專利名稱：：一種與甘藍(lán)黑腐病黃單胞菌致病相關(guān)基因的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種植物病原細(xì)菌的致病基因的應(yīng)用，尤其涉及甘藍(lán)黑腐病原細(xì)菌的致病相關(guān)基因的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：植物病害一直是農(nóng)作物減產(chǎn)及其生產(chǎn)品質(zhì)降低的主要因子之一。隨著病原菌對(duì)藥物抗性的增強(qiáng)，農(nóng)藥用量在不斷增加，這不僅增加了環(huán)境中的藥物殘留而加劇了環(huán)境污染，也大大提高了農(nóng)業(yè)成本。因此，農(nóng)產(chǎn)品亟待研發(fā)新型的無(wú)公害藥物作為新的植物病害防治策略。弄清植物病原菌侵染寄主的遺傳機(jī)制則是開(kāi)發(fā)無(wú)公害藥物和提出新防病策略的關(guān)鍵。許多革蘭氏陰性植物病原細(xì)菌通過(guò)III型分泌系統(tǒng)(T3SS,將之稱為III型效應(yīng)物的毒性蛋白)分泌并轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入植物體內(nèi)，從而引起植物致病或過(guò)敏反應(yīng)(Kjemtrup，2000)。在植物病原細(xì)菌中，T3SS是由/wp(hypersensitivereactionandpathogenicity)基因編碼的。許多革蘭氏陰性植物病原細(xì)菌在易感寄主植物上的致病作用以及在抗性寄主或非寄主植物上引起過(guò)敏反應(yīng)(hypersensitivereaction,HR)是受/2r/基因控制的(Alfano,1997)。過(guò)敏反應(yīng)是植物被侵染部位組織細(xì)胞快速凋亡的一種自身免疫反應(yīng)(Klement，1982)。效應(yīng)物蛋白從結(jié)構(gòu)上可分為分泌轉(zhuǎn)運(yùn)信號(hào)區(qū)和互作功能區(qū)(Mudgett,2000)。黃單胞菌III型效應(yīng)物的轉(zhuǎn)運(yùn)依賴于易位子HrpF(Buttner,2002)。盡管效應(yīng)物的詳細(xì)功能仍不十分清楚，近年來(lái)的研究揭示，效應(yīng)物可改變寄主細(xì)胞骨架和膜結(jié)構(gòu)、攻擊寄主的免疫防御系統(tǒng)與寄主DNA的功能，干擾寄主的正常代謝以及改變寄主的嚢胞運(yùn)輸?shù)龋龠M(jìn)病原菌進(jìn)入寄主細(xì)胞和在寄主細(xì)胞內(nèi)生長(zhǎng)、擴(kuò)展和定殖(Nomura,2005)。甘藍(lán)黑腐病黃單胞菌，也稱為甘藍(lán)黑腐病黃單胞菌野油菜致病變種(JTawf/omo"oscampesfn'spv.campestris，簡(jiǎn)-爾Xcc),是一種能在全J求范圍內(nèi)引起所有十字花科植物黑腐病的革蘭氏陰性細(xì)菌(Qian，2005)。該菌能在寄主的任何生長(zhǎng)期通過(guò)水孔、氣孔或傷口侵入植物體內(nèi)，而引起寄主病害。寄主包括甘藍(lán)、花椰菜、大白菜、蘿卜以及油菜等。典型的黑腐病癥狀是在葉緣上形成v字形病斑，隨著病斑的擴(kuò)大，葉脈變黑，因而凈皮稱為黑腐病。黑腐病被認(rèn)為是對(duì)十字花科植物危害最為嚴(yán)重的病害，尤其在熱帶和亞熱帶地區(qū)，溫度和濕度都適宜于該菌的生長(zhǎng)繁殖，因此發(fā)病更加嚴(yán)重。由于遺傳穩(wěn)定性和遺傳可操作性，甘藍(lán)黑腐病黃單胞菌一直被用作研究微生物與植物相互作用分子機(jī)理的模式細(xì)菌。因此，鑒定與黃單胞菌致病相關(guān)的新基因，對(duì)防治植物病害具有顯著的意義。III型效應(yīng)物是病原細(xì)菌致病的決定性致病因子。鑒定III型效應(yīng)物蛋白并研究其功能，對(duì)于解明病原菌的致病機(jī)理、寄主范圍和進(jìn)化具有重要意義。參考文獻(xiàn)1.KjemtrupS，NimchukZ,DanglJL.Effectorproteinsofphytopathogenicbacteria:bifimctionalsignalsinvirulenceandhostrecognition[J].CurrOpinMicrobiol,2000,3:73-78.2.AlfanoJR，CollmerA.ThetypeIII(Hrp)secretionpathwayofplantpathogenicbacteria:traffickingharpins,Avrproteins,anddeath[J].JBacteriol,1997，179:5655-5662.3.KlementZ.Hypersensitivity.InMountM.S.andLacy,G.H.(eds),PhytopathogenicProkaryotes.Vol.2.AcademicPress,NewYork,1982,149-177.4.MudgettMB，ChesnokovaO,DahlbeckD,etal.MolecularsignalsrequiredfortypeIIIsecretionandtranslocationoftheAvrBs2proteintopepperplants[J].ProcNatlAcadSciUSA,2000,97:13324-13329.5.ButtnerD,NennstielD,KlusenerB,etal.FunctionalanalysisofHrpF，aputativetypeIIItransloconproteinfromJTa涵o附owascaw/eWWspv.簡(jiǎn)c她na[J].JBacteriol,2002,184:2389-2398.6.QianW,JiaY,RenSX，etal.ComparativeandfunctionalgenomicanalysesofthepathogenicityofphytopathogencampesWspv.c"wpesWs[J].GenomeRes,2005,15:757-767.7.NomuraK,HeSY.Powerfulscreensforbacterialvirulenceproteins[J].ProcNatlAcadSciUSA,2005，102:3527-3528.8.StaskawiczB，DahlbeckD,KeenNT,etal.Molecularcharacterizationofclonedavirulencegenesfromrace0andrace1ofPseudomonassyringaepv.glycinea[J].JournalofBacteriology,1987,169:5789-94.
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種與甘藍(lán)黑腐病黃單胞菌致病相關(guān)基因的應(yīng)用。為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種與甘藍(lán)黑腐病黃單胞菌致病相關(guān)的m型效應(yīng)物基因在植物甘藍(lán)黑腐病害防治中的應(yīng)用，所述基因是下列核香酸序列之一(1)序列表中序列1的DNA序列；(2)與序列表中序列1限定的DNA序列具有80。/。以上同源性的DNA序列。通過(guò)將所述基因用作甘藍(lán)黑腐病黃單胞菌的藥物靶標(biāo)，實(shí)現(xiàn)其在植物甘藍(lán)黑腐病害防治中的應(yīng)用。本發(fā)明通過(guò)提供一種與甘藍(lán)黑腐病黃單胞菌致病相關(guān)的III型效應(yīng)物基因XC3160,其為防治甘藍(lán)黑腐病黃單胞菌病害提供了藥物靶標(biāo)，從而為防治植物病害研發(fā)無(wú)公害藥物及環(huán)境保護(hù)打下堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。圖1為XC3160基因的克隆五coRI/Z&fll酶切電泳圖譜；圖2為XC3160基因插入突變體203G01的PCR驗(yàn)證凝膠圖3為XC3160效應(yīng)物轉(zhuǎn)運(yùn)4企測(cè)；5圖4為XC3160基因插入突變體203G01的致病性試驗(yàn)。具體實(shí)施例方式本發(fā)明提供一種與甘藍(lán)黑腐病黃單胞菌致病相關(guān)的III型效應(yīng)物基因在植物甘藍(lán)黑腐病害防治中的應(yīng)用，該基因是下列核苷酸序列之一(1)序列表中序列1的DNA序列；(2)與序列表中序列1限定的DNA序列具有80。/。以上同源性的DNA序列。該基因XC3160的序列已在美國(guó)國(guó)立生物4支術(shù)信息中心NCBI公布，基因組序列號(hào)為NC007086，該基因編碼蛋白序列號(hào)YP—244224。攜帶該基因序列表中序列1的DNA是甘藍(lán)黑腐病黃單胞菌8004菌抹的DNA,由6150個(gè)堿基組成。含完整的義opXcc/^基因，自5'端的第1至第6147位核苷酸為該基因的ORF，自5'端的第1至第3位核苷酸為該基因的起始密碼子ATG,自5'端的第6148至第6150位核苷酸為該基因的終止密碼子TAA。序列表中序列2的蛋白質(zhì)A^因XC3160編碼的效應(yīng)物蛋白產(chǎn)物，由2049個(gè)氨基酸組成。該蛋白質(zhì)預(yù)測(cè)分子量為218816.38道爾頓，等電點(diǎn)為6.06。含有基因XC3160的DNA序列的表達(dá)載體?；騒C3160的插入突變體203G0L在防治甘藍(lán)黑腐病黃單胞菌植物病害上的用途。含有本發(fā)明開(kāi)放閱讀框及其部分序列的表達(dá)載體均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。下面結(jié)合實(shí)施例和附圖對(duì)本發(fā)明將基因XC3160用作防治甘藍(lán)黑腐病黃單胞菌的藥物靶標(biāo)的技術(shù)方案進(jìn)行詳細(xì)闡述。在本發(fā)明的實(shí)施例中所用到的材#+包括大腸桿菌(&c/zen'c;^co//)抹系JM109、載體pUC19購(gòu)自Promega公司，pLAFRl、pLAFR6為本研究室保存的柯斯質(zhì)粒(Staskawiczetal，1987);限制性內(nèi)切酶、修^飾酶等試劑購(gòu)自Promega、Stratagene、QIAGEN^厶司。實(shí)施例l:甘藍(lán)黑腐病黃單胞菌突變體庫(kù)的構(gòu)建以大腸桿菌和Jfcc之間的穿梭質(zhì)粒pLAFRl為載體將Tn5gwW5(Sharma,1990)引入義cc野生型菌株8004[1958年分離自英國(guó)薩塞克斯花椰菜(5rays/caoferaceavar.botrytis)]，然后通過(guò)引入不相容質(zhì)4立pPHlJI(Beringer,1978)驅(qū)趕pLAFRl，通過(guò)抗生素(卡那霉素)抗性標(biāo)記篩選Xcc中帶有Tn5g附A5插入突變體，結(jié)合Xcc全基因組序列和TAIL-PCR(ThermalAsymetricInterlaced-PCR)-技術(shù)(Liu，1995)，確定Tn5gw"5在基因纟且上的插入位置，并對(duì)插入位置進(jìn)行PCR驗(yàn)證。通過(guò)考察突變體的致病性、胞外酶活性、胞外多糖合成等表型的變化，篩選致病相關(guān)基因，本實(shí)施例涉及其中一個(gè)與甘藍(lán)黑腐病致病相關(guān)的基因XC3160，其插入突變體編號(hào)為203G01。實(shí)施例2:對(duì)XC3160克隆及序列測(cè)定由于XC3160的ORF長(zhǎng)度達(dá)6150bp,根據(jù)XC3160的基因序列，設(shè)計(jì)3對(duì)引物GGGGAATTCGCGACTGGGTGCTGGACATGG/CCCGGGAAGCTTGAGCTCGAC;TTGGTCGAGCTCAAGCTTCCCGG/AAGGTCCGTGCAGGATCCGCATC;ATGCGGATCCTGCACGGACCTTGTC/GGGTCTAGAAATGCACGATGCCTGGGTGGTCG;以甘藍(lán)黑腐病黃單胞菌8004菌抹總DNA為模板，PCR擴(kuò)增該基因左中右三,殳序列(95。C3min;95。C20sec,60。C20sec,72。C3min，30個(gè)循環(huán);72°C5min)，并將其克隆至克隆載體pUC19中，用雙脫氧核苷酸法在ABI377DNA自動(dòng)測(cè)序儀上測(cè)定DNA核苷酸序列。將測(cè)序驗(yàn)證正確的XC3160基因三段序列克隆至穿梭載體pLAFRJ中，獲得了含該基因的重組質(zhì)粒pLXC3160。該質(zhì)粒用￡coRI和I雙酶切，除了一個(gè)22kb的載體條帶外，還有一個(gè)5417bp的外源片段，請(qǐng)參見(jiàn)圖1。其中1:X////"dni標(biāo)準(zhǔn)DNA(片段大小從大到小依次為:23.1kb,9,4kb,6.6kb，4.4kb，2.4kb,2.0kb);2:pLAFRJ;3:重組質(zhì)4立pLXC3160。通過(guò)對(duì)基因XC3160的克隆及對(duì)克隆基因的序列測(cè)定，獲得XC3160并i正實(shí)其正確性。實(shí)施例3:XC3160插入突變體203G01的驗(yàn)證對(duì)插入突變體203G01進(jìn)行TAIL-PCR測(cè)序定位，發(fā)現(xiàn)其插在XC3160基因內(nèi)。用轉(zhuǎn)座子Tn5上側(cè)的一條引物(TTGTAACGCGCTTTCCCACCAACGC)和下游基因XC3159的一條引物(5'-GTCTCCACGCACGACGCGGC-3，)配對(duì)進(jìn)行PCR驗(yàn)證(95。C3min;95。C20see,60°C20sec,72°C3min,30個(gè)循環(huán)；72°C5min),產(chǎn)物預(yù)期大小3354bp,請(qǐng)參見(jiàn)圖2。其中，1:100bp標(biāo)準(zhǔn)DNA(片段大小從大到小依次為3kb，2kb，1.5kb，1.2kb，lkb，0.9kb,0.8kb，0,7kb等)；2:XC3160基因插入突變體203G01;3:A/州'wdl11標(biāo)準(zhǔn)DNA。插入突變體203G01用于后面證實(shí)XC3160與甘藍(lán)黑腐病黃單胞菌的致病相關(guān)。實(shí)施例4:XC3160效應(yīng)物轉(zhuǎn)運(yùn)^r測(cè)實(shí)馬全所用寄主植物為辣4權(quán)苗(種名為O^s/cwwcv.ECW-10R)(Hibberd，1987;Castaneda，2005)，接種方法為壓滲法(Xu,2007)。辣椒栽種于室外約23個(gè)月至成抹期后，選取六至八葉齡的全展葉片供試。接種供試的X"菌抹至加有相應(yīng)抗生素的NYGB過(guò)夜培養(yǎng)至OD6()o=1.0以上；收集lmL的菌液，用1mL無(wú)菌水清洗并重懸；調(diào)006()。至0.3,用無(wú)針頭的針筒吸取IO^L菌液壓滲到-束椒葉片背面的葉肉中，形成一個(gè)可見(jiàn)的浸潤(rùn)斑；接種后保濕80%并置于熒光燈下按16/8h(^^/4支)照射，24h后觀察結(jié)果并照相。正對(duì)照選用甘藍(lán)黑腐病黃單胞菌野生型8004菌4朱，負(fù)對(duì)照用"wSW缺失突變體和AvrBsl功能區(qū)。XC3160啟動(dòng)子信號(hào)區(qū)融合AvrBsl功能區(qū)后能在辣椒ECW-10R上引起快速的過(guò)敏反應(yīng)，而/^pF突變后又不能引起過(guò)敏反應(yīng)，證明XC3160是一個(gè)III型依賴的效應(yīng)物，請(qǐng)參見(jiàn)圖3。其中，A:野生型；B:aw^s7缺失突變體；C:avrAy/缺失突變體含有AvrBsl功能區(qū)；D:/w77F缺失突變體含有XC3160啟動(dòng)子信號(hào)區(qū)融合AvrBsl功能區(qū)；E:缺失突變體含有XC3160啟動(dòng)子信號(hào)區(qū)融合AvrBsl功能區(qū)；F:XC3160突變體203G01。實(shí)施例5:XC3160基因插入突變體203G01的致病性檢測(cè)實(shí)—瞼所用寄主植物為蘿卜苗(種名為i(3p/7aw^^//v^var.Manshenhong),所用的接種方法為剪葉法(Qian，2005)。XC3160基因插入突變體和野生型菌抹在28。C下用NYGBi咅養(yǎng)基進(jìn)行液體培養(yǎng)(Tang,2005),15-18個(gè)小時(shí)。用NYGB稀釋到OD6oo=0.001,用滅過(guò)菌的剪刀在菌液浸泡5秒鐘后，在健康葉片距葉尖1-2cm垂直葉脈的方向剪到中軸處，停留5秒鐘，被接種的植物在25-30。C培養(yǎng)一周后觀察結(jié)果，正對(duì)照選用甘藍(lán)黑腐病黃單胞菌野生型8004菌抹(A)。致病試驗(yàn)表明，XC3160基因的插入突變體的致病性顯著降低(B),請(qǐng)參見(jiàn)圖4。其中，A:甘藍(lán)黑腐病黃單胞菌野生型菌株8004;B:XC3160基因插入突變體203G01;C:互補(bǔ)菌林C203G01。序列1:DNA序列ATGACCTTACCGGATTCGATCACACGTTCGCCTGCAGAACCAGCGACGGCTTCACCGCAGATCCTGGGCGCCTTGCCTGCACGGGCGGGGGCGCTCCACGTGCAGMCGTTTCATCGCATGGCGCGGCTGCCGCAGACGGCGATGTCACGCCCGTCGTTCACAGCGMTCCAGTCTGGGTGATCGTGACGACTCGCGCATGCCACGCAACCTGATCGCAGCTCTTACCGTGCATCCGGCGGCCGACCAGGTCGCCAGTCAGCTGGCCGATCAGGCTGCCGACGGGCMTGTTTCGCCCTGTCCGGGCACTGGGCAGCCGTACCGCTGCCAATGCTTGGCCGGCAGGCCGATGGCGGTGTGGCCGGCAACGAGCAGATGTCCATCGCGGTGTTCGATGCGGACGGCAGGCCATGCATGCTCGATCAGCCCGGCCGGGTCGTGGAACTGACGTCGACACCTGCGATGCCTGTGGATGTGTTGGATGACAAGGGACGTGTGTATGAAGCCGACCGATTGACGTTGCCTCGCCCGATGGGCAGCTTGTCGACCGATCACAGCGTGCATCTTCTGCTGCAGCGGCCGGCAGGGCAAGCGCAGTTCTTGCTCATGCGCAGCGAGGGGCTGCAGATGGTGCTTGATGGGCACGCGCAACTGGGACATCCGMCCAGCCATGGGAGCGGCTGACGCTTTCCCTGCATAGCGGTCCGCGCGGTTTTGTCGCACCGTCCCGATTGGTCGAGCTCMGCTTGCGGCGCCCAGCACACCCTCGGGTGGGCCGCGTTGCCTGCCGATCGCCCGCTTCGATGAACGCAGCGCTGTGGTGATGGCCGCCTCGGGGAGCGGGGACGTGCCCGCGCTGGMGGCGTTTTGTACGCCTTGAGCCAACCCGGCGATGGACATGACCGGTGGGAGGCTTTTCCGGTTACGCTGCGAACCACGCGTACCGGACAGCTGCAGCTGCCAGCGATGACCGGTCCCGACCGGGCCTCGCCTGATGACGTGGCCGTTTCCGGCACCCAGCAGGCAAGCCGTCTCAGGACACCGGACGGGACCACCTCTACCGATCCACTGAGCCTGGGCCGCGCGCAGGCCGCTGCGCTCGTAAAGCGTGCCGTGGCCGGGTGGACTGGCGTTGGAGCCCGTTTCCGTTCCGAGGCAGAGCAGGTCTTGCCGGTACTGGCAGAGGCGCGTATTGCCAGTCAGTCGCGACAAACGCCMCGCTGGAG60AGTAGGCCTGCACCCGAGACTGCGGCCGAC120CGCAGGGCATCCAGTAAGACCGCCAATGCT180GGTGGACGGCGGGCTCGCATGCACCTTGAG240AGCTTGATGGAGGCGTGTCTGGCGCGTCGG300GGCGGTGGACGTCTGTTGCGCTACATGCCG360GAGGCGTTCTTCACCACCATCCCCGGCTTG420GTCGAGCGCCGCACCGGTACTACGCCGACG480CCGCCGATCGGCCAGCTGACCGGCATCTGG540CGTGCCMCCAACTGCATCGTGTCGAGGCG600CCGGCATGTGATGCGATTGCTCATCTCTGC660TACGTCCGTGCAGGCGAGCTGTGCTGGCGT720GGCCCGACGCCCGAAGGCGCCTTGCTGCGG780CATGCTGGTGTACTGCGCCGCTGCGATGAC840CGTCCGGTAGCTGGCGGCCCGGCCTTCGAG■CCACTGGCGCATGCCGCTGTCTTGGTGCTT960ATGCGCGGGAGCGGGCCGATTGTCGCGCGA1020GAGCAGGGCTGGGCGGTGACCTCCATGGGG1080CTCGAACACAGCGACGGCAGGCGCATCTCG1140CAGCCGGCGTTCATGCTGGATCGTCCGTTG1200CCTGCGGATGAGGCGATGCAGTCGCGGGTG1260CTGGACGGCGTACTGCATTACTCGCCTTCT1320CCCGGCGGCGCGCCGTTGACCGGCGTTGTC1380GATCGTCGTCCGGTGTTCGCACTGCTGGCC1440CCCGGGCGCACCACCTGGCTGGCTGCTCAT1500CTCGCCGTGGTGCCGGACGTGGTGGAGGTG1560GACATCGCGCAGGCGGCGGTGCATGCAGAC1620CGATTGATCAAGGTCGATGCGGATCGAAAC1680GTCGCGATCGCGGTGGGATTGGATGATGCC1740TCTGCACACGTGCACCGTCTTTCGCACGAC1800TTGCCGCAGACCTCGCCACTCCCGAGTGCG1860TTACGGCTCGGCGCGCAGTGGCACACGGTG1920CGCTTGCCTGCACGCGTGGCTGCGCATGCG1980CAGTCCGGCTCCAATGCACGGGTCAATCGG2040CACGATGCGGCGGTCAGCACCACGTTGCTG2100CGCTCGAATGCACGGGTGCTCGCACAGAGC2160GTGCTCACGGACGTTGCCGGTGGCACTGCG2220TACGCGCCCACCACGCAGCAACGGCGGCTC2280CTGTCTTTGGCGCTTGAGATGTTCGACACC2340GGTGCCGCAGGTCCGCACCAGCCTGCCGCGCTGTCGCAGAGCCAGCACGAACGACTTACGCTGCGCGATCTGCGCMGATCGGGTTCCGTGCGGATGGCGGGTGCACCCAGCGCGCGAGTTGGCGGCGGGCGCGTTCGGCCGTGATGCGCCCGCACTTGGATCGTTGCATCGCTGCGCTGTTGACCGCTATGGAGCATGCACMCTGGCCGCTGCCGGGGTCAGATTGCCGATCCGMATCATGCCCTGCGCAGTGCATGCCTGCTCGCAGTCGATGATGCGGCGGCGCTGGAGGCGGCCGCCCTGGCGAAGCTGGGTCTGTCGTCATGGACCACCTTCCGCGAGGAAGTCGCCACCCCGAGCATCGGCCTGTCGCCAGGCGCGGCCCCGTTGCAGGACCTGTTCMTCGCAGCACGTTCCGCGGCTCGCTCGGTTCTACGCMTGGATGGGCGAAGCCATCCACGCGCTGGGTGTCGMGGACTGGTTGCCTTCTTCGTTCGGCATGCCCGCATTGATCTCCGGCCTGGCCCAGGMCCCGGACCTTGTCGGCGACGTGGGGCGGGGCGCATGGCGTGGGCGCAGCCGTCATCCTCTCGTTGTTTGATCGTCATGATGACGATACCACCGCGATCGGGCTGGATCTGTTCGAAACCAATTTACAGCCGCTCGCGGTGCGGCATTCTTACGCGCCAGACGCAGCCGGCACCGACMCCCGAGCATGACGGCGCAGGCCGGTGTGCAATGGTGGCMGAGATCATCGGACTCGAGTTCCAGAGCGGCATCAATCTCTCGGGCGCATTGACGGTCMCGCGGTTACCGGTGCCGGCMTCTGGACGTGCAACTGCCGACCGATGCGCCATTGACCGCCAGCTACAAGCGCACGCTTGACACGTGGGACGCGATGCGCAMCGGCTCGAAGAGGGAATGCGATATCCGGCGACACCTGGCGAGCGTATTCAGGGGGCGCAGGCGCGTGCGATCCTGGCACAACAACGTGCGTGCGCCGMCMMGGGCGGCTCGCCCTCCGAGCGCGCGGCCGAGGACGCTGCCGCCATCCAGCAGCGTGCGAACATGTTCGGGCGCGAATCGCTCGACGCGCTTGGCGAGAAAATGCGCGACGTTGCGGAGGTATTGCAGAGGTTCAAGGATGTTCCCMCCGGCCCCAGGCAATTGTCGCGATCMCGACGCAGCCGCACTGGGATTGCGGGAGCCCGCAGCCGCGCAGCGGTCGCCGGATCTCTACCGTGAAAACCCGGTGACCAGTCGCGTCGGCCTGTCGTCGCACCAGCTGTTCGAGGCAGAGATCGAGGGCGCCGAAGTGCTCGAGGCAGGAGTAACGCTGCGTAAAACMCCTTGGCTGGCTTG2460GAGGGCGTTCTGGCTGCCGATTTCTCCATG2520TCGACCGCMGTTATCGCGCCGCCGAGCTT2580ACGACGGTACAGAACAGCGATGACATGTTG2640GCCGGCGGTGCGTCGCTGCATCCGCAGGCG2700GMTTGCGCGAGGTCAGTCATCGGCTCAAG2760GGTCGCGCCACCGATGCGTCGAGTGATCCG2820AGTCTGATGGAGTACAACGCGTTGCTGGAT2880GACGCMGGCAGCGGCMTCCGGGCTGCGA2940CGTGAATTGGAGGCCTTCGACGACGTGGTG3000GGGAGCGCGCGTCAGCTGCAATTGCTCAAG3060GACGMATGGCTGCGCGCATGATCGATGTG3120TTCACAAGCAGAGTGCGCTCTGCCGAGCTG3180GATCTCAATCCGGTCAGCGTCGGCATGGGC3240CGCATCGGCGACTCGMGGACGGCGATGCG3300AAAGCGACCGCGTCAGGGACGGCAGGCATA3360GGCGCACATGTCTACGATGCGGATCCTGCA3420GCAAATCTCAGCGCAGGCGGTACCTACCM3480CCATCGACGATTCCTGAGTTCGCCAGGCTG3540MGCTATTGCGTGCAGGCGTGAACGAGGGG3600GCCMTGGATCGCTCMCGTCAACCTGACC3660GGTCCAAGACAGCCCGTCGCACCCAACGCC3720CGTAGCGCAGTCTCGGCCTCCTTGCCGTTC3780AGCCAGATGGAGCTGCATCTGGACCATGCG3840GGCCGCGTCGGCCTCACTGCCGAGGTCAGC3900TCGGTGCTTGGCCGAAATTTCGCACGGCTG3960CAGTTGGCCGGTGTTCGAGTGGCCTCCAGC4020GACGATACGCGCACCGGTCCTTTGCTGGGG4080CAAGCCGCCCAGCCGATTAGCCCGCAGGCA4140ATCATCCCGGAGAGCATGGCCGMCTTGAT4200CGACGGGACGTACTGCTGAAAGCMTCGAA4260GMGCTGGCGCCTTGCTGGAGGGTCCGGCG4320GCCACCCTTGCCGAGGCGTCCTCGCTATGG4380ATGGTCGACCTGCTGCACCAGTTGCGGCAA4440CGCATCATTCCTGGCGCACGTGTGGAGATC4500GTGGTCAGCCATGCCATTGGTCATTACGCG4560CTGCGTCGCAAGATTCCCGGGCTGGGCGAG4620GTGAATCAGGTTCGCTTCGTGTTCGAMTG4680GCGCTGGAGGTCAAACAGCACGCGCAGGCT4740GGTGCAATGGCCTGGCGTGATGCGCTCGTT4800CTGGCGGCTATCGCTGTGCACAATACCGAC4860CCGCTGCTGAATGTGGCAGCTACGGCAGTG4920CAGTTCCGTTATGGGCTGTACGATCGTATC4980CGTGCACTGCGACAGTCACTGGACCCTTTG5040CAGGTGGTGGGTGTGCAGGCGCTCGGGCAACCGGTCT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