括重組載體，其包含至少一種本發(fā)明的分離的本發(fā)明的核苷酸分子，所述核苷酸分子插入至能夠?qū)⑺龆嗪塑账岱肿虞斔椭了拗骷?xì)胞內(nèi)的任何載體內(nèi)。所述載體含有異源多核苷酸序列，即所述多核苷酸序列天然情況下不與本發(fā)明的核苷酸分子鄰近，且優(yōu)選地其所來源的物種不同于所述多核苷酸分子所來源的物種。載體可以是RNA或DNA，真核細(xì)胞的或原核細(xì)胞的，且典型地是轉(zhuǎn)座子(例如參見美國5,792,294)、病毒或質(zhì)粒。一類重組載體包含可操縱地連接于表達(dá)載體的本發(fā)明的核苷酸分子。術(shù)語"可操縱地連接"指的是多核苷酸分子插入至表達(dá)載體內(nèi)的方式使得轉(zhuǎn)化至宿主細(xì)胞內(nèi)之后所述分子能夠表達(dá)。在本文中，表達(dá)載體是DNA或RNA載體，其能夠轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞并實(shí)現(xiàn)特定多核苷酸分子的表達(dá)。優(yōu)選地，表達(dá)載體還能夠在宿主細(xì)胞復(fù)制。表達(dá)載體可以是原核細(xì)胞的或真核細(xì)胞的，且典型地是病毒或質(zhì)粒。本發(fā)明的表達(dá)載體包括在本發(fā)明的宿主細(xì)胞內(nèi)有功能(即，指導(dǎo)基因表達(dá))的任何載體，宿主細(xì)胞包括細(xì)菌、真菌、內(nèi)寄生物、節(jié)肢動物細(xì)胞、動物細(xì)胞和植物細(xì)胞。本發(fā)明的特別優(yōu)選的表達(dá)載體可指導(dǎo)基因在酵母和/或植物細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。具體而言，本發(fā)明的表達(dá)載體含有調(diào)控序列，例如轉(zhuǎn)錄控制序列、翻譯控制序列、復(fù)制起點(diǎn)和與重組細(xì)胞具有相容性并控制本發(fā)明的核苷酸分子表達(dá)的其他調(diào)控序列。具體而言，本發(fā)明的重組分子包括轉(zhuǎn)錄控制序列。轉(zhuǎn)錄控制序列是控制轉(zhuǎn)錄起始、延長和終止的序列。特別重要的轉(zhuǎn)錄控制序列是那些控制轉(zhuǎn)錄起始的序列，例如啟動子、增強(qiáng)子、操縱子和阻遏物序列。合適的轉(zhuǎn)錄控制序列包括能夠在至少一種本發(fā)明的重組細(xì)胞中起作用的轉(zhuǎn)錄控制序列。各種各樣的此類轉(zhuǎn)錄控制序列是本領(lǐng)域人員已知的。特別優(yōu)選的轉(zhuǎn)錄控制序列是那些在植物中具有轉(zhuǎn)錄指導(dǎo)活性的啟動子，根據(jù)所使用的植物或其部分，可以是組成型的或具有階段和/或組織特異性。植物啟動子包括，但不限于，表現(xiàn)組成型表達(dá)的啟動子，例如花椰菜花葉病病毒(CaMV)的35S啟動子，果實(shí)特異性表達(dá)啟動子，例如來自番茄的聚半乳糖醛酸酶(PG)啟動子。本發(fā)明的重組分子還可含有(a)分泌信號(g卩，信號節(jié)段核酸序列)，以便使得已經(jīng)表達(dá)的本發(fā)明的多肽能夠自產(chǎn)生所述多肽的細(xì)胞分泌，和/或(b)融合序列，其導(dǎo)致本發(fā)明的核酸分子以融合蛋白的形式表達(dá)。合適的信號節(jié)段的實(shí)例包括能夠指導(dǎo)本發(fā)明的多肽的分泌的任何信號節(jié)段。優(yōu)選的信號節(jié)段包括，但不限于，黃花煙草(Mco"a憩"ecton'")信號肽(美國5,939,288)、煙草延伸信號、大豆油質(zhì)蛋白油體結(jié)合蛋白信號。此外，可將本發(fā)明的核酸分子結(jié)合于將所編碼的多肽導(dǎo)向蛋白體的融合節(jié)段，例如遍在蛋白融合節(jié)段。重組分子還可包括位于本發(fā)明的核酸分子的核酸序列周邊和/或內(nèi)部的干擾序列和/或非翻譯序列。宿主細(xì)胞本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式包括重組細(xì)胞，其包含用一或多種本發(fā)明的重組分子轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞?？赏ㄟ^任何方法將多核苷酸分子轉(zhuǎn)化至細(xì)胞內(nèi)，所述方法可將多核苷酸分子插入至細(xì)胞內(nèi)。轉(zhuǎn)化技術(shù)包括，但不限于，轉(zhuǎn)染、電穿孔、微注射、脂染、吸附和原生質(zhì)體融合。重組細(xì)胞可保持單細(xì)胞狀態(tài)或可生長為組織、器官或多細(xì)胞生物體。經(jīng)轉(zhuǎn)化的本發(fā)明的核苷酸分子可保持在染色體外或可整合至被轉(zhuǎn)化(即，重組)細(xì)胞的染色體內(nèi)的一或多個(gè)位點(diǎn)，使得其能夠被表達(dá)。用于轉(zhuǎn)化的合適的宿主細(xì)胞包括任何可用本發(fā)明的多核苷酸轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。本發(fā)明的宿主細(xì)胞可內(nèi)源性地(即，天然地)具有產(chǎn)生本發(fā)明的多肽的能力，或可在經(jīng)至少一種本發(fā)明的核苷酸分子轉(zhuǎn)化之后能夠產(chǎn)生所述多肽。本發(fā)明的宿主細(xì)胞可以是任何能夠產(chǎn)生至少一種本發(fā)明的蛋白質(zhì)的細(xì)胞，并包括植物細(xì)胞、細(xì)菌、真菌(包括酵母)、寄生蟲和節(jié)肢動物細(xì)胞。優(yōu)選地，宿主細(xì)胞是植物細(xì)胞、節(jié)肢動物細(xì)胞或酵母細(xì)胞。節(jié)肢動物細(xì)胞的非限制性實(shí)例包括昆蟲細(xì)胞，例如草地夜蛾OS/ocfoptera戶"g^Wa)(Sf)細(xì)胞，如Sf9、Sf21、粉紋夜蛾(Trichoplusiani)細(xì)胞和果蠅S2細(xì)胞?？捎米鞅景l(fā)明的宿主細(xì)胞的細(xì)菌細(xì)胞的實(shí)例是聚球藻屬C^恥c/w"w)也稱集胞藻屬(辦"ec/zoc^&)物種，例如細(xì)長聚球藻C^"ec/20cocc^35細(xì)胞可以是適合于發(fā)酵方法的生物體。在本文中，術(shù)語"發(fā)酵方法"指的是任何發(fā)酵方法或包括發(fā)酵步驟的方法。發(fā)酵方法包括，但不限于，用于生產(chǎn)以下物質(zhì)的發(fā)酵方法醇(例如乙醇、甲醇、丁醇)；有機(jī)酸(例如檸檬酸、乙酸、甲叉丁二酸、乳酸、葡糖酸)；酮(例如丙酮)；氨基酸(例如谷氨酸)；氣體(例如H2和C02);抗生素(例如青霉素和四環(huán)素)；酶；維生素(例如核黃素、P-胡羅卜素)；和激素。發(fā)酵方法還包括消費(fèi)性釀酒業(yè)(例如啤酒和葡萄酒)、乳品業(yè)(例如發(fā)酵乳產(chǎn)品)、皮革業(yè)和煙草業(yè)所使用的發(fā)酵方法。優(yōu)選的發(fā)酵方法包括醇類發(fā)酵方法，這是本領(lǐng)域人員所熟知的。優(yōu)選的發(fā)酵方法是厭氧發(fā)酵方法，這是本領(lǐng)域人員所熟知的。合適的發(fā)酵細(xì)胞，典型地是微生物，能夠?qū)⑻抢缙咸烟腔螓溠刻侵苯踊蜷g接發(fā)酵為(即轉(zhuǎn)化為)所需的發(fā)酵產(chǎn)物。發(fā)酵微生物的實(shí)例包括真菌生物體，例如酵母。在本文中，"酵母"包括酵母屬物種，釀酒酵母，卡爾酵母(Sacc^ra/^casca/^^gera/力、假絲酵母屬物種、克魯維酵母屬物種(義/"vera/^casspp.)、畢赤酵母屬物種、漢遜酵母屬物種、木霉屬物種、斯氏油脂酵母(h》omycM"wfe力和解脂耶氏酵母(Fa;roWa印o/^ca)。優(yōu)選的酵母包括酵母屬物種的菌株，特別是釀酒酵母。商品化的酵母包括，例如RedStar/LesaffreEthanolRed(獲自RedStar/Lesaffre,USA)、FALI(獲自Fleischmann'sYeast，其是BurnsPhilpFoodInc.,USA的分機(jī)構(gòu))、SUPERSTART(獲自Alltech)、GERTSTRAND(獲自GertStrandAB，Sweden)和FERMIOL(獲自DSMSpecialties)。可采用重組DNA技術(shù)來提高轉(zhuǎn)化的多核苷酸分子的表達(dá)，例如提高操控宿主細(xì)胞內(nèi)多核苷酸分子的拷貝數(shù)、所述多核苷酸分子的轉(zhuǎn)錄效率、所得轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的翻譯效率、以及轉(zhuǎn)錄后修飾的效率?？捎糜谠黾颖景l(fā)明的核苷酸分子表達(dá)的重組技術(shù)包括，但不限于，將多核苷酸分子可操縱地連接于高拷貝數(shù)質(zhì)粒，將多核苷酸分子整合至一或多個(gè)宿主細(xì)胞染色體中，給質(zhì)粒添加載體穩(wěn)定序列，置換或改進(jìn)轉(zhuǎn)錄控制信號(例如啟動子、操縱子、增強(qiáng)子)，置換或改進(jìn)翻譯控制信號(例如核糖體結(jié)合位點(diǎn)、Shine-Dalgamo序列)，改進(jìn)本發(fā)明的核苷酸分子以符合宿主細(xì)胞內(nèi)的密碼子使用情況，以及去除使轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物不穩(wěn)定的序列。轉(zhuǎn)基因植物術(shù)語"植物"在本文中作為名詞指的是整個(gè)植物，但作為形容詞使用時(shí)指的是存在于植物中的、自植物獲得的、來源于植物的或與植物有關(guān)的任何物質(zhì)，例如，植物器官(例如，葉、莖、根、花)、單個(gè)的細(xì)胞(例如，花粉)、種子、植物細(xì)胞等等。本發(fā)明所提供的或者預(yù)期可用于本發(fā)明的植物包括單子葉植物和雙子葉植物。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明的植物是農(nóng)作物植物(例如，谷類和豆類、玉蜀黍、小麥、馬鈴薯、木薯(tapioca)、稻、蜀黍、粟、木薯、大麥、或豌豆)或其他豆科植物?？煞N植植物用于產(chǎn)生可食用的根、塊莖、葉、莖、花或果實(shí)。植物可以是蔬菜或觀賞植物。本發(fā)明的植物可以是玉黍蜀(Zeawqyj)、蕓苔(甘藍(lán)型油菜(5nxw/ca"a/ws)，Bra5^fcarapassp.)、亞麻(Ziww附MwYarilss/mw附)、紫花首稽(A/ec^'cagoj""v")、矛§(Oyz"saf/va)、黑麥(Seca/ecera/e)、蜀泰OSbrg/mmSorg/mwvw/gare)、向曰奏(i/WcmAus"朋—、小麥(7>7'//"附aeWvww)、大丑(G7少c7,"e、煙草(A^co"'a"(3fafc"cw附)、馬鈴墓(iSo/a"w附ft^erosw附)、花生(/^rac/z/s./z>pogaea)、棉花(Coyjj/z'柳/w>^w/,)、蕃著(丄o/W7oea6"to加)、木薯(Mam7wfescw/e"to)、助卩啡(Co/kspp.)、挪子(Cocos"w"y^ra)、鳳梨(^4w朋acomosw"、樹矛露(C7/7-wsspp.)、可可(7Tzeo6raw"cacao)、茶(Came〃/ase"e"w》、香蕉spp.)、轉(zhuǎn)梨(戶enseaamen'cawa)、無花果(F/cwscaw'ca)、番石權(quán)(/^(i/w/wg呵'flfva)、芒果(Ma"gzyb-zW/ca)、撤攬(O/eaewrc;paea)、木瓜(C/capa/aya)、腰果(^"ac"rt^'m附oc"Vfew/a7^)、夏威夷果(Afacfl(i"w/a/wferg/7》//fl)、杏仁(/Vw"wsfl，g(ia/m力、糖用甜菜(&tovw/g"Ws)、燕麥、或大麥。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，植物是被子植物。在一個(gè)實(shí)施方式中，植物是油料種子植物，優(yōu)選地是油料種子農(nóng)作物植物。在本文中，"油料種子植物"是用于從植物的種子中商品化生產(chǎn)油的植物物種。油料種子植物可以是油料種子油菜(例如蕓苔)、玉蜀黍、向日葵、大豆、蜀黍、亞麻(亞麻子)或糖用甜菜。此外，油料種子植物可以是其他的蕓苔屬(^^m/cw)、棉花、花生、罌粟、芥菜、蓖麻子、芝麻、紅花，或產(chǎn)生堅(jiān)果的植物。植物在其果實(shí)中可產(chǎn)生高水平的油，例如橄欖、油椰子或椰子。本發(fā)明可使用的園藝植物是萵苣、菊苣、或蕓苔屬蔬菜，包括甘藍(lán)、椰菜、或花椰菜。本發(fā)明可用于煙草、葫蘆、胡蘿卜、草莓、番茄或胡椒。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，用于產(chǎn)生本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物的非轉(zhuǎn)基因植物(特別是在其種子中)產(chǎn)生的油具有低于20%、低于10%或低于5%的18:2脂肪酸和/或具有低于10%或低于5%的18:3脂肪酸。在本發(fā)明中，轉(zhuǎn)基因植物包括這樣的植物(以及所述植物的部分或細(xì)胞)及其子代，它們已經(jīng)通過重組技術(shù)進(jìn)行了遺傳學(xué)修飾以便在所需的植物或植物器官內(nèi)產(chǎn)生至少一種本發(fā)明的多肽?？赏ㄟ^本領(lǐng)域已知的技術(shù)產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物，這些技術(shù)例如可參見A.Slater等，PlantBiotechnology-TheGeneticManipulationofPlants,OxfordUniversityPress(2003)禾口P.ChristouandH.Klee，HandbookofPlantBiotechnology,JohnWileyandSons(2004)。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，轉(zhuǎn)基因植物對于已經(jīng)被引入的每個(gè)基因(轉(zhuǎn)基因)均是純合子，這樣其子代的所需表型不會出現(xiàn)分離。轉(zhuǎn)基因植物對于引入的轉(zhuǎn)基因也可以是雜合子，例如，在從雜交種子生長而來的Fl子代中即是如此。此類植物可具有一些優(yōu)點(diǎn)，例如例如本領(lǐng)域熟知的雜種優(yōu)勢。轉(zhuǎn)基因植物還可包含參與產(chǎn)生LC-PUFA的額外的轉(zhuǎn)基因，例如，但不限于，A6去飽和酶、A9鏈延長酶、A8去飽和酶、A6鏈延長酶、對20:3底物具有活性的A5去飽和酶、(D-去飽和酶、A9鏈延長酶、A4去飽和酶、A7鏈延長酶和/或多聚乙酰合酶途徑成員。此類酶的實(shí)例是本領(lǐng)域已知的并包括WO05/103253中所述的那些(見例如，WO05/103253的表1)。轉(zhuǎn)基因植物中的本發(fā)明的多核苷酸可組成型表達(dá)于所有的發(fā)育階段。根據(jù)所使用的植物或植物器官，多肽可以階段特異性的方式表達(dá)。此外，多核苷酸可以組織特異性表達(dá)。本發(fā)明可使用已知或被發(fā)現(xiàn)能夠在植物中表達(dá)編碼感興趣的多肽的基因的調(diào)控序列。所用調(diào)控序列的選擇取決于感興趣的靶植物和/或靶器官?？蓮闹参锘蛑参锊《精@得此類調(diào)控序列或者是化學(xué)合成此類調(diào)控序列。此類調(diào)控序列是本領(lǐng)域人員熟知的。適用于穩(wěn)定轉(zhuǎn)染植物細(xì)胞或建立轉(zhuǎn)基因植物的多種載體已被公開，例如參見Po而els等，CloningVectors:ALaboratoryManual,1985，supp.1987;WeissbachandWeissbach,MethodsforPlantMolecularBiology,AcademicPress,1989;禾卩Gelvin等，PlantMolecularBiologyManual,KluwerAcademicPublishers,1990。典型地，植物表達(dá)載體包括，例如，受5'和3'調(diào)控序列轉(zhuǎn)錄調(diào)控的一或多個(gè)克隆的植物基因和顯性選擇標(biāo)記物。此類植物表達(dá)載體還可含有啟動子調(diào)控區(qū)(例如，調(diào)控區(qū)控制誘導(dǎo)型或組成型表達(dá)、環(huán)境調(diào)控型或38發(fā)育調(diào)控型表達(dá)、或細(xì)胞或組織特異性表達(dá))、轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)、核糖體結(jié)合位點(diǎn)、RNA加工信號、轉(zhuǎn)錄終止位點(diǎn)、和/或多腺苷酸化信號。已經(jīng)公開了在植物細(xì)胞內(nèi)具有活性的多種組成型啟動子。用于在植物中進(jìn)行組成型表達(dá)的合適的啟動子包括，但不限于，花椰菜花葉病病毒(CaMV)35S啟動子、玄參花葉病病毒(FMV)35S、甘蔗桿狀病毒啟動子、鴨跖草黃色斑點(diǎn)病毒啟動子、來自核酮糖-l，5-二磷酸羧化酶小亞基的光誘導(dǎo)型啟動子、稻的細(xì)胞質(zhì)磷酸丙糖異構(gòu)酶啟動子、擬南芥的腺嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶啟動子、稻肌動蛋白1基因啟動子、甘露氨酸合酶和章魚堿合酶啟動子、Adh啟動子、蔗糖合酶啟動子、R基因復(fù)合體啟動子和葉綠素a/p結(jié)合蛋白基因啟動子。這些啟動子已經(jīng)用于構(gòu)建在植物中表達(dá)的DNA載體；參見，例如PCT出版物WO8402913。所有這些啟動子均已用于構(gòu)建可在植物中表達(dá)的各類重組DNA載體。為了在植物的源組織例如葉、種子、根或莖中進(jìn)行表達(dá)，優(yōu)選地，本發(fā)明所用的啟動子在這些特定組織中具有相對高的表達(dá)。為此，可為基因選擇多種具有組織或細(xì)胞特異性或增強(qiáng)型的啟動子。文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)的此類啟動子的實(shí)例包括豌豆的葉綠體谷氨酰胺合成酶GS2啟動子、小麥的葉綠體果糖-l，6-二磷酸酶啟動子、馬鈴薯的核光合ST-LS1啟動子、擬南芥的絲氨酸/蘇氨酸激酶啟動子和葡糖淀粉酶(CHS)啟動子。以下啟動子也被報(bào)導(dǎo)在具有光合作用活性的組織中具有活性，東方落葉松(丄Wx/an'c^)的核酮糖-l，5-二磷酸羧化酶啟動子、松Cab基因Cab6的啟動子、小麥Cab-l基因啟動子、菠菜Cab-l基因啟動子、稻Cab1R基因啟動子、玉蜀黍的丙酮酸-正磷酸雙激酶(PPDK)啟動子、煙草LhcbP2基因的啟動子、擬南芥Suc2蔗糖-H^協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)子啟動子、菠菜的類囊體膜蛋白基因啟動子(PsaD，PsaF,PsaE,PC，F(xiàn)NR，AtpC，AtpD,Cab，RbcS)。葉綠素a/p-結(jié)合蛋白的其他啟動子也可用于本發(fā)明，例如白芥菜CS/"";^"/6")LhcB基因和PsbP基因的啟動子。應(yīng)答于環(huán)境、激素、化學(xué)品和/或發(fā)育信號而被調(diào)控的各種植物基因啟動子也可用于在植物細(xì)胞中表達(dá)RNA-結(jié)合蛋白基因，包括受到以下調(diào)控的啟動子(l)熱；(2)光(例如豌豆RbcS-3A啟動子、玉蜀黍RbcS啟動子)；(3)激素，例如脫落酸類；(4)致傷(wounding)(例如W皿I);或(5)化學(xué)制品，例如茉莉酮酸甲酯、水楊酸、類固醇激素、醇、Safeners(WO9706269);或者使用(6)器官特異性啟動子也是有利的。為了在植物的庫組織(sinktissues)中表達(dá)，例如在馬鈴薯的塊莖、番茄的果實(shí)、或大豆、蕓苔、棉花、玉蜀黍、小麥、稻和大麥的種子中表達(dá)，本發(fā)明所用的啟動子優(yōu)選地在這些特異性組織中具有相對高的表達(dá)。已知多種具有塊莖特異性或增強(qiáng)型表達(dá)的基因啟動子，包括I類patatin啟動子、馬鈴薯塊莖ADPGPP基因啟動子(大和小亞單位)、蔗糖合酶啟動子、包括22kD蛋白質(zhì)復(fù)合物和蛋白酶抑制劑的主要塊莖蛋白的啟動子、顆粒結(jié)合型淀粉合酶基因(GBSS)的啟動子以及其他I和II類patatin啟動子。其他啟動子也可用于在特定組織例如種子或果實(shí)中表達(dá)蛋白質(zhì)?？墒褂肑3-伴大豆球蛋白啟動子或其他種子特異性啟動子例如napin和菜豆球蛋白啟動子。用于玉蜀黍胚乳表達(dá)的特別優(yōu)選的啟動子是稻的谷蛋白基因啟動子，更具體而言是Osgt-l啟動子。適合用于在小麥中表達(dá)的啟動子實(shí)例包括ADPglucosepyrosynthase(ADPGPP)亞單位的啟動子、顆粒結(jié)合型及其他淀粉合酶的啟動子、分支酶和脫支酶的啟動子、胚發(fā)生-高豐度蛋白的啟動子、麥醇溶蛋白的啟動子、和麥谷蛋白的啟動子。稻中的此類啟動子的實(shí)例包括ADPGPP亞單位的啟動子、顆粒結(jié)合型及其他淀粉合酶的啟動子、分支酶的啟動子、脫支酶的啟動子、蔗糖合酶的啟動子、和谷蛋白的啟動子。特別優(yōu)選的啟動子是稻的谷蛋白Osgt-l基因啟動子。大麥中的此類啟動子的實(shí)例包括ADPGPP亞單位的啟動子、顆粒結(jié)合型及其他淀粉合酶的啟動子、分支酶的啟動子、脫支酶的啟動子、蔗糖合酶的啟動子、大麥醇溶蛋白的啟動子、胚球蛋白的啟動子、和糊粉特異性蛋白的啟動子。還可使用根特異性啟動子。所述啟動子的實(shí)例是酸性殼多糖酶基因啟動子。還可使用已經(jīng)得到鑒定的CaMV35S啟動子的根特異性亞結(jié)構(gòu)域來實(shí)現(xiàn)在根組織中的表達(dá)。在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，啟動子在脂肪酸和油進(jìn)行生物合成的組織和器官中指導(dǎo)表達(dá)，特別是種子細(xì)胞例如胚乳細(xì)胞和發(fā)育的胚的細(xì)胞。合適的啟動子是油料種子油菜napin基因啟動子(美國5,608,152)、蠶豆(F/da/a6a)USP啟動子(Baumlein等，1991)、擬南芥油質(zhì)蛋白啟動子(WO98/45461)、菜豆(尸/zo^o/ww/gan》的菜豆球蛋白啟動子(美國5,504,200)、蕓苔屬Bce4啟動子(WO91/13980)或豆球蛋白B4啟動子(Baumlein等，1992)和在單子葉植物例如玉蜀黍、大麥、小麥、黑麥、稻等中引起種子特異性的表達(dá)啟動子。合適的著名啟動子是大麥lpt2或lptl基因啟動子(WO95/15389和WO95/23230)或WO99/16890所述的啟動子(大麥的大麥醇溶蛋白基因的啟動子、稻的谷蛋白基因的啟動子、稻的oryzin基因的啟動子、稻的醇溶谷蛋白基因的啟動子、小麥的麥醇溶蛋白基因的啟動子、小麥的谷蛋白基因的啟動子、玉蜀黍的玉米醇溶蛋白基因的啟動子、燕麥的谷蛋白基因的啟動子、蜀黍kasirin基因的啟動子、黑麥的黑麥醇溶蛋白基因的啟動子)。其他啟動子包括Broun等(1998)和美國20030159173所述的啟動子?？蓮倪x定的啟動子衍生出5'非翻譯前導(dǎo)序列以表達(dá)本發(fā)明的多核苷酸的異源基因序列，需要的話還可對其進(jìn)行修飾以便增加mRNA的翻譯。如何優(yōu)化轉(zhuǎn)基因的表達(dá)可參見Koziel等(1996)的綜述。5'非翻譯區(qū)也可得自植物病毒RNA(煙草花葉病病毒、煙草刻蝕病毒、玉蜀黍矮花葉病病毒、紫花苜?；ㄈ~病病毒等等)、合適的真核細(xì)胞基因、植物基因(小麥和玉蜀黍葉綠素^結(jié)合蛋白基因前導(dǎo)區(qū))、或合成的基因序列。本發(fā)明不限于其中所述非翻譯區(qū)衍生自伴隨啟動子序列的5'非翻譯序列的構(gòu)建體。前導(dǎo)序列也可衍生自無關(guān)的啟動子或編碼序列?？捎糜诒景l(fā)明的前導(dǎo)序列包括玉蜀黍Hsp70前導(dǎo)區(qū)(美國5,362,865和美國5，859，347)和TMVco元件。轉(zhuǎn)錄的終止是通過嵌合載體內(nèi)與感興趣的多核苷酸可操縱地連接的3'非翻譯DNA序列而實(shí)現(xiàn)的。重組DNA分子的3'非翻譯區(qū)含有多腺苷酸化信號，其在植物中的作用是導(dǎo)致在RNA的3'端添加腺嘌呤核苷酸。3'非翻譯區(qū)可得自在植物細(xì)胞中表達(dá)的各種基因。常用的是胭脂堿合酶3'非翻譯區(qū)、豌豆的小亞單位核酮糖二磷酸羥化酶(Rubisco)基因的3'非翻譯區(qū)、大豆的7S種子貯藏蛋白基因的3'非翻譯區(qū)。含有聚腺苷酸化信號的土壤桿菌(々ra^改n'wm)腫瘤誘導(dǎo)型(Ti)質(zhì)?；虻?'轉(zhuǎn)錄的非翻譯區(qū)也是合適的。已經(jīng)公開了4種常規(guī)的方法用于將基因直接輸送至細(xì)胞內(nèi)(l)化學(xué)方法(Graham等，1973);(2)物理方法，例如微注射(Capecchi，1980);電穿孔(參見，例如，WO87/06614，美國5,472,869，5,384,253,WO92/09696和WO93/21335);和基因槍(參見，例如，美國4,945,050和美國5，141,131);(3)病毒載體(Clapp，1993;Lu等，1993;Eglitis等，1988);和(4)受體介導(dǎo)的機(jī)制(Curiel等，1992;Wagner等，1992)?？墒褂玫募铀俜椒òǎ?，微粒轟擊等等。將轉(zhuǎn)化核酸分子輸送至植物細(xì)胞內(nèi)的方法的一個(gè)實(shí)例是微粒轟擊。該方法的綜述見Yang等，Particle轟擊TechnologyforGeneTransfer,OxfordPress,Oxford,England(1994)。非生物學(xué)顆粒(微粒)可包被上核酸并通過推進(jìn)力輸送至細(xì)胞內(nèi)。示例性的顆粒包括含鎢、金、鉑等的顆粒。其除了是可重復(fù)性地轉(zhuǎn)化單子葉植物的有效手段之外，微粒轟擊的特別優(yōu)勢還在于，既不需要分離原生質(zhì)體，也不需要對土壤桿菌感染的易感性。通過加速而將DNA輸送至玉蜀黍細(xì)胞內(nèi)的方法的一個(gè)示例性實(shí)施方式是生物彈道學(xué)a-顆粒輸送系統(tǒng)，其能夠驅(qū)動包被有DNA的顆粒通過一個(gè)屏，例如不銹鋼或Nytex屏，到達(dá)以懸浮培養(yǎng)的玉黍蜀細(xì)胞所覆蓋的濾膜表面上。適合用于本發(fā)明的顆粒輸送系統(tǒng)是氦加速槍PDS-1000/He，可自Bio-RadLaboratories獲得。為進(jìn)行轟擊，可將懸浮的細(xì)胞濃縮于濾膜上。將含有待轟擊細(xì)胞的濾膜放置在距微粒停止板下方合適的距離處。需要的話，還可在槍和待轟擊細(xì)胞之間放置一或多個(gè)屏?；蛘?，可將不成熟的胚或其他耙細(xì)胞設(shè)置在固相培養(yǎng)基上。待轟擊細(xì)胞放置在距微粒停止板下方適當(dāng)距離處。如果需要，還可在加速裝置和待轟擊細(xì)胞之間放置一或多個(gè)屏。通過在此所述的技術(shù)可獲得1000或更多個(gè)瞬時(shí)表達(dá)標(biāo)記物基因的細(xì)胞焦點(diǎn)。轟擊后48小時(shí)焦點(diǎn)內(nèi)表達(dá)外源基因產(chǎn)物的細(xì)胞數(shù)量在一到10個(gè)，平均為一到3個(gè)。在轟擊轉(zhuǎn)化中，可優(yōu)化轟擊前培養(yǎng)條件和轟擊參數(shù)，以產(chǎn)生最大數(shù)量的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化體。轟擊的物理學(xué)和生物學(xué)參數(shù)對于該技術(shù)均十分重要。物理因素涉及操控DNA/微粒沉淀物或影響大顆?；蛭⒘５娘w行和速率的因素。生物學(xué)因素包括涉及在轟擊之前和轟擊后即刻對細(xì)胞的操控步驟、調(diào)節(jié)耙細(xì)胞的滲透壓以便減輕與轟擊相關(guān)的損傷、以及轉(zhuǎn)化DNA的性質(zhì)，例如是線性化DNA還是完好的超螺旋質(zhì)粒。轟擊前操控被認(rèn)為對于成功轉(zhuǎn)化未成熟胚而言是特別重要的。在另一個(gè)替代性實(shí)施方式中，可穩(wěn)定轉(zhuǎn)化質(zhì)體。在高等植物中轉(zhuǎn)化質(zhì)體的已知方法包括用顆粒槍輸送含有選擇標(biāo)記物的DNA并通過同源重組將DNA導(dǎo)向質(zhì)體基因組(美國5,451,513，美國5,545,818，美國5,877,402，美國5,932479，和WO99/05265)。因此，預(yù)期可以的是，可通過在小規(guī)模的研究中調(diào)整轟擊參數(shù)的各個(gè)方面以便充分優(yōu)化條件。特別希望調(diào)整的是物理參數(shù)，例如間隙距離、飛行距離、組織距離和氦氣壓力。還可通過改變影響受者細(xì)胞的生理學(xué)狀態(tài)并因此可影響轉(zhuǎn)化和整合效率的條件以使得降低損傷因素最小化。例如，可調(diào)節(jié)滲透壓狀態(tài)、組織水合和受者細(xì)胞的亞培養(yǎng)階段或細(xì)胞周期以達(dá)到最佳轉(zhuǎn)化。根據(jù)在此公開的內(nèi)容，本領(lǐng)域人員知曉如何進(jìn)行其他常規(guī)的調(diào)整。土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)移是將基因引入植物細(xì)胞的廣泛適用的系統(tǒng)，這是因?yàn)镈NA可被引入完整的植物組織內(nèi)，從而不需要從原生質(zhì)體產(chǎn)生完整的植物。使用土壤桿菌介導(dǎo)的植物整合載體將DNA引入植物細(xì)胞是本領(lǐng)域熟知的(參見，例如，美國5,177,010，美國5,104,310，美國5,004,863，美國5，159，135)。此外，T-DNA的整合是相對精確的過程，其極少產(chǎn)生重排。待轉(zhuǎn)移的DNA區(qū)域由邊界序列限定，干預(yù)DNA通常被插入至植物基因組內(nèi)?，F(xiàn)代土壤桿菌轉(zhuǎn)化載體能夠在大腸桿菌和土壤桿菌中復(fù)制，便于操控(Klee等，In:PlantDNAInfectiousAgents,HohnandSchell,eds.,Springer-Verlag:NewYork,pp.179-203(1985)。此外，土壤桿菌介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移載體的技術(shù)進(jìn)步改善了載體內(nèi)的基因排列和限制性位點(diǎn)，有助于構(gòu)建能夠表達(dá)各種多肽編碼基因的表達(dá)。已經(jīng)公開的載體具有便利的多連接物區(qū)域，其側(cè)翼為啟動子和多聚腺苷酸化位點(diǎn)，用于指導(dǎo)插入的多肽編碼基因的表達(dá)，這適合本發(fā)明的目的。此外，既可使用含有未弱化的(armed)Ti基因的土壤桿菌也可使用Ti基因弱化的(disarmed)土壤桿菌進(jìn)行轉(zhuǎn)化。在可有效進(jìn)行土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化的那些植物品種中，該方法由于具有方便且明確的基因轉(zhuǎn)移特性，因此是首選。采用土壤桿菌轉(zhuǎn)化方法形成的轉(zhuǎn)基因植物典型地含有位于一條染色體上的單個(gè)基因座。此類轉(zhuǎn)基因植物可被稱為所添加的基因的半合子。更優(yōu)選的轉(zhuǎn)基因植物是所添加的基因的純合子；即，轉(zhuǎn)基因植物含有兩個(gè)所添加的基因，一對染色體的每一條的相同基因座上具有一個(gè)基因?？赏ㄟ^用獨(dú)立的隔離的轉(zhuǎn)基因植物(含有單個(gè)的所添加的基因)進(jìn)行有性繁殖(自花授粉)，使所得種子發(fā)芽，并分析所得植物中的感興趣的基因，從而獲得純合子轉(zhuǎn)基因植物。還要理解，兩種不同的轉(zhuǎn)基因植物可雜交產(chǎn)生含有兩種獨(dú)立地分離外源基因的子代。合適子代的自花授粉可產(chǎn)生兩種外源基因均為純合子的植物。也預(yù)期了與親代植物進(jìn)行回交以及與非轉(zhuǎn)基因植物進(jìn)行異系雜交，以及營養(yǎng)體繁殖。常規(guī)采用的對不同性狀和作物的其他育種方法可參見Fehr，In:BreedingMethodsforCultivarDevelopment,WilcoxJ.ed.，AmericanSocietyofAgronomy,MadisonWis.(1987)?？刹捎没诹姿徕}沉淀、聚乙二醇處理、電穿孔以及這些處理的組合的方法實(shí)現(xiàn)植物原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化。如何將這些系統(tǒng)應(yīng)用于不同植物品種取決于自原生質(zhì)體再生出特定植株的能力。自原生質(zhì)體再生谷類的示例性方法已被公開(Fujimura等，1985;Toriyama等，1986;Abdullah等，1986)。還可采用其他的細(xì)胞轉(zhuǎn)化方法，包括但不限于通過以下方法將DNA引入植物直接將DNA轉(zhuǎn)移至花粉，直接將DNA注射至植物的繁殖性器官，或直接將DNA注射至未成熟胚的細(xì)胞內(nèi)隨后對干燥的胚進(jìn)行再水化。從單個(gè)植物原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化體或各種轉(zhuǎn)化的外植體再生、發(fā)育和栽培出植物是本領(lǐng)域熟知的(Weissbach等，In:MethodsforPlantMolecularBiology,AcademicPress,SanDiego,Calif.,(1988)。這種再生和生長方法典型地包括以下步驟選擇轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，培養(yǎng)個(gè)體化細(xì)胞歷經(jīng)從胚發(fā)育至有根的小植株階段的通常階段。轉(zhuǎn)基因胚和種子的再生類似。得到的轉(zhuǎn)基因的有根的苗隨后栽植在合適的植物生長培養(yǎng)基例如土壤中。含有外來的外源基因的植物的發(fā)育或再生是本領(lǐng)域熟知的。優(yōu)選地，再生的植物自花傳粉以產(chǎn)生純合子轉(zhuǎn)基因植物。或者，將得自再生的植物的花粉與由具有重要農(nóng)藝價(jià)值的株系的種子長成的植物進(jìn)行雜交。反過來，可使用來自這些重要株系的植物的花粉給再生的植物授粉?？刹捎帽绢I(lǐng)域人員熟知的方法栽培含有所需外源核酸的本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物。主要采用根癌土壤桿菌(^gro6a"en'Mmfwm^/"flc/em)轉(zhuǎn)化雙子葉植物以及獲得轉(zhuǎn)基因植物的方法已經(jīng)用于棉花(美國5，004,863，美國5,159,135,美國5,518,908);大豆(美國5,569,834,美國5，416，011);蕓苔屬(美國5,463,174);花生(Cheng等，1996);和豌豆(Grant等，1995)。轉(zhuǎn)化谷類植物例如小麥和大麥以便通過引入外源核酸而在植物中引入遺傳變異以及用于從原生質(zhì)體或未成熟的植物胚再生植物的方法是本領(lǐng)域熟知的，參見例如，加拿大專利申請No.2,092,588、澳大利亞專利申請No61781/94、澳大利亞專利No667939、美國專利No.6,100,447、國際專利申請PCT/US97/10621、美國專利No.5,589,617、美國專利No.6,541,257，其他方法參見專利說明書W099/14314。優(yōu)選地，通過根癌土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因小麥或大麥植物。攜帶所需核酸構(gòu)建體的載體可被引入組織培養(yǎng)的植物或外植體的可再生的小麥細(xì)胞內(nèi)、或合適的植物系統(tǒng)例如原生質(zhì)體中。可再生的小麥細(xì)胞優(yōu)選地來自未成熟胚、成熟胚、來自它們的愈傷組織、或分生組織的盾片。為了證實(shí)轉(zhuǎn)基因細(xì)胞和植物內(nèi)存在轉(zhuǎn)基因，可采用本領(lǐng)域人員己知的方法進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增或Southern印跡分析。根據(jù)產(chǎn)物的性質(zhì)，可通過多種途徑檢測轉(zhuǎn)基因表達(dá)產(chǎn)物，包括免疫印跡和酶分析。在不同植物組織中定量蛋白質(zhì)表達(dá)和檢測復(fù)制的一種特別有用的方法是使用報(bào)告基因，例如GUS。一旦獲得轉(zhuǎn)基因植物，可使之生長產(chǎn)生具有所需表型的植物組織或部分?？墒斋@植物組織或植物部分和/或收集種子。種子可用作來源用于生長出具有所需特性的額外的植物、組織或部分。轉(zhuǎn)基因非人類動物"轉(zhuǎn)基因非人類動物"指的是動物而非人類，所述動物含有同一物種或品種的野生型動物所不具有的基因構(gòu)建體("轉(zhuǎn)基因")。在此所述的"轉(zhuǎn)基因"具有生物
技術(shù)領(lǐng)域：
內(nèi)的通常含義，且包括這樣的遺傳學(xué)序列，所述序列是經(jīng)重組DNA或RNA技術(shù)產(chǎn)生或改變的且已經(jīng)被引入至動物細(xì)胞內(nèi)。轉(zhuǎn)基因可包括來源于動物細(xì)胞的遺傳學(xué)序列。典型地，轉(zhuǎn)基因已經(jīng)通過人為操作引入至動物內(nèi)，例如，通過轉(zhuǎn)化，但也可通過本領(lǐng)域人員所知的任何方法。產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動物的技術(shù)是本領(lǐng)域熟知的。該方面的通用教科書是Houdebine，Transgenicanimals—GenerationandUse(HarwoodAcademic,1997)。異源DNA可被引入至例如哺乳動物的受精卵內(nèi)。例如，可通過微注射、磷酸鈣介導(dǎo)的沉淀、脂質(zhì)體融合、反轉(zhuǎn)錄病毒感染或其他手段轉(zhuǎn)化全能或多能干細(xì)胞，然后將轉(zhuǎn)化的細(xì)胞引入胚胎，并使胚胎發(fā)育為轉(zhuǎn)基因動物。在高度優(yōu)選的方法中，使用含義所需DNA的反轉(zhuǎn)錄病毒感染發(fā)育的胚胎，并自感染的胚胎產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動物。不過，在最優(yōu)選的方法中，合適的DNA被共注射至前核或胚胎的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，優(yōu)選地在單個(gè)細(xì)胞階段，并使胚胎發(fā)育為成熟的轉(zhuǎn)基因動物。z產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動物的另一方法涉及通過標(biāo)準(zhǔn)的方法將核酸微注射至原核期卵內(nèi)。然后培養(yǎng)被注射的卵，隨后轉(zhuǎn)移至假孕受者的輸卵管內(nèi)。還可通過核移植技術(shù)產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動物。采用這種方法，用質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染來自供者動物的成纖維細(xì)胞，該質(zhì)粒整合有置于調(diào)控序列控制下的感興趣的45結(jié)合結(jié)構(gòu)域或結(jié)合區(qū)的編碼序列。然后將穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染體與去核的卵母細(xì)胞融合，培養(yǎng)并轉(zhuǎn)移至雌性受者內(nèi)。飼料(Feedstuffs)本發(fā)明包括可用作飼料的組合物。在本發(fā)明中，"飼料"包括供人類或動物攝入(包括用于胃腸道和/或胃腸外攝入)的任何食物或制品，當(dāng)其進(jìn)入肌體后，(a)用于營養(yǎng)或強(qiáng)健組織或提供能量；和/或(b)保持、恢復(fù)或支持足夠的營養(yǎng)狀態(tài)或代謝功能。本發(fā)明的飼料包括嬰兒和/或幼兒的營養(yǎng)組合物。本發(fā)明的飼料包含，例如，本發(fā)明的細(xì)胞、本發(fā)明的植物、本發(fā)明的植物部分、本發(fā)明的種子、本發(fā)明的提取物、本發(fā)明的方法的產(chǎn)物、本發(fā)明的發(fā)酵方法的產(chǎn)物、或本發(fā)明的組合物，以及合適的載劑。術(shù)語"載劑"取其最為廣泛的含義，涵蓋具有或不具有營養(yǎng)價(jià)值的任何成分。本領(lǐng)域人員能夠理解，載劑必須適合于用于詞料(或以足夠低的濃度使用)，以便其不會對攝入所述飼料的生物體產(chǎn)生有害作用。本發(fā)明的伺料包含使用本發(fā)明的方法、細(xì)胞或植物直接或間接產(chǎn)生的油、脂肪酸酯或脂肪酸。組合物可以是固體或液體的形式。此外，組合物可包括可食用的常量營養(yǎng)物、維生素、和/或礦物質(zhì)，它們的量符合特定的需要。這些成分的量可以變化，這取決于組合物是用于正常個(gè)體還是用于具有特殊需求的個(gè)體，例如患有代謝性疾病和類似情況的個(gè)體。具有營養(yǎng)價(jià)值的合適的載劑的實(shí)例包括，但不限于，常量營養(yǎng)物例如可食用的脂肪、糖類和蛋白質(zhì)。此類可食用的脂肪的實(shí)例包括，但不限于，椰子油、琉璃苣油、真菌油、黑醋栗油、大豆油和甘油一酸酯和甘油二酯。此類糖類的實(shí)例包括(但不限于)葡萄糖、食用乳糖、和水解淀粉。此外，可用于本發(fā)明的營養(yǎng)組合物中的蛋白質(zhì)的實(shí)例包括(但不限于)大豆蛋白、電滲析乳清、電滲析脫脂乳、乳乳清、或這些蛋白質(zhì)的水解產(chǎn)物。至于維生素和礦物質(zhì)，以下物質(zhì)可添加至本發(fā)明的詞料組合物中鈣、磷、鉀、鈉、氯、鎂、錳、鐵、銅、鋅、硒、碘和維生素A、E、D、C、和復(fù)合B。其他的此類維生素和礦物質(zhì)也可添加。用于本發(fā)明的飼料組合物的成分可以是半純化來源的或純化來源的。半純化來源的或純化來源的指的是通過對天然材料進(jìn)行純化而制備的物質(zhì)或通過從頭合成而制備的物質(zhì)。本發(fā)明的飼料組合物也可添加至食物中，即使是在不需要飲食增補(bǔ)的情況下也可以。例如，組合物可添加至任何類型的食物中，包括(但不限于)人造黃油、改性黃油、奶酪、乳、酸奶、巧克力、糖果、點(diǎn)心、色拉油、烹飪用油、烹飪用脂肪、肉、魚和飲料。酵母屬物種用于釀造啤酒和葡萄酒以及烘焙，特別是烘制面包。酵母是植物提取物的主要成分。酵母也用作動物feed的添加劑。顯然，可產(chǎn)生遺傳工程化的酵母菌株使之適合于合成在此所述的LC-PUFA。這些酵母菌株隨后可用于食品以及葡萄酒和啤酒釀造，以便提供具有增加的脂肪酸含量的產(chǎn)P叩o此外，根據(jù)本發(fā)明產(chǎn)生的脂肪酸或經(jīng)轉(zhuǎn)化后含有并表達(dá)對象基因的宿主細(xì)胞也可用作動物食物增補(bǔ)劑，以改變動物組織或乳的脂肪酸組成，使之更適合人類或動物攝入。此類動物的實(shí)例包括羊、牛、馬等等。此外，本發(fā)明的飼料還可用于水產(chǎn)業(yè)以提高供人類或動物攝入的魚的脂肪酸水平。組合物本發(fā)明還包括組合物，特別是藥物組合物，所述組合物包含一或多種采用本發(fā)明的方法產(chǎn)生的脂肪酸和/或所得的油。藥物組合物可包含一或多種脂肪酸和/或油，連同標(biāo)準(zhǔn)的、熟知的、非毒性藥用可接受的載劑、佐劑或載體，例如磷酸緩沖鹽溶液、水、乙醇、多元醇、植物油、濕潤劑或乳狀液，例如水/油乳狀液。組合物可以是液體或固體形式。例如，組合物的形式可以是片劑、膠囊、可攝入的液體或粉末、注射形式、或局部用藥膏或乳劑?？赏ㄟ^例如保持分散體系所需要的粒徑和通過使用表面活性物質(zhì)而保持合適的流動性。還可加入等滲劑，例如，糖、氯化鈉等等。除了此類惰性修飾劑之外，組合物還可包括佐劑，例如濕潤劑、乳化和混懸劑、甜味劑、調(diào)味劑和芳香劑。混懸液除了含有活性化合物之外還包含混懸劑，例如乙氧基異硬脂醇(ethoxylatedisostearylalcohols)、聚氧乙烯山梨醇酯和聚氧乙烯山梨糖酯、微晶纖維素、偏氫氧化鋁(aluminummetahydroxide)、班脫土、瓊脂、和黃芪膠或這些物質(zhì)的混合物?？赏ㄟ^采用本領(lǐng)域熟知的技術(shù)制備固體劑量形式例如片劑和膠囊。例如，根據(jù)本發(fā)明產(chǎn)生的脂肪酸可壓成片劑，其中使用常規(guī)的片基例如乳糖、蔗糖和玉米淀粉，聯(lián)合使用的有粘合劑例如阿拉伯樹膠、玉米淀粉或白明膠，崩解劑例如馬鈴薯淀粉或褐藻酸，以及潤滑劑例如硬脂酸或硬脂酸鎂。可通過將這些賦形劑連同抗氧化劑和相關(guān)的脂肪酸裝入白明膠膠囊而制備膠對于靜脈施用，可將根據(jù)本發(fā)明產(chǎn)生的脂肪酸或其衍生物摻入至商品化的配制品中。特定脂肪酸的典型劑量是0.1mg至20g，每天攝入1至5次(高達(dá)每日100g)，且優(yōu)選地在每天大約10mg至大約1、2、5、或10g的范圍內(nèi)(一次或分多次攝入)。本領(lǐng)域已知，每天需要最少大約300mg的脂肪酸，特別是LC-PUFA。不過，應(yīng)該理解任何量的脂肪酸對對象均可能是有益的。本發(fā)明的藥物組合物的可能的施用途徑包括，例如，胃腸道(例如口服和直腸)和胃腸外。例如，可口服或直腸施用液體制備物。此外，可將均質(zhì)的混合物完全分散至水中，在無菌條件下與生理學(xué)可接受的稀釋劑、防腐劑、緩沖劑或推進(jìn)物混合物，形成噴劑或吸入劑。待施用于患者的組合物的劑量可由本領(lǐng)域人員確定，這取決于多種因素，例如患者的體重、患者的年齡、患者的總體健康狀況、患者的既往病史、患者的免疫狀態(tài)等等。此外，本發(fā)明的組合物可用于化妝品。其可添加至已有的化妝品組合物中一般形成混合物，或是將根據(jù)本發(fā)明產(chǎn)生的脂肪酸用作化妝品組合物中的唯一的"活性"成分。油的產(chǎn)生可采用本領(lǐng)域常規(guī)使用的技術(shù)來提取、加工和分析由本發(fā)明的細(xì)胞、植物、種子等產(chǎn)生的油。典型地，植物種子經(jīng)熟化、壓榨和提取以產(chǎn)生粗制油，然后進(jìn)行脫膠、精制、脫色和除味。通常，種子壓碎技術(shù)是本領(lǐng)域已知的。例如，給油料種子噴水使之變軟，并使之含水量升高至，例如8.5%，使用間隙設(shè)置為0.23至0.27mm的平滑滾筒將其制成薄片。根據(jù)種子的類型，在壓碎之前可以不加水。加熱可使酶失活，且有助于細(xì)胞進(jìn)一步破壞，使油滴凝結(jié)，并使蛋白質(zhì)凝聚，所有這些均有助于提取加工。通過螺旋壓搾機(jī)可使得大部分種子油釋放出來。從螺旋壓搾機(jī)排出的餅隨后進(jìn)行溶劑提取，例如以己垸，使用伴熱柱(heattracedcolumn)?；蛘?，壓榨工序所產(chǎn)生的粗制油可通過沉降罐，其上部具有槽狀金屬絲網(wǎng)引流構(gòu)造，以去除壓榨工序過程中隨油而擠出的固形物。凈化的油再通過板框式濾器，以去除任何殘余的微小固形顆粒。如果需要，自提取工序所回收的油可與凈化的油混合以產(chǎn)生摻合的粗制油。將溶劑從粗制油中去除后，將壓榨部分和提取部分混合餅對其進(jìn)行常規(guī)的油加工過程(即，脫膠、堿法凈化、脫色和除味)?？赏ㄟ^向粗制油中添加濃磷酸進(jìn)行脫膠，將不可水合的磷脂轉(zhuǎn)化為可水合形式，并螯合存在的少量金屬。通過離心將膠與油分離?？赏ㄟ^添加足量的氫氧化鈉溶液滴定全部脂肪酸并移除所形成脂肪酸鹽，以精制油?？赏ㄟ^在真空條件下將油加熱至260°C并以0.1ml/分鐘/100ml油的速度緩慢向油中引入蒸汽而進(jìn)行除味。噴射30分鐘后，將油在真空中冷卻。典型地，油被轉(zhuǎn)移至玻璃容器并充入氬氣，然后冷藏。如果油量有限，則可置于真空條件下，例如Parr反應(yīng)器內(nèi)，并加熱至260°C，加熱時(shí)間與用于除味所需的時(shí)間一樣。這一處理可改善油的顏色并去除絕大部分的揮發(fā)性物質(zhì)。抗體本發(fā)明還提供針對本發(fā)明的多肽或其片段的單克隆或多克隆抗體。因此，本發(fā)明還提供用于產(chǎn)生針對本發(fā)明多肽的單克隆或多克隆抗體的方法。術(shù)語"特異性結(jié)合"指的是抗體能夠結(jié)合本發(fā)明的蛋白質(zhì)而不結(jié)合其他己知的去飽和酶、結(jié)合酶、環(huán)氧化酶和/或羥化酶樣多肽。在本文中，術(shù)語"表位"指的是本發(fā)明的多肽內(nèi)與抗體發(fā)生結(jié)合的區(qū)域。表位可被施用于動物以產(chǎn)生針對該表位的抗體，不過，本發(fā)明的抗體優(yōu)選地特異性結(jié)合完整多肽情況下的表位區(qū)域。如果需要多克隆抗體，可用免疫原性多肽免疫選定的動物(例如小鼠、兔、山羊、馬等等)，免疫原性多肽例如是SEQIDNO.'16至30、73至78、80和134所示的那些。收集被免疫動物的血清，并按照已知的步驟進(jìn)行處理。如果含多克隆抗體的血清含有針對其他抗原的抗體，則可通過免疫親和色譜純化多克隆抗體。產(chǎn)生和加工多克隆抗血清的技術(shù)是本領(lǐng)域已知的。為了制備此類抗體，本發(fā)明還提供本發(fā)明的肽或其片段，其與在動物中用作免疫原的另一種肽發(fā)生半抗原化。本領(lǐng)域人員還可容易地制備針對本發(fā)明的多肽的單克隆抗體。通過雜交瘤制備單克隆抗體的通用技術(shù)是已知的?？赏ㄟ^細(xì)胞融合而建立產(chǎn)生抗體的永生細(xì)胞系，其他的技術(shù)例如為使用癌基因DNA直接轉(zhuǎn)化B淋巴細(xì)胞，或是用Epstein-Barr病毒進(jìn)行轉(zhuǎn)染?？舍槍Ω鞣N性質(zhì)篩選單克隆抗體；即，針對同種型和表位親和力進(jìn)行篩選。另一種替代性的技術(shù)涉及篩選噬菌體展示文庫，其中，例如噬菌體在其表面表達(dá)具有大量互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)的scFv片段。該技術(shù)是本領(lǐng)域熟知的。在本發(fā)明中，除非另有說明，術(shù)語"抗體"包括完整抗體的片段，所述片段仍保留與靶抗原的結(jié)合活性。此類片段包括Fv、F(ab')和F(ab')2片段，以及單鏈抗體(scFv)。此外，抗體及其片段可以是人源化抗體，例如參見EP-A-239400。本發(fā)明的抗體可結(jié)合于固相支持物和/或在合適的容器內(nèi)與合適的試劑、對照、說明等包裝成試劑盒。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的抗體具有可檢測標(biāo)記物?？捎糜谥苯訙y定抗體結(jié)合的可檢測標(biāo)記物的實(shí)例包括放射性標(biāo)記物、熒光團(tuán)、染料、磁珠、化學(xué)發(fā)光物、膠體顆粒等。可用于間接測定結(jié)合的標(biāo)記物的實(shí)例包括酶，其底物可提供顏色或熒光產(chǎn)物?？蓹z測標(biāo)記物的額外的實(shí)例包括共價(jià)結(jié)合的酶，在加入合適的底物后，所述酶能夠提供可檢測產(chǎn)物信號。適合用于綴合物的酶的實(shí)例包括辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶、蘋果酸脫氫酶等。在不能商購的情況下，可通過本領(lǐng)域人員已知的技術(shù)容易地產(chǎn)生此類抗體-酶綴合物。進(jìn)一歩的示例性可檢測標(biāo)記物包括生物素，其以高親和力結(jié)合抗生物素蛋白或抗生蛋白鏈菌素；可用于熒光激活的細(xì)胞分選儀的熒光染料(例如藻膽蛋白、藻紅蛋白和別藻藍(lán)蛋白；熒光素和德克薩斯紅)；半抗原；等等。優(yōu)選地，可檢測標(biāo)記物允許在光度計(jì)板內(nèi)直接測定例如生物素。此類標(biāo)記的抗體可用于本領(lǐng)域已知的技術(shù)來檢測本發(fā)明的多肽。實(shí)施例實(shí)施例1一鑒定赤擬谷盜(7WZ)0//,cwto"w附)基因組的去飽和酶在2005年底，使用ClustalX程序(Thompson等，1997)比對了64份公開的全長昆蟲去飽和酶蛋白質(zhì)序列。根據(jù)序列比對選擇出高度保守的肽序列(HNYHHAYPWDYKAAEIGMPLNSTASLIRLCASLGWAYDLKSV(SEQIDNO:31))，并用于通過TBLASTN程序(Altschul等，1997)搜索赤擬谷盜基因組。根據(jù)這一分析，鑒定了15種去飽和酶樣序列，將它們命名為Tribdesatl(編碼序列為SEQIDNO:l，氨基酸序列為SEQIDNO:16)、Tribdesat2a(編碼序列為SEQIDNO:2，氨基酸序列為SEQIDNO:17)、Tribdesat2b(編碼序列為SEQIDNO:3，氨基酸序列為SEQIDNO:18)、Tribdesat2c(編碼序列為SEQIDNO:4，氨基酸序列為SEQIDNO:19)、Tribdesat3(編碼序列為SEQIDNO:5，氨基酸序列為SEQIDNO:20)、Tribdesat4(編碼序列為SEQIDNO:6，氨基酸序列為SEQIDNO:21)、Tribdesat5(編碼序列為SEQIDNO:7，氨基酸序列為SEQIDNO:22)、Tribdesat6a(編碼序列為SEQIDNO:8，氨基酸序列為SEQIDNO:23)、Tribdesat6b(編碼序列為SEQIDNO:9，氨基酸序列為SEQIDNO:24)、Tribdesat7a(編碼序列為SEQIDNO:IO，氨基酸序列為SEQIDNO:25)、Tribdesat7b(編碼序列為SEQIDNO:ll，氨基酸序列為SEQIDNO:26)、Tribdesat8(編碼序列為SEQIDNO:12，氨基酸序列為SEQIDNO:27)、Tribdesatl0(編碼序列為SEQIDNO:13，氨基酸序列為SEQIDNO:28)、Tribdesatll(編碼序列為SEQIDNO:14，氨基酸序列為SEQIDNO:29)和Tribdesat12(編碼序列為SEQIDNO:15,氨基酸序列為SEQIDNO:30)。根據(jù)克隆和相應(yīng)cDNA的測序結(jié)果，對上述序列中的Tribdesat2a、2b、2c、3、4、5、6a、8、10、11、12進(jìn)行了修正(見實(shí)施例2-5)。然后在Softberry(http:〃www.softberrv.com/cgi-bin/programs/gfin/fgenesh)中對各個(gè)重疊群進(jìn)行基因預(yù)測程序。測試了果蠅、按蚊、秀麗隱桿線蟲(C.e/ega旭)和馬來絲蟲(^n^/am"/"少fl)的參數(shù)的預(yù)測去飽和酶基因的能力。對于每一個(gè)基因預(yù)測，將這些蛋白質(zhì)針對NCBI數(shù)據(jù)庫中的所有蛋白質(zhì)進(jìn)行BLASTP分析，以確定它們是否類似于去飽和酶。除了使用按蚊參數(shù)的TribdesatlO，按蚊和果蠅參數(shù)均沒有對去飽和酶給出正確的預(yù)測。對于一些去飽和酶，用于預(yù)測秀麗隱桿線蟲或馬來絲蟲的基因的參數(shù)預(yù)測到類似于去飽和酶的基因。對于去飽和酶中的3種，使用任何默認(rèn)參數(shù)的預(yù)測均未預(yù)測到去飽和酶基因(Tribdesat4、Tribdesat7a和Tribdesat7b)。對于去飽和酶基因(2組重疊群)中未能使用基因預(yù)測程序預(yù)測的3種，將基因組區(qū)域針對NCBI數(shù)據(jù)庫中的所有蛋白質(zhì)進(jìn)行BLASTX比較。注意到了類似于去泡和酶的基因組片段最5'的區(qū)域，并將上游DNA序列進(jìn)行硅片上(/"w7/co)翻譯，并觀測檢查甲硫氨酸殘基。以此作為蛋白質(zhì)序列的起始甲硫氨酸。以相似的方式檢查類似于去飽和酶的基因組片段3'區(qū)域的終止密碼子。觀測檢查每一這些蛋白質(zhì)序列的所有的去飽和酶保守基序(表2)。對于Tribdesat4，無法合理預(yù)測蛋白質(zhì)的N端或C端，因?yàn)檫@些區(qū)域的基因組序列不完整。還檢查了每一蛋白質(zhì)序列是否存在3個(gè)"組氨酸盒"(His盒)，它們是所有去飽和酶中高度保守的基序。這些盒中的組氨酸殘基被認(rèn)為參與結(jié)合去飽和酶活性所需的鐵原子。表3列出了這些蛋白質(zhì)的His盒以及來自C7ww/z'og"^^/"gw6Wj(見實(shí)施例5)的其他兩個(gè)His盒的氨基酸位置和序列，已經(jīng)根據(jù)對cDNA克隆的分析(實(shí)施例2-5)修正了預(yù)測的蛋白質(zhì)序列。表2-所鑒定的擬谷盜屬氨基酸序列中存在(A/)或不存在(X)的保守性去飽和酶基序(注序列中的基序可能與相應(yīng)的保守性序列基序不完全相同)。保守性序列基序鑒定的基因預(yù)測的蛋白質(zhì)大小(氨基酸)1234568Tribdesatl348々VX々Tribdesat2a320V々々々々Tribdesat2b297々々-々々々々Tribdesat2c321VVV々々々Tribdesat3286VXVVTribdesat5353々VV々々Tribdesat6a350々V々々々丁ribdesat6b289VXXVXX々X丁ribdesat8374VVVVV々VTribdesatlO366々VVV々々々Tribdesatl1323V々々VVVTribdesatl2455VVVVV基序的共有氨基酸序列1,AGAHRLW(SEQIDNO:104);2，SETDAD(SEQIDNO:105);3,FFFSHVG(SEQIDNO:106);4,QKKY(SEQIDNO:107);5，NSAAH(SEQIDNO:108);6，GEGWHNYHH(SEQIDNO:109);7,PWDY(SEQIDNO:110);8，GWAY(SEQIDNO:111)。表3—擬谷盜屬和士兵甲蟲(soklierbeetle)去飽和酶序列中組氨酸盒的氨基酸位置和序列。各盒編號對應(yīng)于基序的第一個(gè)氨基酸殘基在蛋白質(zhì)內(nèi)的位置。第一HIS盒第二HIS盒第三HIS盒Tribdesat190;HRLWTH(SEQIDNO:112)109;HRVHH(SEQIDNO:116)249;HNYHH(SEQIDNO:121)Tribdesat2a60;HRLWSH(SEQIDNO:113)97;HRAHH(SEQIDNO:117)238;HNYHHTribdesat2b62;HRLWAH(SEQIDNO:114)99;HRIHH240;HNYHHTribdesat2c55;HRLWAH92;HRVHH233;HNYHHTribdesat365;HRLWAH102;HQVHH(SEQIDNO:118)243;HNYHHTribdesat496;HRLWSH133;HRVHH274;HNYHHTribdesat588;HRLWAH125;HRVHH265;HNYHHTribdesat6a88;HRLWAH125;HRVHH265;HNYHHTribdesat6b15;HRLWAH52;HRLHH(SEQIDNO:119)189;WISYH(SEQIDNO:122)Tribdesat7a57;HRLWSH94;HRAHH234;HNYHHTribdesat893;HRLWAH130;HRVHH271;HNYHHTribdesat1075;HRLWAH112;HRVHH254;HNYHHTribdesat1177;HRLYSH(SEQIDNO:115)114;HRQHH(SEQIDNO:120)255;HNYHHTribdesat12104;HRLWAH141;HRVHH282;HNYHHCL1(SEQIDNO:73)88;HRLWAH125;HRVHH265;HNYHH(SEQIDN0:74)88;HRLWSH125;HRVHH265;HNYHH實(shí)施例2—Tribdesat4的克隆本發(fā)明人嘗試了在cDNA上進(jìn)行反向PCR以獲得Tribdesat4,這是因?yàn)槲覀儫o法從基因組序列預(yù)測出該基因的起點(diǎn)或終點(diǎn)。如下合成第一鏈混合533fil幼蟲RNA(24pg)、100pmol各種寡核苷酸引物(Clontech)，SmartIVOligo5'AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTGGCCATTACGGCCGGG-3，(SEQIDNO:32);和CDS/3'(5'ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATG-d(T)30VN)(N=A，G，C或T;V=A,G或C(SEQIDNO:33))。72°C溫育2分鐘，隨后立即冰上冷卻。向管中的內(nèi)容物加入2nl5X第一鏈緩沖液(Powerscript;CIontech),1^1DTT(20mM)，lpldNTP混合物(各種dNTP終濃度為200pM)和1^1Powerscript反轉(zhuǎn)錄酶(Clontech)。第一鏈cDNA合成在42。C進(jìn)行l(wèi)小時(shí)，隨后立即冰上冷卻。加入NaOH(lnl，25mM),68。C溫育3分鐘。測定用量的第一鏈合成物(6pl)與5pi10XAdvantage2Buffer(Clontech),ljul50XdNTP混合物，lplCDS/5oligo(5'AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT;Clontech(SEQIDNO:34))，lplCDS/3oligo,1^150XAdvantage2Polymerase混合，使得終體積為50pl。然后對混合物進(jìn)行如下溫度方案72°C/10分鐘；95°C/1分鐘；然后3循環(huán)的95。C/15秒，68。C/8分鐘。在1%瓊脂糖凝膠上分離測定用量(5W)的樣品以確認(rèn)擴(kuò)增發(fā)生。然后以Sfil在50°C消化樣品2小時(shí)，使用QIAgenPCR純化試劑盒按照生產(chǎn)商的說明除去限制性酶。洗脫的樣品稀釋后用于連接，以保證發(fā)生分子內(nèi)連接而非分子間連接。消化后的DNA(0.5pg)稀釋于500pl連接混合物并在16。C溫育過夜。連接物用糖原沉淀濃縮(150ng糖原，1.4ml冰冷的95%乙醇，-80°C，2小時(shí))，隨后離心沉淀DNA(12000g,20分鐘)。DNA重懸于10pl無菌水。使用lpl這種沉淀的DNA進(jìn)行反向PCR反應(yīng)，反應(yīng)包括5^110XAdvantage2PCRBuffer(Clontech),10pmolDesat4GSP1(5，ATTATGAGCGGATCGGCTTCCAAGTC(SEQIDNO:35),10pmolDesat4GSP2(5'CGAAACAATTTGGAATTCGTTTTGGG(SEQIDNO:36)，200|iM的各種dNTP,1^150XBDAdvantage2Polymerase和無菌水，終體積為50pl。PCR條件如下95°C/1分鐘，然后30個(gè)循環(huán)的95。C/30秒，68°C/3分鐘，然后68。C/3分鐘。1%瓊脂糖凝膠分離測定用量(5yl)的PCR產(chǎn)物。發(fā)現(xiàn)了單一條帶，并克隆入pGEM-T-Easy。測序插入體，發(fā)現(xiàn)其含有Tribdesat4的絕大部分5'端和Tribdesat4的完整的3，端。然后將現(xiàn)有的Tribdesat45'端與已有的來自赤擬谷盜的EST序列進(jìn)行BLASTN分析。從該分析中鑒定了一個(gè)EST(AccessionNo.DT795463)，并鑒定了該5'端的其余部分。針對Tribdesat4編碼區(qū)的5'和3'端設(shè)計(jì)引物并用于RT-PCR反應(yīng)以獲得全長的Tribdesat4。RT-PCR反應(yīng)包括25pl2X反應(yīng)混合物(Invitrogen)，37ngRNA,1SuperscriptIIRT/PlatinumTaqDNA聚合酶(Invitrogen),100pmol的各種引物，加無菌水至50nl。反應(yīng)條件如下50°C/30分鐘，94°C/2分鐘，然后35個(gè)循環(huán)的94。C/30秒，55。C/l分鐘，72。C/l分鐘，然后72。C/5分鐘。測定用量樣品在1%瓊脂糖凝膠上電泳。獲得了單一條帶(約lkb講克隆入pGEMTEasy。對插入體進(jìn)行測序，并鑒定為全長cDNA。SEQIDNO:6顯示的是該cDNA的編碼區(qū)的核苷酸序列。實(shí)施例3—從成體擬谷盜屬RNA中擴(kuò)增去飽和酶序列采用Trizol法(Invitrogen)提取赤擬谷盜(TC4株)甲蟲RNA。100mg的成體甲蟲在1mlTrizol試劑中勻漿，混合物在25°C溫育5分鐘，隨后在樣品中加入200pl氯仿。手搖混合物15秒，然后25。C靜置3分鐘。離心分離有機(jī)層和水層(12，000g，15分鐘，4°C)。將上面的水層轉(zhuǎn)移至新的管中，并加入500pi異丙醇沉淀RNA。25°C溫育10分鐘后，4°C離心沉淀RNA，12,OOOg/10分鐘。RNA沉淀以75%乙醇洗漆一次然后空氣干燥10分鐘。RNA隨后溶解于30pl的無Rnase水中。RNA具有明顯的棕色著色，采用用于RNA凈化(QIAgen)的RNeasy小方案進(jìn)一步純化，按照生產(chǎn)商的說明進(jìn)行。對10種去飽和酶序列(Tribdesatl，2a，2b，3，5，6a，6b，8，10和ll)進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增反應(yīng)。向各樣品加入25^2X反應(yīng)混合物(Invitrogen)，37ngRNA，1nlSuperscriptIIRT/PlatinumTaqDNA聚合酶(Invitrogen),100pmol的各種引物，加無菌水至50pl。反應(yīng)條件如下50°C/30分鐘，94°C/2分鐘，然后35循環(huán)的94。C/30秒，55°C/1分鐘，72°C/1分鐘，然后72。C/5分鐘(PCR條件55/72)。測定用量的各種樣品在1%瓊脂糖凝膠上電泳。采用QIAquickPCR純化試劑盒(QIAgen)純化含有大約lkb的單一擴(kuò)增產(chǎn)物的樣品(Tribdesatl,3,5,6a,10，ll)并克隆至pGEMTEasy(Promega)。采用標(biāo)準(zhǔn)的分子生物學(xué)技術(shù)(Sambrook等，1989)將連接混合物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH10B。檢查含有插入體的克隆的DNA序列。圖1至5顯示了基因預(yù)測與Tribedesat2b,3,6b，10和11的RT-PCR產(chǎn)物之間的比較。根據(jù)基因組序列預(yù)測的序列與觀察到的cDNA序列顯然有著不同，在一些情況中，這應(yīng)該是根據(jù)基因組序列預(yù)測編碼序列不正確引起的，在其他情況中，一些差異，例如單核苷酸多態(tài)性，可能是昆蟲群體內(nèi)存在的基因的不同等位基因引起的。還采用上述Trizol法提取赤擬谷盜幼蟲RNA。按照上述方法RT-PCR反應(yīng)擴(kuò)增6種去飽和酶序列(Tribdesat2a，2b,2c,6b,8和12)。第一輪PCR后沒有觀察到任何擴(kuò)增產(chǎn)物，所以將對反應(yīng)體系進(jìn)行第二輪PCR。在Tribdesat2b、Tribdesat2c、Tribdesat12和Tribdesat8樣品中觀察到大約1kb的擴(kuò)增產(chǎn)物。使用QIAquick膠回收試劑盒(QIAgen)自瓊脂糖凝膠提取產(chǎn)物并克隆至pGEMTEasy(Promega)。檢查含有插入體的克隆的DNA序列。圖1和3分別給出基因預(yù)測與得到的Tribdesat2b和6b的RT-PCR產(chǎn)物的基因之間的比較。實(shí)施例4一從士兵甲蟲(T/^w/Zog^//^/wg^nV)擴(kuò)增去飽和酶基因片段房,戰(zhàn)伊,譜力殺泡浙斷疑采用擬谷盜屬所使用的上述Trizo1法自100mg成年雄性C./wg^ni甲蟲提取RNA。使用InvitrogenSuperscriptII和polyT弓|物(5、TTTTTTTTTTTTTTTTTT(SEQIDNO:81))合成cDNA。該polyT引物(100pmol)、RNA(2pl)和無RNase水的終體積為15.5pl，70。C溫育IO分鐘然后冰上冷卻。向其中加入10XPCRBuffer(2.525mMMgCl2(2.5(^1)，10mMdNTP混合物(lpl)和0.1MDTT(2.5pl)。該混合物在42。C加熱1分鐘，隨后加入SuperscriptII反轉(zhuǎn)錄酶(1pl)并將混合物在42°C放置50分鐘。70°C滅活SuperscriptII反轉(zhuǎn)錄酶15分鐘，用1^1RNaseH(2單位，30分鐘，37°C)降解RNA。PCR反應(yīng)洗脫含有1pldNTP(200^M各種dNTP)，5pi10xThermoPolBuffer(NEB),1.5F2(5、TTCTTCTTCKCNCAYKTHGGNTGG(SEQIDplcDNA，0.1U7^DNA聚合酶(NEB)，加無菌水至50pl。PCR條件如下最初在94°C變性3分鐘，然后30個(gè)循環(huán)的94°C/15s，48eC/30s，72°C/2分鐘，最后延伸72°C/5分鐘。1.5%瓊脂糖凝膠分離測定用量的樣品，觀察到大約400bp的條帶。使用QIAgenQIAquickPCR純化試劑盒按照生產(chǎn)商的說明純化PCR反應(yīng)并克隆入pGEMTEasy(Promgea)。通過DNA序列分析檢查到大約30個(gè)含有插入體的克隆?？偣茶b定到3個(gè)獨(dú)特的去飽和酶序列，相應(yīng)于CL6(SEQIDNO:75)、CL7(SEQIDNO:76)和CL8(SEQIDNO:77)。iT譜微:f^伊鵬鄉(xiāng)去柳餅度如上提取RNA并合成cDNA。按照與上述相同的方法使用簡并引物F2/R2禾QClu—f(5、GCNCAYMGNYTNTGGGCNCA(SEQIDNO:84))/Clu-r(5、AANRYRTGRTGGTAGTTGIG(SEQIDNO:85))(見表4)對雌性成體RNA進(jìn)行2次簡并PCR。觀察到大約400bp(F2/R2)和550bp(Clu_f/Clu—r)的擴(kuò)增產(chǎn)物并將它們克隆至pGEMTEasy。PCR擴(kuò)增并分析來自經(jīng)F2/R2轉(zhuǎn)化的70個(gè)集落的各個(gè)插入體，PCR引物為T7(5、TAATACGACTCACTATAGGG(SEQIDNO:86》和SP6(5、ATTTAGGTGACACTATAG(SEQIDNO:87))。由于與去飽和酶具有序列相似性的經(jīng)測序的來自雄性士兵甲蟲組織的克隆中有大約70°/。是CL6，因此使用限制性酶及^1消化PCR產(chǎn)物以除去CL6克隆。在獲得的70個(gè)PCR產(chǎn)物中，僅有20個(gè)沒有被it^I消化。所得到的去飽和酶片段是CL7、CL8以及一種新的獨(dú)特的去飽和酶片段，稱為CL9。使用雌性成體RNA和引物Clu一f/Clu一r進(jìn)行的另一簡并PCR反應(yīng)得到了16個(gè)另外的克隆并得到了它們的核苷酸序列，將這些序列與前面的克隆進(jìn)行比較，并將其中之一命名為CL1。表4一用于分離C.的內(nèi)部去飽和酶片段的RNA的組織來源和簡并弓<table>tableseeoriginaldocumentpage57</column></row><table>切取雄性和雌性混合群體的防衛(wèi)腺組織。首先去除頭和翅鞘。剩下的組織分為兩部分一一腹部樣品和防衛(wèi)腺組織。如上提取RNA并合成cDNA。如下3組不同引物組合用于簡并PCR:Clu—f/Clu一r、F2/Clu—r和XRF2b(5TTYTTYTWYKCNCAYATGGGNTGG(SEQIDNO:88))/Clu一r。在1.5%瓊脂糖凝膠上分析后，僅在使用XRF2b/Clu一r組合的樣品中觀察到預(yù)期大小的條帶。其他兩對引物甚至在60個(gè)循環(huán)的PCR之后均未觀察到任何擴(kuò)增產(chǎn)物。使用QIAgenQIAquickPCR純化試劑盒純化所得到的PCR產(chǎn)物并克隆至pGEM-T-Easy。通過測序分析檢查了11個(gè)克隆。得到的新的去飽和酶基因片段命名為CL3和CL5。CL5內(nèi)部片段似乎含有殘余的內(nèi)含子，因?yàn)闇y定到這樣一個(gè)部分，其與去飽和酶沒有密切的序列相似性，而且影響了讀碼框，插入終止密碼子。5、浙J、WC五議蕕淳全長,身/家唐基于每一上述克隆的簡并引物結(jié)合位點(diǎn)內(nèi)的序列設(shè)計(jì)了用于5，-和3'-RACE的引物(表5)。表5—用于5、和3、RACE的引物(5，至3')<table>tableseeoriginaldocumentpage58</column></row><table>根據(jù)生產(chǎn)商的說明，使用ClontechCreatorSMARTSystem用來自腹部或防衛(wèi)腺組織的RNA獲得了5、和3'RACE產(chǎn)物。寡核苷酸引物SmartIV(5AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTGGCCATTACGGCCGGG(SEQIDNO:97))和CDS鵬、(5、ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATG-d(T)30N_iN;N=A,G,C或T;N-產(chǎn)A,G或C(SEQIDNO:98))用于反向轉(zhuǎn)錄PCR。5、RACE反應(yīng)使用引物CDSV5、AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT(SEQIDNO:99)和CLXfront引物。3、RACE反應(yīng)使用引物CDS111/3、PCR和CLXend。通過集落PCR篩選克隆的插入體。用DNA序列分析檢查所有產(chǎn)生預(yù)期條帶(~350bp)的克隆。首先檢查DNA序列與去飽和酶的序列相似性。使用來自內(nèi)部序列即5、RACE和3、RACE產(chǎn)物的序列信息在硅片上匯編全長序列，并檢查以ATG作為起始并終止于終止密碼子的且翻譯后具有去飽和酶的全部基序(表2)的開放讀框。實(shí)施例5—分離全長的C.fag^Ws去飽和酶cDNA按照生產(chǎn)商的說明，使用Invitrogen的一步法RT-PCR試劑盒和PCR條件55〃2(見上)獲得CL1和其他去飽和酶樣序列的全長cDNA克隆。使用的弓l物是GGTACCATGCCACCCAACGCCCAC(SEQIDNO:100)和GAATTCTCACTTTTGTTTGTGAGT(SEQIDNO:101)。使用QIAgen的QIAquickPCR純化試劑盒，按照生產(chǎn)商的說明純化大約1kb的條帶，并克隆至pGEM-T-Easy。獲得陽性克隆并通過DNA序列分析進(jìn)行檢查。驗(yàn)證序列后，以限制性酶消化含有去飽和酶cDNA的pGEM-T-Easy克隆，以切下插入體，在1%瓊脂糖凝膠上分離，切下lkb的片段并以QIAquick膠回收試劑盒(QIAgen)純化，用于克隆至酵母表達(dá)載體，例如pYES2(見下)。實(shí)施例6—分離C77aM//ogyfl^i^wo6!7&fas的去飽和酶基因C7;a"fogwflte"。Zu7/o加伍〃.cfeoM)是另——禾中士兵甲蟲，其類似于C/wg"Z^j但通常較小且在澳大利亞東南部分布較少。這些甲蟲與蛾例如擬谷盜屬的關(guān)系不密切，實(shí)際上它們在昆蟲綱內(nèi)離得很遠(yuǎn)。采用上述的Trizol法提取C.woMWus成體的RNA。使用Invitrogen的SuperscriptII試劑盒合成cDNA。進(jìn)行3組簡并PCR。第一組使用簡并引物F2/Clu—r，第二組使用簡并引物XRF2b/Clu—r，而第三組使用簡并引物Clu一fClu一r。1.5%瓊脂糖凝膠分離測定用量的各個(gè)反應(yīng)產(chǎn)物，在前兩組反應(yīng)中觀察到了條帶。使用QIAquickPCR純化試劑盒(QIAgen)將其純化并克隆至pGEM-T-Easy。通過DNA序列分析檢査來自第一組PCR的總共12個(gè)克隆以及來自第二組PCR的總共14個(gè)克隆。獲得了3種獨(dú)特的去飽和酶序列，它們的相應(yīng)的來自C./"g"6^的直系同源物以及特征性基序(Knipple等(2002))在表6中給出。59表6—分離自C."o6///^^的內(nèi)部去飽和酶片段及其在C./"gw6Wj中的相應(yīng)的直系同源物。還顯示了特征性基序和用于分離這些內(nèi)部片段的引物。<table>tableseeoriginaldocumentpage60</column></row><table>用于分離CwWz7/w^的內(nèi)部去飽和酶片段的第二種方法是使用特異于C.去飽和酶的引物。使用上述合成的cDNA作為模板，用CL6、CL7、CL9和CL1的特異性引物進(jìn)行PCR。測定用量的各個(gè)反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠分離，用CL7、CL9和CLl-特異性引物觀察到了條帶，但用CL6或CL10引物沒有觀察到產(chǎn)物。使用QIAgenQIAquickPCR純化試劑盒純化CL7、CL9和CL1產(chǎn)物并克隆至pGEM-T-Easy。獲得了陽性克隆并通過DNA序列分析檢查。如實(shí)施例5所述，使用Invitrogen的一步法SuperscriptII反轉(zhuǎn)錄酶/Platinum『a《DNA聚合酶試劑盒從C./wM/af^RNA擴(kuò)增到CL3禾nCL1直系同源物的全長cDNA序列。表7給出了使用的引物。對各個(gè)反應(yīng)獲得的克隆進(jìn)行測序以確認(rèn)各個(gè)cDNA性質(zhì)。表7—用于獲得選定的去飽和酶的全長C.朋6z7&加直系同源物的引物。<table>tableseeoriginaldocumentpage60</column></row><table>實(shí)施例7—從cDNA文庫分離去飽和酶基因辦來^C./一Ws腐微恭柳c藩J乂庠采用上述方法提取C.lugubris腹部組織的RNA。采用InvitrogenCloneminer試劑盒按照生產(chǎn)商的說明構(gòu)建cDNA文庫。將部分文庫轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH10BElectroMax感受態(tài)細(xì)胞(Invitrogen)并在含25pg/ml卡那霉素的LB瓊脂平板上選擇轉(zhuǎn)化體。大約90%的克隆含有平均大小為1.5kb的插入體。通過PCR方法或使用來自上述克隆的探針通過雜交篩選從文庫中鑒定并分離去飽和酶克隆。PO方法,遂廣粒c房^文庫將其體積代表大約50個(gè)集落形成單位的質(zhì)粒cDNA文庫接種于含有300plLB并補(bǔ)充了50pg/ml卡那霉素的96孔板，37°C生長過夜并搖動。來自板中各孔的100^1的各個(gè)液體培養(yǎng)物匯集至1.5ml管中以得到8個(gè)"道匯集物(lanepools)"，比國內(nèi)使用QIAquickminiprepspin試劑盒(Qiagen)按照生產(chǎn)商的說明提取質(zhì)粒。10h1的各個(gè)"道匯集物"洗脫物混合至1.5ml管中，產(chǎn)生"板匯集物"。使用基因特異性引物在各"板匯集物"上進(jìn)行PCR篩選，并在1%TAE瓊脂糖凝膠上電泳，以鑒定陽性板匯集物。一旦鑒定到陽性板，則在相應(yīng)于陽性"板匯集物"的"道匯集物"上重復(fù)PCR篩選，并在1%TAE瓊脂糖凝膠撒謊功能電泳，以鑒定陽性"道匯集物"，并在隨后的篩選輪次中鑒定單個(gè)孔和各個(gè)集落，以分離陽性克隆。通過限制性酶消化和序列分析來分析含有感興趣的基因的質(zhì)粒。鄉(xiāng)微微桌驗(yàn)效嫌透制備10倍系列稀釋的cDNA文庫(l-106)，并在補(bǔ)充了50pl/ml卡那霉素的LB瓊脂上鋪板，以確定在每個(gè)82mm培養(yǎng)皿內(nèi)產(chǎn)生大約300-500個(gè)集落的稀釋度。將合適稀釋度的轉(zhuǎn)化的細(xì)菌分布在補(bǔ)充了5(^g/ml卡那霉素的LB瓊脂平板上，37。C溫育過夜。將集落印在尼龍膜(Hybond-N+,AmershamBiosciences)上并按照集落雜交的標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行處理。使用dNTP加生物素-dATP標(biāo)記的去飽和酶基因片段和DNA聚合酶IKlenow片段，按照NEBlotphototope試劑盒(NewEnglandBiolabs)制備生物素標(biāo)記的DNA探針。探針與膜在65°C(高嚴(yán)格性)或55°C(中等嚴(yán)格性)雜交過夜。按照Phototope-StardetectionKit手冊(NewEnglandBiolabs)附錄C中詳述描述的對集落雜交的改進(jìn)方法檢測雜交的生物素化的DNA。將膜暴露于HyperfilmECL(Amersham61Biosciences)達(dá)1分鐘，并按照AmershamBiosciences的建議手工處理。通過限制性酶消化和測序分析來分析陽性雜交克隆。實(shí)施例8—酵母表達(dá)載體構(gòu)建和基因功能性分析在釀酒酵母中表達(dá)各個(gè)全長去飽和酶基因，以便使用酵母表達(dá)載體pYES2或pVT100-U(Vemet，T等1987)進(jìn)行功能性表征。檢查含有推定的去飽和酶基因的各個(gè)基因組區(qū)域的限制性核酸酶的識別位點(diǎn)。選擇不切割基因組區(qū)域但有助于定向克隆至pYES2或pVT100-U內(nèi)的限制性酶。設(shè)計(jì)針對預(yù)測的去飽和酶基因的最5'和3'區(qū)域的引物(表8)，各個(gè)引物的5'端具有限制性位點(diǎn)以便定向克隆。制備酵母載體DNA并以相應(yīng)的限制性酶消化，然后以小牛腸道堿性磷酸酶(Roche)去磷酸化。去磷酸化后，使用QIAquickPCR純化試劑盒(QIAgen)純化消化的載體。將從膠中提取的含去飽和酶片段與消化的載體連接，連接物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌.DH10B，在含有100jig/ml氨芐青霉素的LB瓊脂上選擇轉(zhuǎn)化體。通過限制性酶分析確認(rèn)含有的插入體的克隆。表8—用于定向克隆至pYES2的引物，限制性位點(diǎn)以粗體字顯示。<table>tableseeoriginaldocumentpage62</column></row><table>3反向GAATTCTTAATAATCACAATCCCC(SEGIDNO:46)4正向AAGCTTATGACGGAAGGCAGCGATGAA(SEQIDNO:47)4反向GCGGCCGCTCAGTTAAAATCCTCCATTTT(SEQIDNO:48)正向GGATCCATGCCACCCTATGTGTCC(SEQIDNO:49)5反向GCATGCTTAATTAAAATCGTCAGA(SEQIDNO:50)6a正向GGATCCATGACACCAAATGCTTCA(SEQIDNO:51)6a反向GAATTCCTACGCACTCTTCCTATG(SEQIDNO:52)6b正向GGTACCATGCTAATCTTACTTTCC(SEQIDNO:53)6b反向CTCGAGCTAATGAAATTTTGAAGG(SEQIDNO:54)7a正向GGATCCATGTTTCAAACACCCATCGTCTGG(SEQIDNO:55)73反向CTCGAGTTATTGCCCAGTCCTCAAAACCCGCTT(SEQIDNO:56)7b正向GGATCCATGGTAGATTTGTTTTTG(SEQIDNO:57)7b反向GAATTCTTA丁TTTTGCAATTGTTT(SEQIDNO:58)8正向GGATCCATGGCTCCAAATTCGCTC(SEQIDNO:59)8反向GAATTCTTACAGTTCTTTGCTACT(SEQIDNO:60)0正向GGATCCATGTCGGCCCAGACCATT(SEQIDNO:61)10反向GAATTCTTAATCCTCCTTCCTGTT(SEQIDNO:62)11正向AAGCTTATGGGAGCGCTCAAACAA(SEQIDNO:63)"反向GAATTCTTAACCATTTGCCGTAAC(SEQIDNO:64)12正向GAATTCATGGCTCCTAATTTGCTAGGA(SEQIDNO:65)12反向CTCGAGTTAATCAAATTTCTCTCTACT(SEQIDNO:66)游表這教達(dá)伴斧眾^"激^^艏寧^兩種釀酒酵母宿主菌株用作pYES-衍生的構(gòu)建體的受體。它們是S288C63(基因型MATa,SUC2gal2malmelflolflo8畫lhapl(MortimerandJohnston(1986))和OLEl(his3Al，leu2A0，ura3A0，YMR272c::kanMX4)，其是編碼A9-去飽和酶的基因的突變體，可用于互補(bǔ)性分析。5種釀酒酵母宿主菌株用作pVT-100衍生的構(gòu)建體的受體。它們是S288C、OLE1和INVSCi(MATa，his3Dlleu2trpl-289ura3-52)、YPH499(MATa,ura3-52lys2-801—amberade2-101一ochretipl-A63hisl-A200leu2-Al)和ELO-l(MATahis3Mleu2A0metl5A0ura3A0AELOl)。轉(zhuǎn)化過程中對這些菌株進(jìn)行相同的處理，不同之處在于所有用于培養(yǎng)釀酒酵母0LE1的培養(yǎng)基中加入17:1(順式-10-十七烯酸，1mM)和Tergitol(NP-40;1%)，而所有用于培養(yǎng)ELO-l的培養(yǎng)基中加入遺傳霉素(200pg/ml)。為進(jìn)行轉(zhuǎn)化，將各個(gè)釀酒酵母菌株劃種至YPD(20g/l蛋白胨，10g/l酵母提取物，2%葡萄糖)并在30。C生長數(shù)日。使用Sigma酵母轉(zhuǎn)化試劑盒按照生產(chǎn)商的說明進(jìn)行轉(zhuǎn)化。在SCMM-U瓊脂平板(6.7g/1不含氨基酸的酵母氮基，1.92g/1不補(bǔ)充尿嘧啶的酵母合成缺陷培養(yǎng)基，2%葡萄糖和2%瓊脂)上30。C選擇轉(zhuǎn)化體達(dá)5天。針對各個(gè)構(gòu)建體對多個(gè)轉(zhuǎn)化體進(jìn)行選擇，并測試是否存在質(zhì)粒DNA。^化沐游緣"為了確認(rèn)轉(zhuǎn)化體內(nèi)表達(dá)構(gòu)建體的性質(zhì)，使用Pierce(Illinois)的Y-DER酵母DNA提取試劑盒，按照生產(chǎn)商的說明從接種環(huán)量(loopfol)的培養(yǎng)物分離DNA。使用基因特異性反向引物和T7引物(載體引物)通過PCR分析分析并確認(rèn)了的質(zhì)粒存在。觀察到了陽性條帶，保留相應(yīng)轉(zhuǎn)化體用于進(jìn)一步分析。微固/艦#絲取50微升培養(yǎng)于含順式-10-十七烯酸(1mM)和1%Tergitol的SCMM-U的OLEl轉(zhuǎn)化體，離心(13，000rpm，3ses)收集并重懸于50piYP(20g/l蛋白胨，10g/l酵母提取物)。重懸的混合物按1:10稀釋，將20)al的各種混合物點(diǎn)樣在含2%半乳糖的YP板上以誘導(dǎo)去飽和酶基因表達(dá)，將這些板在30。C溫育3-5天。過程是否出現(xiàn)生長。含順式-10-十七烯酸(1mM)和1%Tergitol的對照板用于確保酵母的活力。OLEl對擬谷盜屬和花螢屬去飽和酶的互補(bǔ)性測試結(jié)果如下。陽性互補(bǔ)見于Tribdesat2a、Tribdesat5、Tribdesat6a和Tribdesatll，后者具有滯后期。在Tribdesat2b和Tribdesat8觀察到可能的弱互補(bǔ)。對Tribdesatl、Tribdesat2c、Tribdesat4、TribdesatlO、Tribdesat12、CL1和CL3沒有觀察到互補(bǔ)性。當(dāng)異源性表達(dá)的基因表達(dá)功能性A9-或M1-去飽和酶時(shí)出現(xiàn)酵母的OLE1表型互補(bǔ)性，并導(dǎo)致產(chǎn)生棕櫚油酸、油酸、或順式-ll-硬脂酸等脂肪酸。因此，結(jié)論是，Tribdesat2a、Tribdesat5、Tribdesat6a和Tribdesatll是去飽和酶，它們能夠使得OLEl酵母細(xì)胞的天然脂質(zhì)去飽和以產(chǎn)生互補(bǔ)性脂肪酸之一，且因此它們類似于對C16:0或C18:0具有活性的A9去飽和酶、或?qū)18:0具有活性的All去飽和酶，而Tribdesatl、Tribdesat2c、Tribdesat4、TribdesatlO、Tribdesat12、CL1和CL3不太可能編碼這些活性之一，且因此編碼的可能是不太的去飽和酶。歸靴娜辦柳譜辨/縱邀衍生自菌株S288C或OLE1的酵母轉(zhuǎn)化體接種于25ml合成的不含尿嘧啶的酵母用基本限定培養(yǎng)基(minimaldefinedmedium)(SCMM-U培養(yǎng)基)，含2%葡萄糖和為OLEl菌株額外添加的0.5mM順式-ll-十七烯酸。接種物在30°C搖動生長24-48小時(shí)。確定培養(yǎng)物的OD600。為此，計(jì)算了在50ml誘導(dǎo)培養(yǎng)基中要獲得0.4的OD600所需的培養(yǎng)物的量。取該量的接種培養(yǎng)物離心(1500xg離心5分鐘，4。C)沉淀細(xì)胞。細(xì)胞重懸于10ml誘導(dǎo)培養(yǎng)基，即SCMM-U，含有2%半乳糖、1%棉子糖和0.5mM脂肪酸底物(添加至乙醇/20%Tergitol中)，并為OLEl衍生的轉(zhuǎn)化體額外地添加了0.5mM順式-ll-十七烯酸。各個(gè)培養(yǎng)物在30。C搖動生長24-48小時(shí)。隨后取2ml或全部培養(yǎng)物，離心收集細(xì)胞后用于分析脂肪酸，如果需要可儲存于-20。C。^存眾游激#摩母楚攻應(yīng)廣#分叛用1%Tergitol水溶液洗滌來自脂肪酸補(bǔ)料實(shí)驗(yàn)的酵母細(xì)胞，4°C1500xg離心5分鐘。細(xì)胞沉淀(200-500mg)重懸于水，然后轉(zhuǎn)移至玻璃試管并再次沉淀細(xì)胞。使用SavantSpeedVacPlusSC110A濃縮/干燥器去除細(xì)胞沉淀中的水。直接使用細(xì)胞沉淀或如下所述使用溶劑提取脂質(zhì)?；贛odifiedFolchMethod(Protocol7，pp22-24,LipidAnalysis,HamiltonandHamilton,1992)提取脂質(zhì)。以2ml氯仿/甲醇(2:1)提取脂質(zhì)，并加入0.5ml的鹽水，即0.9%w/vNaCl水溶液。充分漩渦混合該混合物。隨后使之分層；當(dāng)出現(xiàn)大量細(xì)胞碎片時(shí)將樣品2500xg離心5分鐘。去除并丟棄上層水相。底層溶劑層移至干凈的玻璃試管。在氮?dú)庵懈稍铮?0°C。分析之前先通過兩種不同的甲基化方法對脂質(zhì)進(jìn)行衍生化。第一種是結(jié)合型脂肪酸的堿性甲基化，即脂肪酸存在于三?；视突蛄字?，沒有游離脂肪酸，該方法基于Christie(2003)的方法。脂質(zhì)樣品首先溶解于0.5ml己烷。加入60m1乙酸甲酷，隨后是50pl甲醇鈉(0.5M，溶于甲醇)。然后充分混合密封的試管，并置于50°C的加熱塊上達(dá)IO分鐘。冷卻5分鐘之后加入一滴乙酸。樣品在30°C的輕柔氮?dú)饬髦懈稍?，溶解?00pl己烷并轉(zhuǎn)移至小管，隨后進(jìn)行GC分析。第二種方法是對全部游離的和結(jié)合型脂肪酸進(jìn)行酸性甲基化，基于Lewis等(2000)的方法。甲醇溶液，即2ml甲醇/鹽酸/氯仿(10:1:1)，加至干燥的酵母沉淀或提取的脂質(zhì)樣品中。充分混合密封的試管，并置于90°c的加熱塊上達(dá)60分鐘。冷卻10分鐘之后加入1ml的0.9%鹽水(NaCl水溶液)。然后以0.3ml己垸提取甲基化的脂肪酸。將己烷層轉(zhuǎn)移至小管內(nèi)然后分析。通過GC和GCMS分析這些脂肪酸甲基酯(FAME)樣品。使用配備有火焰離子化檢測器(FID)和BPX70毛細(xì)管柱(長度30m，i.d.0.32mm，膜厚度0.25pm)的Varian3800氣相色譜儀進(jìn)行GC分析。以分流模式(splitmode)進(jìn)行注射，使用氦氣作為載體氣體，初始柱溫度為100°C。溫度以3。C/分鐘升高直至150°C，然后以5。C/分鐘升高直至170°C，保持5分鐘，隨后以50。C/分鐘升高直至255°C。使用類似的色譜條件進(jìn)行GC/MS分析，但初始柱溫度為60°C，以20。C/分鐘升高直至H0。C，保持5分鐘，然后以50。C/分鐘升高直至255°C。使用TECPolarisQIonTrap或Varian1200SingleQuadrupole質(zhì)譜儀進(jìn)行檢測。在50-400原子質(zhì)量單位(amu)之間的全掃描模式中，以正電子撞擊獲得質(zhì)譜，掃描速度為每秒2次。對應(yīng)于色譜圖中的各個(gè)峰的質(zhì)譜被自動地與計(jì)算機(jī)化的NIST文庫中的譜進(jìn)行比較。這樣便試驗(yàn)性地鑒定到那些與文庫譜高精確度匹配并與真實(shí)標(biāo)準(zhǔn)品同時(shí)被洗脫下來或是以合理的保留時(shí)間被洗脫下來的測試譜。通過以下方法確認(rèn)了脂肪酸的性質(zhì)使用Yu等(1988)的方法將脂肪酸轉(zhuǎn)化為其二甲基噁唑啉(DMOX)衍生物，并與Dobson和Christie(2002)及其中的參考文獻(xiàn)所述的DMOX質(zhì)譜進(jìn)行比較。66縻草^^^勸虔絲i^f^"菜根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)和表10(見下)的總結(jié)，得出如下結(jié)論7>腸犯&對長度為C10:0至C16:0的飽和脂肪酸碳鏈(當(dāng)這些脂肪酸被補(bǔ)料至酵母轉(zhuǎn)化體中時(shí))具有A9去飽和酶活性。對14:0的活性最大，不過15-.0和16:0也是有效的底物。在酵母細(xì)胞中，其對18:0、20:0或更長的飽和脂肪酸沒有可檢測到的去飽和酶活性。該蛋白質(zhì)的推定長度為320個(gè)氨基酸，并包括8個(gè)保守性去飽和酶基序和3個(gè)His盒(表3)。基于與已知的?；o酶A去飽和酶的序列同源性，推測該酶作用于?；o酶A底物。該酶因此被表征為豆蔻酰-輔酶AA9去飽和酶。7WMg^6浙7HM咖Gc是密切相關(guān)的蛋白質(zhì)，基于使用BLOSUM62的總體比對，具有64%氨基酸序列相同性，它們分別從棕櫚酸和硬脂酸催化產(chǎn)生5-十六碳烯酸和5-十八碳烯酸。它們因此被表征為作用于飽和底物C16:0和C18:0的A5去飽和酶。它們在酵母細(xì)胞中將C18:0轉(zhuǎn)化為C18:1A5的轉(zhuǎn)化效率是將C16力轉(zhuǎn)化為C16:lAs的效率的兩倍以上(表9)。在各種情況中，這些酶能夠?qū)⒅辽?.0%的底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物，Tribdesat2b對C18:0則為至少40%。當(dāng)補(bǔ)料至酵母細(xì)胞中時(shí)，沒有檢測到這些酶使C14或更短的底物(包括C14:0或C14:l,或C20或更長的底物(包括C20:0或C20:l^)去飽和。此外，這些酶沒有去飽和單不飽和脂肪酸或多不飽和脂肪酸，包括C16:1A9、C18:1A9、C18:2或C18:3。這些蛋白質(zhì)包括8個(gè)保守性去飽和酶基序和3個(gè)His盒(表3)，并與己知的酰基輔酶A去飽和酶具有序列同源性。它們因此被表征為硬脂酰-輔酶AA5去飽和酶。它們還具有棕櫚酰-輔酶AA5去飽和酶活性。表9一表達(dá)Tribdesat2b或空pYes載體的酵母細(xì)胞(提供了0.5mM18:0)的脂肪<table>tableseeoriginaldocumentpage67</column></row><table>Cahoon等(2000)從白芒花(丄/w"a"^^)分離了編碼一種A5去飽和酶的基因，該酶對C20:0的活性高于對C18:0或C16:0的活性，因此其不是在此所定義的硬脂酰-輔酶AA5去飽和酶。Sayanova等(2007)從^"emo"e/eve/〃d的種子中克隆了兩種編碼A5去飽和酶的基因，所述的酶對?；o酶A底物有活性。去飽和酶AL21對飽和底物和不飽和底物C16:0、C18:0禾BC20:2均有活性，而AL10僅對C20:2，n-6有活性。不過，AL21對不飽和底物的活性高于對飽和底物的活性，因此其不應(yīng)該被認(rèn)為是在此所定義的硬脂酰-輔酶AA5去飽和酶。當(dāng)比較這些蛋白質(zhì)的全長序列時(shí)，氨基酸序列的相同性程度為AL21與Tribdesat2b之間為25%;AL21與Tribdesat2b之間為27%;ALIO與Tribdesat2b之間為24%;ALIO與Trib2c之間為28%。因此，可以得出這樣的結(jié)論，即植物的與昆蟲的?；o酶A依賴性去飽和酶之間沒有明顯的同源性或幾乎不具有同源性。7h'Z^g^d浙7WZ7^m/在酵母細(xì)胞中表現(xiàn)出A9去飽和酶的活件，它們主要且非常高效地作用于硬脂酸以產(chǎn)生油酸。它們還對棕櫚酸具有某些活性，可產(chǎn)生棕櫚油酸。當(dāng)?shù)孜锉谎a(bǔ)料至酵母細(xì)胞中時(shí)，沒有檢測到這些酶使C14或更短的底物(包括C14:0或C14:l,或C20或更長的底物(包括C20:0)去飽和。它們因此被表征為硬脂酰-輔酶AA9去飽和酶。7>驗(yàn)』能夠去飽和棕櫚酸產(chǎn)生棕櫚油酸，因此被認(rèn)為是A9去飽和酶。沒有檢測到其在酵母細(xì)胞中對C14或更短的底物、或?qū)18:0或更長的飽和底物、或?qū)尾伙柡突蚨嗖伙柡偷孜?包括C16:1A9、C18:1A9、C18:2或C18:3)具有去飽和酶活性。因此其似乎對棕櫚酸具有特異性。該蛋白質(zhì)的推定長度為374個(gè)氨基酸，并包括8個(gè)保守性去飽和酶基序和3個(gè)His盒(表3)。基于與已知的?；o酶A去飽和酶的序列同源性，推測該酶作用于?；o酶A底物。該酶因此被表征為棕櫚酰-輔酶AA9去飽和酶。7WMey"W0對棕櫚油酸和油酸晶示出A12去飽和酶活性，分別產(chǎn)生C16:2A9，412和C18:2A9，A12(LA)。在酵母細(xì)胞中轉(zhuǎn)化油酸底物(至少30%被轉(zhuǎn)化)的效率是轉(zhuǎn)化棕櫚油酸的大約2倍。沒有觀察到對C16:0、C18:0或更長的飽和底物、或C14或更短的底物(包括C14:l^)具有活性，因此該酶似乎象A12去飽和酶一樣特異性作用于連接于輔酶A的長度為C18和C16的A9-單不飽和底物。該蛋白質(zhì)的推定長度為366氨基酸，并包括8個(gè)保守性去飽和酶基68序和3個(gè)His盒(表3)。基于與已知的?；o酶A去飽和酶的序列同源性，推測該酶作用于酰基輔酶A底物。因此該酶被表征為油酰-輔酶AA12去飽和酶。其還顯示出棕櫚油酰-輔酶AA12去飽和酶活性。認(rèn)為這是第一個(gè)被表征為編碼這樣一種酶的基因。7W6血"〃7對鏈長為C14:0至C24:0的飽和底物顯示出A9去飽和酶活性，觀察到其對C22:0(稱為山崳酸或二十二酸)和C24:0(稱為木蠟酸或二十四烷酸)具有最大的轉(zhuǎn)化效率。因此，該酶被認(rèn)為是二十四酰-輔酶AA9去飽和酶，不過其也具有二十二酰-輔酶AA9去飽和酶活性。CX7對棕櫚油酸和油酸顯示出A12去飽和酶活性，分別產(chǎn)生C16:2A9'A12和LA，這與TribdesatlO的活性譜相同，但其活性不如TribdesatiO那樣有效。m對C14:0顯示出有效的去飽和作用活性，產(chǎn)生C14:1氣沒有檢測到該酶對C12:0或C16:0的活性，因此其似乎是特異性的豆蔻酰-輔酶AA9去飽和酶。其對單不飽和底物例如C12:1A5或C20:l沒有活性。基于與已知的?；o酶A去飽和酶的序列同源性，推測該酶作用于?；o酶A底物。該酶因此被表征為豆蔻酰-輔酶AA9去飽和酶。<table>tableseeoriginaldocumentpage70</column></row><table>實(shí)施例9一將去飽和酶基因克隆至Gateway入門載體pENTRll為了構(gòu)建功能性基因或待在Gateway入門載體中測試的基因，用限制性酶消化含有全長基因序列的pGem-T-Easy構(gòu)建體，以切下插入體。在1%瓊脂糖凝膠上分離，并使用QIAquick膠回收試劑盒(Qiagen)，按照生產(chǎn)商的說明純化大約lkb片段的DNA。制備Gateway入門載體pENTR11(Invitrogen)并用所需的限制性酶消化，并用小牛腸道堿性磷酸酶(Roche)去磷酸化?；蚱闻c載體連接并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌菌株JM109。在含50嗎/ml卡那霉素的LB瓊脂平板上選擇轉(zhuǎn)化體。通過限制性酶和序列分析確認(rèn)含有插入體的克隆。獰去齒浙艨基茵克蘑至Ga^w^^游載沐以建J表這克虔選定兩種表達(dá)系統(tǒng)，SF9昆蟲細(xì)胞和擬南芥，并為它們各自選擇Gateway表達(dá)載體。對于SF9昆蟲細(xì)胞，選擇pDEST8，并在LB上篩選DH10Bac轉(zhuǎn)化體，該LB補(bǔ)充了卡那霉素(50ng/ml)、慶大霉素(7ng/ml)和四環(huán)素(10pg/ml)、Bluo-gal(100嗎/ml)和IPTG(40pg/ml)。為轉(zhuǎn)化擬南芥，選擇二元載體pXZP391(CSIROPlantIndustry),并在補(bǔ)充了壯觀霉素(50pg/ml)的LB上篩選轉(zhuǎn)化體。制備含基因插入體的pENTRll克隆和合適的pDEST載體，并按照生產(chǎn)商(GatewayLRclonase酶混合物，Invitrogen)的說明進(jìn)行LR重組反應(yīng)。為了pXZP391，將所得重組混合物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌菌株JM109(Invitrogen)，或?yàn)榱藀DEST8，將所得重組混合物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌菌株DH10Bac(Invitrogen)。通過限制性酶分析和使用載體特異性引物的序列分析確認(rèn)了含有正確插入體的轉(zhuǎn)化體。實(shí)施例IO—用重組桿狀病毒產(chǎn)生昆蟲去飽和酶或acetylenase采用上述Gateway重組方法將Tribdesat2b和CL3基因克隆至pDest8載體(Invitrogen)。通過熱休克法用pDest8克隆轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH10Bac細(xì)胞(Invitrogen)。在LB瓊脂上篩選轉(zhuǎn)化體，所述LB含卡那霉素、四環(huán)素和慶大霉素(分別為50叫/mL、10jiig/mL和7ng/mL)和適當(dāng)濃度的IPTG和Xgal，并在此培養(yǎng)基上再次劃線接種以便純化。一旦DH10Bac中出現(xiàn)了重組事件，則使用M13正向和反向引物鑒定重組桿粒(現(xiàn)稱為pFastbac)，以便集落篩選71DH10Bac細(xì)胞中的pFastbac內(nèi)的2b和CL2插入體。陽性克隆產(chǎn)生大約3kb的條帶。挑選沒有任何空載體污染跡象(空載體可觀察到300bp的產(chǎn)物)的克隆用于下面的用途。將含有具有2b和CL2插入體的pFastbac質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化體在LB培養(yǎng)基(含抗生素)上生長過夜。使用的是改進(jìn)的堿性裂解質(zhì)粒分離方案，按照Bac-to-BacExpressionSystem手冊上生產(chǎn)商的說明進(jìn)行。分離的DNA溶解于40pL的1XTE緩沖液，pH8.0，并采用Nanodrop分光光度計(jì)定量，4。C儲存。存糴虔^潘應(yīng)Sf9(草地夜蛾卵細(xì)胞系)細(xì)胞接種于6孔組織培養(yǎng)板，9乂105個(gè)細(xì)胞/孔，每孔2mL的SF900II無血清培養(yǎng)基(Invitrogen)。允許細(xì)胞在孔的表面粘附2小時(shí)，27。C。為進(jìn)行各個(gè)轉(zhuǎn)染，將l)ig純化的桿粒DNA稀釋于聚苯乙烯管中的100uL的無添加Grace's培養(yǎng)基(Invitrogen)中。6pL的Cellfectin⑧試劑(Invitrogen)稀釋于聚苯乙烯管中的100jiL的無添加Grace's培養(yǎng)基中。然后將DNA和Cellfectin⑧試劑混合并室溫溫育30分鐘。在溫育DNA:脂質(zhì)復(fù)合物時(shí)，以2mL的無添加Grace's培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞一次，然后去除培養(yǎng)基。將0.8mL的無添加Grace's培養(yǎng)基加入至DNA:脂質(zhì)復(fù)合物，混合然后添加至洗滌的SF9細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染在27°C進(jìn)行5小時(shí)。將DNA:脂質(zhì)復(fù)合物從細(xì)胞移除，并加入2raL的SF900H。細(xì)胞在27。C溫育，直至出現(xiàn)明顯的感染跡象。一-旦細(xì)胞表現(xiàn)出被感染，通過將細(xì)胞培養(yǎng)基在20°ClKrpm離心5分鐘收集病毒。將凈化后的細(xì)胞培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至管中，儲存于4°C。這稱為Pl病毒原液。r撒拔竊碰用Sf9細(xì)胞接種25cm4咅養(yǎng)瓶，1Xl(^個(gè)細(xì)胞/mL，共5mL培養(yǎng)基。用Pl病毒原液感染細(xì)胞，感染復(fù)數(shù)(MOI)為0.1病毒顆粒/細(xì)胞，按照5乂106個(gè)細(xì)胞/mL估計(jì)。27。C48小時(shí)后，細(xì)胞表現(xiàn)出感染跡象，如上所述收集細(xì)胞培養(yǎng)基。這稱為P2病毒原液。然后用P2原液產(chǎn)生P3原液。細(xì)胞接種于75cm2培養(yǎng)瓶中，lXl()6個(gè)細(xì)胞/mL，共15mLSF卯OII培養(yǎng)基，以MOI為0.1病毒顆粒/細(xì)胞進(jìn)行感染，按照5X10S個(gè)細(xì)胞/mL估計(jì)。27。C48小時(shí)后，細(xì)胞表現(xiàn)出感染跡象，如上所述收集細(xì)胞培養(yǎng)基。這稱為P3病毒原液。72為了確定各個(gè)P3原液的確切滴度，進(jìn)行TCID5。(組織培養(yǎng)物感染劑量)。96孔板中每孔接種3X1()S個(gè)細(xì)胞。細(xì)胞在27。C溫育過夜。制備10倍稀釋的病毒直至10'8。50pL的10-3-10'8稀釋物各加入至8個(gè)孔中。將TCID5()在27。C溫育7天。評價(jià)各孔病毒感染是陽性還是陰性。確定病毒滴度后即可以已知的感染復(fù)數(shù)(MOI)感染SF9細(xì)胞。取感染的細(xì)胞并真空干燥。使用前述的直接酸性甲醇試劑獲得感染了表達(dá)Tribdesat2b的構(gòu)建體的昆蟲細(xì)胞的脂肪酸甲基酯，并通過GC/MS進(jìn)行分析。GC/MS痕量和色譜顯示，與SF9對照相比，表達(dá)Tribdesat2b的SF9產(chǎn)生C16:1A5和C18:1A5。經(jīng)構(gòu)建體轉(zhuǎn)導(dǎo)的昆蟲細(xì)胞內(nèi)的C16:0至C16:ld5的轉(zhuǎn)化效率為16.9%，而C18:0至C18:ld5的轉(zhuǎn)化效率為29.7%。這些數(shù)據(jù)證實(shí)了從表達(dá)Tribdesat2b的酵母細(xì)胞得到的數(shù)據(jù)，因此可得出結(jié)論，該基因編碼對C16:0和C18:0底物具有活性的A5-去飽和酶，且對后者的活性較大。因此其基本上確定編碼硬脂酰-輔酶AA5-去飽和酶，以往還沒有報(bào)道發(fā)現(xiàn)克隆的基因上具有這種活性。類似地，也預(yù)期另一種去飽和酶在昆蟲細(xì)胞中具有活性。實(shí)施例ll一在植物中表達(dá)擬谷盜屬和花螢屬基因如上所述將擬谷盜屬TribdesatlO和2b基因克隆至pENTRll，隨后重組至植物表達(dá)載體pXZP391中，后者用于表達(dá)置于分離自甘藍(lán)型油菜(^ra^/c"朋，"的種子特異性napin啟動子(Fpl)(Stalberg等，1993)控制下的編碼區(qū)插入體。將表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至根癌土壤桿菌AGL1，并用于通過植物轉(zhuǎn)化法(inplanta)轉(zhuǎn)化至缺乏A12-去飽和酶活性的擬南芥fad2/fael雙突變體內(nèi)。噴涂接種植物3-4周后收集種子并在選擇性培養(yǎng)基上鋪板。在含有40mg/L卡那霉素和100mg/L特美汀的MS培養(yǎng)基上鑒定Tl轉(zhuǎn)化的植物并轉(zhuǎn)移至溫室花盆中。氣相色譜法分析來自Tl植物的T2種子的脂肪酸組成。圖6所示數(shù)據(jù)證實(shí)了TribdesatlO在擬南芥中具有A12去飽和酶活性，因?yàn)樵趂ad2/fael突變體植物中從油酸產(chǎn)生了LA?？p鵬鵬盧微郷微柳表這Tribdesat2b、CL1和CL2編碼區(qū)以"有義"方向克隆至植物表達(dá)載體pVEC8(Wang等，1997)中，置于調(diào)控序列CaMV35S啟動子和章魚堿合酶轉(zhuǎn)錄終止/多腺苷酸化信號(Gleave，1992)的控制下，這可在絕大多數(shù)植物組織中造成的轉(zhuǎn)基因強(qiáng)組成型表達(dá)。通過土壤桿菌介導(dǎo)的葉組織轉(zhuǎn)化(Horsch等，1985)將轉(zhuǎn)基因引入至煙草內(nèi)，并在含潮霉素的培養(yǎng)基上篩選轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系。基于潮霉素抗性篩選轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞，該抗性由pVEC8衍生載體內(nèi)的/2/^抗性標(biāo)記物基因賦予。培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的煙草株以產(chǎn)生愈傷組織或再生為整個(gè)植物，這取決于篩選和生長培養(yǎng)基內(nèi)的植物激素方案(MurashigeandSkoog，1962;Horsch等，1985)。通過在愈傷組織誘導(dǎo)性植物激素(0.5mg/L吲哚乙酸(IAA)和0.05mg/L激動素)上篩選而產(chǎn)生未分化轉(zhuǎn)基因煙草愈傷組織，愈傷組織維持在瓊脂平板上。首先通過加入苗誘導(dǎo)性植物激素(100jLig/LN-6-芐基腺嘌呤(BAP)禾卩500ng/LLIAA)在苗誘導(dǎo)性培養(yǎng)基上篩選轉(zhuǎn)基因材料而產(chǎn)生分化的煙草植物。在該培養(yǎng)基上生長3周后，從葉盤切下單個(gè)的煙草頂體(apices)，并再次鋪板于含根誘導(dǎo)性植物激素(50ng/LIAA)的根誘導(dǎo)性培養(yǎng)基上。根的形成再需要3周。根據(jù)需要，選擇轉(zhuǎn)基因材料，即愈傷組織或整個(gè)植物，用于分析。還使用LRclonase將Tribdesat2b基因重組至植物表達(dá)載體pXZP393(CSIROPlantIndustry)內(nèi)，置于組成型CaMV35S啟動子的控制下。所得表達(dá)質(zhì)粒pXZP384被轉(zhuǎn)化至AGL1內(nèi)，并用于如上所述植物轉(zhuǎn)化至煙草的葉子內(nèi)。通過GC和GC-MS分析轉(zhuǎn)基因煙草葉和種子的脂肪酸組成，以顯示因添加新的去飽和酶活性而造成的脂肪酸組成的改變。實(shí)施例12—從美洲蟋蟀克隆去飽和酶基因一些昆蟲被認(rèn)為具有A12-去飽和酶活性，但盡管20年間付出了大量的努力，迄今尚未分離到編碼這種酶的基因。直至本發(fā)明之前仍不清楚這方面不成功的原因。一種已知具有A12-去飽和酶活性的昆蟲是美洲蟋蟀，即普通蟋蟀。在最初試圖克隆美洲蟋蟀A12-去飽和酶基因時(shí)，所使用的一組簡并引物AdD12Des-Fl(5'-TTGTTCTGTGTGGGTCAYGAYTGYGGWCA(SEQIDNO:127》和AdD12Des-Rl(5'-GTGATGGGCGACGTGACYGTYKGTRAT(SEQIDNO:128)是基于擬南芥A12-去飽和酶FAD2(P46313)、秀麗隱桿線蟲(a^"or/wM/fee/eg^w)A12-去飽和酶FAT-2(AAF63745)和A15-去飽和酶FAT-1(L41807)的保守性組氨酸盒I和組氨酸盒III區(qū)域(相應(yīng)于FAT-2的LFCVCHDCGH(氨基酸殘基88-97)和ITNGHVAHH(氨基酸殘基291_299))而設(shè)計(jì)的。不過，盡管反復(fù)嘗試并反復(fù)改變條件，但使用美洲蟋蟀脂肪體總74RNA和這組引物進(jìn)行的RT-PCR反應(yīng)均未能擴(kuò)增到任何特異性產(chǎn)物，這提示美洲蟋蟀編碼A12-去飽和酶的基因可能與植物或線蟲A12-去飽和酶基因具有很低的同源性?？紤]了一種不同的方法來克隆美洲蟋蟀A12-去飽和酶基因。基于來自包J舌纟工帶巻蛾(/4rg>rotoew/ave/wf/"awa)(AAF44709)、家蠶(5owAy;cwon〕(BAD18122,AAF80355)、蘋淺褐巻蛾(五p^/^ospos加'加"a)(AAK94070)、煙夜蛾(//e/fcoverpaaww/0(AAM28484，AAM28483)、谷實(shí)夜蛾(AAF81787，AAF81788)、家蠅(MuycadoweWca)(AAN31393)、亞洲玉米螟(OsW"/a/w"acafc)(AAL27034，AAL32060,AAL35746)、歐洲玉米螟(O.(AAF44710，AAL35330，AAL35331)、粉紋夜蛾(AAB92583,O44390:AAD03775)等物種的55種昆蟲脂肪酸?；o酶AA9-、A10-、All-和A14-去飽和酶之間所共有的氨基酸序列同源性，設(shè)計(jì)了簡并引物(AdD12Des-F25，-TTCTTCTTCKCNCAYKTHGGNTGG(SEQIDNO:129)和AdD12Des-R25，誦TGRTGGTAGTTGTGVHANCCCTC(SEQIDNO:130))以試圖克隆昆蟲A12-去飽和酶基因，所述引物針對的是這些去飽和酶的兩個(gè)保守區(qū)(FFFS/AHI/VGW(SEQIDNO:131)和EGY/W/FHNYHH(SEQIDNO:132)，對應(yīng)于紅帶巻蛾A9-去飽和酶AAF44709的氨基酸殘基145-152和263-270)。出乎預(yù)料的是，RT-PCR從美洲蟋蟀脂肪體總RNA中擴(kuò)增到一個(gè)趨異性的360bp的去飽和酶樣序列，連同另一種與已知的美洲蟋蟀A9-去飽和酶G^D9D化AF338466)的一部分相同的去飽和酶基因片段。使用GeneRacerKit(Invitr。gen)快速擴(kuò)增cDNA末端和該360bp片段內(nèi)部的序列得到一個(gè)1597bp的cDNA序列，命名為A/D72Z)es(SEQIDNO:133)，其編碼一種357個(gè)氨基酸殘基的肽(SEQIDNO:134)。將v4JD9Dw、A/D/2Des和7HMesaf川的cDNA序列各自克隆至酵母表達(dá)載體pYES2(Invitrogen)，分別產(chǎn)生質(zhì)粒pXZP277、pXZP282和pYES2-Trib10。將質(zhì)粒pYES2、pXZP277、pXZP282和pYES2-Trib10轉(zhuǎn)化至釀酒酵母o/e/株的細(xì)胞內(nèi)，o/W株含有A9-去飽和酶敲除突變(Stukey等，1990)，以便測試該突變是否被互補(bǔ)并由此提示存在A9-去飽和酶活性。除非細(xì)胞內(nèi)表達(dá)A9-去飽和酶，否則酵母WW細(xì)胞需要補(bǔ)充不飽和脂肪酸例如C16:l"以維持生長，這是互補(bǔ)測試的基礎(chǔ)。在補(bǔ)充0.5mMC16:l^和1%NP-40的缺陷培養(yǎng)基(SD-Um)瓊脂板上篩選o/W細(xì)胞的轉(zhuǎn)化體。攜帶上述質(zhì)粒的酵母o/W轉(zhuǎn)化體首先生長在30°C的補(bǔ)充了0.5mMC16:l"和1%NP-40的YPD培養(yǎng)基(1%酵母提取物，2%蛋白胨，2%葡萄糖)中，直至OD6Q。大約為1.0。然后將樣品調(diào)整至OD6。。為1.0，1:10系列稀釋，并取1^L測定用量的各個(gè)稀釋物點(diǎn)樣在YPG瓊脂平板上，該板與YPD培養(yǎng)基相同，不同之處在于前者含有2%半乳糖而不是葡萄糖，以誘導(dǎo)pYES2衍生的載體的基因表達(dá)。30。C培養(yǎng)2天后觀察細(xì)胞的生長。美洲蟋蟀A9-去飽和酶在o/e/細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)明顯互補(bǔ)了o/W表型，而美洲蟋蟀^ZD"Das的表達(dá)沒有形成互補(bǔ)，說明其在酵母細(xì)胞內(nèi)不具有A9-去飽和酶的功能。表達(dá)赤擬谷盜A12-去飽和酶的o/"細(xì)胞僅在存在添加的C17:l時(shí)才在YPG板上生長。這些數(shù)據(jù)證實(shí)，克隆的」^D"Z)m或7WWera/M基因不編碼A9-去飽和酶家族的另一成員。還將這些表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至釀酒酵母S288C細(xì)胞，這是一種普通的實(shí)驗(yàn)室酵母菌株。如Zhou等(2006)所述從酵母細(xì)胞提取脂肪酸甲基酯(FAME)并分析。酵母脂肪酸甲酯的氣相色譜法(GC)證實(shí)，與僅具有pYES2載體的細(xì)胞(圖7B)相比，.J^)72C^在釀酒酵母中的表達(dá)分別從C18:l和C16:l產(chǎn)生了新的二烯脂肪酸C18:2和C16:2(圖7A)，這一點(diǎn)通過與純(318:2^'12標(biāo)準(zhǔn)品具有相同的保留時(shí)間和質(zhì)譜而得到證實(shí)。通過4，4-二甲基噁唑啉衍生物的GC-質(zhì)譜法(FayandRichli，1991)證實(shí)，C16:2和C18:2產(chǎn)物的雙鍵的位置位于A9和A12位，在m/z196和208,236和248之間間隔12個(gè)原子質(zhì)量單位(圖2C)。這些二烯的產(chǎn)生證實(shí)^aO/2Z)m和7WWera//0編碼作用于C16:l^或C18:lA9的A12-去飽和酶。當(dāng)表達(dá)于酵母菌株o/e7的細(xì)胞內(nèi)時(shí)，赤擬谷盜A12-去飽和酶從C18:1產(chǎn)生C18:2的轉(zhuǎn)化率為30.5%,從C16:l產(chǎn)生C16:2的轉(zhuǎn)化率為16.0%(表11)，說明該酶偏向于C18底物而非C16底物。細(xì)胞內(nèi)的底物脂肪酸水平同步降低。表ll一表達(dá)位于pYES2中的赤擬谷盜去飽和酶Tribdesat10的酵母o/e/細(xì)胞的脂肪酸組成(占總脂肪酸的％)，補(bǔ)料C16:1或C18:1底物，與空pYES2載體對照相比。__脂肪酸組成(占總脂肪酸的％)_12:014:015:016:016:117:016:217:118:018:118:2pYES2+C18:l3.02.20.741.70.20.6010.916.923.80Tribdesatl0+C18:l3.32.31.043.20.10.808.618.015.76.9pYES2+C16:l3.92.90.742.520.60.509.119.40.40Tribdesatl0+C16:l4.23.10.843.614.70.62.87.821.90.40美洲蟋蟀和赤擬谷盜A12-去飽和酶蛋白質(zhì)編碼區(qū)也被克隆至植物表達(dá)載體，分別產(chǎn)生質(zhì)粒pXZP375和pXZP376，受控于種子特異性啟動子(Stalberg等，1993)。如Zhou等(2006)所述通過根癌土壤桿菌將這些表達(dá)質(zhì)粒引入擬南芥/"d2^e7雙突變體(Smith等，2003)的組織，產(chǎn)生轉(zhuǎn)化的植物?；救缜八鲞M(jìn)行種子FAME的GC分析。表12顯示了一個(gè)實(shí)例，經(jīng)編碼美洲蟋蟀A12-去飽和酶的^必WDm基因轉(zhuǎn)化的6個(gè)轉(zhuǎn)基因株有效產(chǎn)生了C18:2，產(chǎn)生的水平為種子油中總脂肪酸的至少42%，而C18:3為至少20%，兩者在種子中均自C18:l產(chǎn)生。由于擬南芥/"d2^^/雙突變體仍具有野生型A15-去飽和酶(FAD3)，因此，推測該酶在存在C18:2的情況下將其轉(zhuǎn)化為C18:3。因此，這些轉(zhuǎn)基因株產(chǎn)生的C18:3也是美洲蟋蟀A12-去飽和酶將C18:l轉(zhuǎn)化為C18:2的產(chǎn)物，并代表了美洲蟋蟀A12-去飽和酶的產(chǎn)物。這一結(jié)果證實(shí)了所克隆的基因的A12-去飽和酶活性，并且是第一次在轉(zhuǎn)化的細(xì)胞證實(shí)重組昆蟲A12-去飽和酶。表12—/"c/2^^/雙突變體內(nèi)表達(dá)美洲蟋蟀AdD12Des的轉(zhuǎn)基因擬南芥種子的脂肪酸組成(占總脂肪酸的％)。__樣品C16:0C16:lC18:0C18:lC18:2C18:3C20:0C20:lfad2/fael*4.90.52.0990.210.22.060.00.35EY16.330.02.4626.6140.0724.53痕量痕量EY65.272.4885.933.742.470.11痕量EY72.90.044.729.123.30.0EY132.30.043.131.023.60.0EY153.90.025.446.224.60.0EY204.160,00.0555.8119.2021.11痕量痕量*fad2/fael對應(yīng)于對照(未轉(zhuǎn)化的)植物代表性?；o酶A或?；|(zhì)去飽和酶蛋白質(zhì)序列的系統(tǒng)發(fā)生分析顯示，AdD12Des和TribdesatlO的氮基酸序列與其他?；o酶A去飽和酶成簇(圖9的右側(cè)；圖10)。用于本分析的昆蟲去飽和酶的登記號和物種為AdD9，美洲蟋蟀AAK25796;AdD12，美洲蟋蟀SEQIDNO:(SEQIDNO:135);BmDl(Ml，家蠶AAF80355;BmDll，家蠶BAD18122;DmD9，黑腹果蠅(Dmsop/7flwe/a"ogosfer)CAB69054;MdD9，家蠅AAN31393;OnD9，歐洲|玉米螟AAF44710;OnDl1，歐洲玉米螟AAL35331;OnD14，歐洲玉米螟AAL35330;PoD9，尸/awotoWr/xAAF73073;PoD10，尸.octoAAG54077;TcD9A，赤擬谷盜XP—969607;TcD9B，赤擬谷盜XP—966962;TcD12,赤擬谷盜Tribdesat10(SEQIDNO:28);TnD9，粉紋夜蛾AAB92583;TnDll，T."/O44390;其他動物的去飽和酶AcD12-15，卡氏棘阿米巴04c朋f/zamo&acosfe〃am7)ABK15557;CeD12，秀麗隱桿線蟲AAF63745;RnD9，褐家鼠(iaW^"orveg!'cws)P07308;細(xì)菌去飽和酶N36D9，Nostocsp,36CAF18423ANoD9，Nostocsp.PCC7120(加6a簡簡.a臉)BAA03434;NoD9，Nostocsp.PCC7120BAA03435;SyD9，集胞藻屬PC6803BAA03982;SyD12，集胞藻屬PC6803P20388;真菌去飽和酶LkD12，丄flc/w"ceaWwyven'BAD08375;MaD9，高山被孢霉(Mom'e/^/^a/p/加)BAA759W;Y1D12，解脂耶氏酵母(7謂油—一ca)CAJ81209;ScD9，釀酒酵母P21147;植物去飽和酶AtD9，擬南芥AAK76592;AtD12—FAD2(ERA12-去飽和酶)，擬南芥P46313;AtD12—FAD6(質(zhì)體A12-去飽和酶)，擬南芥P46312;PgD9，白云杉(尸&eag/做c力AAM12238)。D9、D10、Dll、D12和D14分別指A9-、△10-、All-、A12-和A14-去飽和酶。AdD12Des和Tribdesat10的全長氨基酸序列與形成另一主要簇的優(yōu)勢?；|(zhì)去飽和酶的細(xì)菌A9-去飽和酶或植物、真菌和動物的A12-去飽和酶僅顯示出很低的相同性(最高達(dá)23%)(圖4左側(cè))。AdD12Des和Tribdesat10與來自其他動物、植物或真菌的A12-去飽和酶具有低水平的相同性這一點(diǎn)是特別出乎預(yù)料的。相反，AdD12Des與包括昆蟲A9-去飽和酶(包括家蟋和赤擬谷盜(redflourbeetle)的那些酶)形成不同的一簇，這提示其可能是從A9-去飽和酶基因進(jìn)化而來。AdD12Des的氨基酸序列這些酶的相同性程度分別為65.2%、55.2%、55.5%、53.5%、53.5%、55.3%、59.4%和53.6%，分別對應(yīng)于來自美洲蟋蟀AF338466、黑腹果蠅CAB69054、家蠅AAN31393、歐洲玉米螟AAF44710、戶.AAF73073、赤擬谷盜XP—969607、赤擬谷盜XP—966962和r.m'AAB9258的昆蟲A9-去飽和酶。具體而言，AdD12Des在序列上與來自相同物種的A9-去飽和酶蛋白相對接近，具有大約65%的氨基酸相同性。由于TribdesatlO在系統(tǒng)發(fā)生樹上出現(xiàn)在與包括擬谷盜屬A9-去飽和酶(與78之具有高達(dá)48%的相同性)在內(nèi)的其他?；o酶A去飽和酶不同的一個(gè)分支上，因此其可能是從昆蟲A9-去飽和酶基因獨(dú)立進(jìn)化而來的。如圖3的數(shù)據(jù)所示，當(dāng)在酵母中表達(dá)時(shí)，AdD12Des對中鏈飽和脂肪酸C14:0和C15:0保留了低水平的A9-去飽和活性。圖3A顯示了僅表達(dá)pYES2載體的酵母細(xì)胞內(nèi)的脂肪酸譜的部分GC圖，而3B顯示了表達(dá)pXZP282的酵母細(xì)胞內(nèi)的脂肪酸譜，其具有額外的C14:l和C15:l峰。不過，在表達(dá)TribdesatlO的酵母內(nèi)沒有觀察到A9-去飽和活性。這些發(fā)現(xiàn)提示，這兩種昆蟲A12-去飽和酶是從遠(yuǎn)古去飽和酶獨(dú)立分開的。同樣值得注意的是，來自秀麗隱桿線蟲和卡氏棘阿米巴的其他動物A12-去飽和酶與植物A12-去飽和酶的相關(guān)性比與昆蟲A12-去飽和酶AdD12Des和TribdesatlO的相關(guān)性更密切(與擬南芥A12-去飽和酶FAD2分別具有27.2%和38.6%的氨基酸序列相同性，或與美洲蟋蟀AdD12Des分別具有11.6%和11.1%的氨基酸序列相同性)。為了測試克隆的美洲蟋蟀A12-去飽和酶是使用?；o酶AC18:l而非酰基-PCC18:l作為底物，在酵母S288C細(xì)胞中表達(dá)了pXZP282中的來自美洲蟋蟀的A12-去飽和酶基因。編碼FAD2的擬南芥M2-去飽和酶基因編碼區(qū)也克隆至pYES2，得到構(gòu)建體pXZP279，并表達(dá)于S288C作為對照基因，作為已知是?；?PC型酶的植物A12-去飽和酶的一個(gè)實(shí)例。在存在C"標(biāo)記的C18:l(5xl06dpm)的情況下接種酵母轉(zhuǎn)化體培養(yǎng)物，并在2、5和30分鐘，以及1、6和24小時(shí)后收集細(xì)胞。為得到最佳結(jié)果，使用玻璃珠繼而反復(fù)通過組織研磨器而裂解細(xì)胞。如Domergue等(2005)所述提取結(jié)合于輔酶A的脂肪酸，轉(zhuǎn)化為FAME并通過銀染-薄層色譜(TLC)進(jìn)行分離。誘導(dǎo)期間加至培養(yǎng)基中的油酸立即出現(xiàn)于?；o酶A、PC和TAG級份中。觀察到擬南芥FAD2從30分鐘開始在酰基輔酶A級份中積聚標(biāo)記的C18:2產(chǎn)物。與此不同的是，最早在加入底物后2分鐘即觀察到蟋蟀去飽和酶將標(biāo)記的C18:l轉(zhuǎn)化為C18:2，說明該酶使用?；o酶A作為底物。因此，AdD12Des，以及推測TribdesatlO,均是?；o酶A油酰A12-去飽和酶類型，而不是?；?PC油酰A12-去飽和酶。此前未曾鑒定到編碼前一類型的A12-去飽和酶的基因。預(yù)期在此所述的昆蟲酰基輔酶AA12-去飽和酶的克隆過程會刺激進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)其他的新的昆蟲多不飽和脂肪酸去飽和酶基因，并將對昆蟲脂肪酸代謝產(chǎn)生更多的認(rèn)識?？赏ㄟ^基因敲除突變體來研究該基因在昆蟲發(fā)育和生理學(xué)中的作用。這些A12-去飽和酶基因的表征還會更多地揭示昆蟲去飽和酶從祖先基因的進(jìn)化過程。最后，這會增加我們對脂肪酸去飽和酶之間的序列一底物類型關(guān)系的了解，因?yàn)槟そY(jié)合型昆蟲A12-去飽和酶被認(rèn)為是利用酰基輔酶A底物(Cripps，等1990)，而膜結(jié)合型植物A12-去飽和酶則利用磷脂酰膽堿(PC)作為底物(StymneandAppelqvist，1978)。'"乙33，s'(S86I)'IB13q涵H.S8-9厶911。uip3io泡spuat工(8661)buibXbxbh'996-1%乙￡I0！8Pwui3ipo!apssuifeooz)，^obh■(uopuo]'iibh^ireuKfeq;3'(uo卩!pgpu乙)5poqpueHP!d門3q工'(s犯1!p3)0661).1"psuojsuno'8SS寸W:SI'd3HIPOlUBid(S66I).IBl31朋JD'6"-9￡r々SX3opj!A("61)，pureqBj￡)Y0乙i-SOn'0乙X3oio!8iBin。3i。pM'(Z66I)sabsiqt^:ssww31am11n33nss!丄itrew(^861)'IB^Bjmu〖ftid['eS6t7乙:乙外sj鄰"S83d(6661)7psips阿86-68/CqcfeiScnBuioJio](1661)nPRIP現(xiàn)Xbj[卞I9墨809:9S3nb!rap3}0!g(8861).Psmi3￡t￡t_9￡:WH'XS010u1p3丄pireaoxrapsp!d!qj;o]Biunofiresdomg(乙OOZ)"ISPHCDP116uosqoQ卞9￡'nS33ii3psiB3!uraipo!gwspuai丄(厶861)PI3s3iBqou3~asa-06卜￡補(bǔ)'68￡'fnraipo舊(SOO。.FP3ngj3uioa卞S"1:￡，丄，'咖h(2661)pi，o'V八'e!jpirex3!v'ssai(jSHSV'sdcuoavsuu！ss3j3cuj'('p3):pyirejf.〖iq'9§￡卞$￡'d'P!。V。no脂八suo!iB3!iddvpsppv-9niB八q3識(9661)tras>[j3C[p現(xiàn)snj3dn3'Wt^-d7乙:tsuw丄upfJ3doosuraq3f(S86I)Pp3〖quicu3.SS6-￡S6:"tmimuoouraiQ3。su13q3f0861)，p"qu10j3917'8"'syCqdoj8ui3ipo!axpiy(0661)Psdd!_o，u!:rad.，(￡661)dd可:)'2fl'J3,3p!jg'ssai(j化o叫丄'uo!i!papj￡'sp〖d!jos!sy(iBUBBJttp叫spueuo卩b3卯u3p！'uo!iRrecfos'uo阿os!:s!sXiBuyp!d!i(￡002)叩s!jq;^"9_￡S9:SI'd3^IPO(966I)FP3u3q;38817-6Z>:22IPO(086I)FP"cfec)'8811I掘11:68VSnPSP呵卿ckwj(乙66t)I它13'uooq^'k3掘Xg。I?！狫阿d(0002)IBp'UOOl|b30I2-I0Z:￡I'f,d(麵).IB13unojg6￡￡￡Z:ZJT(Z66I)'I它PupimnBg'A外-6S廿:SZ乙u3￡>'ow(1661)，pupiumE8￡"-6U:61S3HP!d!l'3ojd(1861)I胸pus!urepBg《2sppv3!3ionN(Z_66I)，Pimpsiv'左80I:17yC3oiouip3io詔(9861)^13qBunpqvKleimanandSpencer(1982)JAmOilChemSoc59，29-38,Knippleetal.(2002)Genetics162:1737-1752.Kozieletal.(1996)PlantMol.Biol.32:393-405.Leeetal.(1998)Science280:915-8.Lewisetal.(2000)JMicrobiolMethods43:107-116.Luetal.(1993)J.Exp.Med.178:2089-2096.MortimerandJohnston(1986)Genetics113:35-43.Motoetal.(2004)ProcNatlAcadSciUSA101:8631-8636.MurashigeandSkoog(1962).PhysiologiaPlantarum15，473-477.MurataandWada(1995)Biochem.J.308:1-8.NeedlemanandWunsch(1970)J.Mol.Biol.48:443-453.Qiuetal.(2001)PlantPhysiol125:847-855.Rodriguezetal.(2004)InsectBiochemMolBiol34:1315-1328.Sayanovaetal(2007)PlantPhysiology144:455-467.Serraetal.(2006)InsectBiochemMolBiol36:822-825.ShanklinandCahoon(1998)Annu.Rev.PlantPhysiol.PlantMol.Biol.49:611-641.Simopoulos(2000)PoultryScience79:961-970.Smith(1971)Prog.Chem.FatsotherLipids11:137-177.Smithetal.2003.Planta217,507-516.Stalbergetal.(1993)PlantMolecularBiology23,671-683.Stukeyetal.1990.JBiolChem265,20144-20149.StymneandAppelqvist(1978).EurJBiochem90,223-229.Thompsonetal.(1997)NucleicAcidsRes.25:4876-4882.Toriyamaetal.(1986)Theor.Appl.Genet.205:34.Trautwein(2001)Eur.J.LipidSci.Technol.103:45-55.vandeLooetal.(1995)ProcNatlAcadSciUSA.92:6743-7.Vernetetal.(1987)Gene，52:225-233.Wagneretal.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:6099-6103.Wangetal.(1997)TheJournalofGenetics&Breeding51:325-334.Whittleetal.(2005)JBiolChem.280:28169-76.Yuetal.(1988)Lipids23:804-810.Zhouetal.(2006)PlantScience170，665-673.8權(quán)利要求1.真核細(xì)胞，其包含編碼多肽的外源核酸，所述多肽是(i)包含SEQIDNO16至30、73至78、80和134中任一氨基酸序列的多肽，(ii)包含與SEQIDNO16至30、73至78、80和/或134中的一或多個(gè)序列具有至少50％相同性的氨基酸序列的多肽，和/或(iii)i)或ii)的生物學(xué)活性片段，其中所述多肽具有選自去飽和酶、結(jié)合酶、環(huán)氧化酶和羥化酶活性中的一或多種活性。2.權(quán)利要求l的真核細(xì)胞，其中所述多肽包含與SEQIDNO:16至30、73至78、80和134中的一或多個(gè)序列具有至少90%相同性的氨基酸序列。3.權(quán)利要求1或2的真核細(xì)胞，其中所述多肽可分離自鞘翅目或直翅目昆蟲。4.權(quán)利要求3的真核細(xì)胞，其中所述昆蟲是擬谷盜屬、花螢屬或蟋蟀的物種。5.權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)的真核細(xì)胞，其中所述多肽是(i)包含SEQIDNO:28、73和/或134中任一氨基酸序列的多肽，(ii)包含與SEQIDNO:28、73禾tl/或134中的一或多個(gè)序列具有至少50%相同性的氨基酸序列的多肽，和/或(iii)i)或ii)的生物學(xué)活性片段，其中所述多肽具有?；o酶AA12去飽和酶活性。6.權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)的真核細(xì)胞，其中所述多肽是(i)包含SEQIDNO:18或SEQIDNO:19的氨基酸序列的多肽，(ii)包含與SEQIDNO:18或SEQIDNO:19的序列具有至少50%相同性的氨基酸序列的多肽，和域(iii)i)或ii)的生物學(xué)活性片段，其中所述多肽具有?；o酶AA5去飽和酶活性。7.權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)的真核細(xì)胞，其中所述多肽是(i)包含SEQIDNO:17、22、23、27、29、74、75和/或76中任一氨基酸序列的多肽，(ii)包含與SEQIDNO:17、22、23、27、29、74、75和/或76中的一或多個(gè)序列具有至少50%相同性的氨基酸序列的多肽，和域(iii)i)或ii)的生物學(xué)活性片段，其中所述多肽具有?；o酶AA9去飽和酶活性。8.真核細(xì)胞，其包含編碼酰基輔酶AA12去飽和酶的外源核酸。9.權(quán)利要求8的真核細(xì)胞，其中所述酰基輔酶AA12去飽和酶包含(i)SEQIDNO:28、73和/或134中任一氨基酸序列，(ii)與SEQIDNO:28、73禾B/或134中的一或多個(gè)序列具有至少50%相同性的氨基酸序列，和域(iii)i)或ii)的生物學(xué)活性片段。10.權(quán)利要求8或9的真核細(xì)胞，相對于缺乏所述外源核酸的相應(yīng)真核細(xì)胞而言，其含有水平升高的16:2^12和/或18:2^12脂肪酸。11.權(quán)利要求8至IO中任一項(xiàng)的真核細(xì)胞，其含有水平升高的與輔酶A酯化的16:2化"2和/或18:2卑12脂肪酸。12.真核細(xì)胞，其包含編碼酰基輔酶AA5去飽和酶的外源核酸，其中所述去飽和酶對18:0和/或16:0底物的活性高于其對與輔酶A酯化的脂肪酸底物的活性，其中所述脂肪酸是18:1A9、16:1A9、20:0和20:2A11A14中的任意一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)或全部。13.權(quán)利要求12的真核細(xì)胞，其中所述?；o酶AA5去飽和酶包含(i)SEQIDNO:18或SEQIDNO:19的氨基酸序列，(ii)與SEQIDNO:18或SEQIDNO:19具有至少50%相同性的氨基酸序列，和/或(iii)i)或ii)的生物學(xué)活性片段。14.權(quán)利要求12或13的真核細(xì)胞，相對于缺乏所述外源核酸的相應(yīng)真核細(xì)胞而言，其含有水平升高的16:n卩/或18:lAs脂肪酸。15.權(quán)利要求12至14中任一項(xiàng)的真核細(xì)胞，其含有水平升高的與輔酶A酯化的16:1"和域18:Ias脂肪酸。16.真核細(xì)胞，其包含編碼?；o酶AA9去飽和酶的外源核酸，其中所述去飽和酶對14:0底物的活性高于其對與輔酶A酯化的脂肪酸底物的活性，其中所述脂肪酸是16:0和/或18:0。17.權(quán)利要求16的真核細(xì)胞，其中所述?；o酶AA9去飽和酶包含(i)SEQIDNO:23或SEQIDNO:74的氨基酸序列，(ii)與SEQIDNO:23或SEQIDNO:74具有至少50%相同性的氨基酸序列，和/或(iii)i)或ii)的生物學(xué)活性片段。18.權(quán)利要求16或17的真核細(xì)胞，相對于缺乏所述外源核酸的相應(yīng)真核細(xì)胞，其含有水平升高的14:1A9。19.權(quán)利要求16至18中任一項(xiàng)的真核細(xì)胞，其含有水平升高的與輔酶A酯化的14:1A9。20.權(quán)利要求1至19中任一項(xiàng)的真核細(xì)胞，其是植物細(xì)胞、哺乳動物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞、真菌細(xì)胞或酵母細(xì)胞。21.權(quán)利要求20的真核細(xì)胞，其在植物或植物種子內(nèi)。22.權(quán)利要求21的真核細(xì)胞，其中所述植物或植物種子分別是油料種子植物或油料種子。23.用于鑒定參與改變脂肪酸的核酸分子的方法，其包括(i)獲得可操縱地連接于啟動子的核酸分子，所述核酸分子編碼一包含氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列與SEQIDNO:28的關(guān)聯(lián)比其與SEQIDNO:135的關(guān)聯(lián)更密切，(ii)將所述核酸分子導(dǎo)入所述啟動子在其中具有活性的細(xì)胞或無細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)，(iii)確定脂肪酸組成相對于導(dǎo)入所述核酸分子之前的該細(xì)胞或無細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)是否被改變，以及(iv)任選地，選擇改變所述脂肪酸組成的核酸分子。24.用于鑒定參與改變脂肪酸的核酸分子的方法，其包括(i)獲得可操縱地連接于啟動子的核酸分子，所述核酸分子編碼一包含氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列與SEQIDNO:28、73、和減134中的一或多個(gè)序列具有至少50%的相同性，(ii)將所述核酸分子導(dǎo)入所述啟動子在其中具有活性的細(xì)胞或無細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)，(iii)確定脂肪酸組成相對于導(dǎo)入所述核酸分子之前的該細(xì)胞或無細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)是否被改變，以及(iv)任選地，選擇改變所述脂肪酸組成的核酸分子。25.權(quán)利要求23或24的方法，其中步驟(iv)包括選擇編碼酰基輔酶AA12去飽和酶的核酸分子。26.權(quán)利要求23至25中任一項(xiàng)的方法，其中所述改變的脂肪酸組成含有水平升高的16:2""12和/或18:2A9，A12。27.用于鑒定參與改變脂肪酸的核酸分子的方法，其包括(i)獲得可操縱地連接于啟動子的核酸分子，所述核酸分子編碼一包含氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列與SEQIDNO:18和/或19中的一或多個(gè)序列具有至少50%的相同性，(ii)將所述核酸分子導(dǎo)入所述啟動子在其中具有活性的細(xì)胞或無細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)，(Hi)確定脂肪酸組成相對于導(dǎo)入所述核酸之前的所述細(xì)胞或無細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)是否被改變，和(iv)任選地，選擇改變所述脂肪酸組成的核酸分子。28.權(quán)利要求27的方法，其中步驟(iv)包括選擇編碼酰基輔酶AA5去飽和酶的核酸分子，其中所述去飽和酶對18:0和/或16:0底物的活性高于其對與輔酶A酯化的脂肪酸底物的活性，其中所述脂肪酸是18:1A9、16:1A9、20:0和20:2A"a"中的任意一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)或全部。29.權(quán)利要求27或28的方法，其中所述改變的脂肪酸組成含有水平升高的16:lAs和/或18:1A5脂肪酸。30.用于鑒定參與改變脂肪酸的核酸分子的方法，其包括(i)獲得可操縱地連接于啟動子的核酸分子，所述核酸分子編碼一包含氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列與SEQIDNO:17、22、23、27、29、74、75和/或76中的一或多個(gè)序列具有至少50°/。的相同性，(ii)將所述核酸分子導(dǎo)入所述啟動子在其中具有活性的細(xì)胞或無細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)，(iii)確定脂肪酸組成相對于導(dǎo)入所述核酸之前的所述細(xì)胞或無細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)是否被改變，和(iv)任選地，選擇改變所述脂肪酸組成的核酸分子。31.權(quán)利要求30的方法，其中步驟(iv)包括選擇編碼酰基輔酶AA9去飽和酶的核酸分子，其中所述去飽和酶對14:0底物的活性高于其對與輔酶A酯化的脂肪酸底物的活性，其中所述脂肪酸是16:0和/或18:0。32.權(quán)利要求30或31的方法，其中所述改變的脂肪酸組成含有水平升高的14:1A9。33.權(quán)利要求23至32中任一項(xiàng)的方法，其中所述多肽是昆蟲多肽或其突變體。34.基本上純化的多肽或重組多肽，其是?；o酶AA12去飽和酶。35.權(quán)利要求34的多肽，其中所述多肽是(i)包含SEQIDNO:28、73和/或134中任一氨基酸序列的多肽，(ii)包含與SEQIDNO:28、73和/或134中的一或多個(gè)序列具有至少50%相同性的氨基酸序列的多肽，和/或(iii)i)或ii)的生物學(xué)活性片段。36.基本上純化的多肽或重組多肽，其是酰基輔酶AA5去飽和酶，其中所述去飽和酶對18:0和/或16:0底物的活性高于其對與輔酶A酯化的脂肪酸底物的活性，其中所述脂肪酸是18:1A9、16:1A9、20:0和20:2A11A"中的任意一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)或全部。37.權(quán)利要求36的多S太，其中所述多肽是(i)包含SEQIDNO:18或SEQIDNO:19的氨基酸序列的多肽，(ii)包含與SEQIDNO:18和/或SEQIDNO:19具有至少50%相同性的氨基酸序列的多肽，和減(iii)i)或ii)的生物學(xué)活性片段。38.基本上純化的多肽或重組多肽，其是?；o酶AA9去飽和酶，其中所述去飽和酶對14:0底物的活性高于其對與輔酶A酯化的脂肪酸底物的活性，其中所述脂肪酸是16:0和域18:0。39.權(quán)利要求38的多肽，其中所述多肽是(i)包含具有SEQIDNO:17或SEQIDNO:74的氨基酸序列的多肽，(ii)包含與SEQIDNO:17和/或SEQIDNO:74中的一或多個(gè)序列具有至少50%相同性的氨基酸序列的多肽，和/或(iii)i)或ii)的生物學(xué)活性片段。40.基本上純化的多肽或重組多肽，其是(i)包含SEQIDNO:16至30、73至78、80和134中任一氨基酸序列的多肽，(ii)包含與SEQIDNO:16至30、73至78、80和/或134中的一或多個(gè)序列具有至少50%相同性的氨基酸序列的多肽，和/或(iii)i)或ii)的生物學(xué)活性片段，其中所述多肽具有選自去飽和酶、結(jié)合酶、環(huán)氧化酶和/或羥化酶活性的一或多種活性。41.權(quán)利要求40的多肽，其中所述多肽包含與SEQIDNO:16至30、73至78、80和/或134中的一或多個(gè)序列具有至少90%相同性的氨基酸序列。42.權(quán)利要求34至41中任一項(xiàng)的多肽，其中所述多肽可分離自鞘翅目或直翅目昆蟲。43.權(quán)利要求40至42中任一項(xiàng)的多肽，其中所述多肽對脂肪酸的A2至△15位之任一位置處的碳-碳鍵具有去飽和酶活性。44.權(quán)利要求43的多肽，其中所述脂肪酸是C16或C18脂肪酸。45.權(quán)利要求34至44中任一項(xiàng)的多肽，其是還包含至少一種其他多肽序列的融合蛋白。46.分離的和/或外源多核苷酸，其包含(i)選自SEQIDNO:l至15、67至72、79和133中的任一核苷酸序列，(ii)編碼權(quán)利要求34至45中任一項(xiàng)的多肽的核苷酸序列，(iii)與SEQIDNO:l至15、67至72、79和/或133中的一或多個(gè)序列具有至少50。/。相同性的核苷酸序列，和/或(iv)在嚴(yán)格性條件下與(i)至(iii)之任一序列雜交的序列。47.包含權(quán)利要求46的多核苷酸的載體。48.權(quán)利要求47的載體，其中所述多核苷酸可操縱地連接于啟動子。49.一種細(xì)胞，其包含權(quán)利要求34至45中任一項(xiàng)的重組多肽、權(quán)利要求46的外源多核苷酸和/或權(quán)利要求47或48的載體。50.權(quán)利要求49的細(xì)胞，其是植物、真菌、酵母、細(xì)菌或動物細(xì)胞。51.產(chǎn)生權(quán)利要求34至45中任一項(xiàng)的多肽的方法，所述方法包括在細(xì)胞或無細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)權(quán)利要求46的多核苷酸。52.權(quán)利要求51的方法，還包括分離所述多肽。53.轉(zhuǎn)基因非人類生物體，其包含權(quán)利要求1至22、49或50中任一項(xiàng)的細(xì)胞。54.權(quán)利要求53的生物體，其是轉(zhuǎn)基因植物。55.包含權(quán)利要求1至21、49或50中任一項(xiàng)的細(xì)胞的種子。56.—種油，其產(chǎn)自或得自權(quán)利要求1至21、49或50中任一項(xiàng)的細(xì)胞、權(quán)利要求53或54的轉(zhuǎn)基因非人類生物體、或權(quán)利要求55的種子。57.權(quán)利要求56的油，其包含脂肪酸16:0、16:1A5、18:0和18:1A5，其中所述油中的18:1^的總量與18:0的總量之比在100:1禾Q1:2之間，且其中所述油的脂肪酸包含低于10c/。(w/w)的20:lAs。58.權(quán)利要求56或57的油，且其中所述油的C18脂肪酸有至少43%是18:1A5。59.權(quán)利要求56至58中任一項(xiàng)的油，其中所述油的脂肪酸包含占所述油的總脂肪酸的百分比為至少3.0。/。(w/w)的18:1A5。60.權(quán)利要求56至59中任一項(xiàng)的油，其中所述油包含占所述油中的總脂肪酸的百分比為低于10。/。(w/w)的18:3A9，A12，A15(ALA)。61.權(quán)利要求56至60中任一項(xiàng)的油，其中所述油是通過從油料種子中提取油而得到的。62.—種油，其包含脂肪酸16:0、16:1A5、18:0和18:1A5，其中所述油中的18:1"的總量與18:0的總量之比在100:1和1:2之間，且其中所述油的脂肪酸包含低于10。/。(w/w)的20:1A5。63.—種油，其包含脂肪酸，其中所述油的C18脂肪酸有至少43%是18:1A5。64.—種油，其包含脂肪酸，所述脂肪酸包含占所述油的總脂肪酸的百分比為至少3.0。/。(w/w)的18:1A5。65.權(quán)利要求64的油，其包含占所述油中的總脂肪酸的百分比為低于100/0(w/w)的18:3A9'A12，A15(ALA)。66.—種脂肪酸，其產(chǎn)自或得自權(quán)利要求1至21、49或50中任一項(xiàng)的細(xì)胞、權(quán)利要求53或54的轉(zhuǎn)基因非人類生物體、或權(quán)利要求55的種子。67.產(chǎn)生含不飽和脂肪酸的油的方法，所述方法包括從權(quán)利要求1至21、49或50中任一項(xiàng)的細(xì)胞、權(quán)利要求53或54的轉(zhuǎn)基因非人類生物體、或權(quán)利要求55的種子中提取油。68.—種組合物，其包含權(quán)利要求1至21、49或50中任一項(xiàng)的細(xì)胞、權(quán)利要求34至45中任一項(xiàng)的多肽、權(quán)利要求46的多核苷酸、權(quán)利要求47或48的載體、權(quán)利要求56至65中任一項(xiàng)的油或權(quán)利要求66的脂肪酸。69.包含權(quán)利要求56至65中任一項(xiàng)的油或權(quán)利要求66的脂肪酸的飼料、化妝品或化學(xué)制品。70.進(jìn)行去飽和酶反應(yīng)的方法，所述方法包括將與輔酶A酯化的飽和脂肪酸、單不飽和脂肪酸或多不飽和脂肪酸底物與權(quán)利要求34至45中任一項(xiàng)的多肽相接觸。71.基本上純化的抗體或其片段，其特異性結(jié)合權(quán)利要求34至45中任一項(xiàng)的多肽。72.治療或預(yù)防能從PUFA中獲益的疾病的方法，所述方法包括給對象施用權(quán)利要求1至21、49或50中任一項(xiàng)的細(xì)胞、權(quán)利要求34至45中任一項(xiàng)的多肽、權(quán)利要求46的多核苷酸、權(quán)利要求47或48的載體、權(quán)利要求56至65中任一項(xiàng)的油、權(quán)利要求66的脂肪酸和/或權(quán)利要求69的飼料。73.權(quán)利要求72的方法，其中所述疾病是心律失常、血管成形術(shù)、炎癥、哮喘、銀屑病、骨質(zhì)疏松、腎結(jié)石、AIDS、多發(fā)性硬化、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、克羅恩氏病、精神分裂癥、癌癥、胎兒酒精綜合征、注意力缺陷多動癥、囊性纖維化、苯丙酮尿癥、單相抑郁癥、攻擊性敵意、腎上腺腦白質(zhì)營養(yǎng)不良、冠心病、高血壓、糖尿病、肥胖、阿爾茨海默氏病、慢性阻塞性肺病、潰瘍性結(jié)腸炎、血管成形術(shù)后再狹窄、濕疹、高血壓、血小板聚集、消化道出血、子宮內(nèi)膜異位、經(jīng)期前綜合征、肌痛腦脊髓炎、病毒感染后慢性疲勞或眼病。74.權(quán)利要求1至21、49或50中任一項(xiàng)的細(xì)胞、權(quán)利要求34至45中任一項(xiàng)的多肽、權(quán)利要求46的多核苷酸、權(quán)利要求47或48的載體、權(quán)利要求56至65中任一項(xiàng)的油或權(quán)利要求66的脂肪酸和/或權(quán)利要求69的飼料在制備用于治療或預(yù)防能從PUFA中獲益的疾病的藥物中的用途。全文摘要本發(fā)明涉及具有去飽和酶、結(jié)合酶、環(huán)氧化酶和/或羥化酶活性的酶，所述的酶可用于合成脂肪酸的方法中。文檔編號A01H5/10GK101578363SQ200780040245公開日2009年11月11日申請日期2007年8月29日優(yōu)先權(quán)日2006年8月29日發(fā)明者A·格林,C·C·伍德,I·霍恩,K·格洛弗,K·達(dá)姆切夫斯基,S·P·辛格,V·S·哈利托斯,周雪榮申請人:聯(lián)邦科學(xué)技術(shù)研究組織;糧食研究發(fā)展公司