專利名稱：：一種提高占補(bǔ)地土壤肥力的微生物制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體地涉及一種提髙占補(bǔ)地土壤肥力的微生物制劑。
背景技術(shù)：
：建設(shè)占用后補(bǔ)償?shù)母?簡稱"占補(bǔ)地")是指耕地被建設(shè)占用后，按照"占一補(bǔ)一"的平衡制度，通過土地整理開發(fā)補(bǔ)充給農(nóng)業(yè)使用的土地。據(jù)統(tǒng)計(jì)，十五"期間，我國建設(shè)占用耕地1641萬畝，而同期補(bǔ)償耕地為2140萬畝。占補(bǔ)地雖然實(shí)現(xiàn)了數(shù)量平衡或略有增加，但占補(bǔ)地一般存在嚴(yán)重的質(zhì)量問題，尤其是土壤肥力低下，具體表現(xiàn)為土壤有機(jī)質(zhì)與氮素養(yǎng)分含量低、土壤微生物數(shù)量少、生物活性低、土壤質(zhì)地不良、結(jié)構(gòu)性差，導(dǎo)致作物長勢不良、產(chǎn)量低下。隨著社會經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，占補(bǔ)地尚有進(jìn)一步增加的趨勢。因此，加強(qiáng)占補(bǔ)地的肥力重建與快速培育，提高占補(bǔ)耕地的綜合生產(chǎn)能力，對于充分發(fā)揮這些土地的生產(chǎn)潛力，實(shí)現(xiàn)真正意義上的占補(bǔ)平衡，確保國家糧食安全和國民經(jīng)濟(jì)快速發(fā)展具有十分重要的戰(zhàn)略意義。在土壤生物肥力方面，隨著人們對土壤可持續(xù)生產(chǎn)能力要求的日益提高，已認(rèn)識到土壤生物，尤其是土壤中的微生物，在土壤肥力和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)能力上的重要性，由此提出和發(fā)展了土壤生物肥力。土壤生物肥力，是生活在土壤中以微生物為主的有機(jī)體為植物生長發(fā)育所需營養(yǎng)提供的貢獻(xiàn)。在化學(xué)肥料為主的農(nóng)業(yè)體系中，生物過程對營養(yǎng)供應(yīng)和植物生長方面起到重要作用。大量的化肥、農(nóng)藥和機(jī)械投入不僅增加了成本，經(jīng)常難以達(dá)不到預(yù)期的效果；微生物對于保持土壤肥力和作物生長起到不可或缺的作用。因此，通過施用微生物肥料，向土壤中接入功能微生物，增加土壤中特定的微生物數(shù)量，改善土壤微生態(tài)條件，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中取得了顯著成效。如通過共生固氮增加植物對氮的吸收；應(yīng)用功能微生物，進(jìn)行低產(chǎn)土壤改良與退化土壤環(huán)境修復(fù)等。土壤生物肥力及其微生物肥料作為當(dāng)代農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的高新技術(shù)，已經(jīng)被深入研究和逐步應(yīng)用，成為快速培育土壤肥力的有效措施之一。在微生物對有機(jī)物的分解與腐殖質(zhì)形成方面，腐殖質(zhì)的形成過程比較復(fù)雜，其中微生物起了關(guān)鍵的作用，特別是降解木質(zhì)素微生物功能菌群直接影響腐殖質(zhì)的形成。研究表明秸桿中的木質(zhì)素類物質(zhì)被微生物降解后，與苯丙烷及氨基酸發(fā)生共聚合作用形成高分子量混合物，紅外光譜和核磁共振波譜顯示該混合物中含有與土壤腐殖質(zhì)中類似的芳香結(jié)構(gòu)。木質(zhì)素降解和腐殖質(zhì)形成是一個多菌種參與、聯(lián)合起作用的過程，如真菌類的白腐菌、褐腐菌、軟腐菌等，高溫放線菌類的鏈霉菌、高溫放線菌、小單孢菌、諾卡氏菌等，以及枯草芽孢桿菌、熒光假單胞菌等很多細(xì)菌都起著關(guān)鍵的作用。
發(fā)明內(nèi)容(一)要解決的技術(shù)問題本發(fā)明的目的是提供一種提高占補(bǔ)地土壤肥力的微生物制劑。(二)技術(shù)方案本發(fā)明所述的木霉(7Wc/zo^rw"sp.)，該菌株已于2008年11月17曰被保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，簡稱CGMCC,保藏編號為CGMCCNo.厶7^t。本發(fā)明所述的短芽孢桿菌(5v/^c/〃wsp.),該菌株已于2008年11月17日被保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心.，簡稱CGMCC,保藏編號為CGMCCNo.^I^L。所述的短芽孢桿菌(GD448)經(jīng)形態(tài)、生理生化特征分析和16srDNA基因序列同源性分析，鑒定為變型細(xì)菌a亞群類芽孢桿菌科短芽孢桿菌屬(5vAa"7/wsp.)。GD448菌最適生長溫度為28°C,最適生長pH為pH7~8。所述纖維素分解菌(863Z-3)經(jīng)形態(tài)、生理生化特征分析和16srDNA基因序列同源性分析，鑒定為木霉(7V/c/2o^，"sp.)。本發(fā)明提供了一種提高占補(bǔ)地土壤肥力的微生物制劑，其活性成分含有木霉(7Wc/w&w^sp.)CGMCCNo.iH^L和短芽孢桿菌(5^vAac/〃wsp.)CGMCCNo.L"7"。本發(fā)明還公開了該微生物制劑在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用，即用于提高占補(bǔ)地土壤肥力。(三)有益效本發(fā)明所述的微生物制劑，與秸桿還田配合使用，可以增加土壤微生物數(shù)量，改善土壤結(jié)構(gòu)，提高占補(bǔ)地的土壤有機(jī)質(zhì)與氮素養(yǎng)分，迅速提高土壤肥力。本發(fā)明所述的木霉(7Wc/^6fem2asp.)，該菌株已于2008年11月17曰被保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，簡稱CGMCC,保藏編號為CGMCCNo.么7+千。本發(fā)明所述的短芽孢桿菌(^"eWkzc/〃wsp.)，該菌株已于2008年11月17曰被保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，簡稱CGMCC,保藏編號為CGMCCNo.么了午7。具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。實(shí)施例l本發(fā)明所述纖維素分解菌的富集分離分別在北京、河北、黑龍江、內(nèi)蒙古等地釆集農(nóng)田土壤、森林土壤、馬糞和腐爛秸桿等樣品共計(jì)15份，釆用郝奇遜(Hutchinson)培養(yǎng)基(KH2P04l.Og,NaN032.5g,MgS047H200.3g,NaClO.lg，CaCl20.1g，F(xiàn)eCl30.01g，瓊脂18.0g,水1000mL，pH7.2)加蓋濾紙片法進(jìn)行了菌種的初步分離，以后又釆用玉米秸稈粉瓊脂平板和木屑粉瓊脂平板進(jìn)一步進(jìn)行了菌種復(fù)篩。秸稈纖維素的制備將玉米秸稈剪成23cm小段，烘干后粉碎至60目，加入2%的氫氧化鈉溶液至固液重量比為1:4,在85'C水洛處理lh，7k洗至pH為中性，烘干備用(木屑粉處理方法相同)。.經(jīng)反復(fù)多次分離純化，獲得分解纖維素和木質(zhì)素能力較強(qiáng)的真菌863Z-3。實(shí)施例2本發(fā)明所述纖維素分解菌(863Z-3)菌株特性測定實(shí)驗(yàn)1、利用木屑能力實(shí)驗(yàn)將分離獲得的真菌接種在木屑平板培養(yǎng)基上，于28。C培養(yǎng)，觀察其生長狀況。<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>2、分解木質(zhì)素實(shí)驗(yàn)將試驗(yàn)菌株接種到液體木素培養(yǎng)基中(250ml三角瓶加100ml營養(yǎng)液和lg木屑粉)，于28。C、160rpm培養(yǎng)6天，觀察其生長狀況。表2菌株分解木質(zhì)素實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>注經(jīng)堿處理的木屑粉過0.25mm(100目)的篩，采收時先將培養(yǎng)液過0.5mm(50目)的篩，用水沖洗菌絲團(tuán)表面附著的木屑，去除菌絲團(tuán)，再將濾液過300目濾網(wǎng)，獲得剩余木屑粉，并烘干。3、耐高溫試驗(yàn)將分離獲得的真菌接種在PDA斜面培養(yǎng)基上，分別置于3CTC、4(TC、5(TC的培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)3天，觀察其生長狀況。表3木質(zhì)素分解菌在不同溫度下生長狀況<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>注++:菌株可以正常生長；+:菌株不長或不能正常生長，但恢復(fù)到常溫又可正常生長；-:菌株不生長，已死亡。實(shí)施例3本發(fā)明所述高效固氮菌株的分離取10g土樣放入90ml無菌水中搖床振蕩20min制成混濁液，吸取5ml放入30ml固氮菌富集培養(yǎng)液ACCC55(成份為蔗糖10g、K2HPCV3H200.5g、NaCl0.2g、CaC031g、MgS04.7H200.2g、蒸餾水lOOOml、pH7.0~7.2)中，100rpm，28。C進(jìn)行搖床振蕩培養(yǎng)，72h后換新鮮培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。重復(fù)培養(yǎng)3次后進(jìn)行固氮芽孢菌分離。吸取1ml上述固氮菌富集培養(yǎng)物放到9ml無菌水中制成IO"稀釋度，繼續(xù)稀釋制成l(T2、l(T3、l(T4、10'5稀釋度的菌懸液，在IO(TC沸水中加熱10min，冷卻后每個稀釋度取0.1ml涂布在固氮菌分離培養(yǎng)基平板上，29C靜置培養(yǎng)。23d待菌落形成后，在改良的ACCC55固氣菌培養(yǎng)基平板上(成份為蔗糖10g、K2HP043H200.5g、NaCl0.2g、CaC031g、MgS04.7H200.2g、酵母膏0.5g、蒸餾水1000ml、瓊脂1.5%~2.0%,pH7.0~7.2)用平板劃線法進(jìn)行菌種純化。實(shí)施例4本發(fā)明所述高效固氮菌株的接種效應(yīng)試驗(yàn)選用菜園土，過2mm土壤篩。試驗(yàn)用盆選用直徑13cm，高12cm的塑料花盆，每盆裝土約700g。1、育苗種子表面滅菌選取大小一致的小白菜種子用95%酒精浸5min，倒去酒精用3%NaOCl溶液表面滅菌2min，倒去次氯酸鈉用無菌水洗6次。育苗及移栽在育苗缽中裝入上述滅菌土壤，澆透水每缽播種3粒種子，在智能光照培養(yǎng)箱中育苗，待真葉長到兩葉一心時進(jìn)行移栽。每盆移栽一株，在溫室中進(jìn)行。2、盆栽試驗(yàn)試驗(yàn)設(shè)4個處理，即1)無氮對照處理(記為CK1)、2)化學(xué)氮肥處理(記為CK2)、3)選育菌種接種處理(記為GD448)和4)參比菌圓褐固氮菌ACCC11103對照處理(記作ACCC11103)。每個處理三盆重復(fù)，每盆種小白菜l株，完全隨機(jī)排列。小白菜移栽兩天后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)處理，方法為1)無氮對照處理CKl,每盆澆50mlFahraeus無氮植物營養(yǎng)液(成份Na2HP04.12H200.15g，MgS04.7H200.12g，檸檬酸鐵0.005g,CaCl2.2H20O.lg，KH2PO40.1g,Gibson微量元素lml,H20lOOOml，PH6.5—7.0。Gibson微量元素液H3B032.86g，ZnS047H200.22g,CuS04.5H200.08g,MnS04'4H202.03g，Na2Mo04'2H201.26g,H20lOOOml);2)氮肥處理CK2每盆澆50ml有氮全營養(yǎng)液(成份在1000mlFahraeus無氮植物營養(yǎng)液中加入0.12g尿素)；3)選育菌種接種處理296,培養(yǎng)收集296菌體，用Fahraeus無氮植物營養(yǎng)液洗滌菌體，稀釋到OD6Q。1.5，每盆澆50ml;4)參比菌圓褐固氮菌對照處理ACCC11103，培養(yǎng)收集ACCC11103菌體，用Fahraeus無氮植物營養(yǎng)液洗滌菌體，稀釋到006。。1.5,每盆澆50ml。小白菜生長期間管理按照常規(guī)方法進(jìn)行，30天后收獲進(jìn)行分析測試。3、測定項(xiàng)目及方法包括植株長勢、生物量等。植株總含氮量參考《土壤農(nóng)業(yè)化學(xué)分析方法》，釆用KDY-9820型凱氏定氮儀進(jìn)行測定。數(shù)據(jù)分析釆用SPSS統(tǒng)計(jì)分析軟件完成。4、實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表4所示。表4高效固氮菌株GD448的接種固氮效能<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>注同一列大寫字母不同表示差異達(dá)到0.01顯著水平，小寫字母不同表示差異達(dá)到0.05顯著水平小白菜接種高效固氮菌株GD448后，與無氮對照相比植株鮮重增加187%,干重增加172%，植株全氮含量增加210%,接種效果達(dá)到了施用化學(xué)氮肥和接種固氮菌生產(chǎn)菌種的同等效果，具有較好的生產(chǎn)應(yīng)用前景。權(quán)利要求1、一種提高占補(bǔ)地土壤肥力的微生物制劑，其活性成分含有木霉(Trichodermasp.)CGMCCNo.和短芽孢桿菌(Brevibacillussp.)CGMCCNo.2、一株能分解纖維素的木霉(7WcWg畫sr>.)CGMCCNo.2了竹。3、一株能固氮的短芽孢桿菌(^^W6ac/〃wsp.)CGMCCNo.27^7。4、根據(jù)權(quán)利要求1所述的微生物制劑在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明提供了一種提高占補(bǔ)地土壤肥力的微生物制劑，其活性成分含有木霉(Trichodermasp.)CGMCCNo.2744和短芽孢桿菌(Brevibacillussp.)CGMCCNo.2747。該制劑與秸稈還田配合使用，可以增加土壤微生物數(shù)量，改善土壤結(jié)構(gòu)，提高占補(bǔ)地的土壤有機(jī)質(zhì)與氮素養(yǎng)分，迅速提高土壤肥力。文檔編號C05F11/08GK101412641SQ20081022619公開日2009年4月22日申請日期2008年11月17日優(yōu)先權(quán)日2008年11月17日發(fā)明者孫建光,晶徐,徐明崗申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與農(nóng)業(yè)區(qū)劃研究所