專利名稱：一種家蠶實用品種轉基因用蠶卵的制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種家蠶實用品種轉基因用蠶卵的制備方法，屬于生物學技術 領域。專用于家蠶二化性實用品種蠶卵顯微注射法制作轉基因家蠶。
背景技術：
自上世紀70年代以來，研究人員對家蠶轉基因技術進行了大量艱苦的試驗， 建立了精子介導法、基因槍法、顯微注射法、病毒介導法、孤雌生殖法等多種外 源基因導入方法，利用同源重組原理進行轉基因嘗試。但是由于沒有理想的轉座 子載體加上蠶卵殼堅硬等原因，使家蠶轉基因的研究進展緩慢。最近，從昆蟲中 鑒定出多個可作為鱗翅目昆蟲轉基因載體的轉座子P因子、Hermes、 minos、 hobo、 mariner和PiggyBac等，成功地在昆蟲轉基因中得到了應用。/^>gj^sc 轉座子對家蠶也有轉座作用，已經(jīng)利用"'^ j5ac轉座子通過顯微注射方法獲得 了穩(wěn)定遺傳的轉基因系統(tǒng)，在研究家蠶重要功能基因、幵發(fā)生物反應器和害蟲防 治等方面具有極大的優(yōu)勢。
由于現(xiàn)行生產(chǎn)上使用的家蠶品種基本上為二化性品種，產(chǎn)卵后需要采用鹽 酸處理等人工方法才能孵化；而且大多數(shù)品種卵殼比較堅硬，難以直接作成以 提高和改進蠶絲產(chǎn)量和質量為目標的轉基因家蠶，制約了家蠶實用品種轉基因 的研究。多化性品種尤其是無滯育期的多化性品種，在胚胎發(fā)育早期(2h 8h) 轉基因顯微注射后，不需要進行鹽酸刺激處理就可以直接催青孵化，這也是迄 今作成的轉基因都是Nistari等多化性品種的原因。然而多化性品種除了抗性 強外，繭絲質性狀都比較差，實用價值很低。目前蠶繭生產(chǎn)中使用的家蠶品種 幾乎都為二化性品種。如果能夠建立一種蠶種處理方法，使二化性品種的蠶卵 在進行轉基因操作(顯微注射)后不經(jīng)過鹽酸刺激可以直接催青孵化，那無疑 將極大地促進家蠶種質創(chuàng)新研究和轉基因實用蠶品種培育以及作為生產(chǎn)貴重藥 用蛋白質的自主式家蠶生物反應器的開發(fā)。

發(fā)明內容
為了解決上述的二化性家蠶品種轉基因存在的技術問題，本發(fā)明提供一種 二化性家蠶蠶卵的制備方法，使二化性家蠶實用品種的蠶卵在進行轉基因操作 (顯微注射)后不需要經(jīng)過鹽酸刺激等處理而直接催青孵化。
為了達到上述的目的，本發(fā)明是通過以下技術方案得以實現(xiàn)。 一種二化性
家蠶實用品種轉基因用蠶卵的制備方法，其步驟如下-
(1) 家蠶實用品種的準備選擇家蠶二化性實用品種，以正常飼養(yǎng)繁殖制備
的越年蠶卵為親本材料；
(2) 親本蠶卵胚胎發(fā)育的調節(jié)將經(jīng)過冬季冷藏3(T60日胚胎活化的越年蠶 卵置于10-15'C的環(huán)境中，調節(jié)胚胎發(fā)育至丙2期；
(3) 親本蠶卵的催青從蠶卵丙z胚胎期開始，采用15 2(TC溫度催青，胚 胎發(fā)育至己5期即蠶卵轉青時改用正常溫度催青，直至蠶卵孵化獲得幼蟲；
(4) 親代家蠶的飼養(yǎng)和非滯育蠶卵的制備將步驟(3)中孵化獲得的幼蟲， 按品種分別飼養(yǎng)，羽化后同一品種的雌蛾與雄蛾交配，制備獲得的子代蠶卵即為 非滯育蠶卵。
上述的步驟(1)所述的家蠶二化性實用品種為中國系統(tǒng)品種。 上述的步驟(3)所述的催青為采用黑暗催青；所述的胚胎發(fā)育至己5期為 經(jīng)過30—18天。
有益效果
本發(fā)明以二化性家蠶實用品種為材料，采用15 18'C溫度催青，經(jīng)過30 18日胚胎發(fā)育至己5期(轉青期)時改用25 26。C催青，再經(jīng)過2日蠶卵孵化。 孵化的蟻蠶釆用正常溫度飼養(yǎng)和保護，羽化后雌、雄蛾交配制種獲得的子代蠶 卵為非滯育蠶卵，其發(fā)育類似多化性品種，在正常溫度濕度條件下，產(chǎn)下后經(jīng) 過9 10日即能孵化成蟻蠶，良卵孵化率達到96%以上。在這種蠶卵的胚胎發(fā)育 早期經(jīng)適當?shù)南咎幚砗笾苯佑糜陲@微注射法制作轉基因家蠶，使二化性家蠶 實用品種轉基因操作后不需要經(jīng)過鹽酸刺激等處理就能直接催青孵化，解決了 家蠶實用品種轉基因中滯育卵不能及時孵化的難題。本發(fā)明成果國內外尚未見
類似報道。
本發(fā)明成果有良好的應用前景，其應用將極大地促進家蠶種質創(chuàng)新研究和 轉基因實用蠶品種培育以及作為貴重藥用蛋白質生產(chǎn)的自主式家蠶生物反應器 的開發(fā)，從而提高我國蠶業(yè)科技水平和經(jīng)濟效益，實現(xiàn)從蠶絲大國到蠶絲強國 的轉變。


圖1為家蠶品種"秋豐"越年蠶卵經(jīng)17-17. 5'C溫度黑暗催青飼養(yǎng)獲得的子 代非滯育蠶卵(點青期)；
圖2為家蠶品種"秋豐"越年蠶卵經(jīng)25-25. 5'C溫度正常催青后飼養(yǎng)獲得 的子代滯育卵圈(灰紫色)。
具體實施例方式
下面結合實例對本發(fā)明"一種家蠶實用品種轉基因用蠶卵的制備方法"作 進一步描述
一、 家蠶品種"秋豐"[公知公用，見參考文獻章佩禎，季平，沈雪華 等.夏秋用蠶品種秋豐X白玉的育成.蠶業(yè)科學，1994 (1) : 17-25]
二、 來源由中國農(nóng)業(yè)科學院蠶業(yè)研究所培育和保存的家蠶品種，并對外 提供。
三、 主要特征特性中系二化性四眠品種；幼蟲具有限性斑紋，雌蠶為普 斑、雄蠶為素蠶，蠶體粗壯，食桑旺盛，發(fā)育整齊，體質較強；老熟齊涌，熟 蠶有趨密性，多營上層繭；越年卵正常催青經(jīng)過IO日，幼蟲期經(jīng)過22日，蟄 中經(jīng)過13 14日；繭形橢圓，繭色潔白，縮皺中等；全繭量1.8 g 2.0g，繭 層率21%，繭絲長1000 m以上，解舒良好；羽化集中，雄蛾活潑、交配性能較 好，雌蛾產(chǎn)卵性能良好，單蛾產(chǎn)卵數(shù)450粒 600粒，卵殼色有淡黃色和白色兩 種。
四、 制備方法 實例1:
(1)親本蠶卵胚胎發(fā)育的調節(jié)以二化性家蠶實用品種"秋豐"越年蠶卵為
材料，待滯育蠶卵活化后在12'C 13'C的環(huán)境中，調節(jié)胚胎發(fā)育至丙2期。
(2) 親本蠶卵(種)的催青丙2胚胎期開始，采用17。C 17.5。C溫度黑暗 催青，經(jīng)過25日胚胎發(fā)育至己5期時，轉移到25t:-26。C繼續(xù)催青，再經(jīng)過2日 蠶卵孵化獲得幼蟲，良卵孵化率90.23%。
(3) 親代家蠶的詞養(yǎng)和非滯育蠶卵的制備步驟(2)獲得的幼蟲采用正常 溫度飼養(yǎng)，羽化后雌蛾與雄蛾交配制種，獲得子代非滯育蠶卵。以卵圈計算，非 滯育卵率達到96. 39%以上，非滯育卵孵化率96. 11%。
二化性家蠶實用品種"秋豐"親代越年蠶卵采用17'C 17.5t:溫度黑暗催 青，獲得的子代蠶卵非滯育卵率高。 實例2:
(1) 親本蠶卵胚胎發(fā)育的調節(jié)按照實例1的方法，調節(jié)"秋豐"越年蠶卵 胚胎發(fā)育至丙2期。
(2) 親本蠶卵(種)的催青丙2胚胎期開始，采用15'C 15.5t:溫度黑暗 催青，經(jīng)過30日胚胎發(fā)育至己5期時，轉移到25'C-26'C繼續(xù)催青，再經(jīng)過2日 蠶卵孵化獲得幼蟲。良卵孵化率68.63%，蟻蠶體質虛弱。
(3) 親代家蠶的飼養(yǎng)和非滯育蠶卵的制備步驟(2)獲得的幼蟲采用正常 溫度飼養(yǎng)，羽化后雌蛾與雄蛾交配制種，獲得子代非滯育卵。以卵圈計算，非滯 育卵率達100%，孵化率95. 86%。
二化性家蠶實用品種"秋豐"親代越年蠶卵采用17'C 17.5X:溫度黑暗催 青，獲得的子代蠶卵100%為非滯育卵。但是，因親代蠶種催青時間過長，幼蟲 體質虛弱，飼養(yǎng)困難。
實例3:
(1) 親本蠶卵胚胎發(fā)育的調節(jié)按照實例1的方法，調節(jié)"秋豐"越年蠶卵 胚胎發(fā)育至丙2期。
(2) 親本蠶卵(種)的催青丙2胚胎期開始，采用19.5。C 20.(TC溫度黑 暗催青，經(jīng)過14日胚胎發(fā)育至己5期時，轉移到25。C-26。C繼續(xù)催青，再經(jīng)過2 日蠶卵孵化獲得幼蟲。良卵孵化率92. 17%。
(3) 親代家蠶的飼養(yǎng)和非滯育蠶卵的制備步驟(2)獲得的幼蟲采用正常 溫度詞養(yǎng)，羽化后雌蛾與雄蛾交配制種，獲得子代蠶卵，以卵圈計算非滯育卵率 為23.53%。
雖然家蠶二化性品種親代蠶種采用15'C 20"C黑暗催青，獲得的幼蟲正常
飼養(yǎng)都可以制備獲得子代非滯育蠶卵，但是15T:黑暗催青時親代幼蟲生命率低，
20. (TC黑暗催青時子代非滯育卵率低，因此不適宜轉基因用蠶卵的制備。而17. 0 。C 17.5。C黑暗催青，不僅親代體質正常，而且子代非滯育卵率達到96%以上，
所以采用本發(fā)明制備家蠶實用品種轉基因用蠶卵時，親代蠶種最適宜的催青溫度 是17°C 17. 5°C。
制作條件
(1) 應具備家蠶品種繁育設備和技術。
(2) 應具備溫度可控的蠶種催青設備(15°C 26°C)和飼養(yǎng)場所(24°C 28°C)(中國農(nóng)業(yè)科學院蠶業(yè)研究所主編，中國養(yǎng)蠶學，上?？萍汲?版社，1991年1月629-709)。
權利要求
1、一種家蠶實用品種轉基因用蠶卵的制備方法，其特征包括如下步驟(1)家蠶實用品種的準備選擇家蠶二化性實用品種，以正常飼養(yǎng)繁殖制備的越年蠶卵為親本材料；(2)親本蠶卵胚胎發(fā)育的調節(jié)將經(jīng)過冬季冷藏30～60日胚胎活化的越年蠶卵置于10-15℃的環(huán)境中，調節(jié)胚胎發(fā)育至丙2期；(3)親本蠶卵的催青從蠶卵丙2胚胎期開始，采用15～20℃溫度催青，胚胎發(fā)育至己5期即蠶卵轉青時改用正常溫度催青，直至蠶卵孵化獲得幼蟲；(4)親代家蠶的飼養(yǎng)和非滯育蠶卵的制備將步驟(3)中孵化獲得的幼蟲，按品種分別飼養(yǎng)，羽化后同一品種的雌蛾與雄蛾交配，制備獲得的子代蠶卵即為非滯育蠶卵。
2、 根據(jù)權利要求1所述的一種家蠶實用品種轉基因用蠶卵的制備方法，其 特征在于步驟(1)所述的家蠶二化性實用品種為中國系統(tǒng)品種。
3、 根據(jù)權利要求1所述的一種家蠶實用品種轉基因用蠶卵的制備方法，其 特征在于步驟(3)所述的催青為采用黑暗催青。
4、 根據(jù)權利要求l所述的一種家蠶實用品種轉基因用蠶卵的制備方法，其 特征在于步驟(3)所述的胚胎發(fā)育至己5期為經(jīng)過30 18日。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種家蠶實用品種轉基因用蠶卵的制備方法。該方法是以二化性家蠶實用品種“秋豐”為材料，從越年蠶卵丙₂胚胎期開始用15℃～20℃的溫度黑暗催青，胚胎發(fā)育至己₅期時用25℃～26℃繼續(xù)催青至孵化。孵化后正常溫度飼養(yǎng)和蟄中保護，羽化后雌、雄蛾交配制種，獲得子代非滯育蠶卵，經(jīng)適當消毒處理后用顯微注射法制作轉基因家蠶。轉基因操作后的蠶卵在正常溫度濕度條件下催青即能孵化。本發(fā)明解決了家蠶二化性實用品種因蠶卵滯育而不能直接用顯微注射法制作轉基因家蠶的難題，將極大地促進家蠶種質創(chuàng)新、家蠶轉基因實用品種的培育和自主式家蠶生物反應器的開發(fā)。
文檔編號A01K67/04GK101361474SQ20081015604
公開日2009年2月11日 申請日期2008年9月19日 優(yōu)先權日2008年9月19日
發(fā)明者唐順明, 張國政, 沈興家, 趙巧玲, 郭錫杰, 陳麗媛 申請人:江蘇科技大學