專利名稱：一種快速培育蓖麻溫敏型隱性核不育單雌系的方法及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物細胞工程及作物雜交育種技術(shù)領(lǐng)域，具體地說是一種利用花粉雄核培養(yǎng)技術(shù)加速溫敏型隱性核不育雌性系的形成，并以其作為供選母本與父本進行蓖麻雜交育種的方法。

背景技術(shù)：
蓖麻是世界最重要的非糧食油料作物之一，是戰(zhàn)略物資和再生能源的重要物質(zhì)來源，不僅廣泛應(yīng)用于軍工、醫(yī)療等行業(yè)制品，而且非替代性的應(yīng)用于航空業(yè)的潤滑和防護。近年來，隨著石油能源的日趨匱乏，蓖麻作為生物能源的重要地位更加突出。然而，同糧食作物比較，蓖麻生產(chǎn)的并不樂觀，呈現(xiàn)投入少、管理粗放、缺乏良種、種植面積較小等不足，因此蓖麻的產(chǎn)量和品質(zhì)始終達不到應(yīng)有水平，也難以滿足加工業(yè)需求。為了實現(xiàn)蓖麻作為重要生物能源的應(yīng)有價值，緩解材料供應(yīng)與需求的矛盾，推動了蓖麻產(chǎn)業(yè)、特別是加工業(yè)的快速發(fā)展，亟待加大蓖麻良種選育力度，以期從源頭解決優(yōu)質(zhì)蓖麻供應(yīng)問題。雜種優(yōu)勢現(xiàn)象在生物界普遍存在，雜種品種可以表現(xiàn)明顯的增產(chǎn)優(yōu)質(zhì)效應(yīng)，已經(jīng)被成功運用到多種作物的育種中，因此雜交育種是發(fā)展蓖麻產(chǎn)業(yè)的突破口。
蓖麻雌性系是實施有效雜交育種的基本材料，目前已發(fā)現(xiàn)4種類型的蓖麻雌性單株。第一種是N型單雌株，遺傳上其雌性特征由一對隱性基因(f)控制(Claasen CE，Hoffman A.，Agron.J.，1950，4279-82)，因此，只有純合時才表現(xiàn)單雌特征。第二種是S型雌性單株(Shifriss O.，Genetics，1956，41256-280)，該單雌性的最大特點是雌雄性狀的不穩(wěn)定性，因此，不同發(fā)育期或不同年度間經(jīng)常出現(xiàn)雌雄混雜。兩種類型雌性系實踐上都曾經(jīng)得到應(yīng)用，主要依賴連續(xù)自交，不僅周期較長，而且在蓖麻雜交制種時需要人工間除兩性植株，因此育種效率低。第三，具溫敏現(xiàn)象的NES型雌性系(Shifriss O.，Journal of Genetics，1960，57361-388)是具有真正實踐意義的雌性系，由于環(huán)境溫度嚴格控制雄花的出現(xiàn)，所以其對雜交育種的貢獻和潛力較大。第四種是Zimmerman等發(fā)現(xiàn)了兼具NES和N型的復(fù)合類型，并發(fā)展成一種新的溫敏型雌性系(Zimmerman L H，Smith J D.Crop Sci，1966，6406-409)，該雌性系具32℃條件產(chǎn)生少量雄花、24℃條件下不形成雄花的特點，因此極有利于雜交種的選育，而由此發(fā)展起來的“兩系法”雜交技術(shù)，已在巴西、美國和印度等國家成功應(yīng)用。我國的蓖麻研究也取得了許多可喜成績。Lm型雌性系是具有標志性狀的標志雌性系，由永283M2品系經(jīng)60Co-γ誘變獲得(朱國立，中國油料，1990，323-26)。研究發(fā)現(xiàn)，雌性標志性狀受兩對連鎖的隱性基因(pp11)控制，在花序現(xiàn)蕾時即可顯現(xiàn)，性狀出現(xiàn)早、易識別，是蓖麻育種的新型良好材料。然而，由于我國育種工作開展較晚，育種環(huán)節(jié)較為薄弱，育種材料依然呈現(xiàn)嚴重不足的局面，這極大地制約了蓖麻雜交育種的開展。
純合體是雜交育種的最佳材料。蓖麻屬于雌雄異花同株植物，遺傳機制復(fù)雜，采用常規(guī)途徑獲得相對純合的親本，周期很長，至少需要經(jīng)過5-7代親本自交。植物花粉單倍體培養(yǎng)技術(shù)已在數(shù)百種植物上獲得成功，花粉作為單倍有機個體，可以在1-2年時間內(nèi)通過誘導(dǎo)培養(yǎng)獲得純合個體，因此開展蓖麻花粉培養(yǎng)有助快速獲得大量單雌植株，加速蓖麻育種進程。


發(fā)明內(nèi)容
本項發(fā)明專利的主要目的是針對我國蓖麻育種材料嚴重缺乏、育種周期長、育種效率低、特定地區(qū)適種蓖麻優(yōu)質(zhì)品種嚴重不足的現(xiàn)實，利用花粉單倍體培養(yǎng)技術(shù)快速繁育隱性核不育基因控制的溫敏型蓖麻單雌系，以其為母本創(chuàng)制高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)和多抗蓖麻新品種的方法。
本發(fā)明提供了一種進行蓖麻花粉單倍體植株的培育方法成熟的處于總苞開裂臨界期的蓖麻雄花序，經(jīng)低溫、表面消毒和干燥處理后，將其中的花粉分離出來并接種到MS培養(yǎng)基(Murashige and Skoog，Physiol.Plant.15473-497，1962)上直接誘導(dǎo)形成愈傷組織，選取新鮮致密的高活性愈傷組織轉(zhuǎn)接到添加了0.05～0.1毫克/升2，4-D和0.5～2.0毫克/升6-BA的MS培養(yǎng)基(即分化培養(yǎng)基)中分化形成再生苗，再生苗轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)基(1/2MS+NAA 0.05+3％蔗糖、0.7％瓊脂，pH5.8)即可培育出花粉單倍體植株。
本發(fā)明提供了一種蓖麻雌性系的培養(yǎng)方法花粉經(jīng)過誘導(dǎo)、分化、生根形成的候選單倍體植株，需進行染色體觀察和核型分析后確認；選取生長良好的單倍體植株，利用0.1％～0.4％秋水仙素溶液處理其莖尖生長點或者全株，可以獲得候選純合二倍體植株，并進行核型分析確認，純合二倍體植株隔離條件自交擴繁后建立純系即可繁育出具有單雌特性的母本；單雌植株具有溫度敏感效應(yīng)的特點，隔離條件下，適時適地種植蓖麻雌性系，使蓖麻開花盛期的環(huán)境溫度處于33℃及以上溫度，能夠誘導(dǎo)植株形成少量的雄花，使雌性系得以種質(zhì)延續(xù)。
本發(fā)明還提供了一種培育雜交蓖麻品種的方法以溫敏型隱性核不育雌性系為母本，配合力強的自交系或者進一步經(jīng)遺傳改良的自交系為父本實施雜交組合可以創(chuàng)制出高產(chǎn)、高油、多抗的蓖麻新品種。根據(jù)吉林等東北地區(qū)的氣候特點，為了使父母本都同時處在盛花期，達到高效授粉的目的，通常父本提前母本7-10天播種；父母本播種比例為1∶6，每公頃保苗2萬株，在苗期、花期、成熟期三次去雜，母本整枝打杈，只保留主穗和2個第一分枝穗。
本發(fā)明還提供了一套栽培方法，配合種植本發(fā)明繁育的蓖麻雜交種該雜交品種適應(yīng)吉林省中西部、內(nèi)蒙古、遼寧等地種植；可在四月中下旬至五月初播種，種植密度在1-1.2萬株/公頃；底肥施三元素復(fù)合肥25-30kg/畝，追肥施尿素10-15kg/畝；霜前40天打頂，去掉無效花蕾；地膜覆蓋種植。
以下內(nèi)容將對本發(fā)明中的常用術(shù)語進行解釋 “蓖麻種質(zhì)資源”是制作蓖麻母本的原始材料，可以是各種來源(國內(nèi)或者國外)的品種、品系或者野生種，但以適種優(yōu)質(zhì)品種、品系或當(dāng)?shù)刂惺燹r(nóng)家品種為首選；蓖麻父本是配合力強的自交系或者進一步經(jīng)遺傳改良的自交系。
“春蓖1號”蓖麻是以單雌系9901為母本，以改良181蓖麻為父本配制而成的蓖麻雜交種。父本和母本均由春蓮集團種質(zhì)資源庫繁育和保藏，春蓖1號由春蓮集團繁育生產(chǎn)保藏(春1-10)，也可從吉林省蓖麻種子經(jīng)銷公司購買。經(jīng)過品種比較和多點生態(tài)試驗鑒定、經(jīng)濟性狀鑒定和配合力測定、品種分析、抗性鑒定等一系列試驗分析鑒定，結(jié)果表明春蓖1號綜合性狀優(yōu)良，具有高產(chǎn)、高油、多抗等特性，2006年已通過吉林省農(nóng)作物品種委員會審定，準予推廣，是取代以往的常規(guī)種的良種之一。春蓖1號主要特點為產(chǎn)量高，一般公頃產(chǎn)量為1350公斤，在地膜覆蓋、管理及時情況下，公頃產(chǎn)量可達2000公斤以上；生育期適中，春蓖1號屬于優(yōu)質(zhì)的中晚熟蓖麻，主穗出苗至成熟約120天，需有效積溫2500℃左右，全株成熟需有效積溫2700℃左右，東北地區(qū)可在四月下旬至五月初播種；品質(zhì)佳，種子百粒重40克，粗蛋白含量為17.90％，粗脂肪含量63.21％，出仁率76.4％；缺點，雖然對土壤肥料要求不嚴，耐旱、耐瘠薄、耐鹽堿，抗倒伏，但不抗枯萎病。
實施例 以下只是作為事例說明發(fā)明人實施本發(fā)明的過程，并不限制本發(fā)明的其它實施范圍，也不排除使用者可使用其它更加有效的方案。
1、單雌系的快繁技術(shù) 以“春蓖1號”為原始種質(zhì)材料，當(dāng)雄花總苞處于開裂臨界期(似開未開)之時，此時雄花已經(jīng)成熟；小心摘取雄花序立即放在黑暗干燥的容器中，并在-15℃冰箱中進行10-30天的低溫處理，優(yōu)選的處理時間為15天。選擇完整未破裂的花蕾，用75％的酒精浸泡0.5分鐘，然后用20％的次氯酸鈉溶液消毒5min，并用無菌水沖洗3次，放在超凈臺上風(fēng)吹30分鐘至干。用鑷子夾住花苞基部，用解剖針剝開花苞，然后敲打鑷子使花藥均勻散落在含有MS培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，并用封口膜封好。整個過程要注意雜菌污染。
花粉在MS培養(yǎng)基首先置于4℃低溫處理24h，然后放在25-28℃、光照時間14h/d、光照強度1500lx的培養(yǎng)室進行誘導(dǎo)培養(yǎng)，直至形成愈傷組織，選取新鮮致密的高活性愈傷組織轉(zhuǎn)接到添加了0.05～0.1毫克/升2，4-D和0.5～2.0毫克/升6-BA的MS培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，其中以0.3毫克/升2，4-D和1毫克/升6-BA為優(yōu)選用量，直至形成花粉單倍體植株。此過程中，要經(jīng)常觀察污染情況、培養(yǎng)基失水情況等，并及時處理污染，或者更換新鮮的培養(yǎng)基。
單倍體植株的核型分析取花粉植株的根尖，采用染色體常規(guī)切片和壓片技術(shù)，以8-羥基喹啉(或者二氯苯)飽和溶液進行預(yù)處理3-5小時，然后用卡諾固定液固定2-24小時，經(jīng)50％乙醇浸泡，蒸餾水沖洗，以及1摩爾濃度的鹽酸溶液解離7-8分鐘后，洗去鹽酸，進行卡寶品紅染色3-5分鐘制片，顯微鏡檢查，并以染色體數(shù)目確認單倍體。
選擇確認為單倍體的生長良好的植株，然后用0.1％～0.4％秋水仙素溶液處理其莖尖生長點或者用棉球進行全株涂抹，即可以獲得純合二倍體植株；秋水仙素優(yōu)選的濃度為0.25％。處理后進行定期核型分析，以確認二倍體植株。
單雌植株具有溫度敏感效應(yīng)的特點，隔離條件下，適時適地種植蓖麻雌性系，使蓖麻開花盛期的環(huán)境溫度處于33℃及以上環(huán)境溫度，可以誘導(dǎo)植株形成少量的雄花，從而繁育出具有單雌特性的母本，使雌性系得以種質(zhì)延續(xù)。
2、蓖麻雜交種的選育 父本改良181自交系的獲得技術(shù)父本是利用花粉管注射技術(shù)，將國外優(yōu)異種質(zhì)資源CS-RD181中的抗性基因?qū)氲疆?dāng)?shù)貎?yōu)質(zhì)品種中，然后通過連續(xù)回交六代改良、再經(jīng)過多代自交成系而得到。
單雌母本的繁育與選擇標準花粉培育并二倍化的純合蓖麻植株，繁育單雌母本的優(yōu)選地區(qū)是蓖麻盛花期環(huán)境溫度超過33℃的地區(qū)(如海南等地)，在此種地區(qū)進行隔離種植，選取結(jié)實率和種子含油量雙高的單雌植株為供試母本。
按照蓖麻兩系雜交制種技術(shù)規(guī)程，利用蓖麻單雌系為母本、改良181作父本進行遠緣雜交，可以生產(chǎn)出高產(chǎn)、高油、多抗的優(yōu)質(zhì)蓖麻雜交品系，命名為“春花1號”。
3、雜交制種模式和配套栽培措施 母本是利用單雌系開花期持續(xù)高溫能分化少量雄花的特點，在海南隔離條件下自交繁殖；父本在隔離條件下自交繁殖。雜交制種方式為父母本錯開播種期，父本提前7-10天；父母本播種比例為一行父本六行母本(即1∶6的比例)，每公頃保苗2萬株。在苗期、花期、成熟期三次去雜，母本整枝打杈，只保留主穗和2個第一分枝穗；霜前50天打頂處理。
4、春花1號配套栽培方法 該雜交品種適應(yīng)吉林省中西部、內(nèi)蒙古、遼寧等地種植；可在四月中下旬至五月初播種，種植密度在1-1.2萬株/公頃；底肥施三元素復(fù)合肥25-30kg/畝，追肥施尿素10-15kg/畝；霜前40天打頂，去掉無效花蕾；首選種植方式為地膜覆蓋種植。
權(quán)利要求
1、一種高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)的蓖麻雜交種的繁育方法，其包括，利用花粉單倍體培養(yǎng)技術(shù)獲得溫敏型隱性純合不育的單雌性植株，隔離條件下自交繁育成蓖麻雌性系，以蓖麻雌性系為母本與蓖麻父本配置實施雜交育種的方法，其特征在于，應(yīng)用該方法能夠快速為蓖麻選優(yōu)提供多種溫敏型單雌系，繼而選育并生產(chǎn)出具有高產(chǎn)、高油、優(yōu)質(zhì)、多抗特性的高純度蓖麻新品種。
2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，蓖麻雌性系來源于花粉雄核的誘導(dǎo)發(fā)育，經(jīng)過花粉單倍體誘導(dǎo)培養(yǎng)、染色體加倍獲得純合的二倍體植株，二倍體植株在隔離條件下自交成系并繁育出母本。
3、根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，蓖麻雌性系的單雌特性由純合的細胞核隱性不育基因控制，其后代的主穗和一級分枝穗100％為雌性花且能夠穩(wěn)定遺傳；單雌特性植株具有溫度敏感效應(yīng)，當(dāng)蓖麻雌性系在開花盛期處于33℃及以上環(huán)境溫度條件下能夠形成少量的雄花，因而可以實施隔離條件下自交繁殖獲得雌性系的目的。
4、根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述花粉單倍體誘導(dǎo)培養(yǎng)是將成熟的處于總苞開裂臨界期的蓖麻雄花序，經(jīng)低溫、表面消毒和干燥處理后，將其中的花粉分離出來接種到MS培養(yǎng)基上直接誘導(dǎo)形成愈傷組織，愈傷組織轉(zhuǎn)接到添加了0.05-0.1毫克/升2，4-D和0.5-2.0毫克/升6-BA的MS培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)分化形成花粉單倍體植株，單倍體植株用0.1％-0.4％秋水仙素溶液處理獲得純合二倍體植株，隔離條件自交擴繁后建立純系。
5、根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，制作蓖麻母本的原始材料選自各種來源的品種、品系或者野生種，蓖麻父本是配合力強的自交系或者進一步經(jīng)遺傳改良的自交系。
6、根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述品種、品系或者野生種為當(dāng)?shù)剞r(nóng)家品種或適種優(yōu)質(zhì)品種、品系。
7、根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，應(yīng)用溫敏型隱性核不育雌性系為母本，配合力強的自交系或者進一步經(jīng)遺傳改良的自交系為父本進行的雜交組合及創(chuàng)制的高產(chǎn)、高油、多抗蓖麻品種；在吉林等東北地區(qū)，根據(jù)父母本生育期和開花特點錯開一定時期，通常父本提前母本7-10天播種，父母本播種比例為1∶6，每公頃保苗2萬株，在苗期、花期、成熟期三次去雜，母本整枝打杈，只保留主穗和2個第一分枝穗。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種高效創(chuàng)制蓖麻單雌系的方法及應(yīng)用于蓖麻雜交育種的途徑，具體地說是一種利用蓖麻花粉再生系統(tǒng)快速培育溫敏型隱性核不育基因純合體，并以其作為母本與自交系父本雜交繁育蓖麻新品種的方法。應(yīng)用本發(fā)明的方法，不僅可以快速高效地創(chuàng)制出大量的溫敏型核不育單雌系種質(zhì)，更重要的是用作育種母本繁育高產(chǎn)、高油、多抗、不落果、不裂朔、籽粒飽滿、出仁率高等性狀的蓖麻新品種。
文檔編號A01H5/00GK101347093SQ200810051129
公開日2009年1月21日 申請日期2008年8月28日 優(yōu)先權(quán)日2008年8月28日
發(fā)明者張世宏, 周春蓮, 毅 魏, 劉金亮, 張鑫生, 飛 閆, 潘洪玉, 王勇軍 申請人:吉林大學(xué), 吉林省春蓮園藝工程(集團)有限公司