專利名稱：番茄黃化曲葉病毒病的嫁接接種鑒定法的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及番茄黃化曲葉病毒病的接種法。
背景技術(shù)：
番茄黃化曲葉病毒病是一由煙粉虱(5^^^ ^&d)傳播的雙生病毒，隨 著近年來(lái)煙粉虱的大發(fā)生，番茄黃化曲葉病毒病成逐年加重趨勢(shì)。因此， 建立番茄黃化曲葉病毒病接種鑒定方法并對(duì)現(xiàn)有的品種或品系進(jìn)行抗病性 鑒定已經(jīng)迫在眉睫。
目前，文獻(xiàn)H. Delatte, H. Holota, B. Reynaud and J. Dintinger. Characterisation of a quantitative resistance to vector transmission of 7bmato ye〃ovv /ea/ ci/W vz'rus in Z^ycopers/cow _p/mp/we//i/b/z'wAn[J]. European Journal of Plant Pathology (2006) 114:245—253報(bào)道了一種采用煙粉虱(5e附Wa to&c/)
接種鑒定法，但是，該方法存在一些明顯的缺陷1、受煙粉虱的繁殖生長(zhǎng) 季節(jié)限制，由于煙粉虱多在夏秋季發(fā)生，冬春季煙粉虱很少，所以很難在
冬春季進(jìn)行煙粉虱接種鑒定。2、受煙粉虱發(fā)生地域的限制，由于煙粉虱多
在我國(guó)的南方地區(qū)發(fā)生，因此在北方地區(qū)無(wú)法糴用煙粉虱接種鑒定發(fā)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種番茄黃化曲葉病毒病的嫁接接種鑒定法，以 克服現(xiàn)有技術(shù)存在的上述缺陷。
本發(fā)明的方法包括如下步驟 (1)選取感染了黃化曲葉病毒病的番茄作砧木，對(duì)待鑒定的材料進(jìn)行育苗，待兩片真葉時(shí)，采用斜切接法將其嫁接到感病砧木上，嫁接后的前5
天，保持90 95%的濕度，溫度為20 25。C，遮光育苗，嫁接5天以后， 在40 70%的濕度，溫度為25 3(TC的條件下正常培養(yǎng)育苗；
對(duì)待鑒定的材料進(jìn)行育苗期間，采用阿克泰防止煙粉虱的侵染； 術(shù)語(yǔ)"斜切接法"在文獻(xiàn)紀(jì)偉鋒.番茄嫁接技術(shù)[J].西南科技大學(xué)學(xué) 報(bào).2005.01:68-69.中有詳細(xì)的描述；
(2)嫁接后的15 40天內(nèi)，提取接穗的DNA，用PCR法檢測(cè)接穗中 是否已經(jīng)含有番茄黃化曲葉病毒病。
所述的PCR法為一種常規(guī)的方法，在文獻(xiàn)Zhang Yongping,Zhu weimin CuiHuimei.Molecular identification and the complete nucleotide sequence of TYLCV isolate from Shanghai ofChina[J] .Virus Genes,DOI
10.1007/s 11262-008-0226-0.中有詳細(xì)的報(bào)道。
所說(shuō)的番茄的品種選自2300或2583，可采用市售的產(chǎn)品；
本接種鑒定方法有以下優(yōu)點(diǎn)-
能保證接種鑒定的準(zhǔn)確性，接種鑒定方法簡(jiǎn)單，可以一年四季或在沒(méi) 有煙粉虱發(fā)生的地區(qū)采用嫁接法進(jìn)行接種鑒定。


圖1為實(shí)施例1的嫁接15天后提取接穗DNA檢測(cè)番茄黃化曲葉病毒 病圖片。
圖2為實(shí)施例1的嫁接30天后提取接穗DNA檢測(cè)番茄黃化曲葉病毒 病圖片。
圖3為實(shí)施例2的嫁接15天后提取接穗DNA檢測(cè)番茄黃化曲葉病毒 病圖片。圖4為實(shí)施例2的嫁接30天后提取接穗DNA檢測(cè)番茄黃化曲葉病毒 病圖片。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1
番茄的品種選自2300。
(1) 選取感染了黃化曲葉病毒病的番茄作砧木，對(duì)待鑒定的材料進(jìn)行 育苗，待兩片真葉時(shí)，采用斜切接法將其嫁接到感病砧木上，嫁接后的前3 天，保持90%的濕度，溫度為2(TC，遮光育苗，嫁接5天以后，在50%的 濕度，溫度為25t:的條件下正常培養(yǎng)育苗；
對(duì)待鑒定的材料進(jìn)行育苗期間，采用阿克泰防止煙粉虱的侵染；
(2) 嫁接后的15天，30天，分別提取接穗的DNA，用PCR法檢測(cè)
接穗中是否已經(jīng)含有番茄黃化曲葉病毒病；
具體的步驟如下 接穗的DNA提取方法
1. 1.5ml離心管加入離心管蓋大小的新鮮葉片2片；
2. 加入液氮，用尖頭玻棒輕輕研磨，然后加入250^ilCTAB混合均勻；
3. 65。C水浴lh;
4. 置于4'C冰箱或室溫冷卻至15'C以下；
5. 加入250^il24:l氯仿/異戊醇，上下混勻5min，保證樣品和氯仿充分 混合；
6. 12000rpm離A、10min;
7. 取上清液200pl，加入預(yù)先加好200pl異丙醇的1.5ml離心管中，輕輕 上下顛倒混勻；8. 4'C冰箱靜置30min以上；
9. 12000rpm離心10min，棄上清液；
10. 吹干DNA，讓異丙醇揮發(fā)干凈；
11. 加入1 OOjil ddH20 (含1 |il 1 Omg/ml的RNase )溶解DNA;
12. 37"C水浴或室溫1小時(shí)去除RNA。
PCR法檢測(cè)方法 引物序列
CoPR， 5'〉GA(AGCT)G(GC)AT G(ACT)GT(AG)CA (AGT)GCCATATA〈3'
AV494, 5，〉GCC (CT) AT (AG) TA (CT) AG (AG) AAGCC (AC) AG<3，。
PCR反應(yīng)條件
10mmol/L dNTP 0.5 [xl， 25mmol/LMgcl2 1.5(il，10*PCR Buffer 2.5(il, COPR和AV494各2.5)al， Taq酶0.2U，力口ddH20使體系為25^il。PCR程序?yàn)?4" 預(yù)變性4min; 94。C變性lmin， 50。C退火45s, 72。C延伸45s， 35個(gè)循環(huán)；72°C 延伸10min。取PCR產(chǎn)物15[！1，于1.5°/。瓊脂糖電泳，觀察結(jié)果。
圖1為嫁接15天后提取接穗DNA檢測(cè)番茄黃化曲葉病毒病圖片； 圖2為嫁接30天后提取接穗DNA檢測(cè)番茄黃化曲葉病毒病圖片。 圖2為嫁接30天后提取接穗DNA檢測(cè)番茄黃化曲葉病毒病圖片。 結(jié)果表明
嫁接15天時(shí)僅在部分接穗體內(nèi)檢測(cè)到TYLCV病毒，而嫁接30天時(shí)， 在接穗中都檢測(cè)到TYLCV病毒。說(shuō)明嫁接可以有效的傳播番茄黃化曲葉病毒。嫁接后接穗傳毒，但接穗表現(xiàn)癥狀所需的時(shí)間相對(duì)煙粉虱接種法要長(zhǎng)，
嫁接后40天才在所有接穗中觀察到病癥。
由此可見(jiàn)，采用待鑒定品種作接穗嫁接到感病植株上，嫁接40天后進(jìn) 行病害調(diào)查可以作為番茄黃化曲葉病毒病的接種鑒定方法。
實(shí)施例2
番茄的品種選自2583。
1)選取感染了黃化曲葉病毒病的番茄作砧木，對(duì)待鑒定的材料進(jìn)行育 苗，待兩片真葉時(shí)，采用斜切接法將其嫁接到感病砧木上，嫁接后的前5 天，保持95%的濕度，溫度為25'C，遮光育苗，嫁接5天后，在70%的濕 度，溫度為3(TC的條件下正常培養(yǎng)育苗；
對(duì)待鑒定的材料進(jìn)行育苗期間，采用阿克泰防止煙粉虱的侵染；
(2)嫁接后的15天，30天，分別提取接穗的DNA，用PCR法檢測(cè)
接穗中是否已經(jīng)含有番茄黃化曲葉病毒??；
具體的步驟如下-接穗的DNA提取方法
1、 1.5ml離心管加入離心管蓋大小的新鮮葉片l 2片。2、加入液氮，用尖
頭玻棒輕輕研磨，然后加入'250plCTAB混合均勻。3、 65。C水浴lh。 4、置
于4t:冰箱或室溫冷卻至15。C以下。5、加入250^il24:l氯仿/異戊醇，上下混
勻5min，保證樣品和氯仿充分混合。6、 12000rpm離心10min。 7、取上清液
20(Hd，加入預(yù)先加好200pl異丙醇的1.5ml離心管中，輕輕上下顛倒混勻。8、
4。C冰箱靜置30min以上。9、 12000rpm離心10min，棄上清液。10、吹干DNA，
讓異丙醇揮發(fā)干凈。11、加入100nlddH20 (含l)il 10mg/ml的RNase)溶解
DNA。 12、 37"C水浴或室溫1小時(shí)去除RNA。PCR法檢測(cè)方法 引物序列
AV494, 5，>GCC (CT) AT (AG) TA (CT) AG (AG) AAGCC (AC) AG<3,。
PCR反應(yīng)條件10mmol/LdNTP0.5 pJ， 25mmol/LMgcl2 1.5nU0*PCR Buffer 2.5^d,COPR和AV494各2.5^d， Taq酶0.2U，力口ddH20使體系為25pl。 PCR程序?yàn)?4。C預(yù)變性4min; 94。C變性lmin， 5(TC退火45s， 72""C延伸45s， 35個(gè)循環(huán)；72。C延伸10min。取PCR產(chǎn)物15jxl，于1.5%瓊脂糖電泳，觀察結(jié)果。
圖3為嫁接15天后提取接穗DNA檢測(cè)番茄黃化曲葉病毒病圖片。圖 4為嫁接30天后提取接穗DNA檢測(cè)番茄黃化曲葉病毒病圖片 結(jié)果表明
嫁接15天時(shí)僅在部分接穗體內(nèi)檢測(cè)到TYLCV病毒，而嫁接30天時(shí)， 在接穗中都檢測(cè)到TYLCV病毒。說(shuō)明嫁接可以有效的傳播番茄黃化曲葉病 毒。嫁接后接穗傳毒，但接穗表現(xiàn)癥狀所需的時(shí)間相對(duì)煙粉虱接種法要長(zhǎng)， 嫁接后40天才在所有接穗中觀察到病癥。
由此可見(jiàn)，采用待鑒定品種作接穗嫁接到感病植株上，嫁接40天后進(jìn) 行病害調(diào)査可以作為番茄黃化曲葉病毒病的接種鑒定方法。 .
權(quán)利要求
1.番茄黃化曲葉病毒病的嫁接接種鑒定法，其特征在于，包括如下步驟(1)選取感染了黃化曲葉病毒病的番茄作砧木，對(duì)待鑒定的材料進(jìn)行育苗，待兩片真葉時(shí)，采用斜切接法將其嫁接到感病砧木上，嫁接后的前3～5天，保持90～95％的濕度，溫度為20～25℃，遮光育苗，嫁接5天以后，在40～70％的濕度，溫度為25～30℃的條件下正常培養(yǎng)育苗；(2)嫁接后的15～40天內(nèi)，提取接穗的DNA，用PCR法檢測(cè)接穗中是否已經(jīng)含有番茄黃化曲葉病毒病。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，對(duì)待鑒定的材料進(jìn)行育苗期間，采用阿克泰防止煙粉虱的侵染。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，所說(shuō)的番茄的品種選自2300或2583。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種番茄黃化曲葉病毒病的嫁接接種鑒定法，括如下步驟(1)選取感染了黃化曲葉病毒病的番茄作砧木，對(duì)待鑒定的材料進(jìn)行育苗，待兩片真葉時(shí)，采用斜切接法將其嫁接到感病番茄砧木上，嫁接后的前3～5天，保持90～95％的濕度，溫度為20～25℃，遮光育苗，嫁接5天以后，在40～70％的濕度，溫度為25～30℃的條件下正常培養(yǎng)育苗；(2)嫁接后的15～40天內(nèi)，提取接穗的DNA，用PCR法檢測(cè)接穗中是否已經(jīng)含有番茄黃化曲葉病毒病。本發(fā)明能保證接種鑒定的準(zhǔn)確性，接種鑒定方法簡(jiǎn)單，可以不受煙粉虱發(fā)生時(shí)間和地域的限制，可以一年四季或在沒(méi)有煙粉虱發(fā)生的地區(qū)采用嫁接法進(jìn)行接種鑒定。
文檔編號(hào)A01G1/06GK101560571SQ20081003612
公開(kāi)日2009年10月21日 申請(qǐng)日期2008年4月16日 優(yōu)先權(quán)日2008年4月16日
發(fā)明者萬(wàn)延慧, 力 于, 朱為民, 朱龍英 申請(qǐng)人:上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院