專利名稱：一種旋覆花提取物及其組合物的制備方法及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及可通過任何一種本發(fā)明的方法獲得的旋覆花的乙醇提取物。例如，可通過煎煮法、浸漬法、滲漏法、或乙醇蒸汽蒸餾法等提取(或者浸出)旋覆花植物材料，得出浸出液。然后，任選地進(jìn)行濃縮、干燥、或者純化、或者它們的任何組合。
所得浸出物或者純化產(chǎn)物可進(jìn)一步配制成目的組合物，如藥物組合。
本發(fā)明的提取物中主要含有萜烯內(nèi)酯類成分，主要抗菌活性成分為大花旋覆花內(nèi)酯，根、莖、葉、花序、全草中大花旋覆花內(nèi)酯含量分別為0.08％、0.11％、0.22％、0.25％、0.19％。
本發(fā)明的提取物具有抑制植物病原真菌的活性，其可以用于制備防治植物真菌病害的農(nóng)藥。
本發(fā)明涉及含有本發(fā)明旋覆花乙醇提取物的組合物。優(yōu)選地，該組合物還含有溶劑及助劑。
在具體實(shí)施方案中，所述組合物是藥物組合物。
將本發(fā)明旋覆花乙醇提取物配制成目的組合物的方法是本領(lǐng)域已知的。根據(jù)不同的需要，本發(fā)明所屬領(lǐng)域技術(shù)人員可以選擇適當(dāng)?shù)闹鷦?、配制方法、劑型、單位劑量等?br> 本發(fā)明組合物可以含有適當(dāng)?shù)闹鷦⑤d體或溶劑?？梢圆捎弥扑庮I(lǐng)域公知的技術(shù)進(jìn)行制劑。
本發(fā)明藥物組合物可以采用多種劑型。
本發(fā)明藥物組合物可通過葉面噴霧施藥。劑量范圍可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員通過常規(guī)試驗(yàn)確定。
本發(fā)明涉及旋覆花乙醇提取物在制備用于防治植物真菌病害的藥物中的用途。
本發(fā)明涉及旋覆花植物材料或者其提取物(優(yōu)選乙醇提取物)用于生產(chǎn)可用于抑制植物病原真菌及防治植物真菌病害的藥物組合物的用途。
本發(fā)明涉及一種防治植物真菌病害的方法，包括在露地或保護(hù)地栽培條件下植物發(fā)病前或發(fā)病初在葉面噴施旋覆花提取物(優(yōu)選乙醇提取物)或旋覆花提取物組合物。實(shí)施例1 2005年8月從河北省承德市郊區(qū)采集盛花期的旋覆花根、莖、葉、花、全草(地上部分)，于室溫下陰干，粉碎至40目干粉。稱取旋覆花(I.japonica)和旋覆花(I.britannica)根、莖、葉、花序、全草干粉各1份，每份50g，按照干粉與溶劑比1:10(g/ml)分別加入95％的乙醇，振蕩提取(50℃、150r/m)3小時。抽濾，濾液減壓(60℃、0.1個大氣壓)濃縮得浸膏。實(shí)驗(yàn)共進(jìn)行3次。結(jié)果表明兩種旋覆花相同提取部位浸膏收率無顯著性差異(表1)，花序中浸膏收率最高，根及莖提取浸膏收率最低。
表1、旋覆花不同采收部位以95％乙醇提取浸膏回收率
實(shí)施例2 稱取旋覆花(Inula japonica)花序6份，每份1kg，加入95％乙醇10升，振蕩提取(50℃、150r/m)1、2、3、4、5、24小時。抽濾，濾液減壓(60℃、0.1個大氣壓)濃縮得95％乙醇提取浸膏52.2、66.1、75.4、77.2、77.9、80.9g，收率分別為5.22％、6.61％、7.54％、7.72％、7.79％、8.09％。稱取旋覆花(Inula britannica)花序6份，每份1千克，采用同樣方法提取得到95％乙醇提取浸膏收率分別為5.30％、6.60％、7.43％、7.69％、7.81％、8.13％。
表2、旋覆花花序提取不同時間的膏體收率
注試驗(yàn)重復(fù)3次，收率為3次重復(fù)的平均值。每列數(shù)值后帶有不同的字母表明數(shù)值之間差異顯著(p＝0.05)。下同。
結(jié)果表明兩種旋覆花以95％乙醇提取相同時間獲得的浸膏收率無顯著差異。提取3小時后，浸膏收率增長平緩(表2)。從經(jīng)濟(jì)角度考慮將3小時定為最佳提取時間。
實(shí)施例3 準(zhǔn)備旋覆花(Inula japonica)和旋覆花(Inula britannica)花序干粉各4份，每份50g，分別加入95％的乙醇振蕩提取1、2、3、4次(50℃、150r/m)，每次3小時。第1次干粉質(zhì)量(g)與溶劑體積(ml)比為1:10，第2、3、4次干粉質(zhì)量(g)與溶劑體積(ml)比為1:8。抽濾，合并濾液，濾液減壓(60℃、0.1個大氣壓)濃縮得浸膏。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。結(jié)果表明兩種旋覆花以95％乙醇提取相同次數(shù)獲得的浸膏收率無顯著差異，提取2—3次獲得的浸膏量較高(表3)。
表3、旋覆花花序以95％乙醇提取不同次數(shù)的膏體收率
實(shí)施例4 準(zhǔn)備旋覆花(I.japonica)和旋覆花(I.britannica)花序干粉各5份，每份50g，按照干粉與溶劑比1:10(g/ml)分別加入95％的乙醇，振蕩提取(150r/m)3小時，提取溫度分別設(shè)定為10℃、20℃、30℃、40℃、50℃。抽濾，濾液減壓(60℃、0.1個大氣壓)濃縮得浸膏。表明兩種旋覆花在相同溫度下提取的浸膏產(chǎn)量無顯著差異。在50℃條件下提取獲得的浸膏產(chǎn)量較高(表4)。
表4、旋覆花在不同溫度下以95％乙醇提取的膏體收率
綜合實(shí)施例1—4，確定提取工藝旋覆花根、莖、葉、花、全草等部位干粉均可采用95％的乙醇振蕩提取2次(50℃、150r/m)，每次3小時，2次提取干粉質(zhì)量(g)與溶劑體積(mL)比分別為1:10和1:8。合并2次提取液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上(60℃、0.1個大氣壓)濃縮至不再有溶劑滴出，得到浸膏。
實(shí)施例5 取按實(shí)施例1方法提取的兩種旋覆花(Inula japonica，Inula britannica)的乙醇提取浸膏少許，溶于乙醇中，進(jìn)行薄層層析比較。
層析板GF254硅膠板 展開劑條件氯仿:乙醚＝4:6(v/v) 顯色條件熒光顯色法，λ＝254nm，365nm. 碘熏法(I2) 層析結(jié)果表明兩種旋覆花植物乙醇提取物組成成分基本相同。另取標(biāo)準(zhǔn)旋覆花藥材1kg按實(shí)施例1方法制成對照藥材溶液，分別點(diǎn)在同一硅膠G254薄層板上展開。與對照藥材相比，呈相同斑點(diǎn)。
表5、兩種旋覆花花序的95％乙醇提取物TLC檢測的Rf值
實(shí)施例6 表6、對兩種旋覆花的95％乙醇提取物定性檢驗(yàn)
結(jié)果表明兩種旋覆花醇提物均含有生物堿、黃酮甙、多酚和鞣質(zhì)等化合物。
實(shí)施例7 菌絲生長速率法測定旋覆花(I.japonica)和旋覆花(I.britannica)花序的95％乙醇粗提物對黃瓜灰霉病菌菌絲生長的抑制作用。將兩種旋覆花粗提物以95％乙醇溶解，稀釋成100mg/mL的藥液。將PDA培養(yǎng)基倒入直徑9cm的培養(yǎng)皿中，待其凝固后在表面加入0.27mLl藥液，涂勻，風(fēng)干。每個平板中心接種一個菌餅，22℃培養(yǎng)5天，測量菌落生長直徑，并計(jì)算抑制率。
抑制生長百分率(％)＝(對照菌落直徑-處理菌落直徑)/對照菌落直徑×100％ 從表7可知，旋覆花(I.japonica)和旋覆花(I.britannica)花序的95％乙醇粗提物對黃瓜灰霉病菌菌絲生長有明顯的抑制作用，且差異不明顯。提取不同時間獲得旋覆花提取物的抑制作用之間無顯著差異。
實(shí)施例8 以菌絲生長速率法測定旋覆花(I.japonica)花序、根、莖、葉、全草的95％乙醇粗提物對黃瓜灰霉病菌菌絲生長的抑制作用。將兩種旋覆花粗提物以95％乙醇溶解，稀釋成100、50、25、12.5、6.25、3.125mg/mL的藥液，乙醇對照涂95％乙醇，設(shè)立空白對照。將PDA培養(yǎng)基倒入直徑9cm的培養(yǎng)皿中，待其凝固后在表面加入0.27ml藥液，涂勻，風(fēng)干。每個平板中心接種一個菌餅，22℃培養(yǎng)5天，測量菌落生長直徑，并計(jì)算抑制率。
表8的數(shù)據(jù)表明旋覆花(I.japonica)根、莖、葉、花、全草分別以95％乙醇提取的浸膏對黃瓜灰霉病菌菌絲生長均有抑制活性，其中花序提取物的抑制活性較高，根、莖、全草、葉提取物活性較低。
表7、兩種旋覆花花序的95％乙醇粗提物100mg/mL對黃瓜灰霉病菌菌絲生長的抑制作用
表8、旋覆花(I.japonica)各部位提取物浸膏對黃瓜灰霉病菌菌絲生長抑制作用
實(shí)施例9 瓊膠平板表面孢子萌發(fā)法測定旋覆花(I.japonica)和旋覆花(I.britannica)花序粗提物對黃瓜灰霉病菌分生孢子萌發(fā)的抑制作用。黃瓜灰霉病菌在PDA平板上22℃黑暗條件下培養(yǎng)7～10天后產(chǎn)孢。將分生孢子懸浮液調(diào)整至10×10倍顯微鏡下每視野50～100個分生孢子，4℃保存?zhèn)溆?。將兩種旋覆花粗提物以乙醇溶解，稀釋成100mg/mL的藥液。將水瓊培養(yǎng)基倒入φ6cm的培養(yǎng)皿中，待其凝固后，在其表面加入0.12mL的藥液，涂勻，晾干。每皿加入分生孢子懸浮液0.15mL后手持培養(yǎng)皿迅速轉(zhuǎn)動使分生孢子懸浮液分散開，20℃黑暗培養(yǎng)8～9小時后10×10倍顯微鏡下鏡檢，每皿6個視野。芽管長度大于分生孢子直徑視為萌發(fā)，計(jì)算兩種旋覆花花序乙醇粗提浸膏對分生孢子萌發(fā)的抑制率。從表9可知，旋覆花(Inula japonica)和旋覆花(Inula britannica)花序的95％乙醇粗提物對黃瓜灰霉病菌分生孢子萌發(fā)有明顯的抑制作用，且差異不明顯。提取不同時間獲得旋覆花提取物的抑制作用之間無顯著差異。
表9、兩種旋覆花花序粗提物對黃瓜灰霉病菌分生孢子萌發(fā)的抑制作用
實(shí)施例10 以瓊膠平板表面孢子萌發(fā)法測定旋覆花(Inula japonica)花序、根、莖、葉、全草的95％乙醇粗提物對黃瓜灰霉病菌分生孢子萌發(fā)的抑制作用。黃瓜灰霉病菌在PDA平板上22℃黑暗條件下培養(yǎng)7～10天后產(chǎn)孢。將分生孢子懸浮液調(diào)整至10×10倍顯微鏡下每視野50～100個分生孢子，4℃保存?zhèn)溆?。將兩種旋覆花粗提物以乙醇溶解，稀釋成100、50、25、12.5、6.25、3.125mg/mL的藥液。將水瓊培養(yǎng)基倒入直徑6cm的培養(yǎng)皿中，待其凝固后，在其表面加入0.12mL的藥液，涂勻，晾干。每皿加入分生孢子懸浮液0.15mL后手持培養(yǎng)皿迅速轉(zhuǎn)動使分生孢子懸浮液分散開，20℃黑暗培養(yǎng)8～9小時后10×10倍顯微鏡下鏡檢，每皿6個視野。芽管長度大于分生孢子直徑視為萌發(fā)，計(jì)算兩種旋覆花花序乙醇粗提浸膏對分生孢子萌發(fā)的抑制率。從表10可知，旋覆花(Inula japonica)根、莖、葉、花、全草分別以95％乙醇提取的浸膏對黃瓜灰霉病菌分生孢子萌發(fā)均有抑制作用，其中花序提取物抑制活性較高，莖提取物活性最低。旋覆花提取物對分生孢子萌發(fā)的抑制作用比對菌絲生長的抑制作用強(qiáng)。
表10、旋覆花(Inula japonica)各部位95％乙醇提取物抑制黃瓜灰霉病菌分生孢子萌發(fā)
實(shí)施例11 盆栽幼苗法測定旋覆花(Inula japonica)各部位的95％乙醇提取物對黃瓜灰霉病菌的抑制作用。將直徑6cm的營養(yǎng)缽裝入一定量的蛭石，每盆播入一粒經(jīng)過催芽的“長春密刺”黃瓜種子，溫室內(nèi)培養(yǎng)約6～8d至兩片子葉完全展開，選出長勢較好的黃瓜小苗，借助喉頭噴霧器，將對照及不同濃度的藥劑按清水、95％乙醇、旋覆花根、莖、葉、花序、全草提取物不同濃度的95％乙醇稀釋液(100、50、25、12.5、6.25、3.125mg/mL)的順序分別噴至黃瓜葉片上，每濃度5株黃瓜苗(10片子葉)，每株噴0.6mL，自然晾干后，用打孔器在培養(yǎng)黃瓜灰霉菌的PDA平板上菌落外圍打0.5cm菌餅。用接種針把菌餅接于黃瓜子葉上，每片子葉接一個菌餅，菌面朝下，放入濕潤的塑料盒中，保鮮膜封口保濕，20～23℃培養(yǎng)3～4天后，觀察灰霉病菌在黃瓜子葉上的發(fā)病面積，記錄病情，并計(jì)算病情指數(shù)及相對防效(％)。
病級分級標(biāo)準(zhǔn)如下0級無?。?級病斑面積不超過整個葉片的10％；3級病斑面積達(dá)到整個葉片的11％-25％；5級病斑面積達(dá)到整個葉片的26％-50％；7級病斑面積達(dá)到整個葉片的51％-75％；9級病斑面積占整個葉片面積76％以上。
病情指數(shù)＝∑(各級病葉數(shù)×對應(yīng)發(fā)病級數(shù))×100/(調(diào)查總?cè)~數(shù)×最高發(fā)病級數(shù)) 防治效果＝[(對照病情指數(shù)-處理病情指數(shù))/對照病情指數(shù)]×100％ 表11、旋覆花(Inula japonica)各部位提取物浸膏對黃瓜幼苗上灰霉病菌抑制作用
從表11可知，旋覆花(Inula japonica)根、莖、葉、花、全草的95％乙醇提取物在活體上均表現(xiàn)出明顯的抑菌活性。旋覆花根、莖、葉、花、全草分別以95％乙醇提取的浸膏中，花序提取物在黃瓜子葉上對灰霉病菌抑制活性較高，莖提取物活性最低。
實(shí)施例12 旋覆花(Inula japonica)花序的95％乙醇提取浸膏的萃取組分對黃瓜灰霉病菌的抑制作用。95％乙醇粗提物浸膏按1:10加入蒸餾水(w/v)，配成懸浮液，用石油醚、氯仿、乙酸乙酯和水飽和正丁醇順次萃取，得到石油醚相、氯仿相、乙酸乙酯相、正丁醇相和水相，減壓濃縮至浸膏狀，4℃保存?zhèn)溆?。將浸膏?5％乙醇溶解稀釋成系列濃度。以菌落生長速率法測定各萃取組分對黃瓜灰霉病菌的菌絲生長的抑制作用。
結(jié)果表明旋覆花花序的95％乙醇提取物分別以正丁醇、乙酸乙酯、氯仿和石油醚萃取的組分明顯地抑制黃瓜灰霉病菌菌絲生長。其中氯仿相和石油醚相的組分抑菌活性較高。其次是正丁醇相和乙酸乙酯相的組分。水相的組分抑菌活性最差。
表12、旋覆花(I.japonica)花序各萃取組分對黃瓜灰霉病菌菌絲生長的抑制作用
實(shí)施例13 以菌落生長法測定旋覆花(Inula japonica)根、莖、葉、花、全草的95％乙醇提取物對黃瓜炭疽病菌的抑制作用。從表13可知，旋覆花各部位提取物均對黃瓜炭疽病菌菌絲生長具有抑制作用，其中花序的95％乙醇提取物的抑制作用最強(qiáng)，其次是葉的95％乙醇提取物。
表13、旋覆花(I.japonica)各部位的95％乙醇提取物抑制黃瓜炭疽病菌菌絲生長
實(shí)施例14 盆栽幼苗法測定旋覆花(Inula japonica)的95％乙醇提取物對黃瓜白粉病菌的抑制作用。將直徑6cm的營養(yǎng)缽裝入一定量的蛭石，每盆播入一粒催芽的“長春密刺”黃瓜種子，溫室內(nèi)培養(yǎng)6～8天至兩片子葉完全展開。從溫室里選出長勢較好的黃瓜小苗，用POTTER噴霧塔，將對照及不同濃度的藥劑按清水、95％乙醇、旋覆花根、莖、葉、花序、全草提取物不同濃度的95％乙醇稀釋液(100、50、25、12.5、6.25、3.125mg/mL)的順序噴至黃瓜葉片上，每濃度5株黃瓜苗(10片子葉)，每株噴2mL。自然晾干后，用喉頭噴霧器噴霧接種3mL分生孢子懸浮液(80～100分生孢子/10×10倍視野)，放入塑料盒中用塑料薄膜密封，24℃保濕培養(yǎng)24小時后揭膜，培養(yǎng)8～10天后調(diào)查發(fā)病。計(jì)算病情指數(shù)、相對防效。
表14、旋覆花(Inula japonica)各部位的95％乙醇提取物浸膏對黃瓜白粉病菌抑制作用
結(jié)果表明旋覆花花序、根、莖、葉、全草的95％乙醇提取物對黃瓜植株上的白粉病菌具有很強(qiáng)的抑制作用，比在黃瓜子葉上對灰霉病菌的抑制作用強(qiáng)。其中花序的提取物抑制作用最強(qiáng)。
實(shí)施例15 盆栽幼苗法測定旋覆花(I.japonica)花序的95％乙醇提取物各萃取組分對黃瓜白粉病菌的抑制作用。95％乙醇粗提浸膏按1:10(浸膏/蒸餾水，w/v)加入蒸餾水，配成懸浮液，用石油醚、氯仿、乙酸乙酯和水飽和正丁醇順次萃取，得到石油醚相、氯仿相、乙酸乙酯相、正丁醇相和水相，減壓濃縮至浸膏狀。將石油醚、氯仿、乙酸乙酯和水飽和正丁醇順次萃取的組分加入95％乙醇溶解，稀釋成不同濃度的藥液(100、50、25、12.5、6.25、3.125mg/mL)。其他操作步驟同實(shí)施例14。結(jié)果表明旋覆花(Inula japonica)花序的95％乙醇提取物經(jīng)過石油醚、氯仿、乙酸乙酯和水飽和正丁醇順次萃取后，氯仿相和石油醚相中的組分對黃瓜白粉病菌具有很強(qiáng)的抑制作用，超過萃取前的粗提物的抑菌活性，其次是乙酸乙酯相中的組分。水相及正丁醇相中的組分抑菌作用較弱。抑菌物主要存在于極性較弱的溶劑萃取相中。
表15、旋覆花(I.japonica)花序各萃取組分對黃瓜幼苗白粉病菌抑制作用
實(shí)施例16 脫葉法測定旋覆花(I.japonica)花序、根、莖、葉、全草的95％乙醇提取物對黃瓜霜霉病菌的抑制作用。在溫室盆栽黃瓜植株上摘下頂部向下第三、四片葉。按清水、95％乙醇、旋覆花根、莖、葉、花序、全草提取物不同濃度的95％乙醇稀釋液(3.125、6.25、12.5、25、50mg/mL)的順序用POTTER噴霧塔(壓力15kp，沉降30s)分別噴霧至黃瓜葉片背面。每濃度3片葉，每片葉噴藥1mL。自然晾干后，用喉頭噴霧器接種接種孢子囊懸浮液(1×105孢子囊/10×10倍視野)，噴勻即可。置于直徑12cm鋪有濕濾紙的培養(yǎng)皿中，葉柄用濕脫脂棉包裹，在每天18～22℃、16小時光照/8小時黑暗條件下培養(yǎng)7天。調(diào)查發(fā)病情況，計(jì)算病情指數(shù)、相對防效。
表16、旋覆花(Inula japonica)各部位的95％乙醇提取物對黃瓜霜霉病菌的抑制作用
結(jié)果表明旋覆花(I.japonica)花序、根、莖、葉、全草的95％乙醇提取物對黃瓜植株上的霜霉病菌具有很強(qiáng)的抑制作用，比在黃瓜子葉上對霜霉病菌的抑制作用強(qiáng)。其中花序的提取物抑制作用最強(qiáng)，其次是全草的提取物，再次是葉片的提取物。根和莖的提取物抑菌作用較差。
實(shí)施例17 脫葉法測定旋覆花(I.japonica)花序的95％乙醇提取物的不同溶劑萃取組分對黃瓜霜霉病菌的抑制作用。95％乙醇粗提浸膏按1:10(浸膏/蒸餾水，w/v)加入蒸餾水，配成懸浮液，用石油醚、氯仿、乙酸乙酯和水飽和正丁醇順次萃取，得到石油醚相、氯仿相、乙酸乙酯相、正丁醇相和水相，減壓濃縮至浸膏狀。將各萃取組分加入95％乙醇溶解，稀釋成不同濃度的藥液(20、10、5、2.5、1.25mg/mL)。在溫室盆栽黃瓜植株上摘下頂部向下第三、四片葉。按清水、95％乙醇、旋覆花根、莖、葉、花序、全草提取物不同濃度的95％乙醇稀釋液(1.25、2.5、5、10、20mg/mL)的順序用POTTER噴霧塔(壓力15kp，沉降30s)分別噴霧至黃瓜葉片背面。每濃度3片葉，每片葉噴藥1mL。自然晾干后，用喉頭噴霧器接種黃瓜霜霉病菌孢子囊懸浮液(1×105孢子囊/10×10倍視野)，噴勻即可。置于直徑12cm鋪有濕濾紙的培養(yǎng)皿中，葉柄用濕脫脂棉包裹，在每天18～22℃、16小時光照/8小時黑暗條件下培養(yǎng)7天。調(diào)查發(fā)病情況，計(jì)算病情指數(shù)、相對防效。
表17、旋覆花(Inula japonica)花序各萃取組分對黃瓜霜霉病菌抑制作用
結(jié)果表明旋覆花(I.japonica)花序的95％乙醇提取物經(jīng)過石油醚、氯仿、乙酸乙酯和水飽和正丁醇順次萃取后，氯仿相和石油醚相中的組分對黃瓜霜霉病菌具有很強(qiáng)的抑制作用，超過萃取前的粗提物的抑菌活性，其次是乙酸乙酯相中的組分。水相及正丁醇相中的組分抑菌作用較弱。抑菌物主要存在于極性較弱的溶劑萃取相中。
實(shí)施例18 以菌落生長速率法測定旋覆花(I.japonica)根、莖、葉、花、全草的95％乙醇提取物對番茄早疫病菌的抑制作用。
表18、旋覆花(I.japonica)各部位提取物浸膏對番茄早疫病菌菌絲生長抑制作用
從表18可知，旋覆花各部位提取物均對番茄早疫病菌菌絲生長具有抑制作用，其中花序的95％乙醇提取物的抑制作用最強(qiáng)，其次是葉的95％乙醇提取物，再次是全草的95％乙醇提取物。
實(shí)施例19 測定旋覆花(I.japonica)花序的95％乙醇提取浸膏的萃取組分對番茄早疫病菌的抑制作用。95％乙醇粗提浸膏按1:10(浸膏/蒸餾水，w/v)加入蒸餾水，配成懸浮液，用石油醚、氯仿、乙酸乙酯和水飽和正丁醇順次萃取，得到石油醚相、氯仿相、乙酸乙酯相、正丁醇相和水相，減壓濃縮至浸膏狀。將浸膏用95％乙醇溶液稀釋成系列濃度的藥液。參照實(shí)施例2，以菌落生長速率法測定旋覆花花序各萃取組分對番茄早疫病菌的抑制作用。結(jié)果表明旋覆花花序的95％乙醇提取物分別以正丁醇、乙酸乙酯、氯仿和石油醚萃取的組分對番茄早疫病菌菌絲生長有明顯的抑制作用。按照抑菌作用從強(qiáng)到弱的順序排列氯仿相、石油醚相、乙酸乙酯相、水相、正丁醇相。
表19、旋覆花(I.japonica)花序各萃取組分對番茄早疫病菌菌絲生長的抑制作用
實(shí)施例20 以菌落生長速率法測定旋覆花(I.japonica)根、莖、葉、花、全草的95％乙醇提取物對番茄葉霉病菌的抑制作用。從表20可知，旋覆花各部位提取物均對番茄葉霉病菌具有抑制作用，其中花序的95％乙醇提取物的抑制作用最強(qiáng)，其次是葉的95％乙醇提取物。
表20、旋覆花(I.japonica)各部位提取物浸膏對番茄葉霉病菌菌絲生長抑制作用
實(shí)施例21 測定旋覆花(I.japonica)花序粗提物各萃取組分對番茄晚疫病菌游動孢子釋放的抑制作用。分別取旋覆花花序粗提物各萃取組分浸膏，以極少量95％乙醇溶解后加入蒸餾水配成50mg/ml的溶液，分別用蒸餾水稀釋得系列濃度(50、25、12.5、6.25、3.125mg/ml)的藥液。最高濃度處理中乙醇與蒸餾水體積比為1:20，設(shè)置95％乙醇對照。用蒸餾水將番茄葉片上新鮮孢子囊沖下，過濾后用蒸餾水將懸浮液調(diào)至10×10倍顯微鏡下每視野30～50個孢子囊。將孢子囊懸浮液與旋覆花花序粗提物各萃取組分的系列濃度溶液按1:1體積比混合，黑暗10℃保存8小時，促使游動孢子釋放。鏡檢孢子囊數(shù)、空孢子囊數(shù)，計(jì)算空孢囊率、孢子囊釋放游動孢子的百分率，每濃度3個重復(fù)，每濃度6個視野，計(jì)算萃取組分不同濃度藥液對游動孢子釋放的抑制率。結(jié)果表明旋覆花花序的95％乙醇提取物分別以正丁醇、乙酸乙酯、氯仿和石油醚萃取的組分對番茄晚疫病菌孢子囊釋放游動孢子有明顯的抑制作用。按照抑菌作用從強(qiáng)到弱的順序排列乙酸乙酯相、氯仿相、石油醚相、正丁醇相、水相。抑菌物主要存在于極性較弱的溶劑萃取相中。
表21、旋覆花(I.japonica)花序各萃取組分抑制番茄晚疫病菌游動孢子釋放
實(shí)施例22 測定旋覆花(Inula japonica)花序粗提物萃取組分對番茄晚疫病菌的孢子囊萌發(fā)的抑制作用。旋覆花花序粗提物萃取組分浸膏的溶解及稀釋均用95％乙醇，濃度設(shè)置為50、25、12.5、6.25、3.125mg/ml，將黑麥瓊脂培養(yǎng)基熔化倒入直徑6cm的培養(yǎng)皿中，待其凝固后，在平板表面加入藥液，0.12mL/皿，對照加入等量的95％乙醇溶液，用涂棒涂勻，在無菌條件下使溶劑完全揮發(fā)掉。參照實(shí)施例25，配制孢子囊懸浮液(10×10倍顯微鏡下每視野30～50個孢子囊)，向涂藥平板中加入孢子囊懸浮液，0.15mL/皿，蕩勻，22℃黑暗培養(yǎng)24小時。鏡檢孢子囊總數(shù)、萌發(fā)孢子囊數(shù)，計(jì)算孢子囊萌發(fā)率。每濃度4個重復(fù)，每重復(fù)10個視野。芽管長度大于孢子囊直徑視為萌發(fā)。計(jì)算各萃取組分不同濃度藥液對孢子囊直接萌發(fā)的抑制率。結(jié)果表明旋覆花花序的95％乙醇提取物分別以正丁醇、乙酸乙酯、氯仿和石油醚萃取的組分對番茄晚疫病菌孢子囊萌發(fā)有明顯的抑制作用。按照抑菌作用從強(qiáng)到弱的順序排列乙酸乙酯相、氯仿相、石油醚相、正丁醇相、水相。抑菌物主要存在于極性較弱的溶劑萃取相中。
表22、旋覆花(I.japonica)花部各萃取組分對番茄晚疫病菌孢子囊萌發(fā)的抑制作用
實(shí)施例23 采用凹玻片法測定旋覆花(I.japonica)花序粗提物萃取組分對番茄晚疫病菌休止孢萌發(fā)抑制作用。浸膏的溶解及稀釋均用95％乙醇，濃度為50、25、12.5、6.25、3.125mg/ml，將系列濃度藥液緩慢地加入到凹玻片的凹槽中，10μL/槽，對照加入等量的95％乙醇溶液。待溶劑完全揮發(fā)后，每槽加入孢子囊懸浮液10μL，將凹玻片平放于墊濕濾紙的塑料盒中，在10℃黑暗條件下培養(yǎng)12～13小時，鏡檢休止孢總數(shù)、萌發(fā)休止孢數(shù)(10×10倍顯微鏡)，計(jì)算休止孢萌發(fā)率。每濃度4個重復(fù)，每重復(fù)10個視野，芽管長于休止孢直徑視為萌發(fā)。計(jì)算萃取組分不同濃度藥液對休止孢萌發(fā)的抑制率。結(jié)果表明旋覆花花序的95％乙醇提取物分別以正丁醇、乙酸乙酯、氯仿和石油醚萃取的組分對番茄晚疫病菌休止孢萌發(fā)有明顯的抑制作用。按照抑菌作用從強(qiáng)到弱的順序排列乙酸乙酯相、氯仿相、石油醚相、正丁醇相、水相。抑菌物主要存在于極性較弱的溶劑萃取相中。
表23、旋覆花(I.japonica)花部各萃取組分對番茄晚疫病菌休止孢萌發(fā)的抑制作用
實(shí)施例24 采用菌絲生長速率法測定旋覆花(I.japonica)各部位95％乙醇提取浸膏對馬鈴薯晚疫病菌菌絲生長抑制作用。將黑麥瓊脂培養(yǎng)基(黑麥60g，蔗糖20g，瓊脂15g，蒸餾水1000mL)熔化后倒入φ9cm的培養(yǎng)皿中，待其凝固后在平板表面分別加入不同濃度的各提取物乙醇稀釋液，0.27mL/皿，每個濃度重復(fù)3次，乙醇對照加入等量的95％乙醇溶液，設(shè)空白對照。藥液或95％乙醇用涂棒涂勻，使溶劑揮發(fā)掉，在平板中央接種馬鈴薯晚疫病菌菌餅(φ0.5cm)，以封口膜封口。在18℃黑暗條件下培養(yǎng)至空白對照接近長滿平板時，測量菌落直徑，計(jì)算抑制率。
表24、旋覆花(I.japonica)各部位95％乙醇提取物抑制馬鈴薯晚疫病菌菌絲生長
結(jié)果表明旋覆花根、莖、葉、花、全草的95％乙醇提取物對馬鈴薯晚疫病菌菌絲生長有明顯的抑制作用，其中花序提取物抑菌活性最高，其次為全草提取物，再次為葉片提取物。
與對其它供試植物病原真菌的抑菌活性類似，旋覆花根或莖的提取物抑菌活性較差。
實(shí)施例25 脫葉法測定旋覆花(I.japonica)各部位粗提物對番茄晚疫病的防治效果。選擇長勢一致、大小均勻的番茄葉片，用POTTER噴霧塔在葉背噴藥(噴藥量1mL/3片；壓力15lb/in2；沉降30s)，對照噴等量的95％乙醇溶液。待溶劑完全揮干后，噴霧接種番茄晚疫病菌孢子囊懸浮液(10×10倍顯微鏡，30～50孢子囊/視野)，葉背面朝上放入培養(yǎng)皿中，保濕培養(yǎng)3～4天(18℃，光照16小時、黑暗8小時交替)。調(diào)查發(fā)病情況，計(jì)算病情指數(shù)、相對防效。
表25、旋覆花(I.japonica)各部位的95％乙醇提取浸膏對番茄晚疫病菌抑制作用
結(jié)果表明旋覆花根、莖、葉、花序及全草的95％乙醇提取浸膏對番茄葉片上的晚疫病菌有明顯的抑制作用。按照抑菌作用從強(qiáng)到弱的順序排列花序、全草、葉、根、莖。
實(shí)施例26 采用脫葉法測定旋覆花各部位粗提物及花序粗提物萃取組分對番茄晚疫病的抑制作用。選擇長勢一致、大小均勻的番茄葉片，用POTTER噴霧塔在葉背噴藥(噴藥量1mL/3片，壓力15lb/in2，沉降時間30s)，對照噴等量的95％乙醇。待溶劑完全揮干后，噴霧接種番茄晚疫病菌孢子囊懸浮液(10×10倍顯微鏡，30～50孢子囊/視野)，葉背面朝上放入培養(yǎng)皿中，保濕培養(yǎng)3～4天(18℃，光照16小時、黑暗8小時交替)。調(diào)查發(fā)病情況，計(jì)算病情指數(shù)、相對防效。
表26、旋覆花花序各萃取組分對番茄離體葉片上晚疫病菌抑制作用
結(jié)果表明旋覆花花序的95％乙醇提取物分別以正丁醇、乙酸乙酯、氯仿和石油醚萃取的組分對番茄晚疫病菌休止孢萌發(fā)有明顯的抑制作用。乙酸乙酯相、氯仿相、石油醚相中的組分抑制作用相當(dāng)，明顯比正丁醇相和水相中的組分抑菌作用強(qiáng)。抑菌物主要存在于極性較弱的溶劑萃取相中。
實(shí)施例27 采用盆栽植株法測定旋覆花(I.japonica)花序粗提物萃取組分對番茄晚疫病的防治效果。配制濃度為25mg/mL的旋覆花花序各萃取組分藥液，用喉頭噴霧器噴至生長一致的盆栽植株上，每處理4個重復(fù)，每植株噴藥量10mL，對照噴等量的95％乙醇。24小時后噴霧接種番茄晚疫病菌孢子囊懸浮液(50～100個孢子囊/視野)，流失為度，放入塑料盒于培養(yǎng)室(18～20℃，光照16小時、黑暗8小時交替)中保濕24小時后拆封，再培養(yǎng)3～4天后調(diào)查病情，并計(jì)算各萃取組分不同濃度藥液的病情指數(shù)和防治效果。結(jié)果表明旋覆花花序的95％乙醇提取物分別以正丁醇、乙酸乙酯、氯仿和石油醚萃取的組分(25mg/mL稀釋液)對番茄晚疫病有明顯的防效。乙酸乙酯相、氯仿相、石油醚相中的防效無顯著差異，明顯比正丁醇相和水相中的組分防效高(表27)。
表27、旋覆花(I.japonica)花序各萃取組分對番茄晚疫病防治作用
實(shí)施例28 菌絲生長速率法測定旋覆花(I.japonica)花序的95％乙醇提取物的各萃取組分對馬鈴薯晚疫病菌抑菌活性。旋覆花花序的95％乙醇粗提浸膏按1:10(浸膏/蒸餾水，w/v)加入蒸餾水，配成懸浮液，用石油醚、氯仿、乙酸乙酯和水飽和正丁醇順次萃取，得到石油醚相、氯仿相、乙酸乙酯相、正丁醇相和水相，減壓濃縮至浸膏狀。旋覆花花序提取物以石油醚、氯仿、乙酸乙酯和水飽和正丁醇順次萃取的組分，加入95％乙醇溶解，稀釋成不同濃度的藥液(50、25、12.5、6.25、3.125mg/mL)。將黑麥瓊脂培養(yǎng)基(黑麥60g，蔗糖20g，瓊脂15g，蒸餾水1000mL)熔化后倒入直徑9cm的培養(yǎng)皿中，待其凝固后在平板表面分別加入不同濃度的各藥液，0.27mL/皿，每濃度重復(fù)3次，對照加入等量的95％乙醇溶液，用涂棒涂勻，使溶劑揮發(fā)完全，接種直徑0.5cm的馬鈴薯晚疫病菌菌餅于平板中央，封口膜封口。在18℃黑暗條件下培養(yǎng)至空白對照接近長滿平板時，測量菌落直徑，計(jì)算抑制率。
結(jié)果表明旋覆花(I.japonica)花序的95％乙醇提取物分別以正丁醇、乙酸乙酯、氯仿和石油醚萃取的組分對馬鈴薯晚疫病菌菌絲生長有明顯的抑制作用。按照抑菌作用從強(qiáng)到弱的順序排列氯仿相、石油醚相、乙酸乙酯相、正丁醇相、水相。抑菌物主要存在于極性較弱的溶劑萃取相中。
表28、旋覆花(I.japonica)花序提取浸膏各萃取組分抑制馬鈴薯晚疫病菌菌絲生長
實(shí)施例29 以菌落生長法測定旋覆花(I.japonica)根、莖、葉、花、全草的95％乙醇提取物對小麥紋枯病菌菌絲生長的抑制作用。結(jié)果表明旋覆花根、莖、葉、花、全草的95％乙醇提取物對小麥紋枯病菌菌絲生長均有一定的抑制作用，其中花序的95％乙醇提取物的抑制作用最強(qiáng)，其次是葉的95％乙醇提取物，再次是葉片的提取物。
表29、旋覆花(I.japonica)各器官提取物對小麥紋枯病菌菌絲生長的抑制作用
實(shí)施例30 旋覆花花序粗提物的氯仿相萃取組分經(jīng)柱層析分離后干柱切割柱9種組分及分離化合物抗菌活性測定。采用實(shí)施例23中的凹玻片法測定萃取物經(jīng)柱層析分離組分及兩種分離化合物對番茄晚疫病菌休止孢萌發(fā)的抑制作用，采用實(shí)施例24中所述的菌落直徑法測定萃取物經(jīng)柱層析分離組分及兩種分離化合物對馬鈴薯晚疫病菌菌絲生長的抑制作用。從表30可知旋覆花花序粗提物的氯仿相萃取組分經(jīng)柱層析分離后干柱切割柱9種組分中，組分D、E對番茄晚疫病菌休止孢萌發(fā)的抑制作用最強(qiáng)，達(dá)到100％，組分D對馬鈴薯晚疫病菌菌絲生長的抑制作用最強(qiáng)，達(dá)到81.73％。
從表31、表32及表33可知，旋覆花乙醇提取物中主要抗菌活性成分為大花旋覆花內(nèi)酯。
表30旋覆花花序粗提物的氯仿相萃取組分經(jīng)柱層析分離后干柱切割柱9種組分對番茄晚疫病菌休止孢萌發(fā)及馬鈴薯晚疫病菌菌絲生長的抑制作用
注番茄晚疫病菌休止孢萌發(fā)濃度為1mg/mL。馬鈴薯晚疫病菌菌絲生長濃度為10mg/mL。萃取浸膏重量為40g。
表31、旋覆花提取物中分離化合物對馬鈴薯晚疫病菌菌絲生長抑制作用
注各化合物濃度均為1mg/mL。上述數(shù)據(jù)為3次重復(fù)的平均值，同列中數(shù)據(jù)后含有相同的字母表明數(shù)據(jù)之間差異不顯著(p＝0.05)。
表32、旋覆花提取物中分離化合物對番茄晚疫病菌抑制作用(脫葉法)
注各化合物測試濃度均為1mg/mL。上述數(shù)據(jù)為3次重復(fù)的平均值，同列中數(shù)據(jù)后含有相同的字母表明數(shù)據(jù)之間差異不顯著(p＝0.05)。
表33、旋覆花提取物中分離化合物對番茄晚疫病菌休止孢萌發(fā)抑制作用
注各化合物測試濃度均為0.1mg/mL。上述數(shù)據(jù)為3次重復(fù)的平均值，同列中數(shù)據(jù)后含有相同的字母表明數(shù)據(jù)之間差異不顯著(p＝0.05)。
實(shí)施例31 旋覆花乙醇提取物中成分的分離及及鑒別。旋覆花(Inula japonica)花序干粉采用95％的乙醇振蕩提取2次(50℃、150r/m)，每次3小時，提取液減壓濃縮至不再有溶劑滴出，獲得的浸膏按1:10加入蒸餾水(w/v)，配成懸浮液，依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯和水飽和正丁醇萃取，得到石油醚相、氯仿相、乙酸乙酯相、正丁醇相和水相，減壓濃縮至浸膏狀，4℃保存?zhèn)溆?。將五種萃取物(浸膏)用95％乙醇溶解稀釋成系列濃度，以菌落生長速率法測定各萃取組分對黃瓜灰霉病菌的菌絲生長的抑制作用。結(jié)果表明旋覆花花序的95％乙醇提取物分別以正丁醇、乙酸乙酯、氯仿和石油醚萃取的組分明顯地抑制黃瓜灰霉病菌菌絲生長，尤其是氯仿和石油醚的組分抑菌活性較高，其次是正丁醇相和乙酸乙酯相的組分。水相的組分抑菌活性最差。對氯仿萃取物進(jìn)行常壓切割柱層析分離。
一級柱層析分離采用常壓切割柱層析分離，柱長度為80cm，直徑6cm，共用200～300目硅膠840g，上樣40g，以氯仿乙醚＝4:6洗脫。等體積150mL收集餾分，共收集4份，待柱中樣品明顯分成理想的幾段后，停止加溶劑，待溶劑流干后，將柱內(nèi)硅膠按2cm等體積切割，共分成32段，連同所收集4份餾分共36組。TLC檢測，餾分1～6中化學(xué)成分Rf值較接近，合并為餾分A；餾分7～10中化學(xué)成分Rf值較接近，合并為餾分B；餾分11～12中成分較接近，合并為餾分C；餾分13～26中成分較接近，合并為餾分D；餾分27～29成分較接近，合并為餾分E；餾分30為餾分F；餾分31～32成分較接近合并為餾分G；所收集的4份較接近，合并為餾分H。測定了8個餾分的相對質(zhì)量及對跟蹤菌的生物活性。
對抑菌活性較高的餾分D進(jìn)行二級常壓柱層析分離濕法裝柱，柱長為80cm，直徑6cm，共用100～200目硅膠630g，上樣15g，以石油醚乙醚＝1:9洗脫。等體積150mL收集，共得123個餾分，TLC檢測，餾分1～36中成分Rf值較接近，合并為Da；餾分37～123中成分Rf值接近，合并為Db；換用溶劑乙醚乙酸乙酯＝1:19洗脫，等體積150mL收集，共得19個餾分，TLC檢測，此19個餾分的成分接近，合并為Dc。
餾分Db室溫下放置過夜瓶壁即有無色條狀晶體出現(xiàn)，回收部分溶劑后有大量結(jié)晶析出，過濾，乙醇重結(jié)晶后，得到晶體化合物J1，真空干燥箱干燥后保存。組分Dc濃縮后得到淡黃色固體，過濾后以正丁醇重結(jié)晶并以甲醇反復(fù)多次洗滌，得到無色顆粒狀結(jié)晶化合物J2。
經(jīng)熔點(diǎn)測定儀測定化合物Db的熔點(diǎn)為124℃～126℃，紫外分光光度計(jì)最大吸收波長為209nm。由狀態(tài)及所得參數(shù)與相關(guān)文獻(xiàn)比較，初步估計(jì)化合物Db為1-O-乙酰大花旋覆花內(nèi)酯(以下簡稱大花旋覆花內(nèi)酯)。
不加校正因子的主成分自身對照法測大花旋覆花內(nèi)酯純度稱取少量化合物Db，以色譜純甲醇配制成0.002mg/mL和0.2mg/mL的溶液，作為對照品溶液和供試品溶液。
色譜條件Hypersil-C18色譜柱(250mm×4.6mm i.d.，5μm)；柱溫25℃；流動相乙腈-水(體積比為3367)；流速1mL/min；檢測波長209nm。
精密量取化合物Db溶液20μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，調(diào)節(jié)縱軸單位使主峰峰高約為滿量程的1/5；再取供試品溶液和對照品溶液各20μL，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖至主成分峰保留時間的2倍。結(jié)果略去溶劑峰，雜質(zhì)峰面積總和小于主峰面積的0.5％，可知化合物Db純度高于99.5％。
化合物Db結(jié)構(gòu)鑒定；化合物經(jīng)H1-NMR、C13-NMR及紅外分析得此化合物分子式為C17H2405，與文獻(xiàn)比較確定為1-O-乙酰大花旋覆花內(nèi)酯。
對石油醚進(jìn)行加壓柱層析分離。取石油醚萃取物65g，用石油醚-乙酸乙酯(10:1～0:10)進(jìn)行梯度洗脫，將洗脫液合并成3部分，濃縮。第1部分經(jīng)過重結(jié)晶得到化合物I(451mg)；第2部分經(jīng)過反復(fù)柱層析和制備液相色譜分離，得到化合物II、V、VI。第三部分經(jīng)制備液相制備得到化合物III、IV。經(jīng)過熔點(diǎn)測定、核磁共振、質(zhì)譜、紅外光譜、紫外光譜分析及對照文獻(xiàn)，分別鑒別出化合物I、II、III、IV、V、VI為蒲公英甾醇乙酸酯、β-香樹脂、β-扶桑甾醇、豆甾醇、羽扇豆醇、ψ-蒲公英甾醇。
實(shí)施例32 旋覆花乙醇提取物中根、莖、葉、花序、全草中大花旋覆花內(nèi)酯的含量測定。采用高壓液相色譜法-外標(biāo)法。分別稱取旋覆花根、莖、葉、花序、全草的乙醇粗提物浸膏少許，以甲醇配成10mg/mL的溶液，用0.45μm的微孔濾膜濾過，同樣配制濃度為0.2mg/mL的1-氧-乙酰大花旋覆花內(nèi)酯溶液，備用。在上述色譜條件下，取對照品溶液和粗提物溶液各20μL，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖及峰面積數(shù)值，計(jì)算出粗提物浸膏中大花旋覆花內(nèi)酯的含量，進(jìn)而計(jì)算出旋覆花測得根、莖、葉、花序、全草干粉中大花旋覆花內(nèi)酯的含量。
公式為m[x]＝m[r]×A[x]/A[r] 其中m[x]為粗提物中含量；m[r]為對照品進(jìn)樣量；A[x]和A[r]分別為粗提物中相應(yīng)峰的峰面積和對照品峰面積。
結(jié)果表明旋覆花花序干粉中大花旋覆花內(nèi)酯含量為0.25％。旋覆花花序干粉采用95％的乙醇振蕩提取2次(50℃、150r/m，每次3小時)的浸膏收率為10.2％，浸膏中大花旋覆花內(nèi)酯含量為2.45％，配制含20％浸膏的制劑中大花旋覆花內(nèi)酯含量為0.49％。測得根、莖、葉、花序、全草乙醇提取物中大花旋覆花內(nèi)酯含量分別為0.08％、0.11％、0.22％、0.25％、0.19％，可見旋覆花各器官中，花序大花旋覆花內(nèi)酯含量最高。
實(shí)施例33 利用旋覆花乙醇提取物制備0.49％大花旋覆花內(nèi)酯乳油。稱取旋覆花花序的乙醇提取浸膏20kg(相當(dāng)于0.49kg大花旋覆花內(nèi)酯)，95％乙醇60kg，十二烷基磺酸鈣5kg，苯乙基苯基聚氧乙烯基醚15kg，在反應(yīng)釜中攪拌均勻，即得100kg0.49％大花旋覆花內(nèi)酯乳油。
實(shí)施例34 利用旋覆花乙醇提取物制備0.49％大花旋覆花內(nèi)酯微乳劑。稱取旋覆花花序的乙醇提取浸膏20kg、甲苯20kg、脂肪酸聚氧乙烯醚亞磷酸酯10kg、十二烷基磺酸鈣5kg，在50％高速攪拌條件下滴加入45kg去離子水，然后再攪拌1小時，即得100kg0.49％大花旋覆花內(nèi)酯微乳劑。該劑16～64倍稀釋液可有效地防治黃瓜霜霉病、黃瓜白粉病、番茄灰霉病及番茄葉霉病。
實(shí)施例35 以隨機(jī)區(qū)組法試驗(yàn)大花旋覆花內(nèi)酯乳油對黃瓜霜霉病(Pseudoperonospora cubensis)的防效。根據(jù)農(nóng)業(yè)部藥檢所“農(nóng)藥田間藥效試驗(yàn)準(zhǔn)則”，進(jìn)行田間防治黃瓜霜霉病效果試驗(yàn)。
供試黃瓜品種為北極1號，溫室栽培，2007年3月5日定植。試驗(yàn)田位于保定市郊區(qū)后營村。
試驗(yàn)設(shè)3.2％土木香內(nèi)酯乳油300倍；3.2％土木香內(nèi)酯乳油200倍；3.2％土木香內(nèi)酯乳油100倍；0.49％大花旋覆花內(nèi)酯乳油64倍；0.49％大花旋覆花內(nèi)酯乳油32倍；0.49％大花旋覆花內(nèi)酯乳油16倍；空白對照等7個處理，每處理3次重復(fù)，共21個小區(qū)，每小區(qū)2架黃瓜，面積11m2。小區(qū)隨機(jī)區(qū)組排列。
采用背負(fù)式手動噴霧器噴霧施藥。初見零星病斑時用第一次藥(4月11日)，間隔7天用藥一次，共用藥4次。噴霧均勻周到，尤其是葉背面。以清水為空白對照。用藥液量為900L/hm2。每小區(qū)隨機(jī)取4點(diǎn)調(diào)查，每點(diǎn)調(diào)查2株，每株調(diào)查全部葉片，按葉片上病斑占整個葉面積的百分率分級。0級無病斑；1級病斑占整個葉面積的5％以下；3級病斑占整個葉面積的6％～10％；5級病斑占整個葉面積的11％～25％；7級病斑占整個葉面積的26％～50％；9級病斑占整個葉面積的50％以上。
施藥前田間零星發(fā)病，病情基數(shù)視為零(4月11日)；第2次用藥后7天及第4次用藥后7天調(diào)查發(fā)病。田間調(diào)查各處理病葉數(shù)并記錄病情，根據(jù)以上分級方法計(jì)算病情指數(shù)、相對防效，數(shù)據(jù)采用鄧肯氏新復(fù)極差法(DMRT)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
病情指數(shù)＝100×[∑(各級病葉數(shù)×相對級數(shù)值)]/(調(diào)查總數(shù)×9) 防治效果(％)＝[(CK病情指數(shù)-PT病情指數(shù))/CK病情指數(shù)]×100 表32、0.49％大花旋覆花內(nèi)酯乳油對黃瓜霜霉病的防治效果

實(shí)施例36 隨機(jī)區(qū)組法試驗(yàn)大花旋覆花內(nèi)酯乳油對黃瓜白粉病的防效。根據(jù)農(nóng)業(yè)部藥檢所“農(nóng)藥田間藥效試驗(yàn)準(zhǔn)則”，進(jìn)行田間防治黃瓜白粉病效果試驗(yàn)。
供試黃瓜品種為“北極1號”。試驗(yàn)田位于定興縣北莊頭村，大棚栽培，8月5日定植，黃瓜白粉病歷年發(fā)生。
試驗(yàn)設(shè)3.2％土木香內(nèi)酯乳油300倍、3.2％土木香內(nèi)酯乳油200倍、3.2％土木香內(nèi)酯乳油100倍、0.49％大花旋覆花內(nèi)酯乳油64倍、0.49％大花旋覆花內(nèi)酯乳油32倍、0.49％大花旋覆花內(nèi)酯乳油16倍、空白對照等7個處理，3次重復(fù)，共21個小區(qū)，每個小區(qū)2架黃瓜，面積11m2。小區(qū)隨機(jī)區(qū)組排列。
采用背負(fù)式手動噴霧器噴霧施藥。初見零星病斑時用第一次藥(8月30日)，間隔7天用藥一次，共用藥4次。噴霧均勻周到，尤其是葉背面。以清水為空白對照。用藥液量為900L/hm2。
每小區(qū)隨機(jī)4點(diǎn)調(diào)查，每點(diǎn)2株，每株調(diào)查全部葉片，按葉片上病斑占整個葉面積的百分率分級。分級標(biāo)準(zhǔn)同實(shí)施例30。
施藥前田間零星發(fā)病，病情基數(shù)視為零(8月30日)；第2、4次用藥后7天調(diào)查發(fā)病。田間調(diào)查各處理病葉數(shù)并記錄病情，根據(jù)以上分級方法計(jì)算病情指數(shù)、相對防效，數(shù)據(jù)采用鄧肯氏新復(fù)極差法(DMRT)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
表33、0.49％大花旋覆花內(nèi)酯EC對黃瓜白粉病的防治效果

實(shí)施例37 隨機(jī)區(qū)組法試驗(yàn)0.49％大花旋覆花內(nèi)酯EC對番茄灰霉病的防效。根據(jù)農(nóng)業(yè)部藥檢所“農(nóng)藥田間藥效試驗(yàn)準(zhǔn)則”，進(jìn)行田間防治番茄灰霉病效果試驗(yàn)。
供試番茄品種為“佳粉2號”，大棚栽培，4月15日定植。試驗(yàn)田位于保定市郊區(qū)西康莊村。試驗(yàn)設(shè)3.2％土木香內(nèi)酯乳油300倍、3.2％土木香內(nèi)酯乳油200倍、3.2％土木香內(nèi)酯乳油100倍、0.49％大花旋覆花內(nèi)酯乳油300倍、0.49％大花旋覆花內(nèi)酯乳油200倍、0.49％大花旋覆花內(nèi)酯乳油100倍、空白對照共7個處理，3次重復(fù)，共21個小區(qū)，每小區(qū)2架番茄，面積11m2。小區(qū)隨機(jī)區(qū)組排列。
采用背負(fù)式手動噴霧器噴霧施藥。初見零星病斑時用第一次藥(4月20日)，間隔7天用藥一次，共用藥4次。噴霧均勻周到，尤其是葉背面。以清水為空白對照。用藥液量為900L/hm2。每小區(qū)隨機(jī)取4點(diǎn)調(diào)查，每點(diǎn)調(diào)查2株，每株調(diào)查全部番茄果。施藥前田間零星發(fā)病，摘除所有病果及病葉，病情基數(shù)視為零(4月20日)；第2、4次用藥后7天調(diào)查發(fā)病。田間調(diào)查各處理病果數(shù)、相對防效，數(shù)據(jù)采用鄧肯氏新復(fù)極差法(DMRT)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
防治效果(％)＝[(CK病果率-PT病果率)/CK病果率]×100 表34、0.49％大花旋覆花內(nèi)酯EC對番茄灰霉病的防治效果
實(shí)施例38 隨機(jī)區(qū)組法試驗(yàn)0.49％大花旋覆花內(nèi)酯EC對番茄葉霉病的防效。根據(jù)農(nóng)業(yè)部藥檢所“農(nóng)藥田間藥效試驗(yàn)準(zhǔn)則”，進(jìn)行田間防治番茄葉霉病效果試驗(yàn)。
供試品種長季節(jié)硬肉番茄紅光。試驗(yàn)田位于河北省定州市辛興村，日光溫室栽培，8月1日定植，番茄葉霉病歷年發(fā)生。
試驗(yàn)設(shè)3.2％土木香內(nèi)酯乳油300倍、3.2％土木香內(nèi)酯乳油200倍、3.2％土木香內(nèi)酯乳油100倍、0.49％大花旋覆花內(nèi)酯乳油64倍、0.49％大花旋覆花內(nèi)酯乳油32倍、0.49％大花旋覆花內(nèi)酯乳油16倍、空白對照等7個處理，3次重復(fù)，共21小區(qū)，每小區(qū)2架番茄，面積11m2。小區(qū)隨機(jī)區(qū)組排列。
采用背負(fù)式手動噴霧器噴霧施藥。初見零星病斑時用第一次藥(8月30日)，間隔7天用藥一次，共用藥4次。噴霧均勻周到，尤其是葉背面。以清水為空白對照。用藥液量為900L/hm2。每小區(qū)隨機(jī)4點(diǎn)調(diào)查，每點(diǎn)2株，每株調(diào)查全部葉片，按葉片上病斑占整個葉面積的百分率分級。分級標(biāo)準(zhǔn)同實(shí)施例30。
施藥前田間零星發(fā)病，病情基數(shù)視為零(8月30日)；第2、4次用藥后7天調(diào)查發(fā)病。田間調(diào)查各處理病葉數(shù)并記錄病情，根據(jù)以上分級方法計(jì)算病情指數(shù)、相對防效，數(shù)據(jù)采用鄧肯氏新復(fù)極差法(DMRT)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
表35、0.49％大花旋覆花內(nèi)酯乳油對番茄葉霉病的防治效果
從表32～表35可知，0.49％大花旋覆花內(nèi)酯乳油16～64倍稀釋液對黃瓜霜霉病、黃瓜白粉病、番茄灰霉病、番茄葉霉病均有較好的防治效果，對黃瓜霜霉病的防效尤為突出，等濃度條件下，0.49％大花旋覆花內(nèi)酯乳油16～64倍稀釋液的防效高于3.2％土木香內(nèi)酯乳油100～300倍稀釋液的防效。



圖1化合物Db的紫外分光光度計(jì)譜圖。
圖2自身對照法對照品和供試品譜圖(上為對照品，下為供試品。
圖3粗提物含量測定譜圖(上為粗提物，下為對照品。
其它參考文獻(xiàn) Qasem，J.R.，et al.，Antifungal Activity of Clammy Inula(Inula viscosa)onHelminthosporium Sativum and Fusarium oxysporum f.sp.lycopersic，Phytopath.Medit.，1995，347-14. Yegen，O.，et al.，Investigations on the Fungitoxicity of Extracts of Six SelectedPlants from Turkey Against Phytopathogenic Fungi，J.Plant Dis.& Prot.，1992，99(4)349-359. Shao，Y.，et al.，Kaurane Glycosides from Inula britannica，Phytochem.，1986，42(3)783-786. Ziv O.，Using Extracts of Inula viscosa for Controlling Plant Diseases on Fresh andDry Postharvest Products，Phytoparasitica，1996，24(2)154. Grande，T.，et al.，Triterpenoids from Dittrichia viscosa，Phytochem.，1992，31(5)1826-1828. Gulacti，T.，et al.，Structurally Related Guaianolides from Inula thapsoidies，Phytochem.，1995，40(4)1717-1722. Sanz，J.，et al.，Oxygenated Nerolidol Esters and Eudesmane Acids from Inula viscosa，Phytochem.，1991，30(11)3653-3655. Gulacti，T.，et al.，Cytotoxic and Antibacterial Sesquiterpenes from Inula graveolens，Phytochem.，1993，33(2)407-410. Bing-Nan，Z.，et al.，Sesquiterpene Lactones from Inula salsoloides，Phytochem.，1994，36(3)721-724. Shtacher，G.，et al.，12-Carboxyeudesma-3，11(13)-diene″，J.Med.Chem.，1970，13(6)1221-1223. Bohlmann，F(xiàn).，et al，Neue Inhaltsstoffe aus Inula viscosa Ait，Verlag Chemie，Jan.，1977，pp.1330-1334. Sevil，0.，et al.，A Eudesmanolide and Other Constituents from Inula graveolens，Phytochem.，1992，31(1)195-197.
權(quán)利要求
1、一種旋覆花提取物的制備方法，包括獲得旋覆花植物材料；用含乙醇溶劑提取旋覆花植物材料，獲得旋覆花的提取物，其特征是由下列步驟構(gòu)成
(1)采集旋覆花植物材料根、莖、葉、花、全草，晾干后粉碎成20目粉末；
(2)用溶劑提取旋覆花植物材料，在溫度為0～100℃、壓力為0.1～5個大氣壓、浸泡時間為1小時～10天，旋覆花植物材料與溶劑的重量體積比為1:1～1:100，浸泡時攪拌；
(3)分離液相和固相，通過過濾、離心或自然沉降；
(4)重復(fù)步驟(2)和(3)1～5次；
(5)合并液相；
(6)濃縮沒有特別的限制，前提是不破壞活性成分；蒸發(fā)或減壓濃縮，濃縮之后進(jìn)行干燥，為常壓干燥、減壓干燥、噴霧干燥和冷凍干燥。
2、按權(quán)利要求1所述的方法，其特征是其中用溶劑提取旋覆花植物材料包括(1)用溶劑浸泡旋覆花植物材料；(2)分離液相和固相；(3)任選地，重復(fù)步驟(1)和(2)1～5次；(4)任選地，合并液相；和(5)任選地，將由步驟(2)或者步驟(4)得到的液相濃縮。
3、按權(quán)利要求1-2所述的方法，其特征是其中所述旋覆花植物材料是旋覆花植物的全草，包括細(xì)胞、組織、器官、花、果實(shí)、根、莖、葉。
4、按權(quán)利要求1所述的方法，其特征是其中所述溶劑是乙醇或者含有乙醇的溶劑；其中溶劑可以是水、甲醇、丙醇、丙酮、正丁醇或它們的組合。
5、按權(quán)利要求1所述的方法，其特征是其中在用含乙醇溶劑提取旋覆花植物材料之前用水或其他有機(jī)溶劑提取，有機(jī)溶劑包括石油醚、氯仿、乙酸乙酯、乙醚、甲醇、丙醇、異丙醇、丙酮或正丁醇或它們的任何組合。
6、按權(quán)利要求4所述的方法，其特征是用95％乙醇提取旋覆花植物材料獲得的旋覆花浸膏。
7、一種旋覆花提取物的組合物的制備方法，其特征在于用旋覆花的根莖葉花及全草為原料，用95％乙醇提取，提取物再和溶劑、農(nóng)藥助劑配制成旋覆花源殺菌劑和殺菌微乳劑。
8、按權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于旋覆花源殺菌劑乳油的各組分重量百分比為
旋覆花提取物 10％～40％(相當(dāng)于大花旋覆花內(nèi)酯0.245％～0.98％)
溶劑 20％～50％
農(nóng)藥助劑 10％～20％
9、如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于該殺菌微乳劑的各組分重量百分比為
旋覆花提取物 10％～40％(相當(dāng)于大花旋覆花內(nèi)酯0.245％～0.98％)
溶劑 20％～50％
水去離子水或蒸餾水 40％～50％
農(nóng)藥助劑 10％～20％
10、按權(quán)利要求8和9所述方法，其特征是其中所述溶劑是甲醇、乙醇、異丙醇、苯、甲苯、二甲苯、乙酸乙酯等中的任一種或幾種。
11、按權(quán)利要求8和9所述方法，其特征是其中所述的農(nóng)藥助劑，是木質(zhì)素磺酸鈉或鈣、烴基萘磺酸鹽的甲醛縮合物，二丁基萘磺酸鹽、聚羧酸酯鈉鹽、十二烷基苯磺酸鈉、琥珀酸二辛酯磺酸鈉、烷基聚氧乙烯醚磺酸鹽中的任一種或幾種。
12、按權(quán)利要求8所述方法，其特征是將旋覆花根、莖、葉、花、全草等部位干粉用95％的乙醇振蕩提取2次50℃、150r/m，每次3小時，2次提取干粉質(zhì)量g與溶劑體積mL比分別為1:10和1:8。合并2次提取液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上60℃、0.1個大氣壓濃縮至不再有溶劑滴出，得到浸膏；在反應(yīng)釜中，按殺菌乳油配比量依次加入各成分，攪拌均勻即可得旋覆花源殺菌乳油—大花旋覆花內(nèi)酯乳油。
13、按權(quán)利要求9所述方法，其特征是先將旋覆花提取物、農(nóng)藥助劑溶解于溶劑中，在40～50℃、高速攪拌條件下將所得溶劑滴加入去離子水中，恒溫?cái)嚢?小時，即得旋覆花源殺菌微乳劑—大花旋覆花內(nèi)酯微乳劑。
14、一種旋覆花提取物及其組合物的用途，其特征在用于防治黃瓜白粉病、黃瓜霜霉病、黃瓜灰霉病、黃瓜炭疽病、番茄灰霉病、番茄早疫病、番茄晚疫病、番茄葉霉病、馬鈴薯晚疫病和小麥紋枯病植物真菌病害，其中優(yōu)選的是，所述組合物是利用旋覆花乙醇提取物制備的大花旋覆花內(nèi)酯乳油及大花旋覆花內(nèi)酯微乳劑。
全文摘要
本發(fā)明屬一種制備旋覆花植物提取物的方法及用途。將旋覆花(包括Inula japonica和Inula britannica)植物材料(根、莖、葉、花序、全草)粉碎，用包括95％乙醇在內(nèi)的溶劑提??；濃縮提取液至與旋覆花粉碎物等重，得旋覆花浸膏，它對黃瓜灰霉病菌、番茄早疫病菌、番茄葉霉病菌、黃瓜炭疽病菌、黃瓜白粉病菌、黃瓜霜霉病菌、馬鈴薯晚疫病菌、番茄晚疫病菌和小麥紋枯病菌均有明顯的抑制作用，其中花序提取物的抑菌活性較強(qiáng)。用乙醇提取的旋覆花浸膏和適宜的溶劑及農(nóng)藥助劑可配成植物源殺菌劑大花旋覆花內(nèi)酯乳油及大花旋覆花內(nèi)酯微乳劑，對黃瓜霜霉病、黃瓜白粉病、番茄灰霉病及番茄葉霉病具有明顯的防效，特別適用于蔬菜等經(jīng)濟(jì)作物上真菌病害的防治，是一種無公害的植物源殺菌劑。
文檔編號A01N65/00GK101518266SQ20081000788
公開日2009年9月2日 申請日期2008年2月27日 優(yōu)先權(quán)日2008年2月27日
發(fā)明者王文橋, 韓秀英, 張小風(fēng), 馬志強(qiáng), 李紅霞, 王紅剛, 張文淵 申請人:河北省農(nóng)林科學(xué)院植物保護(hù)研究所