專利名稱：：花臉蘑提取物以及它的制備方法與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種花臉蘑提取物以及它的制備方法與應(yīng)用，特別涉及到一種花臉蘑抗植物病毒蛋白提取物及它的制備方法與其在防治植物病毒病中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：植物病毒病是生產(chǎn)中很難防治的一類病害，素有"植物癌癥"之稱。據(jù)估計，全世界每年因植物病毒病害造成的損失超過150億美元，其中煙草花葉病毒病(7b6"ccow仍"/cw'n^)的危害每年造成的損失達l億多美元(吳云峰.世界農(nóng)業(yè)，1995，(5):3536)。煙草花葉病毒(7b6accowoy"fcw'r^，TMV)是一種非常重要的植物病毒，寄主范圍廣泛，可危害多種植物。目前，對于煙草花葉病毒病害還沒有非常有效的防治方法。近年來，從天然提取物中發(fā)現(xiàn)某些蛋白能對這種病毒有一定的防治效果，尤其是從高等真菌中提取的抗病毒蛋白引起了廣泛的關(guān)注。且這種天然提取物對人類和環(huán)境的危害性極小，屬于環(huán)境友好型。食用菌作為一種食品被人們所廣泛了解，其所含蛋白質(zhì)種類多樣且含量豐富，是抗病毒蛋白篩選的較好源材。但到目前為止食用菌中的活性成分在植物病毒病的防治方面研究還比較少，國內(nèi)外的幾個特例報道操作都異常復(fù)雜，不利于實際生產(chǎn)應(yīng)用，且菌種來源主要是人工栽培種，缺少從野生食用菌種天然產(chǎn)物篩選的廣泛性?；樐?epi"a幼rc/iVa)，屬擔(dān)子菌亞門(Basidiomycotina)香蘑屬(Z印紅to)。其子實體一般中等大小，蛋白質(zhì)含量豐富，在夏秋季節(jié)的產(chǎn)量較高，主要野生于內(nèi)蒙古、東北黑龍江和福建等地，目前尚未有關(guān)于花臉蘑內(nèi)活性物質(zhì)抗植物病毒的任何報道。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種花臉蘑提取物以及其它的制備方法與應(yīng)用。本發(fā)明所提供的花臉蘑提取物的制備方法，是將花臉蘑子實體粉與pH值為6-9的磷酸緩沖液混合，在0-4"C浸提，離心取其上清液即得到花臉蘑粗提物溶液。所述方法中，花臉蘑子實體粉干重與磷酸緩沖液的混合比例為lg花臉蘑子實體粉干重10-20ml磷酸緩沖液。所述方法中，磷酸緩沖液的pH值優(yōu)選為8.0;所述浸提的時間優(yōu)選為2-6小時。所述方法中，花臉蘑子實體粉的粒徑為60目以下。所述花臉蘑子實體粉為將花臉蘑子實體在20-4(TC烘干，粉碎，過60目篩得到的花臉蘑子實體粉末。所述方法中，所述離心得到的沉淀還可以lg:10—20ml的比例與pH值為6-9的磷酸緩沖液混合，在0-4。C浸提，得到花臉蘑粗提物溶液。所述方法中，花臉蘑提取物溶液還經(jīng)過下述步驟提取1)將所述花臉蘑粗提物溶液中加入硫酸銨至飽和度為50%，在0-4X:放置8-16小時后，離心，收集上清液；2)將步驟1)得到的上清液中加入硫酸銨至飽和度為70%,在0-4t:放置8-16小時后，離心，收集沉淀得到花臉蘑蛋白提取物。本發(fā)明所提供的花臉蘑提取物為上述方法制備的花臉蘑蛋白提取物。本發(fā)明花臉蘑蛋白提取物可用于防治煙草花葉病毒。本發(fā)明首次以花臉蘑為材料，對其子實體進行了活性成份分析，并對其抗TMV的活性物質(zhì)進行了純化和性質(zhì)研究，為抗TMV的生物源農(nóng)藥開發(fā)提供了另一條全新的途徑。本發(fā)明的花臉蘑蛋白提取物對TMV具有很好的抑制效果，在提取物調(diào)至蛋白濃度為60iig/ml后，采用莖葉噴霧的方式處理煙草植株，可以誘導(dǎo)煙草對TMV的抗性，對煙草花葉病毒的侵染抑制率可達77%以上。本發(fā)明的花臉蘑提取物屬于天然提取物，對人類和環(huán)境均無害。本發(fā)明花臉蘑蛋白提取物的制備方法簡單容易操作。圖1為本發(fā)明的花臉蘑蛋白提取物獲得方法的流程示意圖圖2為本發(fā)明的花臉蘑蛋白提取物抗TMV實驗照片具體實施例方式下述實施例中所述的方法，如無特別說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所示的百分含量，如無特別說明，均為質(zhì)量百分含量。實施例l、一種花臉蘑提取物的獲得及其效果實驗一、花臉蘑粗提物的獲得1、將上述獲得的花臉蘑子實體于3(TC烘箱中烘干，粉碎，過60目篩得到花臉蘑子實體粉末。2、將10g步驟l)得到的花臉蘑子實體粉末與0.025mol/LpH8.0的磷酸緩沖液按照lg/10ml的比例混合；在4。C，浸提4小時后，10000rpm/min離心20分鐘，收集上清液，將沉淀再于0.025mol/LpH8.0的磷酸緩沖液按照lg/10ml的比例混合，離心收集上清液，合并兩次得到的上清液，得到200ml花臉蘑粗提物。用BCA蛋白濃度試劑盒(美國Pierce公司)檢測該花臉蘑粗提物的蛋白濃度，測定方法按照試劑盒的說明書進行。二、花臉蘑提取物的抗TMV活性物質(zhì)分離1、將步驟一得到的花臉蘑粗提物，進行如下分級沉淀1)0-30%硫酸銨分級沉淀將步驟一得到的花臉蘑緩沖液提取液加入硫酸銨至飽和度為30%，放置4'C下沉淀12h，10000rpm/min離心20min沉淀即為0-30%硫酸銨沉淀蛋白。同時收集上清液留待后續(xù)操作。2)將步驟l)離心得到的上清液繼續(xù)加入硫酸銨至飽和度為40%，放置4"C下沉淀12h，10000rpm/min離心20min沉淀即為30%~40%硫酸銨沉淀蛋白。同時收集上清液留待后續(xù)操作。3)將步驟2)離心得到的上清液繼續(xù)加入硫酸銨至飽和度為50%，放置4°。下沉淀12h，10000rpm/min離心20min沉淀即為4(P/()50Q/()硫酸銨沉淀蛋白。同時收集上清液留待后續(xù)操作。4)將步驟3)離心得到的上清液繼續(xù)加入硫酸銨至飽和度為60%，放置4。C下沉淀12h，10000rpm/min離心20min沉淀即為50%~60%硫酸銨沉淀蛋白。同時收集上清液留待后續(xù)操作。5)將步驟l)離心得到的上清液繼續(xù)加入硫酸銨至飽和度為70%，放置4'C下沉淀12h，10000rpm/min離心20min沉淀即為60%~70%硫酸銨沉淀蛋白。同時收集上清液留待后續(xù)操作。6)將步驟l)離心得到的上清液繼續(xù)加入硫酸銨至飽和度為85%，放置4"C下沉淀12h，10000rpm/min離心20min沉淀即為70%85%硫酸銨沉淀蛋白。2、分別將步驟一得到的花臉蘑粗提物以及上述各個分級沉淀得到的組分，用0.025mol/L，PH=8.0的磷酸緩沖液稀釋至總蛋白濃度均為60"g/ml。按照下述方法處理煙草，并檢測它們對TMV的抑制率。1)植株處理將上述得到的提取物及各分級沉淀溶液(總蛋白濃度均為60ug/ml)，分別對苗齡一致(3-4葉)的枯斑三生煙dco"朋s^b3c鵬5"湖^"7W)進行整株噴霧，每個處理做三個重復(fù)，每個重復(fù)三株，每株三片葉子。同時設(shè)置對照(CK)(對照只用清水進行噴霧處理)。2)病毒接種液的制備病毒為TMV普通株系(以普通煙OVco"a朋"&c咖泡呢朋3功為繁殖寄主，本研究室活體保存)，其接種液獲取方法是將感染TMV的普通煙的煙葉去除主脈，與0.01mol/LpH=8.0的磷酸緩沖液以1:20(g/ml)混合，每20ml磷酸緩沖液加0.015g金剛砂，將葉片研磨，得到接種液。3)接種將按步驟l)的方法噴霧72小時后得到的煙草，用步驟2)得到的接種液進行摩擦接種(植病研究方法第三版，方中達，中國農(nóng)業(yè)出版社)，接種后立即用清水沖洗，在溫室培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為28。C光照12小時，18。C無光照12小時，交替進行。(4)抑制率計算接種72小時后調(diào)查發(fā)病情況，調(diào)查每張葉片的的枯斑數(shù)量，按下式計算出枯斑抑制率。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage6</formula>(式I)式I中，X為枯斑抑制率，單位％;CK為清水對照葉片的平均枯斑個數(shù)，單位:個；Y為經(jīng)花臉蘑子實體粗提物誘導(dǎo)處理后葉片的平均枯斑個數(shù)，單位個。結(jié)果如表l所示，結(jié)果表明，50-60%硫酸銨分級沉淀組分和60-70%硫酸銨分級沉淀組分對TMV抑制率最高。表l.花臉蘑提取物的TMV抑制實驗結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>3、花臉蘑提取物進一步提取根據(jù)上述步驟1和步驟2得到的結(jié)論，按照下述方法對將步驟一得到的花臉蘑提取物進一步提取1)在步驟一得到的花臉蘑粗提物中加硫酸銨至飽和度為50%，在4t:放置12小時后，10000rpm/min離心20分鐘，收集上清液。2)在步驟l)得到的上清液中，繼續(xù)加入硫酸銨至飽和度70%，在4t:放置12小時后，10000rpm/min離心20分鐘，收集沉淀，即得到花臉蘑抗TMV蛋白提取物。按照步驟2的方法對該步得到的花臉蘑蛋白提取物進行TMV抑制檢測，結(jié)果如表2和圖2所所示，結(jié)果顯示該飽和度的硫酸銨沉淀對TMV的抑制效果較好，在濃度為60ug/ml時可達77.1%。圖2中A為步驟一得到的花臉蘑粗提物抗煙草花葉病毒抑制實驗照片，其中左圖為清水噴霧72小時后摩擦接種的對照(CK)植株葉片照片，右圖為步驟一得到的花臉蘑粗提物噴施72小時后摩擦接種的植株的葉片照片；圖2中B為上述步驟3得到的花臉蘑蛋白提取物的TMV抑制實驗照片，其中左圖為清水噴霧72小時后摩擦接種的對照植株葉片照片，右圖為上述步驟3得到的花臉蘑蛋白提取物噴施72小時后摩擦接種的植株葉片照片。表2.花臉蘑提取物的TMV抑制實驗結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>實施例2、一種花臉蘑提取物的提取方法及其TMV抑制實驗本發(fā)明的花臉蘑提取物的提取流程圖如圖l所示，具體方法如下所述1)將上述獲得的花臉蘑子實體于2(TC烘箱中烘干，粉碎，過60目篩得到花臉蘑子實體粉末。2)將10g步驟l)得到的花臉蘑子實體粉末與磷酸緩沖液(0.02M，pH7.0)按照lg/20ml的比例混合；在4'C，浸提2小時后，10000rpm/min離心20分鐘，收集上清液，將沉淀再與磷酸緩沖液(0.02M，pH7.0)按照lg/20ml的比例混合，離心收集上清液，合并兩次得到的上清液，得到400ml花臉蘑粗提物。用BCA蛋白濃度試劑盒(美國Pierce公司)檢測該花臉蘑粗提物的蛋白濃度，測定方法按照試劑盒的說明書進行。3)在步驟2)得到的花臉蘑粗提物粗提液中加硫酸銨至飽和度為50%，在4'C放置8小時后，10000rpm/min離心20分鐘，收集上清液。4)在步驟l)得到的上清液中，繼續(xù)加入硫酸銨至飽和度70%,在4"C放置8小時后，10000rpm/min離心20分鐘，收集沉淀，即得到花臉蘑抗TMV蛋白提取物。按照實施例1的步驟二的步驟3的方法，分別對步驟2)、步驟4)獲得的花臉蘑粗提物進行抗TMV抑制率檢測實驗，結(jié)果如表3所示。<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>實施例4、一種花臉蘑提取物的獲得及其TMV抑制實驗本發(fā)明的花臉蘑提取物的提取流程圖如圖l所示，具體方法如下所述-1)將上述獲得的花臉蘑子實體于4(TC烘箱中烘干，粉碎，過60目篩得到花臉蘑子實體粉末。2)將10g步驟1)得到的花臉蘑子實體粉末與磷酸緩沖液(0.025mol/L，PH-9.0)按照lg/10ml的比例混合；在4。C，浸提3小時后，10000rpm/min離心20分鐘，收集上清液，將沉淀再與磷酸緩沖液(O.025raol/L，pH=9.0)按照lg/10ml的比例混合，離心收集上清液，合并兩次得到的上清液，得到200ml花臉蘑粗提物。用BCA蛋白濃度試劑盒(美國Pierce公司)檢測該花臉蘑粗提物的蛋白濃度，測定方法按照試劑盒的說明書進行。3)在步驟2)得到的花臉蘑粗提物中加硫酸銨至飽和度為50%，在4。C放置12小時后，10000rpm/min離心20分鐘，收集上清液。4)在步驟l)得到的上清液中，繼續(xù)加入硫酸銨至飽和度70%，在4。C放置8小時后，10000rpm/min離心20分鐘，收集沉淀，即得到花臉蘑抗煙草花葉病毒蛋白提取物。按照實施例1的步驟二的步驟3的方法，分別對步驟2)、步驟4)和步驟6)獲得的花臉蘑提取物進行煙草花葉病毒抑制率檢測實驗，結(jié)果如表5所示。表5.本發(fā)明的花臉蘑提取物的煙草花葉病毒抑制率檢測實驗結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>實施例5、本發(fā)明的花臉蘑蘑提取物的獲得及其效果實驗本發(fā)明的花臉蘑提取物的提取流程圖如圖l所示，具體方法如下所述1)將上述獲得的花臉蘑子實體于3(TC烘箱中烘干，粉碎，過60目篩得到花臉蘑子實體粉末。2)將10g步驟l)得到的花臉蘑子實體粉末與磷酸緩沖液(0.02M，pH8.0)按照lg/10ml的比例混合；在4。C，浸提4小時后，10000rpm/min離心20分鐘，收集上清液，將沉淀再與磷酸緩沖液(0.02mol/L，pH=8.0)按照lg/10ml的比例混合，離心收集上清液，合并兩次得到的上清液，得到200ml花臉蘑粗提物。用BCA蛋白濃度試劑盒(美國Pierce公司)檢測該花臉蘑粗提物的蛋白濃度，測定方法按照試劑盒的說明書進行。3)在步驟2)得到的花臉蘑提取物粗提液中加硫酸銨至飽和度為50%，在4'C放置12小時后，10000ipm/min離心20分鐘，收集上清液。4)在步驟l)得到的上清液中，繼續(xù)加入硫酸銨至飽和度70%,在4。C放置12小時后，10000rpm/min離心20分鐘，收集沉淀，即得到花臉蘑抗煙草花葉病毒蛋白提取物。按照實施例1的步驟二的步驟3的方法，分別對步驟2)、步驟4)獲得的花臉蘑提取物進行抗煙草花葉病毒抑制率檢測實驗，結(jié)果如表6所示。表6.本發(fā)明的花臉蘑蘑提取物的TMV抑制實驗結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>權(quán)利要求1、一種花臉蘑提取物的制備方法，是將花臉蘑子實體粉與pH值為6-9的磷酸緩沖液混合，在0-4℃浸提，離心取上清液得到花臉蘑提取物溶液。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述花臉蘑子實體粉與所述磷酸緩沖液的混合比例為lg花臉蘑子實體粉干重10—20ml磷酸緩沖液。3、根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述磷酸緩沖液的pH值為8，所述浸提的時間為2-6小時。4、根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述花臉蘑子實體粉的粒徑為60目以下。5、根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于所述花臉蘑子實體干粉為將花臉蘑子實體在20—4(TC烘干，粉碎，過60目篩得到的花臉蘑子實體粉末。6、根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于所述離心得到的沉淀還可以lg:10—20ml的比例與pH值為6-9的磷酸緩沖液混合，在0-4"C浸提，得到花臉蘑提取物溶液。7、根據(jù)權(quán)利要求1-6中任意一項所述的方法，其特征在于所述花臉蘑蛋白提取物溶液還經(jīng)過下述步驟的提取1)將所述花臉蘑提取物溶液中加入硫酸銨至飽和度為50%，在0-4'C放置8-16小時后，離心，收集上清液；2)將步驟l)得到的上清液中加入硫酸銨至飽和度為70%，在0-4t:放置8-16小時后，離心，收集沉淀得到花臉蘑蛋白提取物。8、權(quán)利要求1-7中任意一項所述的方法獲得的花臉蘑蛋白提取物。9、權(quán)利要求8所述的花臉蘑蛋白提取物在防治煙草花葉病毒中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明公開了一種花臉蘑提取物以及它的制備方法與應(yīng)用。該方法(1)是將花臉蘑子實體粉與pH值為6-9的磷酸緩沖液混合，在0-4℃浸提，離心取上清液得到花臉蘑粗提物；(2)上清液加入硫酸銨至飽和度為50％，在0-4℃放置8-16小時后離心；(3)上清液加入硫酸銨至飽和度為70％，在0-4℃放置8-16小時后離心。(4)用蒸餾水溶解沉淀得到花臉蘑抗TMV的蛋白。本發(fā)明的花臉蘑提取物屬于天然提取物，對人類和環(huán)境均無害，屬于環(huán)境友好型。且本發(fā)明的花臉蘑提取物的純化方法簡單，步驟精略，容易操作。文檔編號A01P3/00GK101375691SQ200810223439公開日2009年3月4日申請日期2008年9月27日優(yōu)先權(quán)日2008年9月27日發(fā)明者紅嚴(yán),瑩周,李興紅,林秀敏,燕繼曄,馬鳳金,黃金寶申請人:北京市農(nóng)林科學(xué)院