專利名稱：生物硒和谷胱甘肽在作為魚飼料添加劑中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及魚類餌料添加劑領(lǐng)域，具體涉及生物硒和谷胱甘肽在 作為魚飼料添加劑中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
在海洋養(yǎng)殖中，赤潮毒素中的軟骨藻酸(domoicacid，DA)、腹瀉 性貝毒、麻痹性貝毒、神經(jīng)性貝毒等在貝類中儲(chǔ)存積累不同，有很大 的危害性，其中軟骨藻酸的危害更廣，在魚類與貝類中均可富集，屬 記憶缺失性貝毒。到目前為止，世界各地均有DA檢出，由此導(dǎo)致的 人和動(dòng)物的中毒事件層出不窮。另外，違禁漁藥中孔雀石綠對我國海 洋養(yǎng)殖水產(chǎn)品質(zhì)量安全的潛在烕脅尤其嚴(yán)重，已多次造成重大經(jīng)濟(jì)損 失，孔雀石綠能結(jié)合或插入DNA，促進(jìn)腫瘤生長，具有明顯的高致 癌、高致畸和致突變作用。
而在淡水養(yǎng)殖中，由于水體富營養(yǎng)化導(dǎo)致有害藍(lán)藻水華頻頻發(fā) 生，并可能產(chǎn)生嚴(yán)重危害國民身體健康的藍(lán)藻毒素。其中銅綠微囊藻 M^rao^iy^n^/mwfl水華是世界各國淡水湖泊、池塘中分布廣、持 續(xù)時(shí)間長的一種可能產(chǎn)毒的藻類水華，其產(chǎn)生的毒素稱為微囊藻毒素 (microcystin，MC)。其中微囊藻毒素-LR是一種環(huán)狀七肽肝毒素，最 常見且毒性高。該毒素在肝臟特異聚積，造成細(xì)胞內(nèi)一系列生理生化 反應(yīng)的紊亂，最終導(dǎo)致肝細(xì)胞損傷，甚至發(fā)生急性死亡事件。微囊藻 毒素的促腫瘤作用也是通過這種方式實(shí)現(xiàn)的。長期飲用或食用含微囊藻毒素的水或水產(chǎn)品可能引發(fā)肝癌，特別是在存在肝炎病毒與黃曲霉 毒素的情況下，這種引發(fā)肝癌的可能性更高。因此，解決水體微囊藻 毒素的污染對我國國民身體健康尤為重要。
來自水體的微囊藻毒素污染主要有兩個(gè)污染源， 一個(gè)是來自污染 水體的飲用水， 一個(gè)是來自污染水體的水產(chǎn)品。對于飲用水微囊藻毒 素污染問題，自來水廠采用物理、化學(xué)方法，主要通過專門裝置去除 水中微囊藻毒素，但隨著水體富營養(yǎng)化進(jìn)程加劇，自來水廠處理成本 迅速攀升而不堪重負(fù)；對于受污染池塘養(yǎng)殖的水產(chǎn)品如羅非魚等淡水 商品魚，根本不可能以流體形式的方法在水產(chǎn)品加工過程去除微囊藻 毒素。
另外，由于相關(guān)農(nóng)藥的使用，使農(nóng)藥等毒物在淡水養(yǎng)殖魚體內(nèi)積 聚。長期食用含有這些藥物的水產(chǎn)品可致畸、致癌，也會(huì)對人類健康 造成嚴(yán)重威脅。藻毒素、違禁漁藥等毒害物質(zhì)的污染對人類健康所造 成的威脅已引起世界各國公共衛(wèi)生系統(tǒng)的廣泛關(guān)注，長期食用含毒素 的水產(chǎn)品可引發(fā)肝癌等各種疾病。
如何去除水產(chǎn)品含有的毒素，甚至是否可能利用水產(chǎn)品自身的排 毒機(jī)制去除其攝取的毒素，都是目前非常緊迫的課題，在大量的研究 中，人們的目光投向了谷胱甘肽。
谷胱甘肽(glfftathione， GSH)是由Hopkins發(fā)現(xiàn)并命名，1929年 Hopkins及Kendall等各自獨(dú)立的發(fā)現(xiàn)其為含有甘氨酸的三肽。谷胱 甘肽化學(xué)名為N-(N-L-r-Glutamyl-L-cysteninyl)glycine，艮P N(N-L-r-谷氨酰-L-半胱氨酰)甘氨酸。谷胱甘肽可分為還原型谷胱甘肽(reducedglutathione, GSH)和氧化型谷胱甘肽(oxidizided glutathione, GSSG)。
通常所說的谷胱甘肽是指還原型谷胱甘肽，是由r-谷氮酸、半胱氨酸、 甘氨酸組成的三肽。
谷胱甘肽是機(jī)體內(nèi)的重要活性物質(zhì)，它具有清除自由基、解毒、 促進(jìn)鐵質(zhì)吸收及維持紅細(xì)胞膜的完整性、維持DNA的生物合成、細(xì) 胞的正常生長及細(xì)胞免疫等多種生理功能。還原型谷胱甘肽(GSH)、 氧化型谷胱甘肽(GSSG)、谷胱甘肽過氧化酶(GSH-Px)和谷胱甘肽還 原酶(GSH-R)共同組成了谷胱甘肽氧化還原系統(tǒng)。該系統(tǒng)具有對抗氧 自由基、保護(hù)組織免受氧化損傷的作用，被稱為組織抗氧化系統(tǒng)。
谷胱甘肽廣泛分布于自然界的生物體中(Wierzbicka等，1989)，主 要存在于酵母、動(dòng)物肝臟、肌肉、血液中，許多植物，如蔬菜、豆類、 谷物、薯類、菇類及細(xì)菌中也含有一定量的谷胱甘肽，在乳制品、熟 食品中含量較低。
目前，谷胱甘肽在畜禽生產(chǎn)中研究較多，已證實(shí)谷胱甘肽可以提 高豬卵母細(xì)胞成熟率及顯微受精胚的卵裂率，提高泌乳動(dòng)物的泌乳性 能，解除黃曲霉毒素B1對雛雞的毒性。
在水產(chǎn)養(yǎng)殖相關(guān)領(lǐng)域方面，張甬元等發(fā)現(xiàn)谷胱甘肽可解除魚體微 囊藻毒素引起的中毒癥。焦采虹曾報(bào)道詞料中添加GSH可促進(jìn)羅非 魚生長和影響氧化應(yīng)激能力。Zambohino等報(bào)道谷胱甘肽能提高鱸魚 生長速度和成活率。趙紅霞等選用初始體質(zhì)量約8.50 g的草魚 (CfcW0/7/W072g0^/2 在56 d的飼養(yǎng)期中分別投喂添加5種不
同劑量谷胱甘肽(GSH)(添加量分別為Omg/kg、 100mg/kg、 200 mg/kg、 300mg/kg和400mg/kg)的試驗(yàn)飼料，觀察GSH對草魚生長、 生理指標(biāo)和抗病力的影響。結(jié)果表明，詞料中添加GSH不僅能夠提 高草魚特定生長率、存活率和飼料效率，還可以提高草魚對嗜水氣單 胞菌的抵抗能力，其中200mg/kgGSH組草魚攻毒后存活率達(dá)到最 高。以特定生長率為判定指標(biāo)，GSH在草魚飼料中的適宜添加量為 350 mg/kg。谷胱甘肽還曾作為強(qiáng)肝劑的一種成分用于水產(chǎn)佴料添加 劑。
然而谷胱甘肽的去毒作用很大程度上依賴于谷胱甘肽過氧化物 酶(GHS-Px)和谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(soluble glutathione S-transferase， sGST), GHS-Px能催化還原型谷胱甘肽(GHS)變成氧化型谷胱甘 肽(GSSG)，同時(shí)使有毒的過氧化物還原和分解為無毒物質(zhì)，此外， 還原型谷胱苷肽本身在可溶性谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(soluble glutathione S-tramferase， sGST)催化下可與多種化學(xué)物質(zhì)包括藻毒素、違禁漁藥、 致癌物以及氧化應(yīng)激產(chǎn)生的各種毒性代謝物發(fā)生加合反應(yīng)，降低毒物 毒性并將其直接經(jīng)排泄系統(tǒng)排出體外。因此，提高GHS-Px和GST 的活性對于谷胱甘肽的解毒去毒功能有著重要的促進(jìn)作用。
硒元素(Se)是GHS-Px活性中心的必須組成成分，研究表明機(jī) 體適當(dāng)補(bǔ)充硒元素可顯著提高GHS-Px酶的活性，此外，Christensen 等給剛斷奶的大鼠分別詞以缺乏、足量或超劑量的含硒食物，測定其 肝、腎GST的活性及基因的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)硒對GST的基因表達(dá)有影響， 并可能存在一種與硒的生理作用有關(guān)的GST基因調(diào)控機(jī)制。
硒是人體必需的微量元素，具有多種生物學(xué)功能。硒與多種酶的活性有關(guān)，另外硒可調(diào)節(jié)維生素A、 C、 E、 K的吸收和消耗，參與 泛醌的合成；促進(jìn)或增加機(jī)體中免疫球蛋白的含量，從而起免疫佐劑 作用。
如果能將生物硒與谷胱甘肽共同作為餌料添加劑喂給魚類，將可 能大大提高魚類去毒基因表達(dá)，從而增強(qiáng)魚類對外界毒物的抵抗及分 解排泄能力。目前尚未有將硒與谷胱甘肽一起用作魚類餌料添加劑的 相關(guān)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對水產(chǎn)品尤其是養(yǎng)殖魚類體內(nèi)毒素，特別是 藻毒素富集嚴(yán)重而現(xiàn)有技術(shù)無法很好去除這些毒素，從而導(dǎo)致人類健 康嚴(yán)重受到威脅等問題，提供一種生物硒和谷胱甘肽在作為魚飼料添 加劑中的應(yīng)用，含有生物硒和谷胱甘肽的魚館添加劑可以促進(jìn)魚類去 毒基因的表達(dá)，不需對養(yǎng)成的水產(chǎn)品進(jìn)行任何專門處理，也不需任何 專門的加工裝置，魚類自身就能將攝取的毒素排泄出來，從而保證了 食用魚的安全性。
本發(fā)明的上述目的是通過如下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)的 首先，本發(fā)明分析了魚體內(nèi)去毒體系的作用原理毒素進(jìn)入魚肝 細(xì)胞后，使細(xì)胞中產(chǎn)生大量活性氧分子，這些活性氧分子將脂質(zhì)分子 氧化為過氧化脂質(zhì)分子，以自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的方式對肝臟造成嚴(yán)重?fù)p 傷。這時(shí)，在肝臟抗氧化脅迫與抑制過量ROS發(fā)生方面起重要作用
的GPX被誘導(dǎo)，過氧化脂質(zhì)分子在谷胱甘肽過氧化物酶GPX的作用 下，被GSH還原生成GSSG和還原型脂質(zhì)分子，而sGST則催化GSH與毒素結(jié)合，成為水溶性化合物排出體外，起到解毒作用。
目前，對于哺乳動(dòng)物中外源物質(zhì)促進(jìn)GST基因表達(dá)的調(diào)控機(jī)理 研究已有相當(dāng)?shù)倪M(jìn)展。當(dāng)機(jī)體接觸外源化學(xué)物質(zhì)產(chǎn)生過氧化壓力和親 電子壓力時(shí)，發(fā)現(xiàn)有超過100個(gè)基因會(huì)發(fā)生應(yīng)激表達(dá)，他們的產(chǎn)物調(diào) 控多種細(xì)胞活動(dòng)包括信號(hào)傳導(dǎo)、增殖和免疫防御反應(yīng)等。我們對編 碼這些抗氧化酶的基因啟動(dòng)子進(jìn)行功能分析發(fā)現(xiàn)了一個(gè)順式轉(zhuǎn)錄調(diào) 控元件，此元件可以調(diào)控這些基因的基礎(chǔ)表達(dá)及介導(dǎo)異生素或抗氧化 劑刺激的誘導(dǎo)表達(dá)。這個(gè)元件被命名為抗氧化反應(yīng)元件(ARE)或親電 子反應(yīng)元件(EpRE)。
Rushmore等利用基因敲除技術(shù)證實(shí)，大鼠GSTl(Ya)亞基基因的 5'側(cè)翼區(qū)存在5個(gè)獨(dú)立的調(diào)控元件，但是有關(guān)魚類GST5'側(cè)翼區(qū)調(diào) 控元件的作用，目前遠(yuǎn)不如哺乳類清楚。
Leaver對比目魚GSTA、 GSTA1、 GSTA2基因的啟動(dòng)子區(qū)域序列 進(jìn)行比較分析，發(fā)現(xiàn)比目魚GSTA啟動(dòng)子區(qū)含4個(gè)ARE (或EpRE) 調(diào)控元件，GSTA1啟動(dòng)子區(qū)含幾個(gè)可被過氧化物酶體增殖物識(shí)別的 序歹U PPRE (peroxisome proliferator response element)禾口 2個(gè)ERE (estrogen responSe elelment)調(diào)控元4牛，而GSTA2的調(diào)控區(qū)則不含 任何可識(shí)別的啟動(dòng)子元件。對比目魚GSTA、 GSTA1及GSTA2啟動(dòng) 子進(jìn)行活性分析發(fā)現(xiàn)，比目魚GSTA啟動(dòng)子活性最高，GSTA1次之， GSTA2最低，認(rèn)為這可能跟這些基因啟動(dòng)子區(qū)含不同的調(diào)控元件有 關(guān)。比目魚GTSA基因的表達(dá)調(diào)控模式，可能跟哺乳類alpha家族 sGST基因相類似，均由一系列親電子的外源性物質(zhì)通過ARE誘導(dǎo)GST基因表達(dá)，提示GSTA在魚類及哺乳類的抗氧化應(yīng)激方面可能 發(fā)揮著相似作用。
本發(fā)明考慮可以通過生物硒促進(jìn)去毒基因的轉(zhuǎn)錄水平，增強(qiáng)魚類 去毒能力；而還原型谷胱苷肽本身在可溶性谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶 (soluble glutathione S-transferase, sGST)催化下可與多種化學(xué)物質(zhì)包J舌 藻毒素、違禁漁藥、致癌物以及氧化應(yīng)激產(chǎn)生的各種毒性代謝物發(fā)生 加合反應(yīng)，降低毒物毒性并將其直接經(jīng)排泄系統(tǒng)排出體外。
綜上所述，本發(fā)明將生物硒和谷胱甘肽用于魚類餌料添加劑中， 所制備的含生物硒和谷胱苷肽的魚飼料，其富硒酵母的含量為每公斤 干飼料含有富硒酵母0.5-1.0克，谷胱苷肽的含量為每公斤干詞料含 有谷胱甘肽0.8 1.2克。
硒元素的來源有許多種，與亞硒酸鈉等無機(jī)硒相比，生物硒具有 吸收利用率高,安全性強(qiáng)，無毒副作用，是人體的最佳硒。富硒酵母，屬 于生物硒，是目前常用的一種含硒添加劑，在國外已實(shí)現(xiàn)工工業(yè)化生 產(chǎn)和進(jìn)入實(shí)用階段。生物硒的含硒量最高可達(dá)1000 ppm，但通常為 300ppm左右。其蛋白質(zhì)含量為55.8%，維生素Bl為3.2ppm，維生 素B2為33.2 ppm，是一種功能性極佳的食品配料。經(jīng)化學(xué)分析表明， 硒在富硒酵母中的存在形式與其在普通啤酒酵母中的天然存在形式 相似，其中有機(jī)硒含量占總硒量的95%以上，而有機(jī)硒中又有27% 的是以共價(jià)鍵形式結(jié)合到大分子(主要是蛋白質(zhì))上。硒蛋白中的含 硒分子結(jié)構(gòu)主要以硒代胱氨酸為主，約占83%，而硒代蛋氨酸的含量 則較少。本發(fā)明采用富硒酵母作為生物硒的主要來源，富硒酵母可以選用市場上可購買得到的成品，根據(jù)其中所含硒的份量按比例混合入 魚飼料中。
谷胱苷肽選用AMRESCO公司的產(chǎn)品，其純度>98.0%。
魚飼料通常是指魚粉，也可以是價(jià)格低廉且含豐富的蛋白質(zhì)如玉 米、大豆等制成的詞料。魚飼料通常分成蛋白質(zhì)飼料和能量飼料。其 中蛋白質(zhì)飼料是指干物質(zhì)中粗蛋白含量>20%,粗纖維含量《18%的 一類飼料；能量飼料是指干物質(zhì)中粗蛋白含量《20%，粗纖維含量《 18%的一類飼料。
考慮到飼料營養(yǎng)與容量的關(guān)系，既要保證魚類能攝入足夠的營 養(yǎng)，又要能使其產(chǎn)生飽感。所以蛋白質(zhì)飼料和能量飼料是具備一定的 比例。為了有利于魚類生長，既要滿足魚類生長對蛋白質(zhì)的需要，又 要使能量和蛋白質(zhì)的比例適中，過高和過低的能量蛋白比都不利于魚 類生長。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果l.本發(fā)明提供了一
種生物硒和谷胱苷肽在魚飼料添加劑中的應(yīng)用，添加有生物硒和谷胱 甘肽的魚詞料能夠促進(jìn)魚類去毒基因的表達(dá)，從而增強(qiáng)魚類抵抗外界
毒物的能力；2.根據(jù)本發(fā)明提供的一種生物硒和谷胱苷肽在魚詞料添 加劑中的應(yīng)用，在淡水養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)魚類在微囊藻等藍(lán)藻水華高發(fā)期、海 水養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)魚類接觸赤潮發(fā)生或者接觸違禁漁藥時(shí)，給養(yǎng)殖的魚類喂 投含添加了高效安全生物硒和谷胱苷肽添加劑的魚飼料，有利于魚類 自身代謝排除微囊藻毒素以及藥物毒素，從而保證魚類食用的安全 性；3.利用本發(fā)明所提供的一種生物硒和谷胱苷肽在魚詞料添加劑中的應(yīng)用，所制備的魚飼料，在水產(chǎn)養(yǎng)殖過程中喂投含給魚類，可以促 進(jìn)魚類去毒基因表達(dá)特別是I、 II時(shí)相代謝去毒相關(guān)基因的表達(dá)，通 過魚自身的代謝體系就能夠?qū)⒆陨頂z入及積累的毒素分解排泄出去， 不需對養(yǎng)成的水產(chǎn)品進(jìn)行任何專門處理，也不需任何專門的加工裝 置，極大地降低了食用魚的后期處理成本，更加環(huán)保經(jīng)濟(jì)。


圖1為雜交羅3貝魚(Oeoc/ ram" m'foft'c"ja 按每公斤飼 料中含富硒酵母0.5 g的量喂食后，其GSTA、 GPX基因mRNA表 達(dá)的RT-PCR分析柱形其中1為PBS， 2為MC-LR， 3為SE+PBS， 4為SE+MC-LR;
圖2為雜交羅非魚(OwocAr(9/m:y m7orici/ja ""re船)按每公斤飼 料中含富硒酵母l.O g的量喂食后，其GSTA、 GPX基因mRNA表 達(dá)的RT-PCR分析柱形其中1為PBS， 2為MC-LR， 3為SE+PBS， 4為SE+MC-LR;
圖3為尼羅羅非魚((9mx^ram^ m7加'c"s)按每公斤飼料中含 GSH0.8 g的量喂食后，其GSTA、 GSTR、 GPX基因mRNA表達(dá)的 RT-PCR分析柱形其中1為PBS，2為MC-LR， 3為GSH+PBS，4為GSH+MC-LR;
圖4為尼羅羅非魚(OeoWAwm;s m'foric^)按每公斤飼料中含 GSH1.0g的量喂食后，其GSTA、 GSTR、 GPX基因mRNA表達(dá)的 RT-PCR分析柱形其中1為PBS， 2為MC-LR， 3為GSH+PBS， 4為GSH+MC-LR;圖5為尼羅羅非魚((9m dzram^ m7oft'c""按每公斤飼料中含 GSH1.2g的量喂食后，其GSTA、 GSTR、 GPX基因mRNA表達(dá)的 RT-PCR分析柱形其中1為PBS， 2為MC-LR， 3為GSH+PBS，4為GSH+MC-LR;
圖6為尼羅羅非魚(O^c/^rom^ m7ofl'c""按每公斤飼料中含富 硒酵母0.6g和GSH1.0g的量喂食后，其GSTA、 GSTR、 GPX基因 mRNA表達(dá)的RT-PCR分析柱形其中1為PBS， 2為MC-LR， 3為SE+GSH+PBS ， 4為 SE+GSH+MC-LR;
圖7為鰱魚(/^7wp/i^zZ/m'c/^/0^ mo/^tc)按每公斤飼料中含富硒 酵母0.6 g和GSH 1.0 g的量喂食后，其GSTA、 GSTR、 GPX基因 mRNA表達(dá)的RT-PCR分析柱形其中1為PBS， 2為MC-LR， 3為SE+GSH+PBS， 4為 SE+GSH+MC-LR。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例l含生物硒和谷胱甘肽的魚飼料
含生物硒和谷胱甘肽的魚飼料的制備方法如下
(1)取購買自廣州市圣格王生物技術(shù)有限公司的富硒酵母，其含 量組份為(質(zhì)量百分比)
水分 《10.0% 蛋白質(zhì)(以N計(jì))》40.0% 灰份 《10.0%硒(以Se計(jì)) 300-2000 mg/kg
(2) 取購買自AMRESCO公司的谷胱甘肽，該谷胱甘肽的純度 >98. 0%:
(3) 按每公斤干飼料含約0.5克富硒酵母，每公斤干飼料含約 0.8克谷胱苷肽的量，分別將富硒酵母和谷胱甘肽混合加入購買自廣 州市澳洋實(shí)業(yè)有限公司魚飼料中即得。
實(shí)施例2含生物硒和谷胱甘肽的魚詞料
含生物硒和谷胱甘肽的魚飼料的制備方法如下
(1)取購買自廣州市圣格王生物技術(shù)有限公司的富硒酵母，其含
量組份為(質(zhì)量百分比)
水分 《10.0% 蛋白質(zhì)(以N計(jì))>40.0% 灰份 《10.0% 硒(以Se計(jì)) 300-2000 mg/kg
(2) 取購買自AMRESCO公司的谷胱甘肽，該谷胱甘肽的純度 〉98. 0%:
(3) 按每公斤干飼料含約1.0克富硒酵母，每公斤干飼料含約 1.2克谷胱苷肽的量，分別將富硒酵母和谷胱甘肽混合加入購買自廣 州市澳洋實(shí)業(yè)有限公司魚飼料中即得。
實(shí)施例3含生物硒和谷胱甘肽的魚詞料促進(jìn)魚類去毒基因表達(dá) 的檢測
本實(shí)施例中，用半定量PCR方法比較不同品種、品系池塘養(yǎng)殖羅非魚肝臟與肌肉微囊藻毒素去毒酶基因的mRNA相對水平，以p-肌動(dòng)蛋白為外參照(我們已克隆羅非魚P-肌動(dòng)蛋白cDNA序列)，相 對比較羅非魚不同品種、品系肝臟與肌肉的微囊藻毒素去毒能力。具 體方法詳見文獻(xiàn)Liang, X. F.， Ogata， H. Y.， Oku， H.， Chen, J.， Hwang， F" 2003. Abundant and constant expression of uncoupling protein 2 in the liver of red Sea bream尸agmsComparative Biochemistry and Physiology A 136: 655-661.
本實(shí)施例中，按Liang et al. (2002)方法通過競爭PCR測定組實(shí)驗(yàn) 魚肝臟與肌肉中微囊藻毒素去毒酶基因mRNA數(shù)量，確定羅非魚不 同品種、品系肝臟與肌肉的微囊藻毒素去毒能力。微囊藻毒素去毒酶 基因cDNA競爭模板(定量標(biāo)準(zhǔn))的制備依照Cell et al. (1993)方法。 具體方法詳見文獻(xiàn)Liang, X.-F.， Ogata， H. Y., Oku， H., 2002. Effect of dietary fatty acids on lipoprotein lipaSe gene expression in the liver and visceral adipoSe tissue of fed and starved red Sea bream Pagrus major. Comp. Biochem. Physiol. A132: 913-919。
本實(shí)施例中，采用黃峙等已成功建立的方法制備生物硒，參照國 際標(biāo)準(zhǔn)確定飼料中適宜的生物硒添加量。生物硒制備具體方法詳見文 獻(xiàn)黃峙，鄭文杰，郭寶江,2002。鈍頂螺旋藻富硒培養(yǎng)條件的優(yōu)化。 生物工程學(xué)報(bào)，18(3): 373-376。
廣東羅非魚良種場提供不同品種、品系池塘養(yǎng)殖羅非魚、鰱魚、 草魚用于本項(xiàng)研究。
(一)含生物硒的魚飼料促進(jìn)魚類去毒基因表達(dá)的檢測1、材料和方法 1.1 實(shí)驗(yàn)魚
實(shí)驗(yàn)雜交羅非魚(5~8 g)隨機(jī)分為兩組，每組30條， 一組喂食含 富硒酵母粉的飼料，每公斤飼料中富硒酵母含量分別為0.5g、 l.Og， 另一組喂食含普通酵母粉的飼料以作對照，每天喂食，喂食次數(shù)相同， 喂飽為止，喂食一個(gè)月以上。馴養(yǎng)期自然死亡率低于10%。魚類養(yǎng)殖 用水為曝氣除氯的自來水，水溫為24士2。C，飼養(yǎng)期間連續(xù)充氧。隨 后每組實(shí)驗(yàn)魚各10尾隨機(jī)分成2組，每組5尾在自然光照周期下飼 養(yǎng)于室內(nèi)，用于染毒試驗(yàn)。經(jīng)人工飼養(yǎng)排毒后的羅非魚染毒方式采用 腹腔注射，以磷酸緩沖液(PBS)為溶劑，MC-LR (微囊藻毒素)的注 射量為50嗎kg—ibwt，對照組直接注射PBS。 24h后冰凍麻醉，分離 肝臟組織。MC-LR為Alexis公司產(chǎn)品公司產(chǎn)品。
實(shí)驗(yàn)魚小心分離出肝臟，肌肉組織從背部取材，迅速稱重后用于 提取總RNA。肝臟總RNA提取與純化使用S.N.A.P. Total RNA Isolation Kit (Invitrogen)， cDNA合成使用lst-strand cDNA Synthesis Kit (Clontech),以oligo(dT)20作為反轉(zhuǎn)錄引物?？俁NA提取與cDNA 合成均按試劑盒推薦的方法進(jìn)行操作。
1.2雜交羅非魚肝臟GSTA、 GPX基因mRNA水平的測定
喂生物硒與對照羅非魚每組各10尾隨機(jī)分成2組，每組5尾， 用于染毒試驗(yàn)。染毒方式采用腹腔注射，以磷酸緩沖液(PBS)為溶劑， MC-LR的注射量為50嗎kg—1 bwt，對照組直接注射PBS。 24 h后冰 凍麻醉，分離肝臟組織?？俁NA提取和cDNA第一鏈的合成同l.l。以P-肌動(dòng)蛋白為外參照，采用RT-PCR方法比較雜交羅非魚肝臟 的GSTA、 GPX基因mRNA相對水平，根據(jù)羅非魚GSTA、 GPX基 因序列設(shè)計(jì)特異引物D-ONGST01F:5、- AggATCCCAAAgAACgAg-3、和D-ONGST02R:5、- CAgAAACCTgCTgATggC -3、，擴(kuò)增1條332 bp的GSTA基因cDNA片段；ONGPXOF: 5、-CACCAAGAGAACT GCAAG -3、和ONGPXOR: 5-CACGTCATTCCTACACAC -3、擴(kuò)增1 條280 bp的GPX基因cDNA片段。
根據(jù)已發(fā)表的羅非魚P-肌動(dòng)蛋白(GenBank: AB037865)設(shè)計(jì)2 條特異引物D-ONACT01F:5、-CgTgACATCAAAgAgAAgC- 3、和D-ACT02R: 5、-TCTgCTggAAggTggACAg- 3\擴(kuò)增羅非魚P-肌動(dòng)蛋白 cDNA片段(436 bp)。
PCR反應(yīng)條件為94。C預(yù)變性3 min， 94°C 60s， 55°C 60s， 72 °C 60s，共30個(gè)循環(huán)，最后72'C延伸5 min。指數(shù)增長期內(nèi)終止反 應(yīng)。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳和溴化乙錠染色后用凝膠成像 系統(tǒng)及相關(guān)軟件(Alphalmaget， Alpha Inotech， USA)進(jìn)行分析，結(jié)果 以GSTA、 GPX基因mRNA分別與p-肌動(dòng)蛋白mRNA的RT-PCR產(chǎn) 物亮度之比(％)表示。
1.3統(tǒng)計(jì)分析
采用統(tǒng)計(jì)分析軟件SPSS 10.0對不同品系羅非魚肝臟GSTA、GPX 基因MC-LR誘導(dǎo)前后mRNA相對表達(dá)水平平均值差異進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分 析。若P〈0.05，平均值的差異即認(rèn)為是顯著的。
2、結(jié)果2.1微囊藻毒素對喂生物硒與不喂生物硒雜交羅非魚肝臟
GSTA、 GPX基因mRNA表達(dá)的影響
以p-肌動(dòng)蛋白為對照，測定微囊藻毒素對喂富硒酵母與不喂富硒 酵母羅非魚肝臟GSTA、 GPX基因mRNA表達(dá)的影響。如圖1所示， 按每公斤飼料中含富硒酵母0.5 g的量，不喂富硒酵母和喂富硒酵母 的雜交羅非魚(Oeoc/zram^ m'/oft'ci^O. )在MC-LR (50 jig kg隱l
body weight (bwt))腹腔注射24h后，其肝臟GSTA、 GPX基因mRNA 表達(dá)水平均沒有顯著差異。如圖2所示，按每公斤飼料中含富硒酵母 1.0 g的量，不喂生物硒與不喂生物硒雜交羅非魚在MC-LR (50昭 kg-1 bwt)腹腔注射24h后，其肝臟GSTA、 GPX基因mRNA表達(dá) 水平均有升高趨勢。
結(jié)果證明，在含富硒酵母0.5 1.0g/kg的干飼料添加濃度范圍內(nèi)， 隨著濃度的增高，毒素誘導(dǎo)后去毒相關(guān)基因GSTA、 GPX的誘導(dǎo)表達(dá) 作用越明顯，對機(jī)體的保護(hù)作用越強(qiáng)。
(二)含谷胱甘肽的魚詞料促進(jìn)魚類去毒基因表達(dá)的檢測
隨機(jī)挑選48尾尼羅羅非魚用于實(shí)驗(yàn)(平均體重17g)，其中，36 尾作為添加劑組喂食含還原型谷胱甘肽飼料(分別0.8、 1.0、 1.2 g/kg)， 12尾作為普通組喂食普通飼料，各組均飽食10天后處理，隨后每組 實(shí)驗(yàn)魚各12尾隨機(jī)分成2組，每組6尾在自然光照周期下飼養(yǎng)于室 內(nèi)，用于染毒試驗(yàn)。羅非魚染毒方式采用腹腔注射，以磷酸緩沖液(PBS) 為溶劑，MC-LR的注射量為50嗎kg—1 bwt，對照組直接注射PBS。 24 h后冰凍麻醉，分離肝臟組織。MC-LR為Alexis公司產(chǎn)品。以P-肌動(dòng)蛋白為外參照，采用RT-PCR方法比較羅非魚肝臟的G STA、 GPX和GSTR基因mRNA相對水平，根據(jù)羅非魚GSTA、 GP X和GSTR基因序列設(shè)計(jì)特異引物D-ONGST01F: 5、-AGGATCCC AAAGAACGAG-3、和D-ONGST02R: 5-CAGAAACCTGCTGATGG C-3、擴(kuò)增1條332 bp的sGSTA基因cDNA片段；ONGPXOF: 5、-C ACCAAGAGAACTGCAAG-3、和ONGPXOR: 5-CACGTCATTCCTA CACAC-3、擴(kuò)增1條280 bp的GPX基因cDNA片段；D-ONGSTR01 F: 5-GAGCACAAGTCCAAAGAAG-3、和D-ONGSTR02R: 5-GCA GATTGTGATACTCTCC-3、擴(kuò)增1條472 bp的sGSTA基因cDNA片 段。根據(jù)已發(fā)表的尼羅羅非魚P-肌動(dòng)蛋白設(shè)計(jì)2條特異引物D-ONA CT01F: 5-CgTgACATCAAAgAgAAgC-3、和D-ACT02R: 5、-TCTgC TggAAggTggACAg-3、擴(kuò)增羅非魚(3-肌動(dòng)蛋白cDNA片段(436 bp)。
PCR反應(yīng)條件為94。C預(yù)變性3 min， 94。C 60s， 55°C 60s， 72 °C 60s，共30個(gè)循環(huán)，最后72'C延伸5 min。指數(shù)增長期內(nèi)終止反 應(yīng)。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳和溴化乙錠染色后用凝膠成像 系統(tǒng)及相關(guān)軟件(Alphalmaget， Alpha Inotech, USA)進(jìn)行分析，結(jié)果 以GSTA、 GPX和GSTR基因mRNA分別與P-肌動(dòng)蛋白mRNA的 RT-PCR產(chǎn)物亮度之比(％)表示。
以p-肌動(dòng)蛋白為對照，測定微囊藻毒素對喂GSH與不喂GSH的 尼羅羅非魚肝臟GSTA、 GPX基因mRNA表達(dá)的影響。如圖3、 4所 示，當(dāng)每公斤干飼料中含0.8 g、 1.0 g GSH的量時(shí)，不喂GSH和喂 GSH的尼羅羅非魚在MC-LR (50嗎kg"bwt)腹腔注射24h后，其肝臟GSTA 、 GSTR基因mRNA表達(dá)水平變化不明顯，GPX基因mRNA 表達(dá)水平有升高趨勢。如圖5所示，當(dāng)每公斤干飼料中含1.2gGSH的 量時(shí)，不喂GSH和喂GSH的尼羅羅非魚在MC-LR (50嗎kg"bwt) 腹腔注射24h后，其肝臟GSTA、 GSTR、 GPX基因mRNA表達(dá)水平 均有升高趨勢。
結(jié)果證明，在含GSH0.8 1.2g/kg的干詞料添加濃度范圍內(nèi)，隨 著濃度的增高，毒素誘導(dǎo)后去毒相關(guān)基因GSTA、 GSTR、 GPX的誘 導(dǎo)表達(dá)作用越明顯，對機(jī)體的保護(hù)作用越強(qiáng)。
(三)含生物硒和谷胱甘肽的魚飼料促進(jìn)魚類去毒基因表達(dá)的檢測 尼羅羅非魚、鰱魚各24尾用于實(shí)驗(yàn)，分別取12尾作為添加劑組 (每公斤飼料中同時(shí)喂食富硒酵母0.6g/kg和GSH 1.0g/kg)， 12尾 作為普通組喂食普通飼料，兩組均飽食10天后處理，隨后每組實(shí)驗(yàn) 魚各12尾隨機(jī)分成2組，每組6尾在自然光照周期下飼養(yǎng)于室內(nèi)， 用于染毒試驗(yàn)。羅非魚染毒方式采用腹腔注射，以磷酸緩沖液(PBS) 為溶劑，MC-LR的注射量為50嗎kg—1 bwt，對照組直接注射PBS。 24h后冰凍麻醉，分離肝臟組織。MC-LR為Alexis公司產(chǎn)品。
以卩-肌動(dòng)蛋白為外參照，采用RT-PCR方法比較尼羅羅非魚、鰱 魚肝臟的GSTA、 GPX和GSTR基因mRNA相對水平，根據(jù)尼羅羅 非魚、鰱魚GSTA、 GPX和GSTR基因序列設(shè)計(jì)特異引物 D-ONGST01F: 5 - AGGATCCCAAAGAACGAG-3、； D-ONGST02R: 5-CAG AAACCTGCTGATGGC-3、； scGSTA01F: 5-GACCTTAAAGAACGGGCT-3、；scGSTA02R: 5-GGAACTTGCTGATTCTTGG-3、分別擴(kuò)增332、
334 bp的2條GSTA基因cDNA片段；
ONGPXOF: 5-CACCAAGAGAACTGCAAG -3、；
ONGPXOR: 5、-CACGTCATTCCTACACAC-3、；
scGPXOF: 5-GTGAACAGGAATGACATCG-3、；
scGPXOR: 5、-AGTGGACGGTCTATCTTGC-3、，分別擴(kuò)增280、
192 bp的2條GPX基因cDNA片段；
D-ONGSTR01F: 5-GAGCACAAGTCCAAAGAAG-3、； D-ONGSTR02R: 5-GCAGATTGTGATACTCTCC-3、； scGSTR01F: 5-TGTGCAGAAGTGAAGGCT-3、； scGSTR02R: 5、-CATAATACTCCATCAGTCG-3、，分別擴(kuò)增472、
457 bp的2條GSTR基因cDNA片段。
根據(jù)已發(fā)表的羅非魚、鰱魚(3-肌動(dòng)蛋白設(shè)計(jì)條特異引物
D-ONACT01F:5，-CgTgACATCAAAgAgAAgC- 3，；
scACT01F:5，-CGTGACATCAAGGAGAAGC-3，；
D-ACT02R:5，-TCTgCTggAAggTggACAg-3，，均擴(kuò)增羅非魚、鰱魚p-肌動(dòng)蛋白cDNA片段(436 bp)。
PCR反應(yīng)條件為94。C預(yù)變性3 min， 94°C 60s， 55°C 60s， 72 °C 60s，共30個(gè)循環(huán)，最后72'C延伸5 min。指數(shù)增長期內(nèi)終止反 應(yīng)。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳和溴化乙錠染色后用凝膠成像 系統(tǒng)及相關(guān)軟件(Alphalmaget, Alpha Inotech, USA)進(jìn)行分析，結(jié)果 以GSTA、 GSTR、 GPX基因mRNA分別與p-肌動(dòng)蛋白mRNA的RT-PCR產(chǎn)物亮度之比(％)表示。
以P-肌動(dòng)蛋白為對照，測定微囊藻毒素對喂生物硒和GSH、不 喂食生物硒和GSH的羅非魚、鰱魚肝臟GSTA、 GSTR、 GPX基因 mRNA表達(dá)的影響。如圖6、 7所示，按每公斤飼料中喂生物硒0.6 g 禾口GSH1.0g的量，不喂添加劑和喂添加劑的羅非魚、鰱魚在MC-LR (50略kg—、wt)腹腔注射24h后，檢測其肝臟GSTA、 GSTR、 GPX基 因mRNA表達(dá)水平變化。研究發(fā)現(xiàn)，羅非魚喂食添加劑的各實(shí)驗(yàn)組 GSTA、 GSTR、 GPX基因mRNA表達(dá)水平比不喂食添加劑的各實(shí)驗(yàn) 組高，喂食添加劑且未染毒實(shí)驗(yàn)組比喂食添加劑且MC-LR毒素染毒 后的實(shí)驗(yàn)組GSTA、 GSTR基因表達(dá)水平稍低，GPX基因表達(dá)水平升 高；鰱魚喂食添加劑的各實(shí)驗(yàn)組GSTA、 GSTR、 GPX基因mRNA表 達(dá)水平比不喂食添加劑的各實(shí)驗(yàn)組高，喂食添加劑且未染毒實(shí)驗(yàn)組比 MC-LR毒素染毒后的實(shí)驗(yàn)組GPX基因表達(dá)水平均升高，鰱魚GSTA 基因表達(dá)水平升高。結(jié)果證明喂食含有喂生物硒和GSH添加劑的魚 飼料可使魚類肝臟中去毒相關(guān)基因有不同程度的升高，從而保護(hù)機(jī)體 受外源毒素的損傷。生物灑和谷胱甘肽在作為魚飼料添加劑中的應(yīng)用序列表 SEQUENCE LISTING
<110> 暨南大學(xué)
<120>生物硒和谷胱甘肽在作為魚飼料添加劑中的應(yīng)用
<130>
〈歸 14
<170> Patenl In version 3.5
<210> 1
<211> 18
<212〉 DNA <213〉人工序列
<柳> 1
aggatcccaa agaacgag 18
<210> 2
〈211〉 18
<212> DNA <213〉人工序'列
<400> 2
cagaaacctg ctgatggc 18
<210> 3
〈211〉 18
<212〉 D貼
<213> 人工序列
<400> 3
caccaagaga actgcaag 18
<210> 4
<211> 18
<212> , <213>人工序列
<400> 4
cacgtcattc ctacacac
<210〉 5
<211> 19
<212> 鵬 <213>人工序列
<400〉 5
cgtgacatca aag縛aagc
<210〉 6
<211> 19
<212〉 DNA <213>人工序列
<400> 6
tctgctggaa ggt鵬cag
<210> 7
〈211> 19
<212> DM <213>人工序列
<400〉 7
gagc3C3agt cc;taag33g
權(quán)利要求
1、生物硒和谷胱甘肽在作為魚飼料添加劑中的應(yīng)用，其特征在于所述應(yīng)用為在魚飼料中同時(shí)加入生物硒和谷胱甘肽。
2、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的應(yīng)用，其特征在于所述生物硒為富硒 酵母，其用量為每公斤干粉飼料中含有富硒酵母0.5 1，0克。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的應(yīng)用，其特征在于所述谷胱甘肽 的用量為每公斤干粉飼料中含有谷胱甘肽0.8~1.2克。
全文摘要
本發(fā)明公開一種生物硒和谷胱甘肽在作為魚飼料添加劑中的應(yīng)用，其中生物硒的用量為每公斤干粉飼料中含有富硒酵母0.5～1.0克，谷胱甘肽的用量為每公斤干粉飼料中含有谷胱甘肽0.8～1.2克。根據(jù)本發(fā)明的應(yīng)用所制備的添加有生物硒和谷胱甘肽的魚飼料，能夠促進(jìn)魚類去毒基因的表達(dá)，特別是I、II時(shí)相代謝去毒相關(guān)基因的表達(dá)，不僅增強(qiáng)魚類抵抗外界毒物的能力，有利于魚類通過自身的代謝體系分解排除微囊藻毒素以及藥物毒素，從而保證魚類食用的安全性，不需對養(yǎng)成的水產(chǎn)品進(jìn)行任何專門處理，也不需任何專門的加工裝置，極大地降低了食用魚的后期處理成本，更加環(huán)保經(jīng)濟(jì)。
文檔編號(hào)A23K1/16GK101438768SQ20081002924
公開日2009年5月27日 申請日期2008年7月4日 優(yōu)先權(quán)日2008年7月4日
發(fā)明者珊 何, 劉秀霞, 李光照, 李觀貴, 群 林, 梁旭方, 琳 王, 程偉軒, 胡永樂, 陳小佳 申請人:暨南大學(xué)