專利名稱：：提高甘草毛狀根次生代謝產(chǎn)物合成量的方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及一種提高甘草毛狀根中次生代謝產(chǎn)物合成量的方法。技術背景甘草是我國重要的傳統(tǒng)中藥，具有清熱解毒、潤肺祛痰、緩急止痛、補氣益脾胃、調(diào)和諸藥等功效，被譽為"眾藥之王"。甘草的主要有效次生代謝產(chǎn)物包括三萜類甘草酸和甘草黃酮，其中甘草酸是非常珍貴的解毒劑，可防治病毒性肝炎、高血脂、癌癥和艾滋病等疾病；甘草黃酮具有抗氧化、抗腫瘤、抗炎、抗?jié)?、抗衰老、保肝等藥理作用。甘草不僅是重要藥材，還廣泛應用于日用化工品及食品領域，其中甘草酸是一種天然甜味劑，而甘草黃酮是一類天然抗菌劑和防腐劑。然而甘草野生資源的瀕臨滅絕阻礙了甘草的深入開發(fā)利用。隨著生物工程技術的不斷提高，利用毛狀根培養(yǎng)來生產(chǎn)次生代謝產(chǎn)物成為研究熱點，其生長迅速，分支多，不需要外源激素，而且比細胞培養(yǎng)容易放大，是藥用植物資源可持續(xù)發(fā)展的有效途徑之一。由發(fā)根農(nóng)桿菌感染植物形成的甘草毛狀根系統(tǒng)，生長速度快，遺傳穩(wěn)定性好，是生產(chǎn)甘草活性成分的良好培養(yǎng)系統(tǒng)。但是甘草毛狀根培養(yǎng)系統(tǒng)仍然存在活性成分低的問題，影響了甘草毛狀根的進一步發(fā)展放大和工業(yè)化。如張蔭麟(1990)等報道烏拉爾甘草毛狀根的總黃酮含量為干重的0.39%，遠遠低于生藥根的含量2.38%;杜旻(2001)等研究的烏拉爾甘草毛狀根黃酮含量也約為0.39%;王裔惟(2004)等檢測光果甘草毛狀根在生長31d后總黃酮達到最高含量為0.78%;楊世海(2006)等檢測了烏拉爾甘草毛狀根中各種不同黃酮的含量，其總黃酮的含量約為0.15%。對甘草毛狀根中甘草酸成分檢測的研究較少，有人報道甘草毛狀根中不含甘草酸，如日本高京秀等的研究表明甘草毛狀根中含有甘草酸；而一些研究卻報道在甘草毛狀根中未檢測到甘草酸，可能與甘草的品種和來源有關。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種提高甘草毛狀根中次生代謝產(chǎn)物合成量的方法。本發(fā)明所提供的提高甘草毛狀根中次生代謝產(chǎn)物合成量的方法，是用可調(diào)節(jié)細胞滲透壓造成干旱脅迫的物質(zhì)處理液體培養(yǎng)基中的甘草毛狀根，得到次生代謝產(chǎn)物含量提高的甘草毛狀根。所述可調(diào)節(jié)細胞滲透壓造成干旱脅迫的物質(zhì)為PEG和/或吐溫。所述PEG可為不同聚合程度的聚乙二醇(PEG)包括PEG6000，PEG8000，PEG20000，優(yōu)選為PEG8000。所述方法中，所述PEG的處理濃度為O.02—0.08g/mL，優(yōu)選為0.02g/mL;所述吐溫的處理濃度為0.01—0.04g/mL，優(yōu)選為0.02g/mL。所述方法中，所述可調(diào)節(jié)細胞滲透壓的物質(zhì)處理的時間為6—72小時，優(yōu)選為6—48小時。所述PEG單獨處理的時間為24-72小時，優(yōu)選為48小時；所述吐溫單獨處理的時間為6-36小時，優(yōu)選為24小時。所述方法中，所述液體培養(yǎng)基為MS液體培養(yǎng)基。所述方法中，所述甘草毛狀根是將甘草毛狀根的根尖部位接種于MS液體培養(yǎng)基中繼代培養(yǎng)2—4代得到。所述甘草毛狀根的根尖部位為自根尖尖部2-3cm的根尖；所述繼代培養(yǎng)每20天換一次培養(yǎng)基。所述方法中，所述次生代謝產(chǎn)物為甘草黃酮。生物體在需氧代謝過程中的氧化還原反應伴有活性氧簇(超氧陰離子自由基、羥自由基、單線態(tài)氧、過氧化氫等)生成，可以引發(fā)生物膜多不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應。損傷膜結(jié)構(gòu)及功能，損傷糖、蛋白質(zhì)及核酸等生物夫分子，導致功能和代謝紊亂。推測干旱脅迫剌激了甘草細胞的抗氧化防御機制，從而能夠刺激黃酮類化合物的大量合成。本發(fā)明的方法通過用可調(diào)節(jié)細胞滲透壓造成干旱脅迫的物質(zhì)處理甘草毛狀根實現(xiàn)提高毛狀根中次生代謝產(chǎn)物的含量，實驗證明，本發(fā)明的方法處理后得到的甘草毛狀根的總黃酮含量增加44%-55%。本發(fā)明的方法為利用甘草毛狀根培養(yǎng)體系來快速高效的獲得高產(chǎn)甘草有效次生代謝產(chǎn)物提供了新型途徑。下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明做進一步說明。圖1為濃度為0.02g/ml的PEG8000處理甘草毛狀根不同時間后總黃酮含量柱形圖。圖2為不同濃度的PEG8000處理甘草毛狀根后總黃酮含量柱形圖；圖2中1為對照，2為濃度2%(g/ml)的PEG8000處理，3為濃度為4%(g/ml)的PEG8000處理，4為濃度為6%(g/ml)的PEG8000處理，5為濃度為8%(g/ml)的PEG8000處理。圖3為相同濃度0.02g/ml、不同種類PEG處理甘草毛狀根48h后總黃酮含量柱形圖；圖3中，1為對照，2為PEG6000，3為PEG8000，4為PEG20000。圖4為不同濃度的吐溫一80處理甘草毛狀根24h后總黃酮含量柱形圖；圖4中1為對照，2為0.Olg/ral的吐溫一80處理，3為0.02g/ml的吐溫一80處理，4為0.03g/ml的吐溫_80處理，5為0.04g/ml的吐溫一80處理。圖5為吐溫-80、0.02g/ml濃度處理甘草毛狀根不同時間后總黃酮含量柱形圖。具體實施方式實施例1、用本發(fā)明的方法處理烏拉爾甘草毛狀根后誘導毛狀根中的次生代謝產(chǎn)物的合成和分泌。一、PEG誘導烏拉爾甘草毛狀根的次生代謝產(chǎn)物合成本實施例中，以烏拉爾甘草毛狀根為材料；以不同聚合程度的聚乙二醇(PEG)包括PEG6000，PEG8000，PEG20000或不同濃度而相同種類的PEG(0,02g/ral-0.2g/ml)處理甘草毛狀根。具體操作步驟如下1、將誘導產(chǎn)生的烏拉爾甘草毛狀根固體培養(yǎng)中生長旺盛的毛狀根白色根尖部位2-3cm切下，接種至含有100mlMS液體培養(yǎng)基的300ml培養(yǎng)瓶里，每瓶毛狀根的接種量為lg，其中MS液體培養(yǎng)基里不含任何激素，在溫度為25°C，轉(zhuǎn)速為100rpm/rain的搖床上黑暗培養(yǎng)40天左右(大約繼代兩次)，20天更換一次培養(yǎng)基。2、收集所有步驟1液體培養(yǎng)得到的甘草毛狀根，除去褐化死亡的毛狀根，其余毛狀根平均分配到300ml培養(yǎng)瓶里，每瓶毛狀根濕重為2g，分成8組，各加入100ml含有不同種類而相同濃度PEG(PEG6000，PEG8000，PEG20000，濃度均為0.02g/ml)或不同濃度而相同種類PEG(0.02g/ml，0.04g/ml，0.06g/ml，0.08g/ml或O.lg/ml)的MS培養(yǎng)基，然后每組分成三小組，分別在與前面繼代培養(yǎng)相同的條件下即溫度為25°C，轉(zhuǎn)速為100rpm的搖床上誘導處理24、48或者72小時，以不含PEG誘導子的MS培養(yǎng)液處理相同時間的毛狀根為對照(CK)。二、PEG處理后甘草毛狀根中總黃酮含量的檢測。1、將步驟一各組PEG處理后的甘草毛狀根及對照毛狀根，分別以無菌水沖洗三次，去除殘留的培養(yǎng)基，于濾紙上吸干水分，放入6(TC烘箱里烘至恒重，粉碎后過60目篩，稱取O.lg粉末，加入5ml甲醇，浸泡過夜(約12小時)，超聲波(40Hz)提取30分鐘，抽濾，濾渣再重復操作一次，合并濾液，定容至10ml。2、紫外分光光度法檢測步驟l得到的各組樣品中的總黃酮含量(以質(zhì)量百分含量表示)。以柚皮苷為標準樣品，作標準曲線。根據(jù)標準曲線計算所測樣品的濃度，從而計算0.lg甘草毛狀根粉末中總黃酮的質(zhì)量百分含量。經(jīng)紫外分光光度法檢測結(jié)果如表1-表3(相應柱形圖如圖1-圖3所示)所示，結(jié)果表明1)濃度為0.02g/ml的PEG8000處理烏拉爾甘草毛狀根不同時間后，從24h至72h之間毛狀根中總黃酮含量均有提高，尤其以48h的毛狀根中總黃酮含量最高(如表l、圖l所示)。表1.濃度為0.02g/ml的PEG8000處理的烏拉爾甘草毛狀根的總黃酮含量項目總黃酮含量(質(zhì)量百分含量％)處理時間24h48h72h對照(ck)1.021.041.03PEG8000(0.02g/ml)1.41.641.372)相同種類而不同濃度PEG處理后的毛狀根中，總黃酮含量從0.02g/ml-0.08g/ralPEG處理均有提高，但是有效提高范圍為0.02g/ml至0.06g/ml之間，尤其以PEG濃度為0.02g/ml處理48小時后為最高，總黃酮含量比對照提高了44%(如表2、圖2所示)；圖2中1為對照，2為濃度2%(g/ml)的PEG8000處理，3為濃度為4%(g/ml)的PEG8000處理，4為濃度為6%(g/ml)的PEG8000處理，5為濃度為8%(g/ml)的PEG8000處理。表2.PEG8000處理不同時間的烏拉爾甘草毛狀根的總黃酮含量項目總黃酮含量(質(zhì)量百分含量％)PEG8000濃度(g/ml)2%4%6%8%對照(ck)1.330PEG80001.9201.8021.6971.5013)不同種類而相同濃度(均為0.02g/ml)PEG處理48h后的毛狀根中總黃酮含量不同，且以PEG8000處理后的總黃酮含量最高(如表3、圖3所示)比對照提高了55.20%。圖3中，l為對照，2為PEG6000，3為PEG8000，4為PEG20000。表3.不同種類PEG處理的烏拉爾甘草毛狀根的總黃酮含量<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>實施例2、吐溫-80處理甘草毛狀根后總黃酮含量檢測按照實施例1的步驟一中的步驟1的方法培養(yǎng)得到液體培養(yǎng)的甘草毛狀根，然后將該液體培養(yǎng)的甘草毛狀根經(jīng)過兩次繼代(MS培養(yǎng)基，溫度為25'C，轉(zhuǎn)速為100rpm的搖床上黑暗培養(yǎng))生長后，收集所有毛狀根，除去褐化死亡的毛狀根，其余毛狀根平均分配到300ral培養(yǎng)瓶里，每瓶毛狀根濕重為2g，各加入100ml含有不同濃度吐溫-80(0.01g/ml、0.02g/ml，0.03g/ral或0.04g/ml)的MS培養(yǎng)基，在與前面繼代培養(yǎng)相同條件下誘導處理6、12、24及36小時，以不含誘導子的MS培養(yǎng)液處理相同時間的毛狀根為對照(ck)。按照實施例1的步驟二的方法檢測處理后的甘草毛狀根及對照毛狀根的總黃酮含量，結(jié)果如表4、表5(其柱形圖為圖4、圖5)所示，結(jié)果表明(1)不同濃度的吐溫一80處理的毛狀根中，從0.01g/ml至0.04g/ml處理的總黃酮含量均有提高，尤其以濃度為0.02g/ml的吐溫_80處理24h的最高，比對照高47.30%(如表4、圖4所示，圖4中1為對照，2為0.01g/ml的吐溫—80處理，3為0.02g/ml的吐溫一80處理，4為0.03g/ml的吐溫一80處理，5為0.04g/ml的吐溫一80處理)表4.不同濃度吐溫處理后的甘草毛狀根的總黃酮含量<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>(2)以濃度為0.02g/ml的吐溫-80處理不同時間段的毛狀根中，從6h到36h處理的總黃酮含量均有提高，尤其以24h的最高，高于對照的49%(如圖5、表5所示)。<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>權利要求1、一種提高甘草毛狀根中次生代謝產(chǎn)物合成量的方法，是用可調(diào)節(jié)細胞滲透壓造成干旱脅迫的物質(zhì)處理液體培養(yǎng)基中的甘草毛狀根，得到次生代謝產(chǎn)物含量提高的甘草毛狀根。2、根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于所述可調(diào)節(jié)細胞滲透壓造成干旱脅迫的物質(zhì)為PEG和/或吐溫。3、根據(jù)權利要求2所述的方法，其特征在于所述PEG的處理濃度為0.02一O.08g/mL;所述吐溫的處理濃度為0.Ol—O.04g/mL。4、根據(jù)權利要求3所述的方法，其特征在于所述PEG的最佳處理濃度為0.02g/mL;所述吐溫的最佳處理濃度為0.02g/mL。5、根據(jù)權利要求4所述的方法，其特征在于所述可調(diào)節(jié)細胞滲透壓的物質(zhì)處理的時間為6—72小時，優(yōu)選為6—48小時。6、根據(jù)權利要求5所述的方法，其特征在于所述PEG單獨處理的時間為24-72小時，優(yōu)選為48小時；所述吐溫單獨處理的時間為6-36小時，優(yōu)選為24小時。7、根據(jù)權利要求6所述的方法，其特征在于所述液體培養(yǎng)基為MS液體培養(yǎng)基。8、根據(jù)權利要求7所述的方法，其特征在于所述甘草毛狀根是將甘草毛狀根的根尖部位接種于MS液體培養(yǎng)基中繼代培養(yǎng)2—4代得到。9、根據(jù)權利要求8所述的方法，其特征在于所述甘草毛狀根的根尖部位為自根尖尖部2-3cm的根尖；所述繼代培養(yǎng)每20天換一次培養(yǎng)基。10、根據(jù)權利要求1-9中任意一項所述的方法，其特征在于所述次生代謝產(chǎn)物為甘草黃酮。全文摘要本發(fā)明公開了一種提高甘草毛狀根中次生代謝產(chǎn)物合成量的方法。該方法，是用可調(diào)節(jié)細胞滲透壓造成干旱脅迫的物質(zhì)處理液體培養(yǎng)基中的甘草毛狀根，得到次生代謝產(chǎn)物含量提高的甘草毛狀根。所述可調(diào)節(jié)細胞滲透壓的物質(zhì)為PEG和/或吐溫。本發(fā)明的方法通過用可調(diào)節(jié)細胞滲透壓造成干旱脅迫的物質(zhì)處理甘草毛狀根實現(xiàn)提高毛狀根中次生代謝產(chǎn)物的含量，實驗證明，本發(fā)明的方法處理后得到的甘草毛狀根的總黃酮含量增加44％-55％。本發(fā)明的方法為利用甘草毛狀根培養(yǎng)體系來快速高效的獲得高產(chǎn)甘草有效次生代謝產(chǎn)物提供了新型途徑。文檔編號A01N31/00GK101263811SQ200810006938公開日2008年9月17日申請日期2008年1月25日優(yōu)先權日2007年2月8日發(fā)明者劉敬梅,驊周,張海超,毅李申請人:北京未名凱拓作物設計中心有限公司