專利名稱：：三倍體黃顙魚的生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種魚類的養(yǎng)殖方法，特別是涉及一種三倍體黃顙魚的生產(chǎn)方法。
背景技術(shù)：
：黃顙魚[Pelteobagrusfulvidraco(Richardson)]俗禾爾黃臘丁，黃鼓魚等，屬鯰形目、鰉科、黃顙魚屬。其肉質(zhì)細(xì)嫩，無肌間刺，蛋白質(zhì)含量15.37%,氨基酸總量14.19%,必需氨基酸指數(shù)達(dá)73.34，高于鱖魚之外的其它魚類，且賴氨酸含量較高，超過雞蛋蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)，具很高的營養(yǎng)價(jià)值。同時(shí)因其肉性味甘、平、有祛風(fēng)、利尿之功效，可用以主治水腫、喉痹腫痛等癥，有一定的藥用價(jià)值而深受消費(fèi)者親睞。目前由于黃顙魚天然資源銳減，市場(chǎng)上黃顙魚價(jià)格逐年攀升(是普通魚價(jià)格的2一倍)，需求量很大，具有較好的市場(chǎng)前景。同時(shí)黃顙魚在日本、韓國、東南亞等國家也有巨大的市場(chǎng)潛力，是出口創(chuàng)匯的優(yōu)良品種。但由于該魚生長速度慢、個(gè)體規(guī)格偏小，通常要兩年才能性成熟。加之該魚產(chǎn)卵量低，一年中分批多次產(chǎn)卵，從整體上影響其養(yǎng)殖產(chǎn)量，遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足市場(chǎng)的需求。為解決這些問題，國內(nèi)學(xué)者進(jìn)行了許多有益的嘗試，主要集中在養(yǎng)殖手段及養(yǎng)殖環(huán)境的優(yōu)化方面，但從國內(nèi)外水產(chǎn)動(dòng)物研究的趨勢(shì)來看，三倍體技術(shù)應(yīng)是最有潛力的一種方法。三倍體水產(chǎn)動(dòng)物由于其不育性的特點(diǎn)，即性腺不能達(dá)到成熟并繁殖后代，因此沒有性成熟階段性腺發(fā)育的能量損耗，避免了性腺發(fā)育階段的生長停止和高死亡率。目前，三倍體水產(chǎn)動(dòng)物在控制過度繁殖、加快生長速度等方面都顯示了良好的效果。目前三倍體技術(shù)在水產(chǎn)動(dòng)物的應(yīng)用主要集中在貝類上，多采用物理或化學(xué)方法，在魚類研究很少，尤其在黃顙魚上實(shí)行人工誘導(dǎo)產(chǎn)生三倍體，從而達(dá)到改良品種性狀，目前尚未有文獻(xiàn)和研究涉及，因此如何根據(jù)黃顙魚的特性，設(shè)計(jì)一種誘導(dǎo)方法，獲得三倍體黃顙魚，以提高黃顙魚的生長速度及養(yǎng)殖成活率，具有廣泛的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益
發(fā)明內(nèi)容為解決現(xiàn)有技術(shù)中黃顙魚生長速度慢及成活率低的問題，本發(fā)明的目的在于提供一種三倍體黃顙魚的生產(chǎn)方法，采用該生產(chǎn)方法得到的黃顙魚具有生長速度快、成活率高的特性。本發(fā)明為實(shí)現(xiàn)上述目的采取的技術(shù)方案為，一種三倍體黃顙魚的生產(chǎn)方法，其特征在于，將采用人工催產(chǎn)獲得的黃顙魚母本和父本進(jìn)行人工授精，1015分鐘后，誘導(dǎo)得到三倍體黃顙魚，誘導(dǎo)持續(xù)時(shí)間1020分鐘。所述的人工催產(chǎn)受精是指將親本選育的黃顙魚經(jīng)雌雄鑒別后，注射催情藥物，雌體注射量為0.20.5ml/尾，雄體注射量為雌體的一半，解剖法獲取精卵后進(jìn)行人工授精。優(yōu)選地，注射部位以背鰭基部注射為主，進(jìn)針深度0.51.0cm。注射方式采用二次注射，第一針?biāo)幜繛槿珓┝康?/4,藥液量為lmL,第二針為全劑量的3/4，藥液量為lmL。二次注射兩針時(shí)間間隔為1012h。所述的催情藥物可選自絨毛膜促性腺激素(HCG)+馬來酸地歐酮(DOM)、促黃體素釋放激素類似物(LHRH-A2)+DOM、HCG+LHRH-A2+DOM三種組合的任意一種。本發(fā)明采用的誘導(dǎo)方法可以為物理誘導(dǎo)、化學(xué)誘導(dǎo)或兩者的結(jié)合?？谒龅奈锢碚T導(dǎo)是指采用冷休克誘導(dǎo)或熱休克誘導(dǎo)，其中冷休克誘導(dǎo)溫度控制在04"C，熱休克溫度控制在3037°C。所述的化學(xué)誘導(dǎo)是指采用化學(xué)誘導(dǎo)劑進(jìn)行誘導(dǎo)，化學(xué)誘導(dǎo)劑可選自細(xì)胞松弛素B(CB)、6-二甲基氨基嘌呤(6-DMAP)、咖啡因、秋水仙素和聚乙二醇(PEG)的任意一種。優(yōu)選的，采用6-DMAP誘導(dǎo)黃顙魚產(chǎn)生三倍體。6-DMAP濃度為300600pmol/L;誘導(dǎo)持續(xù)時(shí)間為1020miiu本發(fā)明的進(jìn)一步方案為誘導(dǎo)得到三倍體黃顙魚后，利用染色體核型分析、細(xì)胞流式儀等技術(shù)測(cè)定上述魚體的染色體倍數(shù)，鑒別、篩選出三倍體黃顙魚進(jìn)行培育a本發(fā)明的有益效果為1、本發(fā)明通過對(duì)人工授精的時(shí)間控制，同時(shí)采用物理或化學(xué)方法迸行誘導(dǎo)，并通過控制誘導(dǎo)持續(xù)時(shí)間，抑制第二極體釋放的時(shí)間，從而大大提高三倍體黃顙魚的誘導(dǎo)率和成活率，據(jù)實(shí)驗(yàn)統(tǒng)計(jì)，所獲得的三倍體黃顙魚的人工誘導(dǎo)率可達(dá)50%以上，成活率達(dá)80%以上。2、采用本發(fā)明所述方法培育的三倍體黃顙魚，具有生長速度快、個(gè)體規(guī)格大、養(yǎng)殖成活率高，抗病能力強(qiáng)、肉味鮮美等優(yōu)點(diǎn)，具有良好的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。圖1為本發(fā)明的工藝流程圖2為各因素對(duì)三倍體誘導(dǎo)的效應(yīng)對(duì)比圖。具體實(shí)施例方式參照?qǐng)D1所示，本發(fā)明所述的三倍體黃顙魚的生產(chǎn)方法如下1.1材料準(zhǔn)備l丄l樣品黃顙魚(尸e/teo^gntf/w/vWracc^取自紹興農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)。肉眼觀察，性腺發(fā)育良好。1.1.2試劑誘導(dǎo)試劑6-二甲基氨基嘌呤(6-Dimethylaminopurine，簡(jiǎn)稱6-DMAP)，為美國Sigma公司產(chǎn)品。分子式0^91^5，分子量163.2，藥品純度高于98%?；蚪M小量抽提試劑盒(包括CdlLysisSolutkMi;Prec^itatiooSolutkm;TE(p胸.0);12mol/LNaCl;ProteinaseK;RnaseA)，為生物工程(上海)有限公司產(chǎn)品。113儀器水箱數(shù)個(gè)，充氣泵，解剖器具1套，1.5ml消化管，移液槍，電子分析天平(JA5003,用于稱量微量的試劑，最大量為500g)，數(shù)顯恒溫水浴鍋(HH-6,恒溫水浴)，高速微量冷凍離心機(jī)(LGR-16-W)，核酸蛋白定量儀，比色管。1.2方法1.2.1雌雄鑒別、性比、注射部位和藥量雌雄鑒別主要看生殖孔，即有生殖乳突為3，無生殖乳突為？。雌雄比一般為l:l。注射部位以背鰭基部注射為主，進(jìn)針深度0.51.0cm，使用二次注耽第一針?biāo)幜繛槿珓┝康膌/4，藥液量為lmL，第二針為全劑量的3/4，藥液量為lmL。^為？劑量的1/2。二次注射兩針時(shí)間間隔為1012h。1.2.2不同催情藥物的比較設(shè)3個(gè)組合絨毛膜促性腺激素(HCG)+馬來酸地歐酮(DOM);促黃體素釋放激素類似物(LHRH-A2)+DOM;HCG+LHRH-A2+DOM。1.2.3精卵解剖法獲取精卵，并進(jìn)行人工授精。1.2.4三倍體誘導(dǎo)用6-DMAP誘導(dǎo)黃顙魚產(chǎn)生三倍體。進(jìn)行正交試驗(yàn)6-DMAP濃度，設(shè)300、450和600nmoI/L;誘導(dǎo)時(shí)機(jī)(即精卵混合后的時(shí)間)，設(shè)10、和30min;誘導(dǎo)持續(xù)時(shí)間，設(shè)10、15、20min。試驗(yàn)平行重復(fù)二次。決定三倍體誘導(dǎo)率的三因素主次順序和最優(yōu)水平組合以直觀分析法得出o1.2.5黃顙魚基因組DNA的提取取冷凍的受精卵30顆碾碎，收集到1.5mL離心管中，用200uLTE懸浮。200nL樣品加400LCellLysisSokrtkxi混勻，再力qA6uLProtdnaseK混勻，置于65"C水浴2h。其間上下混勻幾次。加入600uL氯仿混勻，不能太劇烈，以保證DNA的完整性。在臺(tái)式離心機(jī)上，10000r/min,室溫離心2分鐘。此時(shí)應(yīng)分J^三層，基因組DNA在上層中。取500pL上層清液，置于無菌1.5mL離心管中。加入500nLPrecipitationSolution混勻，室溫放置2分鐘。10000r/min，離心2分鐘。吸去上清，立即加入100mL，1.2mol/LNaCl，請(qǐng)輕振蕩直至DNA樣品完全溶解，加入3^RnaseA，置于37-C5-10分鐘，以去除RNA。加入300nL冰冷乙醇，-20'C放置10分鐘。10000r/min，離心5-8分鐘。吸走或倒掉乙醇，用70%乙醇洗一次。倒置室溫干燥10分鐘。DNA用100pLTE溶解。1.2.7倍性檢査DNA的含量鑒定由于核酸所含的嘌呤和嘧啶分子中都有共軛雙鍵，使核酸分子在紫外260nm波長處有最大吸收峰，這個(gè)性質(zhì)可用于核酸的定量測(cè)定。而普通三倍體細(xì)胞的DNA含量是二倍體的1.5倍，因此可以通過DNA的含量區(qū)分出二倍體和三倍體。實(shí)驗(yàn)所得的提取物中DNA含量的定性與定量測(cè)定均在核酸蛋白定量儀(SmartSpecplus,主要用于測(cè)定抽提的核酸OD值)上進(jìn)行。吸取10nlDNA樣品，轉(zhuǎn)入比色杯中，用超純水校正零點(diǎn)。吸收波長取260nm和280nm，以260nm處的吸收值作為計(jì)算DNA含量參數(shù)。在波長為260nm的光程為，一個(gè)吸收單位(1A260)相當(dāng)于雙鏈DNA濃度為50pg/ml，單鏈DNA為33ng/ml，單鏈RNA為40pg/ml，寡核甘酸為2030pg/ml。DNA的含量計(jì)算公式如下.-所提DNA樣品濃度0ig/mi;K)D260x50xDNA稀釋倍數(shù)。DNA產(chǎn)量(nghDNA濃度x樣品的體積(ml)13.實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析表l注射過HCG+LHRH-A2的三倍體誘導(dǎo)率<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>從表l中可以看出，6-DMAP濃度較低時(shí)，適當(dāng)延長誘導(dǎo)時(shí)機(jī)可以提高三倍體的誘導(dǎo)率，但是當(dāng)濃度達(dá)到一定程度時(shí)，如果再延長誘導(dǎo)時(shí)機(jī)誘導(dǎo)率反而會(huì)變低，可能由于高濃度的藥物對(duì)受精卵產(chǎn)生了毒性，造成了誘導(dǎo)率下降。雖然可以產(chǎn)生一定百分比的三倍體，但是都沒有達(dá)到50%，也可能說明HCG+LHRH-A2催產(chǎn)率并不高。表2注射過HCG+DOM的三倍體誘導(dǎo)率<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>從表2中可Bl看出，6-DMAP誘導(dǎo)三倍體黃顙魚時(shí)有個(gè)閾值，其濃度低于或高于這個(gè)閾值時(shí)，三倍體的誘導(dǎo)率都會(huì)有所下降?？赡茉蚴钱?dāng)濃度低于閾值時(shí)，不能有效抑制住極體的釋放，所以多倍體產(chǎn)生的幾率變小；當(dāng)濃度高于閾值時(shí)，對(duì)受精卵產(chǎn)生了毒害，故造成了誘導(dǎo)率下降。表2中誘導(dǎo)率較高，可能說明HCG+DOM的催產(chǎn)率效果比較好。表3注射過LHRH-A2+DOM的三倍體誘導(dǎo)率<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>從表3中可以看出，三倍體的誘導(dǎo)情況和表2基本一致，6-DMAP誘導(dǎo)三倍體黃顙魚時(shí)有個(gè)閾值，其濃度低于或高于這個(gè)閾值時(shí)，三倍體的誘導(dǎo)率都會(huì)有所下降。另外適當(dāng)延長誘導(dǎo)時(shí)機(jī)可以提高三倍體的誘導(dǎo)率。表3中三倍體誘導(dǎo)率處于中間水平，可能說明LHRH-A2+DOM催產(chǎn)效果一般。綜合表I、2、3，本實(shí)驗(yàn)得到的三倍體誘導(dǎo)率各影響因素效應(yīng)對(duì)比如圖2，從圖2中可以看出，影響三倍體誘導(dǎo)率三個(gè)因素中1、6-DMAP的濃度是誘導(dǎo)三倍體的一個(gè)重要因素，在抑制受精卵的極體釋放有個(gè)閾值。若其濃度低于這個(gè)閾值，不管誘導(dǎo)持續(xù)時(shí)間有多長，都不能有效抑制住極體的釋放，都不能使之產(chǎn)生多倍體。只有當(dāng)6-DMAP濃度達(dá)到閾值后,并且誘導(dǎo)持續(xù)時(shí)間達(dá)到一定的效應(yīng)時(shí)間時(shí)才能抑制住極體的釋放，才能產(chǎn)生多倍體。若是抑制第二極體釋放，這個(gè)"一定的效應(yīng)時(shí)間"則應(yīng)為釋放出第一極體后開始到釋放出第二極體所需要的時(shí)間；若誘導(dǎo)濃度大大超過閾值，則所誘導(dǎo)的受精卵雖然能產(chǎn)生多倍體，但必然會(huì)出現(xiàn)胚胎的孵化率很低和幼體的畸形率很高的現(xiàn)象。因此超出一定的濃度范圍三倍體誘導(dǎo)率會(huì)明顯降低，所以適宜的藥物濃度是保證三倍體誘導(dǎo)成功的前提。2、誘導(dǎo)時(shí)機(jī)人工受精后10min為誘導(dǎo)時(shí)機(jī)獲得的誘導(dǎo)效果較好。誘導(dǎo)魚類三倍體產(chǎn)生的機(jī)制就是抑制受精卵第二極體的排出，使得受精卵中保留兩套雌核染色體和一套雄核染色體而成為三倍體，因此，只有將誘導(dǎo)處理起始時(shí)間準(zhǔn)確定位在第二極體排出之前，才有可能獲得較好的誘導(dǎo)率，但由于第二極體排出時(shí)間十分短暫，而且受精卵的發(fā)育不完全同歩，這就使得處理起始時(shí)間的準(zhǔn)確選擇有一定的難度。3、誘導(dǎo)持續(xù)時(shí)間對(duì)黃顙魚受精卵持續(xù)誘導(dǎo)15min的效果明顯好于誘導(dǎo)10min和20min的效果，過短的處理時(shí)間對(duì)抑制受精卵第二極體的排出的效果不明顯，導(dǎo)致三倍體誘導(dǎo)效率不高。而過長的處理時(shí)間不但不能提高三倍體誘導(dǎo)率，反而會(huì)對(duì)受精卵造成嚴(yán)重?fù)p傷，導(dǎo)致胚體大量畸形，影響孵化率?？梢?，在確定了適宜的處理溫度和開始處理時(shí)間后，處理持續(xù)時(shí)間的長短將直接影響受精卵的誘導(dǎo)率。權(quán)利要求1、一種三倍體黃顙魚的生產(chǎn)方法，其特征在于，將采用人工催產(chǎn)獲得的黃顙魚母本和父本進(jìn)行人工授精，10～15分鐘后，誘導(dǎo)得到三倍體黃顙魚，誘導(dǎo)持續(xù)時(shí)間10～20分鐘。2、如權(quán)利要求1所述的一種三倍體黃顙魚的生產(chǎn)方法，其特征在于，所述的人工催產(chǎn)受精是指將親本選育的黃顙魚經(jīng)雌雄鑒別后，注射催情藥物，雌體注射量為0.20.5ml/尾，雄體注射量為雌體的一半，解剖法獲取精卵后進(jìn)行人工授精。3、如權(quán)利要求2所述的一種三倍體黃顙魚的生產(chǎn)方法，其特征在于，注射部位以背鰭基部注射為主，進(jìn)針深度0.51.0cm。注射方式采用二次注射，第一針?biāo)幜繛槿珓┝康?/4,藥液量為lmL，第二針為全劑量的3/4，藥液量為lmL。二次注射兩針時(shí)間間隔為1012h。4、如權(quán)利要求2或3所述的一種三倍體黃顙魚的生產(chǎn)方法，其特征在于，所述的催情藥物可選自絨毛膜促性腺激素(HCG)+馬來酸地歐酮(DOM)、促黃體素釋放激素類似物(LHRH-A2)+DOM、HCG+LHRH-A2+DOM三種組合的任意一種。5、如權(quán)利要求1所述的一種三倍體黃顙魚的生產(chǎn)方法，其特征在于，所述誘導(dǎo)方法可以為物理誘導(dǎo)、化學(xué)誘導(dǎo)或兩者的結(jié)合。6、如權(quán)利要求5所述的一種三倍體黃顙魚的生產(chǎn)方法，其特征在于，所述的物理誘導(dǎo)是指采用冷休克誘導(dǎo)或熱休克誘導(dǎo)，其中冷休克誘導(dǎo)溫度控制在04°C，熱休克溫度控制在3037'C。7、如權(quán)利要求5所述的一種三倍體黃顙魚的生產(chǎn)方法，其特征在于，所述的化學(xué)誘導(dǎo)是指采用化學(xué)誘導(dǎo)劑進(jìn)行誘導(dǎo)，化學(xué)誘導(dǎo)劑可選自細(xì)胞松弛素B(CB)、6-二甲基氨基嘌呤(6-DMAP)、咖啡因、秋水仙素和聚乙二醇(PEG)的任意一種。8、如權(quán)利要求7所述的一種三倍體黃顙魚的生產(chǎn)方法，其特征在于，優(yōu)選的，采用6-DMAP誘導(dǎo)黃顙魚產(chǎn)生三倍體。6-DMAP濃度為300600nmol/L;誘導(dǎo)持續(xù)時(shí)間為1020min。9、如權(quán)利要求1所述的一種三倍體黃顙魚的生產(chǎn)方法，其特征在于，誘導(dǎo)得到三倍體黃顙魚后，利用染色體核型分析、細(xì)胞流式儀等技術(shù)測(cè)定上述魚體的染色體倍數(shù)，鑒別、篩選出三倍體黃顙魚進(jìn)行培育。全文摘要本發(fā)明公開了一種三倍體黃顙魚的生產(chǎn)方法，屬于魚類養(yǎng)殖
技術(shù)領(lǐng)域：
，將采用人工催產(chǎn)獲得的黃顙魚母本和父本進(jìn)行人工授精，10～15分鐘后，誘導(dǎo)得到三倍體黃顙魚，誘導(dǎo)持續(xù)時(shí)間10～20分鐘。誘導(dǎo)得到三倍體黃顙魚后，利用染色體核型分析、細(xì)胞流式儀等技術(shù)測(cè)定上述魚體的染色體倍數(shù)，鑒別、篩選出三倍體黃顙魚進(jìn)行培育。本發(fā)明通過對(duì)人工授精的時(shí)間控制，同時(shí)采用物理或化學(xué)方法進(jìn)行誘導(dǎo)，并通過控制誘導(dǎo)持續(xù)時(shí)間，抑制第二極體釋放的時(shí)間，從而大大提高三倍體黃顙魚的誘導(dǎo)率和成活率，據(jù)實(shí)驗(yàn)統(tǒng)計(jì)，所獲得的三倍體黃顙魚的人工誘導(dǎo)率可達(dá)50％以上，成活率達(dá)80％以上。文檔編號(hào)A01K61/00GK101305698SQ20081006290公開日2008年11月19日申請(qǐng)日期2008年7月4日優(yōu)先權(quán)日2008年7月4日發(fā)明者沈文英,文羅,鄧先余申請(qǐng)人:紹興文理學(xué)院;羅文;沈文英