專利名稱：：板栗的組織培養(yǎng)方法及其專用培養(yǎng)基的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種板栗的組織培養(yǎng)方法及其專用培養(yǎng)基。技術(shù)背景板栗是一種重要的經(jīng)濟(jì)作物，全身是寶，例如，板栗果實(shí)具有重要的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，可加工成多種食品；板栗樹(shù)材質(zhì)堅(jiān)硬，紋理通直，防腐耐濕，是制造軍工、車船、家具等良好材料；其枝葉、樹(shù)皮、刺苞富含單寧，可提取烤膠；花可作為是很好的蜜源等等。正是由于板栗具有諸多重要的應(yīng)用價(jià)值，市場(chǎng)需求大，所以人們?cè)絹?lái)越注重其優(yōu)良品種的培育。尤其是在20世紀(jì)初，美國(guó)發(fā)生的栗疫病(Cryphonectriaparasitica(Murr.)Barr)，引起了前所未有的大面積生態(tài)環(huán)境災(zāi)害，幾乎毀滅了美國(guó)東部所有天然的栗樹(shù)林，此后，育種學(xué)家們更加注重培育抗疫病性的板栗新品種。離體培養(yǎng)技術(shù)作為現(xiàn)代育種技術(shù)的基礎(chǔ)和良種繁育的重要手段，受到了極大地青睞。栗屬樹(shù)種離體培養(yǎng)最早是Jacquiot開(kāi)始嘗試的，1971年，Borrot完成了對(duì)莖形成層的研究，以成熟板栗樹(shù)(IOO年以上)的形成層做外植體，經(jīng)過(guò)離體培養(yǎng)形成愈傷組織，隨后在Trippi等人的研究中，也只獲得了愈傷組織(callustissue)，而未見(jiàn)器官分化或只分化到"類芽組織"或芽原基。中國(guó)板栗(CastaneamollissimaBL.)具有抗疫病性(blight-resistance)和抗黑水病(inkdisease)的優(yōu)良特性，是一種良好的種質(zhì)資源。但是中國(guó)板栗極難生根，扦插繁殖生根率很低，而在生物技術(shù)方面的研究很少，還未見(jiàn)中國(guó)板栗成年樹(shù)無(wú)菌培養(yǎng)體系的成功報(bào)道。其有關(guān)組培技術(shù)的欠缺極大地束縛了現(xiàn)代生物技術(shù)在板栗的科研、生產(chǎn)中的應(yīng)用與發(fā)展。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種用于培養(yǎng)板栗的培養(yǎng)基。本發(fā)明所提供的板栗培養(yǎng)基，是在WPM培養(yǎng)基中添加包括IBA和下述兩種激素中的至少一種得到的培養(yǎng)基KT和TDZ;所述IBA的終濃度為0.1-1.Omg/L，所述KT或TDZ的終濃度為0.5-1.Omg/L。為了防止內(nèi)生菌的產(chǎn)生，所述培養(yǎng)基還可以包括終濃度為250-500rag/L的頭孢霉素。為了防止褐化，所述培養(yǎng)基還可包括終濃度為3-5g/L的活性炭。其中，所述IBA的終濃度優(yōu)選為0.1irig/L，所述KT或TDZ的終濃度優(yōu)選為1.Omg/L，所述頭孢霉素的終濃度優(yōu)選為250mg/L，所述活性炭的終濃度優(yōu)選為4g/L。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種組織培養(yǎng)板栗的方法。本發(fā)明所提供的組織培養(yǎng)板栗的方法，包括如下步驟以板栗帶腋芽的莖段為外植體，利用上述任一所述培養(yǎng)基進(jìn)行組織培養(yǎng)，得到板栗組培苗。所述培養(yǎng)的條件可以為溫度為23土2。C、相對(duì)濕度為50-60%、光強(qiáng)為2000-2500Lx、光照明暗周期為14小時(shí)光照/10小時(shí)黑暗。所述莖段取自板栗成年樹(shù)的春季新生枝條。為了改變外植體材料表面所攜帶真菌及細(xì)菌的正常生活溫度，在殺菌前使其生理代謝產(chǎn)生紊亂，從而增加外植體的成活率，而又能保證新生枝條維持正常的生命代謝，所述新生枝條在所述初代培養(yǎng)前最好先在4'C條件下保存24h。上述培養(yǎng)基及培養(yǎng)方法適合于一般板栗的培養(yǎng)，如中國(guó)板栗，具體可以為中國(guó)板栗燕紅。本發(fā)明培養(yǎng)基篩選出了適合中國(guó)板栗生長(zhǎng)的激素種類、抗生素種類、防褐化物質(zhì)等，解決了目前中國(guó)板栗培養(yǎng)中存在的污染和褐化問(wèn)題，成功建立了中國(guó)板栗成年樹(shù)的無(wú)菌培養(yǎng)體系。用本發(fā)明培養(yǎng)基培養(yǎng)板栗的方法，成功篩選出了建立中國(guó)板栗成年樹(shù)無(wú)菌培養(yǎng)體系的外植體材料——板栗成年樹(shù)春季枝條，保證了優(yōu)良性狀的遺傳穩(wěn)定性，完善了殺菌處理方法，還具有操作簡(jiǎn)單、成本低廉。因此，本發(fā)明培養(yǎng)基及板栗培養(yǎng)方法適合于推廣應(yīng)用。圖1為中國(guó)板栗燕紅初代培養(yǎng)的生長(zhǎng)情況。圖2為中國(guó)板栗燕紅的繼代培養(yǎng)的生長(zhǎng)狀況。具體實(shí)施方式下述實(shí)施例中所用方法如無(wú)特別說(shuō)明均為常規(guī)方法。實(shí)施例中用到的試劑及基本培養(yǎng)基如下瓊脂、蔗糖、活性炭、濾紙、封口膜、75%乙醇、95%乙醇、硝酸銨、硝酸鈣、硫酸鉀、氯化鈣、磷酸二氫鉀、硫酸鎂、鉬酸鈉、硫酸錳、硫酸鋅、硫酸銅、硼酸、乙二胺四乙酸鈉鐵、甘氨酸、肌醇、Ph試紙、鹽酸硫胺素、鹽酸吡卩多醇、核黃素均購(gòu)自北京廣達(dá)恒益科技有限公司。3-吲哚丁酸(IBA)、6-糠氨基嘌呤(KT)、噻苯隆(TDZ)、頭孢霉素均購(gòu)自北京華夏康源科技有限公司。升汞購(gòu)自上海開(kāi)通化工有限公司。草酸銨結(jié)晶紫、碘液、蕃紅(或沙黃)購(gòu)自上海生工生物工程有限公司。本發(fā)明利用WPM培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，具體的營(yíng)養(yǎng)成分如下表l、WPM基本培養(yǎng)基組成(mg/L)<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>實(shí)施例1、板栗離體培養(yǎng)各實(shí)驗(yàn)條件的探索一、激素種類及濃度的選擇設(shè)3個(gè)實(shí)驗(yàn)組，篩選方法如下實(shí)驗(yàn)1:將中國(guó)板栗燕紅的帶腋芽的莖段接種于含有1.0mg/L的細(xì)胞分裂素KT和O.1mg/L的生長(zhǎng)素IBA的培養(yǎng)基中，在23士2。C、相對(duì)濕度50-60%、光強(qiáng)2000-2500Lx、每天光照10小時(shí)的條件下進(jìn)行培養(yǎng)30天，觀察莖段生長(zhǎng)狀況，結(jié)果100%的莖段開(kāi)始有腋芽萌發(fā)。實(shí)驗(yàn)2:將中國(guó)板栗燕紅的帶腋芽的莖段接種于含有1.0mg/L的KT和0.1mg/L的BA的培養(yǎng)基中，進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件等均與實(shí)驗(yàn)l所述相同。結(jié)果都沒(méi)有腋芽萌發(fā)，最后莖尖干枯死亡。實(shí)驗(yàn)3:將中國(guó)板栗燕紅的帶腋芽的莖段接種于含有1.Omg/L的TDZ和0.1mg/L的IBA的培養(yǎng)基中，進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件等均與實(shí)驗(yàn)l所述相同。結(jié)果100%的莖段開(kāi)始有腋芽萌發(fā)。因此，以上實(shí)驗(yàn)表明，在培養(yǎng)基中添加終濃度為1.0mg/L的KT(或TDZ)和終濃度為O.1mg/L的IBA，可有效促進(jìn)中國(guó)板栗莖段腋芽萌發(fā)，而相同質(zhì)量濃度的BA效果較差，腋芽不萌動(dòng)。二、抗生素的篩選方法本發(fā)明分別在WPM培養(yǎng)基中添加250mg/L頭孢霉素和25mg/L利福平，其抑菌效果如表2所示。表2、抗生素的抑,對(duì)效果比對(duì)<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>結(jié)果表明，在WPM培養(yǎng)基中添加250mg/L頭孢霉素可有效抑制外植體材料的污染率，比25mg/L利福平的效果要好。三、防褐化物質(zhì)的篩選方法本發(fā)明以常用的防褐化物質(zhì)Vc、PVP、顆粒狀活性炭、粉末狀活性炭等為實(shí)驗(yàn)原料，將其分別以常用的濃度，分別添加到WPM培養(yǎng)基中。結(jié)果表明，添加100mg/L的Vc和lg/L的PVP均褐化嚴(yán)重；顆粒狀活性炭聚集于培養(yǎng)基底部，防止褐化效果較差；粉末狀活性炭可溶解于培養(yǎng)基中，防止褐化效果較好。實(shí)施例2、中國(guó)板栗燕紅的離體培養(yǎng)一、外植體材料的獲得及消毒處理取材于北京4月底至5月初晴天上午，取中國(guó)板栗燕紅成年樹(shù)春季新生枝條，用濕報(bào)紙包裹材料放入4'C冰箱24h(注意此時(shí)不要用流水沖洗外植體材料)，然后將材料剪成lcm左右?guī)б秆康那o段，去除大葉片，流水沖洗。取材時(shí)間很重要，是關(guān)系到無(wú)菌體系能否成功建立的決定因素。本發(fā)明通過(guò)實(shí)驗(yàn)表明，冬季休眠芽、生長(zhǎng)季枝條均不適合作為建立無(wú)菌體系的外植體材料。消毒在超凈工作臺(tái)上，將莖段先用75%乙醇浸泡303，無(wú)菌水沖洗2次，每次2min，再用0.1%升汞處理5min，無(wú)菌水沖洗3次，每次2min,最后用無(wú)菌濾紙將材料表面的水分吸干，將材料的托葉去除后待接種。二、外植體的培養(yǎng)(一)用培養(yǎng)基I進(jìn)行培養(yǎng)初代培養(yǎng)將步驟一消過(guò)毒的帶腋芽莖段接種于培養(yǎng)基I中，在23'C、相對(duì)濕度55%、光強(qiáng)2250Lx、光照明暗周期為光照14h/黑暗10h的條件下進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)30天。培養(yǎng)基I的組成為在WPM培養(yǎng)基中添加終濃度為1.Orag/L的KT、終濃度為0.1mg/L的IBA、終濃度為250mg/L的頭孢霉素和4g/L粉末狀活性炭。向培養(yǎng)基中添加頭孢霉素的方法為由于頭孢霉素經(jīng)高壓會(huì)分解，所以需要過(guò)濾滅菌。將空三角瓶和培養(yǎng)基高壓滅菌后，在超凈工作臺(tái)中，待培養(yǎng)基溫度降至60'C，將經(jīng)過(guò)過(guò)濾滅菌的頭孢霉素添加到培養(yǎng)基中，搖勻分裝。實(shí)驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)，每次培養(yǎng)30個(gè)莖段。結(jié)果表明，共培養(yǎng)的90個(gè)莖段中，有90個(gè)(100%)長(zhǎng)出新生枝(圖l)，每個(gè)帶腋芽的莖段生出一個(gè)枝，每個(gè)新生的枝約lcm，每個(gè)新生枝帶有一個(gè)腋芽。繼代培養(yǎng)將上述初代培養(yǎng)中得到的新生枝去掉葉片，再切成帶腋芽的莖段，然后按照上述初代培養(yǎng)的方法繼續(xù)培養(yǎng)30天，結(jié)果表明，所有繼代培養(yǎng)的莖段均正常生長(zhǎng)(圖2)，均無(wú)染菌現(xiàn)象。(二)用培養(yǎng)基II進(jìn)行培養(yǎng)初代培養(yǎng)將步驟一消過(guò)毒的帶腋芽莖段接種于培養(yǎng)基n中，在2rc、相對(duì)濕度50%、光強(qiáng)2000Lx、光照明暗周期為光照14h/黑暗10h的條件下進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)30天。培養(yǎng)基II的組成為在WPM培養(yǎng)基中添加終濃度為0.8mg/L的TDZ、終濃度為0.6mg/L的IBA、終濃度為350mg/L的頭孢霉素和3g/L粉末狀活性炭。實(shí)驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)，每次培養(yǎng)30個(gè)莖段。結(jié)果表明，共培養(yǎng)的90個(gè)莖段中，有90個(gè)(100%)長(zhǎng)出新生枝，每個(gè)帶腋芽的莖段生出一個(gè)枝，每個(gè)新生的枝約lcm，每個(gè)新生枝帶有一個(gè)腋芽。繼代培養(yǎng)將上述初代培養(yǎng)中得到的新生枝去掉葉片，再切成帶腋芽的莖段，然后按照上述初代培養(yǎng)的方法繼續(xù)培養(yǎng)30天，結(jié)果表明，所有繼代培養(yǎng)的莖段均正常生長(zhǎng)，均無(wú)染菌現(xiàn)象。(三)用培養(yǎng)基m進(jìn)行培養(yǎng)初代培養(yǎng)將步驟一消過(guò)毒的帶腋芽莖段接種于培養(yǎng)基m中，在25"C、相對(duì)濕度60%、光強(qiáng)2500Lx、光照明暗周期為光照14h/黑暗10h的條件下進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)30天。培養(yǎng)基m的組成為在WPM培養(yǎng)基中添加終濃度為0.5mg/L的KT、終濃度為1mg/L的IBA、終濃度為500mg/L的頭孢霉素和5g/L粉末狀活性炭。實(shí)驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)，每次培養(yǎng)30個(gè)莖段。結(jié)果表明，共培養(yǎng)的90個(gè)莖段中，有90個(gè)(100%)長(zhǎng)出新生枝，每個(gè)帶腋芽的莖段生出一個(gè)枝，每個(gè)新生的枝約lcm，每個(gè)新生枝帶有一個(gè)腋芽。繼代培養(yǎng)將上述初代培養(yǎng)中得到的新生枝去掉葉片，再切成帶腋芽的莖段，然后按照上述初代培養(yǎng)的方法繼續(xù)培養(yǎng)30天，結(jié)果表明，所有繼代培養(yǎng)的莖段均正常生長(zhǎng)，均無(wú)染菌現(xiàn)象。權(quán)利要求1、一種板栗培養(yǎng)基，是在WPM培養(yǎng)基中添加包括IBA和下述兩種激素中的至少一種得到的培養(yǎng)基KT和TDZ；所述IBA的終濃度為0.1-1.0mg/L，所述KT或TDZ的終濃度為0.5-1.0mg/L。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)基，其特征在于所述培養(yǎng)基還包括終濃度為250-500mg/L的頭孢霉素。3、根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的培養(yǎng)基，其特征在于所述培養(yǎng)基還包括終濃度為3-5g/L的活性炭。4、根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一所述的培養(yǎng)基，其特征在于所述IBA的終濃度優(yōu)選為O.lmg/L，所述KT或TDZ的終濃度優(yōu)選為1.0mg/L，所述頭孢霉素的終濃度優(yōu)選為250mg/L，所述活性炭的終濃度優(yōu)選為4g/L。5、一種組織培養(yǎng)板栗的方法，包括如下步驟以板栗帶腋芽的莖段為外植體，利用權(quán)利要求1-4中任一所述培養(yǎng)基進(jìn)行組織培養(yǎng)，得到板栗組培苗。6、根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于所述培養(yǎng)的條件為溫度為23±2°C、相對(duì)濕度為50-60%、光強(qiáng)為2000-2500Lx、光照明暗周期為14小時(shí)光照/10小時(shí)黑暗。7、根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的方法，其特征在于所述莖段取自板栗成年樹(shù)的春季新生枝條。8、根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于所述新生枝條在所述組織培養(yǎng)前先在4'C條件下保存24h。9、根據(jù)權(quán)利要求5-8中任一所述的方法，其特征在于所述板栗為中國(guó)板栗。10、根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于所述板栗為燕紅板栗。全文摘要本發(fā)明公開(kāi)了一種繁殖板栗的方法及其專用培養(yǎng)基。本發(fā)明培養(yǎng)基，是在WPM培養(yǎng)基中添加包括IBA和下述兩種激素中的至少一種得到的培養(yǎng)基KT和TDZ；所述IBA的終濃度為0.1-1.0mg/L，所述KT或TDZ的終濃度為0.5-1.0mg/L。本發(fā)明培養(yǎng)基篩選出了適合中國(guó)板栗生長(zhǎng)的激素種類、抗生素種類、防褐化物質(zhì)等，解決了目前中國(guó)板栗培養(yǎng)中存在的污染和褐化問(wèn)題，成功建立了中國(guó)板栗成年樹(shù)的無(wú)菌培養(yǎng)體系。用本發(fā)明培養(yǎng)基培養(yǎng)板栗的方法操作簡(jiǎn)單、成本低廉，適合于推廣應(yīng)用。文檔編號(hào)A01H4/00GK101331851SQ20081011776公開(kāi)日2008年12月31日申請(qǐng)日期2008年8月5日優(yōu)先權(quán)日2008年8月5日發(fā)明者寧孫,李天忠,憶王,許雪峰,韓振海申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)