專利名稱：一種用于培育轉(zhuǎn)基因禽的種蛋孵化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于培育轉(zhuǎn)基因禽的種蛋孵化方法。
背景技術(shù)：
利用基因工程技術(shù)可以將禽類中不利的基因剔除，以提高禽類的抗病抗逆性、提高禽類生產(chǎn)性能和改善肉質(zhì)。繼乳腺生物反應(yīng)器之后，利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)將人或動物的抗體基因?qū)氲半u體內(nèi)，將其改造成輸卵管生物反應(yīng)器，可以使其所產(chǎn)的蛋中含有大量具有經(jīng)濟(jì)價(jià)值的蛋白質(zhì)，再用其生產(chǎn)藥品和保健品。因此，轉(zhuǎn)基因禽類具有巨大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和應(yīng)用前景。 近年來已有不少轉(zhuǎn)基因雞的研究報(bào)告出爐，但是真正可以投入生產(chǎn)的卻幾乎沒有，主要原因之一是轉(zhuǎn)基因禽類的成功孵化比較難實(shí)現(xiàn)。 禽類為卵生孵化，其受精卵在體內(nèi)受精后不久就被蛋清和蛋殼包裹并開始發(fā)育，到種蛋產(chǎn)出體外時(shí)就已經(jīng)是有5-6萬個(gè)細(xì)胞的囊胚了，排出的種蛋會在合適的溫度濕度等條件下再繼續(xù)進(jìn)行發(fā)育，所以禽類的轉(zhuǎn)基因不像哺乳類動物那樣可以在受精卵單細(xì)胞層面上進(jìn)行顯微操作，而大多是對剛產(chǎn)出的種蛋進(jìn)行囊胚水平上的轉(zhuǎn)基因操作，再使轉(zhuǎn)基因后的種蛋繼續(xù)孵化培養(yǎng)直至出雛。隨之，雞胚的體外培養(yǎng)體系也建立起來。起初人們將雞胚放在陶瓷缸、塑料膜中培養(yǎng)，雞胚最久可以發(fā)育到14天，但是沒有活的雞胚出雛；后來發(fā)展出代用蛋殼孵化體系，其在體外培養(yǎng)系統(tǒng)中成功獲得了出雛的小雞，但是孵化率較低，主要是因?yàn)閺?fù)雜的體外培養(yǎng)孵化體系并不能很好的滿足雞胚在原蛋殼內(nèi)的發(fā)育要求，再加上其復(fù)雜的程序和苛刻的條件，使其推廣應(yīng)用受到限制。 如果要提高轉(zhuǎn)基因雞的孵化率，最好的方法就是在種蛋原殼中孵化轉(zhuǎn)基因雞胚。近年來發(fā)展出"開窗法"轉(zhuǎn)基因操作種蛋轉(zhuǎn)基因過程，其方法如下在種蛋原殼的赤道面上開直徑0. 5-1. 0cm的圓窗，透過其對雞胚X期胚盤進(jìn)行轉(zhuǎn)基因操作，術(shù)后將開口用各種材料(例如膠類、塑料膜、石蠟?zāi)さ任镔|(zhì))封閉，使轉(zhuǎn)基因后的雞胚在種蛋原殼內(nèi)繼續(xù)進(jìn)行孵化。這種稱為"開窗法"的操作方法可以成功的獲得轉(zhuǎn)基因雛雞并且孵化率比以往的雞胚體外培養(yǎng)方法要高。但是與實(shí)際需求相比，這種方法的孵化率仍然很低，主要是因?yàn)榉趸^程中封口后的種蛋普遍出現(xiàn)蛋清外溢的現(xiàn)象，最多可以在一批蛋中100%的出現(xiàn)不同程度的蛋清外溢現(xiàn)象，蛋清的外溢破壞了蛋內(nèi)水分和營養(yǎng)的平衡，影響了雞胚的正常發(fā)育，并且外溢的蛋清極易滋生細(xì)菌，引發(fā)細(xì)菌的污染，造成雞胚的死亡。有關(guān)研究認(rèn)為蛋清外溢是由于開窗導(dǎo)致蛋內(nèi)氣壓的失衡引起的，所以，又采取封窗前往蛋內(nèi)添加稀蛋清或是磷酸鹽緩沖液的辦法來解決，也有采取去掉種蛋鈍端部分蛋殼的方法來解決，雖然這樣的措施部分降低了蛋清外溢的程度，但是這些方法均操作繁瑣，并且也沒有在根本上杜絕蛋清外溢的發(fā)生。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種孵化種蛋的方法，該方法特別適合應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因禽的培育。
本發(fā)明所提供的孵化種蛋的方法，是將蛋殼的赤道上有被封閉的開孔的種蛋，按照使被封閉的開孔朝上并處于所述種蛋的最高處的方式放置，進(jìn)行靜置孵化；至所述種蛋內(nèi)的絨毛膜發(fā)育到包裹種蛋內(nèi)的全部內(nèi)容物時(shí)，再將所述種蛋大頭朝上小頭朝下放置，進(jìn)行翻蛋孵化；然后再進(jìn)行靜置孵化直至出雛。 其中，所述種蛋內(nèi)的絨毛膜包裹種蛋內(nèi)的全部內(nèi)容物時(shí)，是指從開始孵化時(shí)計(jì)起，孵化至第4-5天，優(yōu)選為第5天。 所述翻蛋孵化共持續(xù)12-15天，優(yōu)選為14天。 所述靜置孵化和翻蛋孵化的溫度為37-38. 5t:，優(yōu)選為38t:;所述靜置孵化和翻蛋孵化的相對濕度為50% _75%，優(yōu)選為75%。 本發(fā)明方法適合于一般禽類種蛋的孵化，如鵪鶉、家鴨和雞等，而且種蛋的品種不限。 所述種蛋為采取開窗法操作的轉(zhuǎn)基因種蛋。 所述蛋殼的赤道上有被封閉的開孔的種蛋可從商業(yè)途徑獲得，也可按照常規(guī)方法(如"開窗法")制備。 本發(fā)明的發(fā)明人經(jīng)過研究發(fā)現(xiàn)，開窗法轉(zhuǎn)基因種蛋在孵化過程中出現(xiàn)蛋清外溢的根本原因是蛋清與有機(jī)封口物質(zhì)直接接觸造成的。用于封閉開窗的封口膜基本采用的是有機(jī)物質(zhì)，其表面含有許多微小的孔隙，而蛋清是堿性的優(yōu)良有機(jī)溶劑，其中還含有各種各樣的酶類物質(zhì)，在孵化的過程中如果使蛋清與封口膜直接接觸，在溫暖高濕的孵化環(huán)境中，蛋清會漸漸的將封口膜物質(zhì)溶解，加上孵化時(shí)翻蛋造成蛋清流動的反復(fù)沖刷，封口膜就會逐漸被溶蝕，其表面的微小孔隙擴(kuò)大，最終導(dǎo)致蛋清的外溢。 本發(fā)明的發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)，開窗法轉(zhuǎn)基因操作中，種蛋赤道上開窗之后，蛋殼內(nèi)會出現(xiàn)一個(gè)微小的空腔(稱人工氣室)。 本發(fā)明的發(fā)明人基于以上發(fā)現(xiàn)，并結(jié)合如下禽類胚胎的發(fā)育過程，創(chuàng)造性地提供了一種從根本上克服了蛋清外溢現(xiàn)象的種蛋孵化方法 種蛋孵化過程中，從開始孵化時(shí)計(jì)起，孵化33小時(shí)后，雞胚胎膜開始發(fā)育，胎膜首
先開始包裹胚胎，后逐漸擴(kuò)大；到孵化第4天時(shí)，胎膜基本合攏，內(nèi)層為羊膜，外層為絨毛
膜，此時(shí)，羊膜已包裹胚胎，絨毛膜貼著蛋殼且已包裹種蛋內(nèi)的全部內(nèi)容物；到孵化第5天
時(shí)，絨毛膜和尿囊融合形成尿囊絨毛膜，此時(shí)尿囊絨毛膜完全合攏并包裹種蛋內(nèi)的全部內(nèi)
容物；以后胚胎通過尿囊絨毛膜及卵囊膜吸收營養(yǎng)和呼吸，最后孵化至出雛。 本發(fā)明方法摒棄了原有的治標(biāo)不治本的封蛋措施，利用種蛋自身的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)和雞
胚發(fā)育過程中胎膜的發(fā)育特點(diǎn)，創(chuàng)造性地通過在孵化期間對轉(zhuǎn)基因種蛋孵化時(shí)蛋位的調(diào)
整，簡單有效地避免了蛋清與封口物質(zhì)的直接接觸。首先，在孵化的前期，即孵化第5天以
前，通過種蛋的擺放，即使蛋殼上的開窗處于種蛋的最高處，利用上述人工氣室將蛋清與封口膜隔絕，使其相互不能直接接觸；在絨毛膜發(fā)育到包裹整個(gè)種蛋內(nèi)容物以后，即孵化第5天后，絨毛膜及后續(xù)形成的尿囊絨毛膜使蛋清與封口物質(zhì)隔絕，使其不能直接接觸后，再將種蛋大頭朝上豎直放置并恢復(fù)翻蛋孵化。因此，在整個(gè)種蛋的孵化過程中，都徹底隔絕了蛋清與封口膜的直接接觸，因而從根本上杜絕了蛋清外溢的可能性。另外，本發(fā)明方法還無需在封閉開孔前，向蛋內(nèi)添加蛋清等補(bǔ)充液體，使操作更簡便。 本發(fā)明方法從根本上克服了傳統(tǒng)方法中蛋清外溢的缺陷，保證了孵化過程中蛋內(nèi)的水分和營養(yǎng)平衡，減少了由于蛋清外溢而造成雞胚死亡的損失，保證了轉(zhuǎn)基因雞胚的正常發(fā)育，直接提高了轉(zhuǎn)基因雞胚的孵化率。本發(fā)明方法步驟簡單，可操作性強(qiáng)，并適合于其它開窗法轉(zhuǎn)基因操作后的禽類種蛋的孵化，如鵪鶉，家鴨等。因此，本發(fā)明方法具有重要的應(yīng)用價(jià)值，適合于推廣。


圖1為種蛋孵化中蛋清外溢現(xiàn)象和蛋清無外溢現(xiàn)象的圖。
圖2為本發(fā)明方法孵化出的雛雞的圖。
具體實(shí)施例方式
下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
實(shí)施例1、開窗法轉(zhuǎn)基因后的雞種蛋的孵化 本實(shí)施例中所用的蛋殼的赤道上有被封閉的開孔的種蛋是通過開窗法進(jìn)行轉(zhuǎn)基因操作后的雞種蛋，用于封閉開孔的有機(jī)物是石蠟?zāi)?Paraffilm)，而且，在封閉開孔前，種蛋內(nèi)不添加稀蛋清或磷酸鹽緩沖液等。
本發(fā)明方法的實(shí)驗(yàn)步驟如下 1、將上述種蛋水平靜置于孵化蛋托上，使蛋殼上的窗口朝上并處于種蛋的水平最高處；用噴霧器向種蛋表面噴灑青霉素和鏈霉素混合溶液(青霉素的濃度為100mg/ml，鏈霉素的濃度為100mg/ml) ， 5ml混合溶液/100個(gè)種蛋；然后將種蛋靜置入孵，孵化時(shí)不翻蛋，期間蛋殼上的窗口一直朝上并處于種蛋的水平最高處，溫度38度，相對濕度75%。
2、孵化至種蛋內(nèi)的絨毛膜已包裹種蛋內(nèi)的全部內(nèi)容物(即從開始孵化計(jì)起，在孵化的第5天)時(shí)，將平置的種蛋改成大頭朝上，小頭朝下豎直放置，并恢復(fù)翻蛋，蛋的擺動幅度為45度，翻蛋頻率為每2小時(shí)翻蛋一次，在溫度38度、75%相對濕度的條件下孵化；翻蛋孵化一共進(jìn)行14天； 3、孵化至第19天，停止翻蛋，將種蛋由孵化蛋托上取下置于蛋盤中，繼續(xù)在溫度38度、75%相對濕度的條件下孵化； 4、孵化至第20-21天，轉(zhuǎn)基因種蛋會陸續(xù)出雛，將出雛的小雞轉(zhuǎn)移至育雛箱中進(jìn)行后續(xù)培養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)。 同時(shí)將經(jīng)同樣開窗轉(zhuǎn)基因操作的雞種蛋用現(xiàn)有的常規(guī)方法進(jìn)行孵化，以作為對照，現(xiàn)有孵化方法的實(shí)驗(yàn)步驟如下 1、將種蛋大頭朝上，小頭朝下豎直放置，開啟翻蛋，蛋的擺動幅度為45度，翻蛋頻率為每2小時(shí)翻蛋一次，在溫度38度、75%相對濕度的條件下孵化。 2、孵化至第19天，停止翻蛋，將種蛋由孵化蛋托上取下置于蛋盤中，繼續(xù)在溫度38度、75%相對濕度的條件下孵化。 實(shí)驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)，用本發(fā)明方法共孵化了 120個(gè)種蛋，用現(xiàn)有方法共孵化了 180個(gè)種蛋，結(jié)果如圖l和圖2所示。表明，用本發(fā)明方法孵化的120個(gè)種蛋均無蛋清外溢現(xiàn)象(圖1A和圖1B)，雞胚可以在不喪失蛋清的條件下正常發(fā)育，最終的轉(zhuǎn)基因種蛋的孵化率為23. 5%;而用現(xiàn)有方法孵化的180個(gè)轉(zhuǎn)基因種蛋均有不同程度的蛋清外溢現(xiàn)象(圖1C為嚴(yán)重外溢，圖1D為中度外溢)，雞胚全部死亡，孵化率為0%。用本發(fā)明方法孵化成功的雛雞如圖2所示。
權(quán)利要求
一種孵化種蛋的方法，是將蛋殼的赤道上有被封閉的開孔的種蛋，按照使被封閉的開孔朝上并處于所述種蛋的最高處的方式放置，進(jìn)行靜置孵化；至所述種蛋內(nèi)的絨毛膜發(fā)育到包裹種蛋內(nèi)的全部內(nèi)容物時(shí)，再將所述種蛋大頭朝上小頭朝下放置，進(jìn)行翻蛋孵化；然后再進(jìn)行靜置孵化直至出雛。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述種蛋內(nèi)的絨毛膜包裹種蛋內(nèi)的全部 內(nèi)容物時(shí)，是指從開始孵化時(shí)計(jì)起，孵化至第4-5天，優(yōu)選為第5天。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于所述翻蛋孵化共持續(xù)12-15天，優(yōu)選 為14天。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于所述靜置孵化和翻蛋孵化的溫度為 37-38. 5t:，優(yōu)選為38t:;所述靜置孵化和翻蛋孵化的相對濕度為50% _75%，優(yōu)選為75%。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于所述種蛋為禽的種蛋。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于所述禽為雞。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于所述種蛋為采取開窗法操作的轉(zhuǎn)基 因種蛋。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種用于培育轉(zhuǎn)基因禽的種蛋孵化方法。該方法是將蛋殼的赤道上有被封閉的開孔的種蛋，按照使被封閉的開孔朝上并處于所述種蛋的最高處的方式放置，進(jìn)行靜置孵化；至所述種蛋內(nèi)的絨毛膜發(fā)育到包裹種蛋內(nèi)的全部內(nèi)容物時(shí)，再將所述種蛋大頭朝上小頭朝下放置，進(jìn)行翻蛋孵化；然后再進(jìn)行靜置孵化直至出雛。本發(fā)明方法從根本上克服了傳統(tǒng)方法中蛋清外溢的缺陷，保證了孵化過程中蛋內(nèi)的水分和營養(yǎng)平衡，減少了由于蛋清外溢而造成雞胚死亡的損失，保證了轉(zhuǎn)基因雞胚的正常發(fā)育，提高了轉(zhuǎn)基因雞胚的孵化率。本發(fā)明方法步驟簡單，可操作性強(qiáng)，并且適合于其它開窗法轉(zhuǎn)基因操作后的禽類種蛋的孵化，如鵪鶉，家鴨等。因此，本發(fā)明方法具有重要的應(yīng)用價(jià)值，適合于推廣。
文檔編號A01K67/00GK101720716SQ20081022533
公開日2010年6月9日 申請日期2008年10月30日 優(yōu)先權(quán)日2008年10月30日
發(fā)明者孫研研, 楊寧, 蔣斌, 鄭江霞 申請人:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)