專利名稱：：藏波羅花苯丙素苷組合物及其制備方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及天然藥物的化合物及其制備方法和用途。具體涉及從傳統(tǒng)藏藥藏波羅花中提取的總苯丙素苷類組合物及其制備方法，以該類組合物作為抗氧化藥物/保健品上的用途，及作為食品、飼料用抗氧化添加劑的用途。技術(shù)背景由于環(huán)境因素、飲食因素、生活因素的影響，現(xiàn)代人體內(nèi)自由基代謝常常容易失去平衡。自由基的生成和清除的平衡對(duì)于生命過程的正常進(jìn)行非常重要，只有氧自由基的產(chǎn)生和清除處于平衡時(shí)，身體才能保持健康。自由基過多或清除能力不足，體內(nèi)就有多余的自由基，引起組織損傷，脂質(zhì)過氧化，酶失活，蛋白質(zhì)變化，DNA突變，免疫功能低下，導(dǎo)致疾病的發(fā)生，最明顯的是癌癥、心腦血管疾病和衰老的發(fā)生。抑制脂質(zhì)過氧化物生成的藥物可以保護(hù)組織免受自由基損傷，有補(bǔ)虛，扶正固體的功能，對(duì)多種疾病有防治意義并有較廣的保健作用，它不但可以延緩衰老，而且還可以減少心、腦血管疾病和癌癥的發(fā)生，還具有美容作用。隨著國內(nèi)外對(duì)食品質(zhì)量和安全的廣泛關(guān)注，如何防止食品變質(zhì)，保障人體備康日顯重要。為了提高食品的抗氧化性能，預(yù)防食物氧化，主要依靠在食品中加入抗氧化劑，以防止食品，特別是油脂的氧化。在畜牧業(yè)養(yǎng)殖中，為保障動(dòng)物機(jī)體抗氧化防御系統(tǒng)的防御能力，防止細(xì)胞和組織的損傷，銅料中必須包括各種抗氧化劑。隨著家畜使用年限的延長，防止氧化對(duì)健康和免疫狀態(tài)造成損害是極其重要的，寵物、奶牛和種禽對(duì)自由基很敏感，需要不斷攝人含有抗氧化劑的日糧和氧化穩(wěn)定性好的飼料。缺乏抗氧化劑則會(huì)引起很多不良反應(yīng)，如奶牛乳房炎、乳房水腫和繁殖機(jī)能下降等與氧化應(yīng)激有關(guān)。傳統(tǒng)合成的抗氧化劑雖然抗氧化能力比較強(qiáng)，但長期食用有潛在的毒性，有的甚至?xí)a(chǎn)生致畸、致癌作用，因此愈來愈受到人們的排斥。如，1977年，美國FDA宣布食品中禁止使用2，6—二叔丁基對(duì)甲酚(BHT)，日本厚生省也曾在l982年宣布禁用丁基羥基回香醚(BHA)及叔丁基對(duì)苯酚(TBHQ)。尋找天然、高效、低毒的植物天然抗氧化劑成為了一種必然趨勢，又因其在自然界中的分布廣泛、抗氧化活性強(qiáng)而倍受關(guān)注。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的正是為了克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足而提供一種從藏波羅花中制備苯丙素苷組合物(化合物藏苷A和藏苷B)的制備方法；提供以苯丙素苷類化合物為有效活性成份的藥物組合物制劑，及其在作為抗氧化藥物及保健品，如，抗衰老上的用途；提供以苯丙素苷類化合物為有效活性成份用于供食品/飼料抗氧化劑用途的組合物。本藏波羅花生于海拔3600-5400米的高山灌叢草地或高山草地，分布于西藏和青海，為青藏高原所特有的物種。據(jù)西藏民間醫(yī)藥傳統(tǒng)記載，藏波羅花的根可入藥，有補(bǔ)養(yǎng)氣血、消炎止痛，祛風(fēng)除濕等功效，是中國藏、蒙、彝、傈僳等多個(gè)民族常用草藥。藏波羅花資源豐富，為傳統(tǒng)安全的藏藥。藏波羅花雖然為我國藏、蒙、彝、傈僳等多個(gè)民族常用草藥，但國內(nèi)外關(guān)于其藥效學(xué)及相關(guān)研究未見報(bào)道。申請(qǐng)人前期還對(duì)藏波羅花進(jìn)行抗氧化相關(guān)研究，利用離體測定方法與在體動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)表明藏波羅花苯丙素苷化合物具有顯著抗氧化、抗衰老作用。相關(guān)研究也未見報(bào)道。本發(fā)明的目的由以下技術(shù)措施來實(shí)現(xiàn)一種由藏波羅花苯丙素苷化合物組成的組合物，含由藏波羅花苯丙素苷化合物A和藏波羅花苯丙素苦化合物B,分別簡稱為藏苷A和藏苷B，其組合物兩者重量比為60—90:40—10,兩者含量之和占總苯丙素苷總重量的70%—100%，其中(1)藏苷A的結(jié)構(gòu)為<formula>formulaseeoriginaldocumentpage7</formula>(2)藏苷B的結(jié)構(gòu)為<formula>formulaseeoriginaldocumentpage8</formula>上述藏波羅花苯丙素苷組合物的制備方法有三種，分別是方法l.取粉碎細(xì)度達(dá)40-200目的藏波羅花藥材，用水、30%-90%的乙醇溶劑或乙酸乙酯分別提取，其中，藏波羅花粉碎物與溶劑的重量/容量比為1:2~20,將按比例混合好的藏波羅花粉碎物與上述溶劑置于提取釜中，提取溫度為30°C~80°C,提取液濃縮后得相應(yīng)的水提取濃縮物、醇溶劑提取濃縮物或乙酸乙酯提取濃縮物，用交換柱進(jìn)行層析，用低級(jí)醇水溶液梯度洗脫，收集其濃度>60%的低級(jí)醇水溶液洗脫部位，得到主要含藏苷A和藏苷B成分的組合物；通過硅膠柱吸附進(jìn)一步精制，用20%乙醇淋洗除雜，再用低級(jí)醇和乙酸乙酯或正丁醇混合液，即低級(jí)醇乙酸乙酯或正丁醇=1:0.5~5洗脫，體積為生藥體積的5—15倍，收集>60%洗脫液，濃縮至無有機(jī)溶劑味，干燥后粉碎、噴霧干燥或冷凍干燥，即得。方法2.取粉碎細(xì)度達(dá)40-200目的藏波羅花藥材，用水、30%-90%的乙醇溶劑或乙酸乙酯分別提取，濃縮后得水提取濃縮物、醇溶劑提取濃縮物或乙酸乙酯提取濃縮物，按濃縮物與乙酸乙酯的重量/容量比為1:2~20,進(jìn)行萃取，濃縮萃取液，得到主要含藏苷A和藏苷B成分的組合物；通過硅膠柱吸附進(jìn)一步精制，用20%乙醇淋洗除雜，再用低級(jí)醇和乙酸乙酯或正丁醇混合液，即低級(jí)醇乙酸乙酯或正丁醇=1:0.5~5洗脫，體積為生藥體積的5~15倍，收集>60%洗脫液，濃縮至無有機(jī)溶劑味，干燥后粉碎、噴霧干燥或冷凍干燥，即得。方法1取粉碎細(xì)度達(dá)40-200目的藏波羅花藥材，用水、醇溶劑和/或乙酸乙酯提取，濃縮后得水提取濃縮物、醇溶劑提取濃縮物或乙酸乙酯提取濃縮物，按濃縮物與乙酸乙酯的重量/容量比為1:2~20，進(jìn)行萃取，濃縮萃取液，用交換柱進(jìn)行層析，用低級(jí)醇水溶液梯度洗脫，收集其濃度>60%的低級(jí)醇水溶液洗脫部位，得到主要含藏苷A和藏苷B成分的組合物；通過硅膠柱吸附進(jìn)一步精制，用20%乙醇淋洗除雜，再用低級(jí)醇和乙酸乙酯或正丁醇混合液，即低級(jí)醇乙酸乙酯或正丁醇=1:0.5~5洗脫，體積為生藥體積的5~15倍，收集>60%洗脫液，濃縮至無有機(jī)溶劑味，干燥后粉碎、噴霧干燥或冷凍干燥，即得。方法l、2或3所用的低級(jí)醇為甲醇、乙醇、丙醇即C1-C5醇類，其重量濃度為30%~90%。所用的交換柱釆用聚酰胺，其型號(hào)為30-60/60-100/100-120目、大孔吸附樹脂，其型號(hào)為HPD-100HPD-100A或HPD-400HPD-400A或離子交換樹脂，其型號(hào)為D001或D113。精制用的硅膠柱規(guī)格是40-80目、60-100目或200-300目。將藏歡羅花苯丙素苷組合物，藏苷A和藏苷B制備成制劑，該制劑是粉劑、片劑、膠囊、顆粒劑、緩釋片、緩釋膠囊、滴丸或液體制劑。制劑應(yīng)用于臨床治療因相關(guān)自由基損傷導(dǎo)致的衰老、動(dòng)脈粥樣硬化、缺血再灌注損傷等的疾病。將藏波羅花苯丙素苷組合物，藏苷A和藏苷B制備成食品/飼料抗氧化制劑，是將藏波羅花總苯丙素苷組合物粉碎成為粒徑為20-150jim的粉狀物，添加適量微晶纖維素、淀粉、梭甲基纖維素鈉，按常規(guī)方法制成，制劑中藏波羅花總苯丙素苷的含量為4.0%-15%,其它成分為藥物輔料，制作出的成品是粉劑。應(yīng)用于制備食品、飼料、飲料的抗氧化制劑。藏波羅花總苯丙素苷有效成分化合物的分離和鑒定取藏波羅花總苯丙素苷10g,加l-3倍量的硅膠攪拌，過硅膠柱，先用水沖洗至無色，再用二氯甲烷-甲醇(5:1)洗脫，收集洗脫液，干燥，得活性最佳組分V。取上述組分100mg，用甲醇溶解，進(jìn)行半制備液相色譜分離純化，色譜條件phenomenexC18反相半制備柱，以不同比例的甲醇一水作為流動(dòng)相，紫外檢測器檢測，收集出峰流份，組分V-1的流動(dòng)相為甲醇一水(25:75)，得淡黃色粉末59mg,為化合物A;組分V-2的流動(dòng)相為甲醇一水(45:65)，得白色粉末13mg,為化合物B。分別采用ESI-MS,1H-麗R，13C-麗R，DEPT,1H-1HCOSY,HSQC，HMBC，NOESY，TOCSY,GC-MS對(duì)化合物A和B進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。通過催分辨ESI-MS得出化合物A和B的分子量均為624，進(jìn)一步通過高分辨HRESI-MS得出它們的分子式均為C29H36015。通過1D-麗R(1H麗R，13C畫R,DEPT)和2D-應(yīng)R(1H-1HCOSY，HSQC,瞧C，NOESY和TOCSY)解析兩個(gè)化合物的結(jié)構(gòu)；并進(jìn)行了化合物A和B水解單糖硅烷化衍生物的GC-MS鑒定，得出化合物A和B的甲基五碳糖均為L-鼠李糖，六碳糖均為D-葡萄糖。鑒定確定的化合物A結(jié)構(gòu)為P-D-Glucopyranoside，2-(3，4-dihydroxyphenyl)ethyl-3-0_(6-deoxy-a-L-man,yranosyl)-,4-[(2E)-3-(3，4-dihydroxyphenyl)-2-propenoate](9CI);鑒定確定的化合物B結(jié)構(gòu)為P-D-Glucopyranoside，2-(3，4-dihydroxyphenyl)ethyl-3-O-(6-deoxy-oc-L-man,yranosyl)-,6-[(2E)_3-(3,4-dihydroxyphenyl)-2-propenoate](9CI)?；衔顰和B均為苯丙素苷化合物，分別稱為藏波羅花苯丙素苷A、藏波羅花苯丙素苷B(簡稱藏苷A和藏苷B)，其結(jié)構(gòu)式見前述。藏波羅花總苯丙素苷樣品中有效成分化合物A和B(藏苷A和藏苷B)的含量測定釆用高效液相色譜法進(jìn)行。分析條件流動(dòng)相釆用乙腈-水(25/75,v/v);流速為1.Oml/min;定量分析的檢測菠長為330nm;柱溫設(shè)置為25'C;進(jìn)樣量20nl。純品化合物A和B用作外標(biāo)，它們分別于乙腈-水(25/75，v/v)中配置成1.Omg/ml的母液。兩種母液分別用乙腈-水(25/75，v/v)按l/2，1/3，1/4和1/5倍進(jìn)行稀釋得到0.50，0.33，0.25和0.20mg/mL濃度的幾種用于分析的溶液。這四種標(biāo)準(zhǔn)液和母液通過分析型HPLC來制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。藏波羅花總苯丙素苷樣品用乙腈-水(25/75,v/v)配置成1.Omg/ml的樣品溶液，樣品溶液在進(jìn)行分析前要用0."n膜進(jìn)行過濾。每個(gè)樣品重復(fù)測定三次。通過標(biāo)準(zhǔn)曲線來求得樣品中藏苷A和藏苷B的含量。經(jīng)多次檢測，藏波羅花總苯丙素苷中，藏苷A和藏苷B含量比例(重量)為60_90:40—10,兩者含量之和在60%(重量)以上。本發(fā)明藏波羅花總苯丙素苷經(jīng)離體測定方法與在體動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)表明具有顯著抗氧化、抗衰老作用。藏波羅花總苯丙素苷(簡寫ZZBG)活性作用試驗(yàn)1.抗氧化活性的測定超氧陰離子清除實(shí)驗(yàn)、羥自由基清除實(shí)驗(yàn)和過氧化脂質(zhì)抑制實(shí)驗(yàn)是目前檢測藥物體外抗氧化的常用指標(biāo)，本發(fā)明用這三個(gè)指標(biāo)分別對(duì)藏波羅花總苯丙素苷(ZZBG)與有效成分藏苷A和藏苷B體外抗氧化活性進(jìn)行了測定。結(jié)果見表1。ZZBG、藏苷A或B清除超氧陰離子(0'2-)的能力藏苷A或B〉ZZBG(36.0%)〉Vc(34.5%)。ZZBG、藏苷A或B對(duì)羥自由基HFR('0H)的清除藏苷A或B-苯甲酸〉ZZBG(300min)>Vc(120min)>空白(15min)。ZZBG的效果略低于苯甲酸，但顯著強(qiáng)于Vc。ZZBG、藏苷A或B對(duì)小鼠肝組織過氧化脂質(zhì)(LPO)抑制活性藏苷A或B-ZZBG(-97.2%)〉BHT(-57.6%)〉Vc(206.3%)。ZZBG、藏苷A或B的效果顯著強(qiáng)于BHT(0.5mg/ml的Vc無抑制LPO的作用，反而有強(qiáng)烈的促氧化作用)。體外抗氧化活性測定結(jié)果表明，ZZBG、藏苷A或B具有極其顯著的抗氧化活性。其綜合抗氧化能力強(qiáng)于陽性對(duì)照(苯甲酸，Vc，BHT)。ZZBG、藏苷A或B可用于制備動(dòng)物(包括人)用抗氧化藥物；也可用于制備食品或飼料用抗氧化劑。表1.藏波羅花總苯丙素苷(ZZBG)、藏苷A和藏苷B體外抗氧化活性(濃度0.5mg/ml)LPO處理OY(抑制率％)'OH(min)(ranol/g組織)3同對(duì)照比±S.D.空白-15404.58±0.81-ZZBG46.0%31811.53±0.95**-97.2%藏苷A49.3%3304.72±0.72**-98.8%藏苷B45.4%3304.44±0.45林-98.9%Vc34.5%1201239.03±2.33**206.3%冊(cè)T'-—171.39±0.72**-57.6%苯甲酸-345--"用SAS軟件進(jìn)行t檢驗(yàn):承求P<0.01;承P<0.05;2.抗衰老活性果蠅是雙翅目果蠅屬昆蟲，其許多代謝途徑，生理功能及發(fā)育階段同哺乳動(dòng)物相似，具有與人類相似的生長發(fā)育，繁殖和衰老階段，用它作材料進(jìn)行壽命實(shí)驗(yàn)，其結(jié)果具有一定的參考價(jià)值。果蠅用作研究抗衰老藥物的模型動(dòng)物之一，還具有下列特點(diǎn)高度純種；生存期短，在正常情況下的平均壽命為60d左右；繁殖快，Ud左右即完成一個(gè)世代，且每個(gè)受精的雌果娓可產(chǎn)卵400~500個(gè)，因此在短時(shí)間內(nèi)就可獲得大量實(shí)驗(yàn)動(dòng)物；判斷藥效的觀察指標(biāo)明確可靠。本發(fā)明利用果蠅進(jìn)行ZDTW抗衰老活性實(shí)驗(yàn)材料，利用果蠅生存(壽命)與果蠅體內(nèi)抗氧化的生化指標(biāo)實(shí)驗(yàn)判斷ZDTW抗衰老活性。(1)果蠅生存(壽命)實(shí)驗(yàn)果蠅壽命實(shí)驗(yàn)由表2可知在雌性和雄性果蠅壽命實(shí)驗(yàn)中，藏波羅花總苯丙素苷(ZZBG)組與空白組比較，具有極顯著性差異(p<0.01)。表2.果蠅壽命實(shí)驗(yàn)統(tǒng)計(jì)<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>用SAS軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)P〈0.05;(2)果蠅體內(nèi)抗氧化的生化指標(biāo)測定ZZBG果繩體內(nèi)抗氧化的生化指標(biāo)測定結(jié)果見表3。ZZBG對(duì)果蠅體內(nèi)超氧化物歧化酶(SOD)清除氧自由基的能力的影響Vc組、ZZBG與空白組比較，均具有差異極顯著性(P<0.01);ZZBG對(duì)果蠅體內(nèi)谷胱甘肽過氧化物酶GSH-Px活性的影響與空白組比較,陽性組Vc無提高GSH-Px活性的作用。ZZBG對(duì)GSH-Px活性明顯提高，為20.8%。ZZBG對(duì)果蠅體內(nèi)CAT活性的影響ZZBG與空白相比具有顯著差異(p<0.01)，Vc效果最好(5.6%)。ZZBG對(duì)果蠅體內(nèi)MDA含量的作用ZZBG具有明顯的降低果蠅體內(nèi)MDA含量的作用。表3.果蠅體內(nèi)SOD、GSH-Px、CAT活性及MDA濃度水平<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>動(dòng)物個(gè)體實(shí)驗(yàn)證明ZZBG具有顯著的抗衰老活性。3.ZZBG抗食品、伺料氧化作用(1)ZZBG對(duì)米糠的抗氧化作用將ZZBG(B)與陽性對(duì)照抗氧化劑乙氧基喹啉(A)添加到米糠中，在室溫、無光照條件下儲(chǔ)存，7天和20天后取樣，分別測定其酸價(jià)，酸價(jià)測定釆用氫氧化鉀滴定法。試驗(yàn)結(jié)果見表4。表4.ZZBG對(duì)米糠的抗氧化作用<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>從表4可見，貯存"天后，相同水平的ZZBG對(duì)米糠的抗氧化效果與乙氧基喹啉相當(dāng)，說明ZZBG抗氧化效果較好。(2)ZZBG對(duì)油脂的抗氧化作用將O.03%ZZBG、乙氧喹(50%)、BHT添加到新鮮豬油中。在110%,通氣速度為20L/h的條件下加速油脂氧化，用油脂氧化測定儀測定油脂的過氧化值。不同抗氧化劑對(duì)油脂的抗氧化試驗(yàn)結(jié)果見表5。由表5可見，在豬油中添加ZZBG等抗氧化劑后，產(chǎn)生相同過氧化值的時(shí)間，添加ZZBG與常用的飼料抗氧化劑乙氧喹啉和BHT相比，產(chǎn)生相同過氧化值的時(shí)間分別延長了1.56和1.22倍。表5.ZZBG對(duì)油脂的抗氧化作用<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>以下是本發(fā)明的說明書附圖的圖面說明圖l是本發(fā)明的三種不同的制備工藝流程。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下積極效果1.原料提取于天然傳統(tǒng)補(bǔ)益藥用植物安全實(shí)用。2.ZZBG抗氧化作用綜合效果高于常用合成氧化劑。3.由組合物制備的制劑可應(yīng)用于臨床治療因相關(guān)自由基損傷導(dǎo)致的衰老、動(dòng)脈粥樣硬化、缺血再灌注損傷等的疾病，為治療這類疾病增加了新的藥物品種。4.由組合物制備的抗氧化制劑可作為食品、飼料的抗氧化添加劑，防止或減緩食品、，飼料酸敗變質(zhì)。具體實(shí)施方式本發(fā)明以下將結(jié)合說明書附圖和實(shí)施例作進(jìn)一步的詳細(xì)說明。實(shí)施例l.l藏波羅花總苯丙素苷(簡寫ZZBG)的制備(使用第一種方法)取粉碎細(xì)度達(dá)IOO目的藏波羅花藥材，用水提取，其中，藏波羅花粉碎物與溶劑的重量/容量比為1:20,將按比例混合好的藏波羅花粉碎物與上述溶劑置于提取釜中，提取溫度為SO。C，提取液濃縮(壓力98Kpa、溫度80°C)后得相應(yīng)的水提取濃縮物，用60-100目聚酰胺柱進(jìn)行層析，用乙醇水溶液梯度洗脫，收集其濃度>60%的乙醇水溶液洗脫部位，得到主要含藏苷A和藏苷A成分的組合物；通過40-80目硅膠柱吸附進(jìn)一步精制，用20%乙醇淋洗除雜，再用乙醇乙酸乙酯=1:2.5的混合液洗脫，體積為生藥體積的5倍，收集>60%洗脫液，濃縮(壓力98Kpa、溫度60°0至無有機(jī)溶劑味，干燥后粉碎、噴霧干燥或冷凍干燥，即得。得率0.85%。經(jīng)分離檢測，其中藏苷A為42.2g,藏苷B為18.3g。實(shí)施例1.2藏波羅花總苯丙素苷的制備(使用第一種方法)取粉碎細(xì)度達(dá)200目的藏波羅花藥材，用3oy。的乙醇溶劑提取，其中，藏波羅花粉碎物與溶劑的重量/容量比為1:20,將按比例混合好的藏波羅花粉碎物與上述溶劑置于提取釜中，提取溫度為50°C，提取液濃縮后得相應(yīng)的醇溶劑提取濃縮物，用HPD-100大孔吸附樹脂柱進(jìn)行層析，用甲醇水溶液梯度洗脫，收集其濃度>60%的甲醇水溶液洗脫部位，得到主要含藏苷A和藏苷A成分的組合物；通過60-100目硅膠柱吸附進(jìn)一步精制，用20%乙醇淋洗除雜，再用甲醇和正丁醇混合液，即甲醇正丁醇=1:0.5洗脫，體積為生藥體積的8倍，收集〉60%洗脫液，濃縮至無有機(jī)溶劑味，干燥后粉碎、噴霧干燥或冷凍干燥，即得。得率0.97。/。。經(jīng)分離檢測，其中藏苷A為62.5g，藏苷B為15.8g。該制備過程中相關(guān)提取液及洗脫液的濃縮均為減壓濃縮(壓力98Kpa、溫度60°C)。實(shí)施例1.3藏波羅花總苯丙素苷的制備(使用第一種方法)取粉碎細(xì)度達(dá)40目的藏波羅花藥材，用90%的乙醇溶劑提取，其中，藏波羅花粉碎物與溶劑的重量/容量比為1:2,將按比例混合好的藏波羅花粉碎物與上述溶劑置于提取釜中，提取溫度為50"C,提取液濃縮后得相應(yīng)的水提取濃縮物、用HPD-400大孔吸附樹脂進(jìn)行層析，用丙醇水溶液梯度洗脫，收集其濃度>60%的丙醇水溶液洗脫部位，得到主要含藏苷A和藏苷A成分的組合物；通過200-300目硅膠柱吸附進(jìn)一步精制，用20%乙醇淋洗除雜，再用丙醇和正丁醇混合液，即丙醇正丁醇=1:2.5洗脫，體積為生藥體積的15倍，收集〉60%洗脫液，濃縮至無有機(jī)溶劑味，干燥后粉碎、噴霧干燥或冷凍干燥，即得。得率0.98%。經(jīng)分離檢測，其中藏苷A為51.7g，藏苷B為12.9g。該制備過程中相關(guān)提取液、萃取液及洗脫液的濃縮均為減壓濃縮(壓力98Kpa、溫度80°C)。實(shí)施例1.4藏波羅花總苯丙素苷的制備(使用第一種方法)取粉碎細(xì)度達(dá)60目的藏波羅花藥材，乙酸乙酯提取，其中，藏波羅花粉碎物與溶劑的重量/容量比為1:IO，將按比例混合好的藏波羅花粉碎物與上述溶劑置于提取釜中，提取溫度為30°C，提取液濃縮后得相應(yīng)的乙酸乙酯提取濃縮物，用D001離子交換樹脂進(jìn)行層析，用乙醇水溶液梯度洗脫，收集其濃度〉60%的乙醇水溶液洗脫部位，得到主要含藏苷A和藏苷A成分的組合物；通過硅膠柱吸附進(jìn)一步精制，用20%乙醇淋洗除雜，再用乙醇和乙酸乙酯混合液，即乙醇乙酸乙酯=1:5洗脫，體積為生藥體積的10倍，收集〉60%洗脫液，濃縮至無有機(jī)溶劑味，干燥后粉碎、噴霧干燥或冷凍干燥，即得。得率1.12%。經(jīng)分離檢測，其中藏苷A為67.lg，藏苷B為13.3g。該制備過程中相關(guān)提取液、萃取液及洗脫液的濃縮均為減壓濃縮(壓力98Kpa、溫度60t)。實(shí)施例2.1藏波羅花總苯丙素苷的制備(使用第二種方法)取粉碎細(xì)度達(dá)100目的藏波羅花藥材，用水提取，濃縮后得水提取濃縮物、按濃縮物與乙酸乙酯的重量/容量比為1:20，進(jìn)行萃取，濃縮萃取液，得到主要含藏苷A和藏苷A成分的組合物；通過60-100目硅膠柱吸附進(jìn)一步精制，用20%乙醇淋洗除雜，再用甲醇和正丁醇混合液，即甲醇正丁醇=1:2.5洗脫，體積為生藥體積的5倍，收集>60%洗脫液，濃縮至無有機(jī)溶劑味，干燥后粉碎、噴霧干燥或冷凍干燥，即得。得率0.98%。經(jīng)分離檢測，其中藏苷A為61.1g，藏苷B為18.3g。該制備過程中相關(guān)提取液及洗脫液的濃縮均為減壓濃縮(壓力98Kpa、溫度80°C)。實(shí)施例2.2藏波羅花總苯丙素苷的制備(使用第二種方法)取粉碎細(xì)度達(dá)200目的藏波羅花藥材，用30%乙醇溶劑提取，濃縮后得醇溶劑提取濃縮物，按濃縮物與乙酸乙酯的重量/容量比為1:10，進(jìn)行萃取，濃縮萃取液，得到主要含藏苷A和藏苷A成分的組合物；通過200-300目硅膠柱吸附進(jìn)一步精制，用20%乙醇淋洗除雜，再用甲醇和乙酸乙酯混合液，即甲醇乙酸乙酯=1:0.5洗脫，體積為生藥體積的10倍，收集〉60%洗脫液，濃縮至無有機(jī)溶劑味，干燥后粉碎、噴霧干燥或冷凍干燥，即得。得率1.09%。經(jīng)分離檢測，其中藏苷A為62.lg,藏苷B為17.5g。該制備過程中相關(guān)提取液及洗脫液的濃縮均為減壓濃縮(壓力98Kpa、溫度80°C)。實(shí)施例2.3藏波羅花總苯丙素苷的制備(使用第二種方法)取粉碎細(xì)度達(dá)40目的藏波羅花藥材，用90%的乙醇提取，濃縮后得醇溶劑提取濃縮物，按濃縮物與乙酸乙酯的重量/容量比為1:2，進(jìn)行萃取，濃縮萃取液，得到主要含藏苷A和藏苷A成分的組合物；通過40-80目硅膠柱吸附進(jìn)一步精制，用20%乙醇淋洗除雜，再用丙醇和乙酸乙酯混合液，即丙醇乙酸乙酯=1:2.5洗脫，體積為生藥體積的5—15倍，收集>60%洗脫液，濃縮至無有機(jī)溶劑味，干燥后粉碎、噴霧干燥或冷凍干燥，即得。得率0.93%。經(jīng)分離檢測，其中藏苷A為60.4g，藏苷B為18.Og。該制備過程中相關(guān)提取液及洗脫液的濃縮均為減壓濃縮(壓力98Kpa、溫度80°C)。實(shí)施例2.4藏波羅花總苯丙素苷的制備(使用第二種方法)取粉碎細(xì)度達(dá)80目的藏波羅花藥材，用乙酸乙酯提取，濃縮后得乙酸乙酯提取濃縮物，按濃縮物與乙酸乙酯的重量/容量比為1:10,進(jìn)行萃取，濃縮萃取液，得到主要含藏苷A和藏苷A成分的組合物；通過60-100目硅膠柱吸附進(jìn)一步精制，用20%乙醇淋洗除雜，再用甲醇和正丁醇混合液，即甲醇正丁醇=1:1.5洗脫，體積為生藥體積的10倍，收集>60%洗脫液，濃縮至無有機(jī)溶劑味，干燥后粉碎、噴霧干燥或冷凍干燥，即得。得率1.12%。經(jīng)分離檢測，其中藏苷A為61.9g，藏苷B為18.8g。該制備過程中相關(guān)提取液及洗脫液的濃縮均為減壓濃縮(壓力98Kpa、溫度80°C)。實(shí)施例3.1藏波羅花總苯丙素苷的制備(使用第三種方法)取粉碎細(xì)度達(dá)200目的藏波羅花藥材，用水提取，濃縮后得水提取濃縮物，按濃縮物與乙酸乙酯的重量/容量比為1:20，進(jìn)行萃取，濃縮萃取液，用D001離子交換樹脂進(jìn)行層析，用甲醇水溶液梯度洗脫，收集其濃度>60%的甲醇水溶液洗脫部位，得到主要含藏苷A和藏苷B成分的組合物；通過40-80目硅膠柱吸附進(jìn)一步精制，用20%乙醇淋洗除雜，再用甲醇和乙酸乙酯混合液，即甲醇乙酸乙酯=1:0.5洗脫，體積為生藥體積的5倍，收集>60%洗脫液，濃縮至無有機(jī)溶劑味，干燥后粉碎、噴霧干燥或冷凍干燥，即得。得率0.95%。經(jīng)分離檢測，其中藏苷A為45.2g，藏苷B為20.3g。實(shí)施例3.2藏波羅花總苯丙素苷的制備(使用第三種方法)取粉碎細(xì)度達(dá)100目的藏波羅花藥材，用30%乙醇溶劑提取，濃縮后得醇溶劑提取濃縮物，按濃縮物與乙酸乙酯的重量/容量比為1:10，進(jìn)行萃取，濃縮萃取液，用HPD-100大孔吸附樹脂柱進(jìn)行層析，用丙醇水溶液梯度洗脫，收集其濃度〉60%的丙醇水溶液洗脫部位，得到主要含藏苷A和藏苷B成分的組合物；通過200-300目硅膠柱吸附進(jìn)一步精制，用20%乙醇淋洗除雜，再用丙醇和乙酸乙酯混合液，即丙醇乙酸乙酯=1:0.5-5洗脫，體積為生藥體積的10倍，收集〉60%洗脫液，濃縮至無有機(jī)溶劑味，干燥后粉碎、噴霧干燥或冷凍干燥，即得。得率0.97%。經(jīng)分離檢測，其中藏苷A為60.5g，藏苷B為16.9g。該制備過程中相關(guān)提取液及洗脫液的濃縮均為減壓濃縮(壓力98Kpa、溫度60°C)。實(shí)施例3.3藏波羅花總苯丙素苷的制備(使用第三種方法)取粉碎細(xì)度達(dá)40目的藏波羅花藥材，用90%乙醇溶劑提取，濃縮后得醇溶劑提取濃縮物，按濃縮物與乙酸乙酯的重量/容量比為1:2，進(jìn)行萃取，濃縮萃取液，用HPD-400大孔吸附樹脂柱進(jìn)行層析，用丙醇水溶液梯度洗脫，收集其濃度>60%的丙醇水溶液洗脫部位，得到主要含藏苷A和藏苷B成分的組合物；通過40-80目硅膠柱吸附進(jìn)一步精制，用20%乙醇淋洗除雜，再用丙醇和正丁醇混合液，即丙醇正丁醇=1:0.5-5洗脫，體積為生藥體積的5倍，收集〉60%洗脫液，濃縮至無有機(jī)溶劑味，干燥后粉碎、噴霧干燥或冷凍干燥，即得。得率1.09y。。經(jīng)分離檢測，其中藏苷A為52.7g，藏苷B為13.5g。該制備過程中相關(guān)提取液、萃取液及洗脫液的濃縮均為減壓濃縮(壓力98Kpa、溫度80。C)'。實(shí)施例3.4藏波羅花總苯丙素苷的制備(使用第三種方法)取粉碎細(xì)度達(dá)80目的藏波羅花藥材，乙酸乙酯提取，濃縮后得乙酸乙酯提取濃縮物，按濃縮物與乙酸乙酯的重量/容量比為1:10,進(jìn)行萃取，濃縮萃取液，用60-100聚酰胺柱進(jìn)行層析，用乙醇水溶液梯度洗脫，收集其濃度〉60%的乙醇水溶液洗脫部位，得到主要含藏苷A和藏苷B成分的組合物；通過60-100目硅膠柱吸附進(jìn)一步精制，用20%乙醇淋洗除雜，再用乙醇和乙酸乙酯混合液，即低級(jí)醇乙酸乙酯=1:2.5洗脫，體積為生藥體積的5倍，收集>60%洗脫液，濃縮至無有機(jī)溶劑味，干燥后粉碎、噴霧干燥或冷凍干燥，即得。得率1.12%。經(jīng)分離檢測，其中藏苷A為66.5g，藏苷B為14.lg。該制備過程中相關(guān)提取液、萃取液及洗脫液的濃縮均為減壓濃縮(壓力98Kpa、溫度60°C)。實(shí)施例4.1.1片劑的制備取藏波羅花總苯丙素苷50g，加入50g可壓淀粉和40g梭甲基淀粉鈉，混合均勻，70%的乙醇作為潤濕劑，制軟材，18目篩制粒，烘干，16目篩整粒，加入3g硬脂酸鎂作為潤滑劑，混合均勻，壓片、包衣，制成iooo片包衣片。實(shí)施例4.1.2片劑的制備取藏波羅花總苯丙素苷10g，加入50g可壓淀粉和40g梭甲基淀粉鈉，混合均勻，70%的乙醇作為潤濕劑，制軟材，18目篩制粒，烘干，16目篩整粒，加入3g硬脂酸鎂作為潤滑劑，混合均勻，壓片、包衣，制成1000片包衣片。實(shí)施例4.2.1膠囊的制備取藏波羅花總苯丙素苷50g，加入80g可壓淀粉和20g梭甲基纖維素鈉，混合均勻，以70y。的乙醇潤濕，制軟材，24目篩制粒，烘干，20目篩整粒，加入3g硬脂酸鎂，混合均勻，裝膠囊，制成1000粒膠囊。實(shí)施例4.2.2軟膠囊的制備取蜂蠟6g,置200g大豆油中，加熱置熔融，放冷到室溫后，加入50g藏波羅花總苯丙素苷，用膠體磨研磨均勻，置軟膠囊生產(chǎn)設(shè)備上，壓制成型，干燥，包裝，制成500粒膠囊。實(shí)施例4.3.1顆粒劑的制備取藏波羅花總苯丙素苷100g,加入450g蔗糖粉、100g梭甲基纖維素鈉、100g微晶纖維素和50g檸檬酸，混合均勻，以3y。PVP為潤濕劑制軟材，20目篩制粒，烘干，18目篩整粒，分裝，制成粒徑為830-880um的IOOO袋顆粒劑。每袋重0.72-0.78g實(shí)施例4.3.2顆粒劑的制備取藏波羅花總苯丙素苷300g,加入350g蔗糖粉、80g梭甲基纖維素鈉、80g微晶纖維素和50g檸檬酸，混合均勻，以3%PVP為潤濕劑制軟材，20目篩制粒，烘干，18目篩整粒，分裝，制成粒徑為830-880um的IOOO袋顆粒劑。每袋重0.80-0.85g。實(shí)施例4.4.1粉針劑的制備取藏波羅花總苯丙素苷12g，羥丙基一p—環(huán)糊精135g，加注射用水3L,攪成糊狀，再加70°C~85°C的注射用水3L,溶解時(shí)溫度控制在70°C~85°C，加甘露醇450g溶解，再用lmoL/L鹽酸溶液調(diào)pH值至5.6,加入針用炭后室溫?cái)嚢?，過濾脫炭，精濾.濾液按每只2ml進(jìn)行分裝，采用速凍法干燥，將制品取出，進(jìn)行封口，即得到性狀為白色疏松塊狀物或粉末。實(shí)施例4.4.2粉針劑的制備取藏波羅花總苯丙素苷30g,環(huán)糊精3"g，加注射用水3L，攪成糊狀，再加70°C~85°C的注射用水3L，溶解時(shí)溫度控制在70°C~85°C,加乳糖300g溶解，再用ltnoL/L鹽酸溶液調(diào)pH值至4.8,加入針用炭后室溫?cái)嚢?，過濾脫炭，精濾。濾液按每只2ml進(jìn)行分裝，采用速凍法干燥，將制品取出，進(jìn)行封口，即得到性狀為白色疏松塊狀物或粉末。實(shí)施例4.5.1滴丸的制備將150g聚乙二醇4000在水浴上加熱得熔融液，趁熱加入藏波羅花總苯丙素苷細(xì)粉50g，攪拌均勻，65。C保溫l小時(shí)，用滴丸機(jī)滴制，滴速120滴/分鐘，滴制溫度65—75。C,在15。C左右的液體石蠟中冷卻，制得丸重約60mg，干燥，包衣，即得。實(shí)施例4.5.2滴丸的制備將150g聚乙二醇4000在水洛上加熱得熔融液，趁熱加入藏波羅花總苯丙素苷細(xì)粉80g，攪拌均勻，65。C保溫l小時(shí)，用滴丸機(jī)滴制，滴速120滴/分鐘，滴制溫度65—75°C，在15C左右的液體石蠟中冷卻，制得丸重約60mg,干燥，包衣，即得。實(shí)施例4.6.1口服液的制備取蒸餾水適量，加入20g藏波羅花總苯丙素苷、180g蔗糖粉、20g檸檬酸，攪拌溶解，過濾，濾液補(bǔ)充蒸餾水至1GQ0Qml，加入香精適量，攪拌均勾，分裝，每支10ml，壓蓋，IO(TC消毒I小時(shí)，檢查合格，即得。實(shí)施例4.6.2口服液的制備取蒸餾水適量，加入100g藏波羅花總苯丙素苷、100g蔗糖粉、20g才寧檬酸，攪拌溶解，過濾，濾液補(bǔ)充蒸餾水至10000ml，加入香精適量，攪拌均勻，分裝，每支10ml，壓蓋，IO(TC消毒I小時(shí)，檢查合格，即得。實(shí)施例4.7.1粉劑的制備取藏波羅花總苯丙素苷30g，粉碎成粒徑為20nm粉狀物，加入500g蔗糖粉、100g梭甲基纖維素鈉、100g微晶纖維素混合均勻，分裝，制成IOOO袋粉劑。每袋重0.68-O."g。添加量為食品或飼料的0.01-1%。實(shí)施例4.7.2粉劑的制備取藏波羅花總苯丙素苷100g,粉碎成粒徑為150ym粉狀物，加入450g蔗糖粉、100g梭甲基纖維素鈉、100g微晶纖維素混合均勻，分裝，制成1000袋粉劑。每袋重0.70-0."g。添加量為食品或飼料的0.01-1%。權(quán)利要求1.一種由藏波羅花苯丙素苷化合物組成的組合物，其特征在于含由藏波羅花苯丙素苷化合物A和藏波羅花苯丙素苷化合物B，分別簡稱為藏苷A和藏苷B，其組合物兩者重量比為60-90∶40-10，兩者含量之和占總苯丙素苷總重量的70％-100％，其中(1)藏苷A的結(jié)構(gòu)為id="icf0001"file="S2008100442209C00011.gif"wi="134"he="71"top="71"left="40"img-content="drawing"img-format="tif"orientation="portrait"inline="no"/>(2)藏苷B的結(jié)構(gòu)為id="icf0002"file="S2008100442209C00012.gif"wi="143"he="68"top="159"left="47"img-content="drawing"img-format="tif"orientation="portrait"inline="no"/>2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種藏波羅花苯丙素苷組合物的制備方法有三種，三種制備方法的特征分別在于(l)取粉碎細(xì)度達(dá)40~200目的藏波羅花藥材，用水、30%-90%的乙醇溶劑或乙酸乙酯分別提取，其中，藏波羅花粉碎物與溶劑的重量/容量比為1:2~20,將按比例混合好的藏波羅花粉碎物與上述溶劑置于提取條中，提取溫度為30°C~80"C，提取液濃縮后得相應(yīng)的水提取濃縮物、醇溶劑提取濃縮物或乙酸乙酯提取濃縮物，用交換柱進(jìn)行層析，用低級(jí)醇水溶液梯度洗脫，收集其濃度>60%的低級(jí)醇水溶液洗脫部位，得到主要含藏苷A和藏苷A成分的組合物；通過硅膠柱吸附進(jìn)一步精制，用20%乙醇淋洗除雜，再用低級(jí)醇和乙酸乙酯或正丁醇混合液，即低級(jí)醇乙酸乙酯或正丁醇=1:0.5-5洗脫，體積為生藥體積的5—15倍，收集>60%洗脫液，濃縮至無有機(jī)溶劑味，干燥后粉碎、噴霧干燥或冷凍干燥，即得；(2)取粉碎細(xì)度達(dá)40-200目的藏波羅花藥材，用水、30%-90%的乙醇溶劑或乙酸乙酯分別提取，濃縮后得水提取濃縮物、醇溶劑提取濃縮物或乙酸乙酯提取濃縮物，按濃縮物與乙酸乙酯的重量/容量比為1:2~20，進(jìn)行萃取，濃縮萃取液，得到主要含藏苷A和藏苷A成分的組合物；通過硅膠柱吸附進(jìn)一步精制，用20%乙醇淋洗除雜，再用低級(jí)醇和乙酸乙酯或正丁醇混合液，即低級(jí)醇乙酸乙酯或正丁醇二l:0.5-5洗脫，體積為生藥體積的5一15倍，收集>60%洗脫液，濃縮至無有機(jī)溶劑味，干燥后粉碎、噴霧干燥或冷凍干燥，即得；(3)取粉碎細(xì)度達(dá)40-200目的藏波羅花藥材，用水、醇溶劑和/或乙酸乙酯提取，濃縮后得水提取濃縮物、醇溶劑提取濃縮物或乙酸乙酯提取濃縮物，按濃縮物與乙酸乙酯的重量/容量比為1:2~20,進(jìn)行萃取，濃縮萃取液，用交換柱進(jìn)行層析，用低級(jí)醇水溶液梯度洗脫，收集其濃度>60%的低級(jí)醇水溶液洗脫部位，得到主要含藏苷A和藏苷A成分的組合物；通過硅膠柱吸附進(jìn)一步精制，用20%乙醇淋洗除雜，再用低級(jí)醇和乙酸乙酯或正丁醇混合液，即低級(jí)醇乙酸乙酯或正丁醇=1:0.5-5洗脫，體積為生藥體積的5—U倍，收集>60%洗脫液，濃縮至無有機(jī)溶劑味，干燥后粉碎、噴霧干燥或冷凍干燥，即得。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述一種藏波羅花苯丙素苷組合物的制備方法，其特征在于所述低級(jí)醇為甲醇、乙醇、丙醇，即C1C5醇類，其重量濃度為30%~90%。4.根據(jù)權(quán)利要求2所述一種藏波羅花苯丙素苷組合物的制備方法，其特征在于所述的交換柱采用聚酰胺，其產(chǎn)品規(guī)格為30-60/60-100/100-120目、大孔吸附樹脂，其型號(hào)為HPD-100HPD-100A或HPD-400HPD—00A或離子交換樹脂，其型號(hào)為D001或D113。5.根據(jù)權(quán)利要求2所述一種藏波羅花苯丙素苷組合物的制備方法，其特征在于所述的精制用的硅膠柱，規(guī)格是40-80目、60-100目或200-300目。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種藏波羅花苯丙素苷組合物制備的制劑，該制劑是片劑、膠囊、顆粒劑、針劑、滴丸、液體制劑、粉劑，其特征在于(1)用藏波羅花總苯丙素苷制備的每片含苯丙素苷10mg-50mg的片劑；(2)用藏波羅花總苯丙素苷制備的每粒含苯丙素苷50mg-100mg的膠囊劑；(3)用藏波羅花總苯丙素苷適量制備的粒徑為830-880pm的顆粒狀物，用袋定量包裝，袋重0.80-0.85g，每袋顆粒劑含苯丙素苷0.1-0.3g;(4)用藏波羅花總苯丙素苷制備含苯丙素苷無菌粉針劑，每只粉針劑含苯丙素苷4mg-9mg;(5)用藏波羅花總苯丙素苷50g-80g與聚乙二醇150g制備成丸重約60mg，苯丙素苷含量為25%-35%的滴丸制劑；(6)用藏波羅花總苯丙素苷制成每毫升含苯丙素苷2mg10mg的口服液制劑；(7)用藏波羅花總苯丙素苷制成粒徑為20|am-150jum粉狀物，用袋定量包裝，每袋重0.68-0.75g,每袋含藏波羅花總苯丙素苷30mg-100mg的粉劑；7.根據(jù)權(quán)利要求1、2、3、4、5和6所述一種藏波羅花苯丙素苷組合物制備的食品/飼料抗氧化制劑，其特征在于用藏波羅花總苯丙素苷組合物粉碎成為粒徑為"-150jam的粉狀物，添加適量微晶纖維素、淀粉、梭甲基纖維素鈉，按常規(guī)方法制成，制劑中藏波羅花總苯丙素苷的含量為4.0%-15%,其它成分為藥物輔料，制作出的成品是粉劑。8.根據(jù)權(quán)利要求6所述一種藏波羅花苯丙素苷組合物的制劑的用途，其特征在于生產(chǎn)用于臨床治療因相關(guān)自由基損傷導(dǎo)致的衰老、動(dòng)脈粥樣硬化、缺血再灌注損傷等的疾病的制劑中的應(yīng)用。9.根據(jù)權(quán)利要求7所述一種藏波羅花苯丙素苷組合物的制劑的用途，其特征在于在制備食品、飼料、飲料抗氧化制品中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明涉及從傳統(tǒng)藏藥藏波羅花中提取的總苯丙素苷類組合物及其制備方法，并以該類組合物作為抗氧化藥物/保健品上的用途，應(yīng)用于臨床治療因相關(guān)自由基損傷導(dǎo)致的衰老、動(dòng)脈粥樣硬化、缺血再灌注損傷等的疾??；以及作為食品、飼料用抗氧化添加劑的用途，防止或減緩飼料酸敗變質(zhì)、營養(yǎng)價(jià)值下降、適口性變差。藏波羅花苯丙素苷化合物組成的組合物，含有藏波羅花苯丙素苷化合物A和藏波羅花苯丙素苷化合物B，其組合物兩者重量比為60-90∶40-10，兩者含量之和占總苯丙素苷總重量的70％-100％。以組合物為主要成分制備的制劑有片劑、膠囊、顆粒劑、針劑、滴丸、液體制劑、粉劑，提供了新的天然、高效、低毒的植物天然抗氧化劑。文檔編號(hào)A23K1/16GK101264094SQ200810044220公開日2008年9月17日申請(qǐng)日期2008年4月16日優(yōu)先權(quán)日2008年4月16日發(fā)明者蔣思萍,平高申請(qǐng)人:西藏自治區(qū)高原生物研究所