專利名稱：：藏獒精液冷凍稀釋液的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種藏獒精液冷凍稀釋液，用于藏獒精液的冷凍及人工授精，屬于動(dòng)物繁殖
技術(shù)領(lǐng)域：
。
背景技術(shù)：
：犬的精液冷凍具有很高的應(yīng)用價(jià)值，使用犬的精液冷凍與人工授精技術(shù)比自然繁殖具有諸多的優(yōu)越性。如可以高度發(fā)揮優(yōu)秀種犬的利用率；減少各種疾病的傳播，特別是生殖系統(tǒng)疾病的傳播；不受時(shí)空限制，引種方便快捷，而且成本低效益高；種質(zhì)資源可以得到有效保存，特別是對(duì)我國(guó)藏獒的品種保護(hù)和發(fā)展具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。目前，我國(guó)在藏獒精液冷凍與人工授精方面研究較少，且在繁殖方面未見比較全面的資料報(bào)道。藏獒屬于青藏高原的一個(gè)物種，傳說純種藏獒分布于我國(guó)的甘肅、青海、四川省交界黃河第一灣一河曲。河曲藏獒被認(rèn)為是真宗藏獒品群，享有"東方神犬"美譽(yù)。藏獒長(zhǎng)期受高海拔、低氣溫、低氧量的生態(tài)環(huán)境影響，具備體型高大，性格剛毅兇猛等特點(diǎn)，深受我國(guó)甚至世界藏獒愛好者的稱贊。近20年來，藏獒文化、經(jīng)濟(jì)得到了快速的發(fā)展，藏獒養(yǎng)殖已使牧民形成了致富的產(chǎn)業(yè)，給牧民帶來了數(shù)以千萬經(jīng)濟(jì)收入。但是，由于牧民對(duì)優(yōu)秀純種藏獒血統(tǒng)保護(hù)意識(shí)薄弱，隨意買賣，原始藏獒與當(dāng)?shù)啬裂蛉y(tǒng)混雜近親繁殖等，導(dǎo)致優(yōu)秀純種藏獒越來越少，這一珍稀犬種瀕臨滅絕的危機(jī)。據(jù)統(tǒng)計(jì)在我國(guó)純種藏獒不足百條，如今即使在青藏高原的原產(chǎn)地，想尋求一條純種藏獒也是很困難的。其次藏獒繁殖的季節(jié)性強(qiáng)，母獒每年只有一次發(fā)情，制約了純種藏獒的繁殖和培育。且藏獒精子與其它犬科動(dòng)物的精子類似，在凍融過程中對(duì)低溫?fù)p傷的抗性較弱，凍融后精子活力下降，受孕率及窩產(chǎn)仔平均數(shù)均低于自然繁殖。藏獒自然繁殖時(shí)的受胎率和窩產(chǎn)仔平均數(shù)低于其他犬種，約分別為80%85%，57只。因此，如何長(zhǎng)期低溫保存優(yōu)質(zhì)純種藏獒精液并充分利用優(yōu)良種源是本領(lǐng)域迫在眉睫需解決的問題。影響犬精液冷凍成功與否的關(guān)鍵因素之一是稀釋液配方，稀釋液質(zhì)量的優(yōu)劣直接影響藏獒精液冷凍與人工受精的成敗。目前國(guó)內(nèi)外進(jìn)行犬冷凍精液研究中應(yīng)用最廣泛的稀釋液有兩類一類是卵黃一乳糖稀釋液，其主要成分是卵黃、乳糖、甘油和抗生素類；另一類是卵黃一tris稀釋液，其主要成分是tris(三羥甲基)、檸檬酸、果糖、甘油和卵黃，使用的抗菌素多為青霉素、鏈霉素和慶大霉素。由潘壽文和禹學(xué)禮等實(shí)驗(yàn)證實(shí)兩種稀釋液中，卵黃一tris稀釋液優(yōu)于卵黃一乳糖稀釋液。(潘壽文等，畜牧與獸醫(yī)，1986;(3):105-106;禹學(xué)禮等，洛陽農(nóng)業(yè)高等專科學(xué)校學(xué)報(bào)1999;(2);2023;河南科技大學(xué)學(xué)報(bào)，2004;(2);32-36)。但是就目前研究水平與自然繁殖相比，受胎率和窩產(chǎn)仔平均數(shù)還存在一定差距。
發(fā)明內(nèi)容鑒于現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供一種藏獒精液冷凍稀釋液，該稀釋液進(jìn)一步降低了藏獒精子在冷凍過程中受過冷刺激所造成的損害，提高了凍精的活力、復(fù)蘇率、頂體的完整率等，從而使受胎率和窩產(chǎn)仔平均數(shù)明顯提高，達(dá)到或接近了自交水平。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是一種藏獒精液冷凍稀釋液，該稀釋液由1液和2液組成1液的各組分及重量為氯化鈣0.200.50g、氯化鉀0.180.36g、氯化鎂0.220.45g、氯化鈉3.55.85g、磷酸二氫鈉0.300.55g、碳酸氫鈉1.383.20g、丙酮酸鈉0.0250.036g、加雙蒸水定容至1L而成；2液以1液為基礎(chǔ)，取l液3555mL，配犢牛血清2030mL、卵黃2025mL、甘油510mL、青霉素1GGGIU/mL混合而成所述稀釋液，且該稀釋液的滲透壓為300330mosmo/L，pH值為6.57.0。本發(fā)明優(yōu)選的配方是該稀釋液由1液和2液組成，1液的各組分及重量為氯化鈣0.30g、氯化鉀0.25g、氯化鎂0.32g、氯化鈉5.85g、磷酸二氫鈉0.45g、碳酸氫鈉2.38g、丙酮酸鈉G.025g、加雙蒸水定容至1L而成；2液以l液為基礎(chǔ)，取l液50mL，配犢牛血清25mL、卵黃20mL、甘油5mL、青霉素1000IU/mL混合而成所述稀釋液，且該稀釋液的滲透壓為325mosmo/L，pH值為6.8。為藏獒精子存活提供最佳基質(zhì)條件。本發(fā)明藏獒精液冷凍稀釋液有以下用途，一是用于藏獒精液低溫保存，另一用途是用于藏獒精液冷凍保存，如果去掉甘油等低溫保護(hù)劑，則還可用于藏獒精液的常溫保存。本發(fā)明根據(jù)藏獒精細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)需要、滲透壓、pH值及能量物質(zhì)的吸收方式等生理特性，將傳統(tǒng)犬的稀釋液配方中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)糖，如葡萄糖、蔗糖、果糖、乳糖、棉籽糖等用犢牛血清替代，作為精細(xì)胞能量代謝的來源，并對(duì)其他電解質(zhì)作了較大的調(diào)整，以維持精子內(nèi)外環(huán)境的滲透壓平衡。此外，本稀釋液用磷酸二氫鈉和碳酸氫鈉作緩沖劑，同時(shí)還加入青霉素等殺菌劑，甘油等保護(hù)劑，提高稀釋液的冷凍保護(hù)效果。使該稀釋液的滲透壓為300330mosmo/L、pH值為6.57.0，為藏獒精子存活提供了最佳基質(zhì)條件，進(jìn)一步降低了藏獒精子在冷凍過程中受過冷刺激所造成的損害，從而使凍精的活力、復(fù)蘇率、頂體的完整率、冷凍精子的受胎率和窩產(chǎn)仔平均數(shù)等指標(biāo)分別達(dá)0.65士0.05、82.3±5.55、51.2±1.23、84%和5只，相比傳統(tǒng)卵黃-乳糖稀釋液及卵黃-Tris稀釋液的O.30±0.03、38.40±4.56、29.4±1.29、22%和2只及0.47±0.04、59.58±4.63、31.9±1.60、57.1%和3只(禹學(xué)禮等，洛陽農(nóng)業(yè)高等專科學(xué)校學(xué)報(bào)，1999;(2):20-23)均有顯著的提高，并且在近幾年的實(shí)驗(yàn)中，各項(xiàng)指標(biāo)更加趨于穩(wěn)定，如下表。2007-2008兩年度藏獒冷凍精液及人工授精試驗(yàn)結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>顯然，本發(fā)明的稀釋液使藏獒冷凍精液的活力可達(dá)到0.60.7，受胎率和窩產(chǎn)仔平均數(shù)可分別達(dá)到77.3%84%和45只，達(dá)到或接近了自交水平，所以本發(fā)明是一種具有實(shí)際應(yīng)用和推廣價(jià)值的藏獒精液冷凍稀釋液。具體實(shí)施例方式本發(fā)明中所用的化學(xué)試劑均選擇分析純。實(shí)施例1。一種藏獒精液冷凍稀釋液，該稀釋液由1液和2液組成，1液的各組分及重量為氯化鈣0.30g、氯化鉀0.25g、氯化鎂0.32g、氯化鈉5.85g、磷酸二氫鈉0.45g、碳酸氫鈉2.38g、丙酮酸鈉0.025g、加雙蒸水定容至1L而成，并加熱溶解，以本領(lǐng)域常規(guī)方法過濾消毒，留濾液為l液；2液以1液為基礎(chǔ)，在無菌條件下，取l液50mL，配犢牛血清25mL、卵黃20mL、甘油5mL、青霉素1000IU/mL混合而成所述稀釋液，且該稀釋液的滲透壓為325mosmo/L，pH值為6.8，其對(duì)藏獒精液冷凍保存效果極佳。使用時(shí)，按h2比例與藏獒精液進(jìn)行同溫稀釋。實(shí)施例2。一種藏獒精液冷凍稀釋液，該稀釋液由1液和2液組成，1液的各組分及重量為氯化鈣0.20g、氯化鉀0.18g、氯化鎂0.22g、氯化鈉5.0g、磷酸二氫鈉G.3g、碳酸氫鈉1.38g、丙酮酸鈉Q.G3g、加雙蒸水定容至1L而成，并加熱溶解，以本領(lǐng)域常規(guī)方法過濾消毒，留濾液為1液；2液以1液為基礎(chǔ)，在無菌條件下，取l液35mL，配犢牛血清30mL、卵黃25mL、甘油10mL、青霉素1000IU/mL混合而成所述稀釋液，且該稀釋液的滲透壓為310mosmo/L，pH值為6.5。所配成的稀釋液對(duì)藏獒精液冷凍保存效果極佳。使用時(shí)，按l:2比例與藏獒精液進(jìn)行同溫稀釋。實(shí)施例3。一種藏獒精液冷凍稀釋液，該稀釋液由1液和2液組成，1液的各組分及重量為氯化鈣0.50g、氯化鉀0.36g、氯化鎂0.45g、氯化鈉3.5g、磷酸二氫鈉G.55g、碳酸氫鈉3.2g、丙酮酸鈉0.036g、加雙蒸水定容至1L而成，并加熱溶解，以本領(lǐng)域常規(guī)方法過濾消毒，留濾液為l液；2液以1液為基礎(chǔ)，在無菌條件下，取l液55mL，配犢牛血清20mL、卵黃20mL、甘油5mL、青霉素1000IU/mL混合而成所述稀釋液，且該稀釋液的滲透壓為330mosmo/L，pH值為7，其對(duì)藏獒精液冷凍保存效果極佳。使用時(shí)，按1:2比例與藏獒精液進(jìn)行同溫稀釋。權(quán)利要求1、藏獒精液冷凍稀釋液，其特征在于該稀釋液由1液和2液組成1液的各組分及重量為氯化鈣0.20～0.50g、氯化鉀0.18～0.36g、氯化鎂0.22～0.45g、氯化鈉3.5～5.85g、磷酸二氫鈉0.30～0.55g、碳酸氫鈉1.38～3.20g、丙酮酸鈉0.025～0.036g、加雙蒸水定容至1L而成；2液以1液為基礎(chǔ)，取1液35～55mL，配犢牛血清20～30mL、卵黃20～25mL、甘油5～10mL、青霉素1000IU/mL，混合而成所述稀釋液，且該稀釋液的滲透壓為300～330mosmo/L，pH值為6.5～7.0。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的藏獒精液冷凍稀釋液，其特征在于該稀釋液由l液和2液組成，l液的各組分及重量為氯化鈣0.30g、氯化鉀0.25g、氯化鎂0.32g、氯化鈉5.85g、磷酸二氫鈉0.45g、碳酸氫鈉2.38g、丙酮酸鈉0.025g、加雙蒸水定容至1L而成；2液以1液為基礎(chǔ)，取1液50mL，配犢牛血清25mL、卵黃20mL、甘油5mL、青霉素1000IU/mL，混合而成所述稀釋液，且該稀釋液的滲透壓為325mosmo/L，pH值為6.8。全文摘要一種藏獒精液冷凍稀釋液，屬于動(dòng)物繁殖
技術(shù)領(lǐng)域：
。包括1液和2液，1液由氯化鈣0.20～0.50g、氯化鉀0.18～0.36g、氯化鎂0.22～0.45g、氯化鈉3.5～5.85g、磷酸二氫鈉0.30～0.55g、碳酸氫鈉1.38～3.20g、丙酮酸鈉0.025～0.036g、加雙蒸水定容至1L而成；2液取1液35～55ml，配犢牛血清20～30ml、卵黃20～25ml、甘油5～10ml、青霉素1000IU/ml混合而成滲透壓為300～330mosmo/l，pH值為6.5～7.0的所述稀釋液。該稀釋液使藏獒冷凍精液的活力達(dá)到0.6～0.7，受胎率和窩產(chǎn)仔平均數(shù)分別達(dá)到77.3％～84％和4～5只，達(dá)到或接近了自交水平，是一種具有實(shí)際應(yīng)用和推廣價(jià)值的藏獒精液冷凍稀釋液。文檔編號(hào)A01N1/02GK101353643SQ20081016098公開日2009年1月28日申請(qǐng)日期2008年9月17日優(yōu)先權(quán)日2008年9月17日發(fā)明者張尤嘉,張振韜申請(qǐng)人:張尤嘉