專利名稱：：一種安全的植物抗逆表達載體及在轉(zhuǎn)基因植物中的應用的制作方法
技術(shù)領域：
：本發(fā)明構(gòu)建了一種安全的植物抗逆表達載體，并實現(xiàn)含有目的基因(DREB2A)的該載體在百脈根中的抗旱性表達。本發(fā)明屬于植物轉(zhuǎn)基因
技術(shù)領域：
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背景技術(shù)：
：自從1983年世界上誕生第一例轉(zhuǎn)基因植株以來，轉(zhuǎn)基因作物的安全性曾經(jīng)在全球范圍引起很大爭議，一個主要的原因是在轉(zhuǎn)基因操作過程中的初期，為了篩選含有目的基因的細胞的需要，用于植物表達的載體往往含有抗生素基因和除草劑基因，而當篩選得到目的細胞后，抗生素基因就沒有用途了，但它在轉(zhuǎn)基因材料中的存在會帶來環(huán)境和食品上的安全隱患。因此，近些年來植物轉(zhuǎn)基因研究的熱點之一就是實現(xiàn)安全性標記，其中糖代謝相關基因研究得最多也最深入，木糖異構(gòu)酶(xyloseisomerase,XI)基因(XylA)是這類選擇標記之一。大腸桿菌XylA基因編碼的木糖異構(gòu)酶能夠催化木糖轉(zhuǎn)變?yōu)槟就?，從而被生物體利用。多數(shù)植物并不能利用木糖的原因在于其體內(nèi)缺乏木糖異構(gòu)酶，因而木糖異構(gòu)酶可以用來作為植物轉(zhuǎn)化的篩選標記，其原理是木糖在XylA的催化下能轉(zhuǎn)變成木酮糖(xylulose)，再經(jīng)過磷酸戊糖途徑分解代謝，最終為細胞生長所利用。在以木糖為唯一碳源或者主要碳源的培養(yǎng)基上，轉(zhuǎn)化細胞因能利用木糖而呈現(xiàn)優(yōu)勢生長，非轉(zhuǎn)化細胞則因碳源供應不足而使生長受到抑制。該酶廣泛分布于動物和部分植物體內(nèi)，并且廣泛應用于食品工業(yè)中，用于生產(chǎn)果糖或高果糖漿，因而不會對人類和動物的健康帶來威脅，事實上動物體內(nèi)也都能合成木糖異構(gòu)酶。植物通過一些特定基因的表達來應答干旱、高鹽和低溫脅迫等逆境脅迫，這些基因的表達產(chǎn)物可以分為兩類一類是起直接保護細胞免受水分脅迫作用的物質(zhì)，包括相關功能蛋白、滲透調(diào)節(jié)因子的合成酶、解毒物質(zhì)等；另一類主要是起調(diào)節(jié)作用，并不直接參與保護，包括傳遞信號和調(diào)控基因表達的轉(zhuǎn)錄因子、感應和傳導脅迫信號的蛋白激酶等。然而，目前的抗逆轉(zhuǎn)基因研究中，主要是將相關的單一基因(即編碼上述第一類產(chǎn)物的基因)直接轉(zhuǎn)到植物中，得到的轉(zhuǎn)基因植物時常不能獲得預期的抗性，主要是因為對干旱、鹽堿的應答反應并不是一兩個基因的表達所能完成的，相反，在大多數(shù)情況下是多基因協(xié)同作用的結(jié)果。因而，轉(zhuǎn)入具有多重作用的轉(zhuǎn)錄因子或信號轉(zhuǎn)導基因被認為是一種更為有效的方法。例如，轉(zhuǎn)入DREB類轉(zhuǎn)錄因子(DREB2A基因是其中之一)的擬南芥、水稻、油菜、煙草、番茄等植物體內(nèi)的游離脯氨酸含量提高，植物的抗逆性明顯增強。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明公開一種安全的植物抗逆表達載體，目的是為培育環(huán)境安全、抗逆性優(yōu)良的轉(zhuǎn)基因植物提供一種有效的表達載體。用該載體轉(zhuǎn)化植物，可以避免使用抗生素和除草劑，篩選獲得高抗逆性的轉(zhuǎn)基因植物。本發(fā)明的安全性植物抗逆表達載體，其特征是以木糖異構(gòu)酶基因XylA為篩選標記、啟動子為物理因素誘導型的啟動子rd29A,目的基因是抗逆性轉(zhuǎn)錄因子DREB2A。本發(fā)明的安全性植物抗逆表達載體是用木糖異構(gòu)酶基因XylA及其所帶rd29A啟動了替換了基礎載體pCAMBIA3301的標記基因潮霉素抗性基因及其啟動子，抗逆性轉(zhuǎn)錄因了-基因DREB2A編碼序列替換了報告基因Gus的編碼序列而構(gòu)建成的。這兩基因位于載體T-DNA左邊界LB和右邊界RB序列之間。其中，XylA基因表達框結(jié)構(gòu)是從5'到3'端方向依次為(I)CaMV35S啟動子，(II)TMVRNA的Q片斷，(III)木糖異構(gòu)酶基因XylA編碼序歹U，(IV)CaMV35SPoly-A序歹ij;DREB2A基因表達框機構(gòu)是從5'到3'端方向依次為(I)CaMV35S啟動子，(II)抗逆轉(zhuǎn)錄因子DREB2A編碼序列，(III)NosPoly-A序列。本載體中的啟動子是rd29A，這個啟動子克隆自擬南芥，該啟動子驅(qū)動的GUS基因在高鹽、高滲和ABA誘導下均能表達，且其表達量不低于組成型的35S啟動子。另外，在不存在誘導條件下有非常微弱的表達，屬于正常，因為在擬南芥中，rd29A基因有很微量的組成型表達，將含有這類應答元件的啟動子，連接上感興趣的基因，便能組成一個分了開關系統(tǒng)。把這樣的分子開關系統(tǒng)應用于轉(zhuǎn)基因植物中，就可以讓目標基因在植物體受到干旱、高鹽、低溫等逆境脅迫或者有外源ABA誘導的時候才表達。目前，該分子開關系統(tǒng)已經(jīng)得到了廣泛的應用。本發(fā)明的安全性植物抗逆表達載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，獲得含有該載體的大腸桿菌轉(zhuǎn)化子。本發(fā)明的安全性植物抗逆表達載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105，獲得含有該載體的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化子，利用該轉(zhuǎn)化子，可以獲得環(huán)境安全、抗逆的轉(zhuǎn)基因植物。利用含有本發(fā)明的安全性植物抗逆表達載體的農(nóng)桿菌EHA105轉(zhuǎn)化子，轉(zhuǎn)化豆科牧草百脈根，以木糖異構(gòu)酶XylA為篩選標記進行篩選，可獲得高抗逆性的轉(zhuǎn)基因百脈根植株。實驗證明，本發(fā)明的載體轉(zhuǎn)化率高；并且本發(fā)明獲得的轉(zhuǎn)基因植物擁有很強的抗逆性(例證抗干旱實驗見實施例7)。以下通過附圖和實施例對本發(fā)明進一步說明。圖l是中間載體pCRD—GUS的構(gòu)建流程。圖2是中間載體pCRD—XI的構(gòu)建流程。圖3是安全性抗逆載體pXIRD—D2A的構(gòu)建流程。圖4是百脈根的轉(zhuǎn)化和篩選過程。圖5是轉(zhuǎn)基因植株的PCR檢測結(jié)果。圖6是轉(zhuǎn)基因百脈根的抗旱能力測定結(jié)果。具體實施例方式為了便于理解本發(fā)明，特例舉以下實施例。其作用被理解為是對本發(fā)明的闡釋而非對本發(fā)明的任何形式的限制。實施例l:安全性植物抗逆表達載體pXIRD—D2A的構(gòu)建首先將質(zhì)粒pCAMBIA3301驅(qū)動GUS的35S啟動子替換成誘導型啟動子rd29A(啟動子片段來源于本實驗室構(gòu)建的載體T-Prd29A:其構(gòu)建過程是PCR法擴增出擬南芥的rd29A基因(GenBankaccessionmimberD13044)的核苷酸序列，連接入pGEMT-easy載體得到的。)用歷"JIII、雙酶切下pCAMBIA3301的35S啟動子，然后切下的35S位置連接入rd29A啟動子，獲得中間載體pCRD—GUS(詳細構(gòu)建過程見附圖l)。再用///"^111、K/7"I雙酶切中間載體pCRD—GUS，切下phosphinothricin基因及其啟動子，替換以35S-Q-XylA片段(該片段來源于本實驗室構(gòu)建的載體pBin438-XI:其構(gòu)建過程是PCR法擴增出以大腸桿菌基因組DNA為模板的XI基因(GenBankaccessionnumberIDeoeMOO}，以XI基因替換pBin438載體BADH基因序列得到的。)，得到中間載體pCRD—XI(詳細構(gòu)建過程見附圖2)。載體構(gòu)建的最后一步是中間載體pCRD—XI中的報告基因GUS被換成目標基因DREB2A:用5g/11、Affin雙酶切pCRD—XI，切下2048bp的GUS基因(具內(nèi)含子)，插入末端分別為5gni和5^EII的DREB2A片段(DREB2A片段來源于本實驗室構(gòu)建的載體T-D2A:其構(gòu)建過程是PCR法擴增出擬南芥的DREB2A基因(GenBankaccessionnumberID830424),連接入pGEMT-easy載體得到的。)，最終獲得以木糖異構(gòu)酶基因為選擇標記，rd29A啟動子驅(qū)動DREB2A基因表達的質(zhì)粒載體pXIRD—D2A(詳細構(gòu)建過程見附圖3)表l.l、表1.2和表1.3是上述實驗涉及到的酶切反應體系，電泳條件和連接反應體系。表1.1歷wffll和A:;7"I雙酶切反應和電泳體系<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>37。C反應過夜，然后用lxTAE(0.04mol/LTris-乙酸，O.OOlmol/LEDTA)酉己制0.8。/o瓊脂糖凝膠，在瓊脂糖凝膠內(nèi)加入EB(溴化乙錠)至終濃度為0.5昭/ml，在5V/cm的電壓下電泳。表1.2連接反應體系<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>表i.3^grn和Ayffin雙酶切反應和電泳體系<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>先加5WEII酶，并在反應液表面封加石蠟油，65'C反應8h，然后加SgZII酶37'C反應過夜，然后用lxTAE(0.04mol/LTris-乙酸，0.001mol/LEDTA)配制0.8。/。瓊脂糖凝膠，在瓊脂糖凝膠內(nèi)加入EB(溴化乙錠)至終濃度為0.5pg/ml，在5V/cm的電壓下電泳。實施例2:含pXIRD—D2A的大腸桿菌轉(zhuǎn)化子的獲得大腸桿菌DH5a感受態(tài)細胞的制備取存于-70'C的菌種在LB(配制方法見表2.1)平板上劃線活化，37'C培養(yǎng)12-16小時；挑取單菌落在5mlLB培養(yǎng)基中，37'C200rpm振蕩培養(yǎng)過夜；取200pl培養(yǎng)過夜的菌液加入至U20mlLB培養(yǎng)基中，37'C200rpm振蕩培養(yǎng)3-4小時，至OD6oo值在0.3-0.4之間，將菌液分裝于1.5ml離心管中，冰浴10分鐘，4'C4000rpm(約1600g)離心10分鐘；棄上清，用lml冰預冷的0.1MCaCh溶液重懸，冰浴30分鐘，4'C4000rpm離心10分鐘，重復此步驟一次；棄上清，用100nl冰預冷的0.1MCaCl2和100^U甘油重懸菌體，即得到感受態(tài)細胞。感受態(tài)細胞可立即凍存于-70備用。0.1MCaCl2和甘油使用前均經(jīng)121'C高壓蒸汽滅菌15分鐘。取實施例l中的連接產(chǎn)物(含有目的基因DREB2A)1(Hd加入到感受態(tài)細胞DH5a懸液中，冰浴30分鐘，之后42'C熱激90秒，然后迅速插入冰中，并于2-4分鐘，隨后加入800pl的LB培養(yǎng)基，37。C200rpm振蕩培養(yǎng)1.5-2.0小時。4000rpm離心5分鐘，倒出上清，用剩余的上清重懸菌體，均勻涂布在含50嗎/mlkanamycin的LB平板上37'C培養(yǎng)過夜。挑取長出的菌落2-3個，接種于5mlLB培養(yǎng)液中(含50嗎/mlkanamycin)，37。C200rpm振蕩培養(yǎng)過夜，用堿裂解法小量制備質(zhì)粒，經(jīng)PCR和酶切檢測后，挑出陽性克隆，其所對應菌落即為轉(zhuǎn)化子，保存于-70'C。表2.1LB液體培養(yǎng)基的成分胰蛋白胨10g酵母提取物5gNaCl10gddH20溶解后pH值用NaOH調(diào)到為7.0。若為固體培養(yǎng)基，則加入1.5%的瓊脂粉。實施例3:含載體pXIRD—D2A的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化子的獲得7農(nóng)桿菌EHA105感受態(tài)細胞的制備取保存于-70'C的EHA105菌種在含50嗎/mlrifampicin的LB(配制方法見表2.1)平板上劃線活化，28'C培養(yǎng)36-48小時；挑取單菌落在5ml含50嗎/ml的rifampicin的LB培養(yǎng)基中，于28'C在200rpm條件下振蕩培養(yǎng)24小時。按l:IOO大比例將菌液轉(zhuǎn)接到新的培養(yǎng)基中，于28'C在200rpm條件下振蕩培養(yǎng)6-7小時，至OD,值為0.6。收集菌液分裝于1.5mL離心管中，然后13000rpm離心30s，棄上清。用800pl的250mM的CaCl2重懸菌體沉淀，13000rpm離心30s，棄上清。用100pl的250m的CaCl2溶液重懸沉淀，冰上放置4小時，即為感受態(tài)細胞，保存于-7(TC備用。250mM的CaCl2溶液使用前經(jīng)12rC高壓蒸汽滅菌15分鐘。取實施例2中含pXIRD—D2A的大腸桿菌轉(zhuǎn)化子提取的質(zhì)粒(pXIRD—D2A)6pl于100111體積的農(nóng)桿菌EHA105感受態(tài)細胞懸液中，立即于冰上放置30min，然后從冰上取出迅速浸入液氮中5min，再37。C水浴5min。最后加入800juH本積的LB液體培養(yǎng)基，28。C溫育3-5小時后，4000rm離心5分鐘，倒出上清，用剩余的上清重懸菌體，均勻涂布在含50嗎/ml的kanamycin、50ng/ml的rifampicin的LB平板上28。C培養(yǎng)36-48小時。挑取長出的菌落2-3個作PCR檢測，陽性菌落即為轉(zhuǎn)化子，保存于-70'C。實施例4:利用含pXIRD—D2A的農(nóng)桿菌獲得轉(zhuǎn)基因百脈根a.外植體準備。百脈根種子經(jīng)表面消毒后浸泡24小時，置于放有濕潤濾紙的培養(yǎng)皿中，光照培養(yǎng)2天后，將發(fā)芽種子接種于MSO培養(yǎng)基中，7天左右取無菌苗子葉，頂端切去1/3作為外植體，接種于培養(yǎng)基I(見表4丄下同)中，預處理3d。b.菌液準備。將帶有pXIRD—D2A的EHA105農(nóng)桿菌分別涂在含有50ng/ml的kanamycin、50嗎/ml的rifampicin，pH7.0的YEB(見表4.2)平板上活化，挑取單菌落，用YEB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)至OD柳值在0.6-1.0之間，收集菌體，用MS0液體培養(yǎng)基重懸至OD60Q值為l.O，溫育4小時左右備用。c.轉(zhuǎn)化、共培養(yǎng)。將預處理3天的外植體在上述菌液中浸泡30min，吸干菌液轉(zhuǎn)入培養(yǎng)基II中共培養(yǎng)l-3天。d.抑菌、篩選。共培養(yǎng)后轉(zhuǎn)入培養(yǎng)基III中；約7天后轉(zhuǎn)入培養(yǎng)基VI中。待農(nóng)桿菌被抑制住之后(約3周)，轉(zhuǎn)到培養(yǎng)基V中。外植體在培養(yǎng)基VI中已開始分化出不定芽，在培養(yǎng)基V中繼續(xù)分化和生長。e.待不定芽長至3cm左右時將不定芽切下，在培養(yǎng)基VI繼續(xù)篩選培養(yǎng)，約25天后將生根的抗性苗轉(zhuǎn)到MSO培養(yǎng)基上擴繁，7天后獲得抗性再生植株。上述百脈根轉(zhuǎn)化所需的培養(yǎng)基見表4.1。表4.1百脈根轉(zhuǎn)化所需的培養(yǎng)基(pH6.0)<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>滅菌后加100mMMgSO4至終濃度為2mM;100mMMgS04溶液，高溫滅菌后用。固體培養(yǎng)基在液體培養(yǎng)基中加入1.5%的瓊脂粉。實施例5:轉(zhuǎn)基因植株的分子檢測用CTAB法提取轉(zhuǎn)基因植株的基因組DNA，以此DNA作為PCR檢測的模板，設計引物對DREB2A是否轉(zhuǎn)入百脈根進行檢測。PCR引物為上游引物5'-CTCTGATCATAAACTGCCATAGATCTGGATCC-3'下游引物5'-CTTGGATCTGGAGAACTAAGGTACCGGTGACC-3'PCR運行參數(shù)為首先94'C變性5min;然后35個循環(huán)循環(huán)步驟為94'C變性50s，53'C退火50s，72X:延伸75s;最后72。C補充延伸10min。PCR產(chǎn)物經(jīng)l。/。瓊脂糖凝膠電泳后用凝膠成像儀分析，結(jié)果見圖5，非轉(zhuǎn)基因植株(標為"一")無帶出現(xiàn)，而轉(zhuǎn)基因植株(標號l一6)出現(xiàn)和質(zhì)粒(標號"+")—致的目的條帶，說明目的基因已經(jīng)轉(zhuǎn)入百脈根中。實施例6:木糖異構(gòu)酶作為篩選標記的百脈根轉(zhuǎn)化體系的效率從外植體準備開始，直到獲得抗性再生植株的時間記為轉(zhuǎn)化周期；用PCR分子手段，確定陽性植株，以下式計算轉(zhuǎn)化率陽性再生植株數(shù)轉(zhuǎn)化率(％)=-X100%抗性再生植株數(shù)轉(zhuǎn)化結(jié)果見表6.1。表6.1木糖篩選體系與除草劑篩選體系的比較轉(zhuǎn)化體系篩選劑轉(zhuǎn)化周期(天)轉(zhuǎn)化率(％)木糖篩選體系木糖9346.7實施例7:利用pXIRD—D2A獲得的轉(zhuǎn)基因百脈根的抗旱性轉(zhuǎn)基因植株在MS0培養(yǎng)基上長到4一5厘米后，移栽到花盆中(夏天溫室條件，光照和溫度同室外，濕度70%左右，人為澆水)，待生長兩個月后，停止?jié)菜?，分別觀察停止?jié)菜?5天后，21天后，27天后轉(zhuǎn)基因植株和非轉(zhuǎn)基因植株的生長情況，如圖6所示，15天后，非轉(zhuǎn)基因植株生長受到抑制，轉(zhuǎn)基因植株生長正常；21天后，非轉(zhuǎn)基因植株基本呈現(xiàn)枯蔞，轉(zhuǎn)基因植株能夠生長但受到抑制；27天后，非轉(zhuǎn)基因植株完全死亡，轉(zhuǎn)基因植株能夠維持生長，部分呈現(xiàn)綠色；同時也能觀察到花盆里的土壤隨著不澆水的天數(shù)增多，干燥和板結(jié)程度加重。綜上所述，表明轉(zhuǎn)基因百脈根植株比非轉(zhuǎn)基因百脈根植株的抗旱能力顯著增強。權(quán)利要求1.一種重組質(zhì)粒載體，其特征在于該載體組合含有rd29A啟動子，木糖異構(gòu)酶基因XylA和抗逆轉(zhuǎn)錄因子基因DREB2A。2.權(quán)利要求1所述的質(zhì)粒載體，其特征在于基因表達框架位于載體T-DNA左邊界LB和右邊界RB序列之間。其中，XylA基因表達框結(jié)構(gòu)是從5'到3'端方向依次為(I)CaMV35S啟動子，(II)TMVRNA的Q片斷，(III)木糖異構(gòu)酶基因XylA編碼序列，(IV)CaMV35SPoly-A序列；DREB2A基因表達框機構(gòu)是從5'到3'端方向依次為(I)CaMV35S啟動子，(II)抗逆轉(zhuǎn)錄因子基因DREB2A編碼序列，(III)NosPoly-A序列。3.權(quán)利要求1所述質(zhì)粒載體的構(gòu)建方法，包括以下步驟用木糖異構(gòu)酶基因XylA及其所帶rd29A啟動子替換了基礎載體pCAMBIA3301的標記基因潮霉素基因及其啟動子；抗逆性轉(zhuǎn)錄因子基因DREB2A編碼序列替換了報告基因Gus的編碼序列。4.按照權(quán)利要求1所述的質(zhì)粒載體，其特征在于含有轉(zhuǎn)化該載體的大腸桿菌。5.按照權(quán)利要求1所述的質(zhì)粒載體，其特征在于含有轉(zhuǎn)化該載體的農(nóng)桿菌。6.利用權(quán)利要求1所述的質(zhì)粒載體得到的轉(zhuǎn)基因植物。7.利用含有權(quán)利要求1所述質(zhì)粒載體的農(nóng)桿菌EHA105轉(zhuǎn)化子，轉(zhuǎn)化豆科牧草百脈根，以木糖異構(gòu)酶XylA為篩選標記進行篩選，得到的高抗逆性的轉(zhuǎn)基因百脈根植株。全文摘要本發(fā)明公開一種安全的植物抗逆表達載體，以木糖異構(gòu)酶基因XylA為篩選標記、啟動子為物理因素誘導型的啟動子rd29A，目的基因是抗逆性轉(zhuǎn)錄因子基因DREB2A，本發(fā)明為培育環(huán)境安全的抗逆性優(yōu)良的轉(zhuǎn)基因作物提供一種有效的表達載體，用該載體轉(zhuǎn)化植物，可以避免使用抗生素和除草劑，篩選獲得高抗逆性的轉(zhuǎn)基因植物。文檔編號A01H1/00GK101423844SQ20081005156公開日2009年5月6日申請日期2008年12月10日優(yōu)先權(quán)日2008年12月10日發(fā)明者劉艷芝,林春晶,蔡勤安,邢少辰,郭喜英,韋正乙申請人:吉林省農(nóng)業(yè)科學院