專利名稱：：生物肥料組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及土壤微生物學(xué)領(lǐng)域，以及能夠促進(jìn)并剌激植物生長而不影響環(huán)境的微生物生物肥料的新應(yīng)用。現(xiàn)有技術(shù)生物肥料被定義為基于通常在土壤中生活的微生物的產(chǎn)品。通過經(jīng)人工接種增加其群體，獲得的應(yīng)答是所述微生物增強了其生物學(xué)活性。因此，為植物提供增強其生長的重要營養(yǎng)素。此外，認(rèn)為微生物能夠為植物提供了對于其發(fā)育來說所必需的激素物質(zhì)(MartinezJ.S.等人，1985."ManualPrdcticodeMicrobiologia",Ed.PuebloyEducaci6n，Cuba)。已對這個主題進(jìn)行了幾項研究，特別是關(guān)于此后將會進(jìn)行分析的一組眾所周知的微生物推測對于根瘤菌屬(Rhizobium)細(xì)菌來說所固有的共生固氮作用是用于回收生態(tài)系統(tǒng)中的氮的最可行的方法之一。已推算出，每年以生物方式固定了1.75億噸的氮；其中70%去往土壤(BurityHA等人，1989.Estimationofnitrogenfixationandtransferfromalfalfatoassociatedgrassesinmixedswardsunderfieldconditions.PlantandSoil,114:249-255)。50%的這種固定來自根瘤結(jié)合，如由根瘤菌屬細(xì)菌所引起的那些(CarreraM等人，2004."Nodulaci6皿aturalenleguminosassilvestresdelEstadodeNuevoLe6n，，)。在下列情況時發(fā)生共生固氮作用細(xì)菌(根瘤菌屬細(xì)菌)識別其宿主，從而引起通過根毛和在皮層細(xì)胞基質(zhì)中的其感染，因此誘導(dǎo)加速的減數(shù)分裂和有絲分裂。這導(dǎo)致過度膨大的組織"根瘤(nodule)"，其是豆科植物根的典型結(jié)構(gòu)。在這個根瘤內(nèi)，根瘤菌屬細(xì)菌喪失其細(xì)胞壁并且變成類菌體，所述類菌體由于其固氮酶的作用而固定氮(N》，將其變成銨(Mg，后者被轉(zhuǎn)移至植物核糖體以用于蛋白質(zhì)合成。同時，通過光合作用，豆科植物將(A還原成碳水化合物，這將充當(dāng)用于根瘤菌屬細(xì)菌的碳源和能源，因此其在根瘤中保持活躍，從而覆蓋植物對氮的需要(BauerT，2001."MicroorganismosFijadoresdeNitr6geno:familiaRhizobiaceae.，，In:http://www.microbiologia.com.ar/suelo/rhizobium.html)。這構(gòu)成禾直凈勿禾口微生凈勿之間最精細(xì)禾口有效的聯(lián)合。這正是為何從那時起最廣泛地對其進(jìn)行研究的原因。固氮菌屬(Azotobacter)的細(xì)菌構(gòu)成了特殊的固氮微生物組。這是因為僅它們是單細(xì)胞的并且明顯能夠在需氧條件下固氮(AndressonAJ等人，1994."Efectodelainoculaci6nconAzotobacteryMVAenvitroplantasdejiame(Dioscoreaalata)，，.CultivosTropicales，15(3):66)。從歷史觀點來看，事實上固氮菌屬細(xì)菌是農(nóng)業(yè)中最廣泛使用的微生物。這種細(xì)菌的首次應(yīng)用可回溯至1902年，在40年代、50年代和60年代這些十年期間獲得了廣泛利用，特別是在東歐國家中(G謹(jǐn)6lezJ和LluchC.，1992."BiologiadelNitr6geno.Interacci6nPlanta-Microorganismo，，.Ed.Rueda，Madrid,Espafia)。3其他生物肥料微生物由來自假單胞菌屬(Pseudomonas)的各種菌株構(gòu)成，這些菌株有助于增強可同化的磷的利用率(LawrenceA.R.，2002.Biofertilizersforricecultivation.AgriculturalUniversitiesofIndia.In:http://www.hinduonnet.com/thehindu/seta/2002/04/04/stories/2002040400120400.htm)。相比于每一種分開地進(jìn)行接種而言，對黃瓜(Cucumissativus，L.)種子聯(lián)合施用下述三個細(xì)菌物種提供了更好的結(jié)果短小芽孢桿菌(BacilluspumilusMeyerandGotheil)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis(Ehrenberg)Cohn)和萎蔫短小桿菌(Curtobacteriumflaccumfaciens(Hedges)CollinsandJones)(RaupachGS禾口Klo印perJW.，1998.Mixturesofplantgrowth—promotingrhizobacteriaenhancebiologicalcontrolofmultiplecucumberpathogens.Phytopathology,88:1158-1164)。已報道了與固氮菌屬物種和蚯蚓腐殖質(zhì)相組合的菌根生成性真菌菌株對于咖啡幼苗(小果咖啡(Coffeeaarabica))的生長的正面效應(yīng)。束球囊霉(Glomusfasciculatum)和秘魯球囊霉(Glomuspeuti)與固氮菌屬細(xì)菌的組合被證明優(yōu)于對照處理(S6nchezC.等人，1994."Utilizaci6ndelasMicorrizasVAyAzotobactersp.enlaproducci6ndeposturasdeCoffeaarabicaL，，CultivosTropicales，15(3):69)。在培養(yǎng)番茄、葉用甜菜、萵苣、菜豆和蘿卜的同時，用球囊霉屬物種(Glomussp.)和固氮菌屬細(xì)菌對這些作物進(jìn)行接種所獲得的陽性結(jié)果確證了這種組合的功效，其明確顯示這兩種微生物以協(xié)同方式起作用(當(dāng)它們同時添加時)(TerryE.等人，2000."EfectividaddeAzotobacterchroococcumyHFMAendiferentescultivoshorticolasencondicionesdeorganop6nico，，.XIISeminarioCientifico，ProgramayResiimenes.LaHabana.INCA，117)。先前報道了微代謝冢村氏菌(Tsukamurellapaurometabola)菌株C-924的殺線蟲活性，其被作為生物殺線蟲劑而用于防控動物和植物的寄生蟲(MenaJ.等人，專利EP0774906B1)。線蟲的生物防治是在農(nóng)業(yè)中使用化學(xué)殺蟲劑的有效替代手段。這種生物殺線蟲劑的作用機制與脫硫酶和殼多糖酶活性對于線蟲及其卵的聯(lián)合效應(yīng)相關(guān)。迄今，除了源自其對線蟲的直接作用的那種外，還未知其他對于農(nóng)作物的有益影響。盡管化學(xué)肥料對于植物生長的快速影響是事實，但將這些肥料施用于土壤引起其他營養(yǎng)失調(diào)和不希望的并行的效應(yīng)。因為這一點，所以必須獲得新的生物肥料。它們旨在促進(jìn)植物的生長和發(fā)育，而不對環(huán)境或人類帶來不希望的有害后果。發(fā)明詳述本發(fā)明通過提供剌激植物的生長和物候?qū)W發(fā)育(phenologicaldevelopment)的生物肥料組合物而解決了上述問題，其特征在于，所述生物肥料組合物在合適的載體中包含至少一種微代謝冢村氏菌菌株、源自其的突變體或者源自所述菌株的代謝物。所述組合物增加土壤肥力，并且調(diào)節(jié)土壤以適于在其中所栽培的植物的更有利的發(fā)育。在本發(fā)明的一個實施方案中，本發(fā)明的生物肥料組合物包含微代謝冢村氏菌菌株C-924(MenaJ.等人，2003.BiotecnologiaAplicada20(4):248-252)，它正面地影響所栽培的各種植物種類的物候?qū)W(phenology)的能力得到了充分證實。因此，使用所獲得的結(jié)果，可以基于在土壤中或者在天然或人工基質(zhì)中使用具有農(nóng)業(yè)應(yīng)用的生物肥料試劑來建立用于剌激植物發(fā)育的方法，所述生物肥料試劑通過促進(jìn)氮和磷(其為與微代謝冢村氏菌菌株C-924的活性相關(guān)的元素)的同化來優(yōu)化植物對于有機物質(zhì)的利用。另外，消除或減少了向土壤中施用化學(xué)肥料。盡管化學(xué)肥料對于植物發(fā)育所發(fā)揮的即刻效應(yīng)，但它們引起其他營養(yǎng)失調(diào)和不希望的并行的效應(yīng)。微代謝冢村氏菌對于植物的生物剌激效應(yīng)通過產(chǎn)生氨(NH3)而產(chǎn)生，所述氨的產(chǎn)生與這種細(xì)菌在存在于土壤或支持植物的基質(zhì)中的有機物質(zhì)和氨基酸上，或者在以任何混合物(其與這種細(xì)菌同時或相組合地施用)形式添加的有機物質(zhì)和氨基酸上的生長相關(guān)。同時，這種微生物參與磷的溶解，從而將其從不能被植物同化變成能被植物同化。借助于具有1.0X107菌落形成單位(cfu)/ml至5.0X1012cfu/ml的細(xì)胞懸浮液或者借助于具有大約10fu/g組合物的濃縮粉末，來向土壤、對于有機基質(zhì)(天然或人工的)或者與有機物質(zhì)和/或氨基酸的載體相組合地施加微代謝冢村氏菌菌株C-924。與其他生物肥料和生物剌激劑相組合地或者獨立地施加的包含微代謝冢村氏菌菌株C_924(由有機物質(zhì)、氨基酸和其他有機載體所支持的)的組合物，以類似于或更優(yōu)于農(nóng)業(yè)中所使用的其他促進(jìn)植物生長的微生物的方式增強植物發(fā)育。因此，使用所獲得的結(jié)果，可以基于在土壤中或者在天然或人工基質(zhì)中使用具有農(nóng)業(yè)應(yīng)用的生物肥料試劑來建立用于剌激植物發(fā)育的方法，所述生物肥料試劑通過促進(jìn)氮和磷(其為與微代謝冢村氏菌菌株C-924的活性相關(guān)的元素)的同化來優(yōu)化植物對于有機物質(zhì)的利用。在本發(fā)明的一個實施方案中，在所述生物肥料組合物中所包含的代謝物可以以天然、重組或合成方式獲得。本發(fā)明的生物肥料組合物可以具有下列成分作為載體有機肥料、預(yù)包裝的土壤、種子覆土(seedcoverer)、粉末、?；?granulated)、霧化物(nebulized)、懸浮液或液體，或者以膠囊包封形式(encapsulatedform)的這些變化形式中的任一種。在本發(fā)明的一個實施方案中，所述微代謝冢村氏菌菌株在合適的載體中與其他生物肥料微生物例如枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、豌豆根瘤菌(Rhizobiumleguminosarum)、褐球固氮菌(Azotobacterchroococcum)、熒光假單胞菌(Pseudomonasfluorescens)、束球囊霉(Glomusfasciculaturn)禾口明球囊霉(Glomusclarum)，或源自所述生物體的突變體，以及通過天然、重組或合成方式獲自所述菌株的任何有效成分或代謝物相組合或混合。本發(fā)明的目的還在于用于用于剌激植物生長的方法，其特征在于，所述方法包括a)獲得生物肥料試劑，其包含微代謝冢村氏菌菌株的培養(yǎng)物或者通過天然、重組或合成方式而獲得的源自所述菌株的代謝物；和b)使土壤或者天然或人工基質(zhì)與有效量的所述生物肥料試劑或源自所述菌株的代謝物相接觸。在本發(fā)明的一個實施方案中，上文所描述的方法的特征在于，所述微代謝冢村氏菌菌株是菌株C-924。在水性懸浮液中的待施用于土壤或基質(zhì)的生物肥料試劑的有效量處于大約106-109cfU/毫升懸浮液的濃度，并且將所述生物肥料試劑至少一次施用在土壤中或者與基質(zhì)相混合。本發(fā)明的生物肥料試劑和用于剌激植物生長的方法對于下列植物是有效的目的是為了獲得用于人類的食物而使用的植物例如水果和蔬菜，以及為了飼喂動物而獲得的植物例如牧草、谷類等。它還可施用于觀賞植物。附圖簡述圖1。在5L生物反應(yīng)器中的培養(yǎng)微代謝冢村氏菌C-924的過程中氨形成的動力學(xué)。工作溫度為28"，和起始pH等于7.0;所采用的攪拌為500rpm。圖2。在前述條件下，積累的氨的濃度與5L生物反應(yīng)器中產(chǎn)生的生物量干重之間的相關(guān)性。實施例實施例1.由在5L生物反應(yīng)器中培養(yǎng)的微代謝冢村氏菌菌株C-924產(chǎn)生的氨。于2『C并且使用500rpm的攪拌速度，在5L生物反應(yīng)器中培養(yǎng)微代謝冢村氏菌菌株C-924。在發(fā)酵過程中在不同時間間隔(2、4、6、8、10、12和13小時)處獲取培養(yǎng)基樣品。使5mL每種樣品(一式三份)離心，并且通過0.2ym濾器進(jìn)行過濾。使所得的濾液經(jīng)歷通過奈斯勒試劑(Nessler'sReagent)方法的銨分析。關(guān)于分光光度測定，在PharmaciaBiotech分光光度計中，使用450nm的波長。在微代謝冢村氏菌菌株C-924的培養(yǎng)過程中的氨產(chǎn)生呈現(xiàn)在圖1中，所述圖1顯示了在5L生物反應(yīng)器中氨形成的動力學(xué)(直至培養(yǎng)14小時)。工作溫度為2『C，并且起始pH為7.0。應(yīng)當(dāng)指出，氨的生產(chǎn)與C-924生長相關(guān)，這證明了所述微生物在氨基酸底物存在下以組成性的方式進(jìn)行氧化脫氨的能力。結(jié)果，pH隨著時間而增加，達(dá)到接近9.0的值；以及直至934yg/ml的NH3濃度。因此，與其他微生物相比較，微代謝冢村氏菌菌株C-924可以被視為氨的高生產(chǎn)者(HoffmannT.，1998.AmmonificationinBacillussubtilisutilizingdissimilatorynitratereductaseisd印endentonresDE.JournalofBacteriology,第180巻，1:186-1895TakahasiN.，2000.MetabolicPathwaysforcytotoxicendproductformationfromglutemateand3sparteteconteiningpeptidesbyPorphyromonasgingiralis.JournalofBacteriology，第182巻，17:4704-4710)。應(yīng)當(dāng)通過作為培養(yǎng)基成分的氨基酸所經(jīng)歷的氧化脫氨過程來維持朋3的產(chǎn)生(Vanhooke幾等人，1999.PhenylalaninedehydrogenasefromRhodococcussp.M4:high—resolutionX_rayanalysisofinhibitoryternarycomplexesrevealkeyfeaturesintheoxidativedeaminationmechanism.Biochemistry,38:2326—2329;PaustianT.，2001.MicrobiologyWebbedOut.UniversityofWisconsin,Madison)。重要的是指出，借助于這個過程，氨基酸進(jìn)行脫氨，從而產(chǎn)生氨和碳?xì)埢?a-酮酸)，因為需要比可同化的氮更多的能量碳(energeticcarbon)，所以通常在培養(yǎng)基中發(fā)生氨的積累(SalleAJ，1966.Bacteriologia.Edici6nRevolucionaria，LaHabana，Cuba)。大概，這禾中機制適合于在由微代謝冢村氏菌菌株C-924所導(dǎo)致的氨積累過程中發(fā)生的那種。在圖2中顯示了在細(xì)胞外介質(zhì)中的氨水平和細(xì)胞濃度之間獲得的實驗相關(guān)性，所述細(xì)胞濃度表示為在5L生物反應(yīng)器中產(chǎn)生的生物量的干重。在這兩個變量之間存在線性相關(guān)，這表明了與微生物生長相關(guān)聯(lián)的NH3的產(chǎn)生，所述微生物生長的速度就生物量濃度而言是恒定的。實施例2.通過微代謝冢村氏菌菌株C-924的磷酸鹽的溶解。磷是對于植物發(fā)育來說最關(guān)鍵的營養(yǎng)物之一，但在大多數(shù)情況下，它在土壤中以不溶形式存在。高百分比的作為肥料施用于土壤的無機磷酸鹽在施用后快速固定，并且保6持不可被植物利用的形式。因此，釋放這些不溶形式的磷酸鹽對于增加土壤中這種元素的利用率將是重要的。為了實驗?zāi)康模瑢⒕闏-924接種在NBRIP培養(yǎng)基(NautiyalC.，1999.Anefficientmicrobiologicalgrowthmediumforscreeningphosphatesolubilizingmicroorganisms.FEMSMicrobiologyLetters170:265-270)中，所述NBRIP培養(yǎng)基可用于測定溶解磷酸鹽的微生物。將其在10天過程中于3(TC進(jìn)行溫育。經(jīng)過所有這些天后，出現(xiàn)了這種培養(yǎng)基所特征性的透明暈圈。已證明，在固體培養(yǎng)基中未顯示暈圈或產(chǎn)生非常小的暈圈的幾種分離物能夠在液體培養(yǎng)基中溶解不溶性磷酸鹽(LeyvalC.和BarthelinJ.，1999.Plantsoil,17:103-110)。為此，在液體培養(yǎng)基中進(jìn)行試驗。作為陽性對照，采用銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)ATCC25922。將所述兩種菌株分別接種在NBRIP液體培養(yǎng)基中，并且使它們于3(TC在180rpm振蕩下溫育5天。此外，使用無菌(未接種的)培養(yǎng)基，以便驗證該試驗。每24小時對樣品進(jìn)行分析。將每種樣品的培養(yǎng)物在3000rpm下離心25分鐘，并且用0.45ym濾器過濾上清液。對于每種情況，使用Fiske和Subbarow的方法(FiskeH和SubbarowY，1925.Thecolorimetricdeterminationofphosphorus.J.Biol.Chem.66:375-400)來領(lǐng)lj定可溶性磷酸鹽的濃度。數(shù)據(jù)顯示在表l中。盡管這兩種微生物均顯示出溶解磷酸鹽的能力，但微代謝冢村氏菌菌株C-924被證明是更有效的。表l.對于所研究的菌株，磷酸鹽溶解的測量的結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>實施例3.包含微代謝冢村氏菌C-924的生物肥料組合物對于大蕉(芭蕉屬物種(Musasp.)雜種，栽培種"Macho")植物的發(fā)育和生長的效應(yīng)。選擇"中等碳酸鹽化的松軟棕壤(Middling-CarbonatedSoftBrownSoil)，，(InstitutodeSuelos，1999."Nuevaclasificaci6ngen6ticadelossuelosdeCuba，，.MinisteriodelaAgricultura.EditorialAGRINFOR，Cuba)。所述土壤通過具有0.5cm(直徑)的孔的篩網(wǎng)進(jìn)行篩分以去除不希望的顆粒。向所述土壤施加5%的蚯蚓腐殖質(zhì)，以便使土壤的有機物質(zhì)含量提高至超過3%的不穩(wěn)定有機物質(zhì)和12%的總有機物質(zhì)。隨后，對頂部直徑為15cm和容量為1.0L的罐進(jìn)行充填，以在生物學(xué)活性實驗中使用。使用來自大蕉(芭蕉屬物種雜種，栽培種"Macho")體外組織培養(yǎng)的小植株(試管植物)，將其種植在所述罐中。對于下述處理中的每一種，使用10次重復(fù)1-對照LuriaBertani培養(yǎng)基(LB)+H20[以1/1000的濃度]，以50mL/罐進(jìn)行施用。2-枯草芽孢桿菌菌株F16/95[調(diào)整至1X107個芽孢/mL]，以50mL/罐進(jìn)行施用。3-微代謝冢村氏菌菌株C-924[調(diào)整至1X107cfu/mL]，以50mL/罐進(jìn)行施用。在實驗開始3個月后，對于下列參數(shù)進(jìn)行最終的評估以克表示的葉重量、以克表示的根重量和兩者的總和。實驗在半控制條件下在溫室中進(jìn)行。將方差分析(ANOVA)應(yīng)用于獲自這些重量的數(shù)據(jù)。為了找出其中存在有顯著差異(p<0.05)的處理，應(yīng)用Tukey's多范圍檢驗。此外，還應(yīng)用用于Windows的程序SYSTAT7.0以執(zhí)行統(tǒng)計學(xué)計算。在移植并應(yīng)用所述處理后3個月，結(jié)果如下表2.在10株植物中的測量的平均值重量(克)對照C-924F16/95根3.3b26.8a30a葉10.9b47.9a59.4a總計14.2b74.7a89.4a具有不同字母的平均值在內(nèi)部(對于每個測量)顯著不同，根據(jù)Tukey's多范圍檢驗，對于P《0.05。所使用的兩種微生物能夠造成大蕉植物生長的顯著增加。在用微代謝冢村氏菌菌株C-924和枯草芽孢桿菌菌株F16/95(用作陽性對照的細(xì)菌)進(jìn)行的處理之間生長不具有差異。枯草芽孢桿菌菌株F16/95已知為植物生長的促進(jìn)劑(McSpaddenBB和FravelDR，2002.BiologicalControlofPlantsPathogens:Research，Commercialization,andApplicationintheUSA.In:http://www.phcmexico.com.mx/apsnet_biological_control,html)。實施例4.微代謝冢村氏菌菌株C-924對于香蕉(芭蕉屬物種雜種，栽培種Cavendish)植物的生長和發(fā)育的效應(yīng)。選擇"中等碳酸鹽化的松軟棕壤(Middling-CarbonatedSoftBrownSoil)，，(InstitutodeSuelos，1999."Nuevaclasificaci6ngen6ticadelossuelosdeCuba，，.MinisteriodelaAgricultura.EditorialAGRINFOR，Cuba)。所述土壤通過具有0.5cm(直徑)的孔的篩網(wǎng)進(jìn)行篩分以去除不希望的顆粒。向所述土壤施加5%的蚯蚓腐殖質(zhì)，以便使土壤的有機物質(zhì)含量提高至超過3%的不穩(wěn)定(或可利用)有機物質(zhì)和12%的總有機物質(zhì)。隨后，對頂部直徑為15cm和容量為1.0L的罐進(jìn)行充填，以在生物學(xué)活性實驗中使用。使用種植在所述罐中的香蕉(芭蕉屬物種雜種，栽培種Cavendish)試管植物。對于下述處理中的每一種，使用10次重復(fù)81-對照LuriaBertani培養(yǎng)基(LB)+H20[以1/1000的濃度]，以50mL/罐進(jìn)行施用。2-枯草芽孢桿菌菌株F16/95[調(diào)整至1X107個芽孢/mL]，以50mL/罐進(jìn)行施用。3-微代謝冢村氏菌菌株C-924[調(diào)整至1X107cfu/mL]，以50mL/罐進(jìn)行施用。在實驗開始5個月后，對于下列參數(shù)進(jìn)行最終的評估以克表示的葉重量、以克表示的根重量和兩者的總和。實驗在半控制條件下在溫室中進(jìn)行。將方差分析(ANOVA)應(yīng)用于獲自這些重量的數(shù)據(jù)。為了找出其中存在有顯著差異(p<0.05)的處理，應(yīng)用Tukey's多范圍檢驗。此外，還應(yīng)用用于Windows的程序SYSTAT7.0以執(zhí)行統(tǒng)計學(xué)計算。在移植并應(yīng)用所述處理后5個月，結(jié)果如下表3.在10株植物中的測量的平均值<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>具有不同字母的平均值在內(nèi)部(對于每個測量)顯著不同，根據(jù)Tukey's多范圍檢驗，對于P《0.05。與在實施例3中一樣，所施用的所述兩種微生物引起香蕉植物生長的顯著增加。在用菌株C-924進(jìn)行的處理和用菌株F16/95(用作對照)進(jìn)行的處理之間沒有差異。實施例5.微代謝冢村氏菌菌株C-924對于大豆(Glycinemax)植物的生長和發(fā)育的效應(yīng)。選擇"鐵鋁性紅壤(FerralithicRedSoil)"(InstitutodeSuelos，1999."Nuevaclasificaci6ngen6ticadelossuelosdeCuba，，.MinisteriodelaAgricultura.EditorialAGRINFOR，Cuba)。所述土壤通過具有0.5cm(直徑)的孔的篩網(wǎng)進(jìn)行篩分以去除不希望的顆粒。這種土壤具有2.6%的不穩(wěn)定(或可利用)有機物質(zhì)和10.7%的總有機物質(zhì)的含量。隨后，對頂部直徑為15cm和容量為1.0L的罐進(jìn)行充填，以在生物學(xué)活性實驗中使用。使用發(fā)芽前的大豆種子。所述種子以每罐3粒的數(shù)目進(jìn)行播種。對于下述處理中的每一種，使用20個罐(各具有3株植物)1-對照:LuriaBertani培養(yǎng)基(LB)+H20[以1/1000的濃度]，以100mL/罐進(jìn)行施用。2-微代謝冢村氏菌菌株C-924[調(diào)整至1X106cfu/mL]，以lOOmL/罐進(jìn)行施用。在播種所述發(fā)芽前種子之前1天施加所述處理。然后，在播種它們后7天，對下列參數(shù)進(jìn)行定量根重量、莖重量、葉重量和植物重量(以克表示)。評估了來自10個罐的植物(總共30株)。實驗在半控制條件下在溫室中進(jìn)行。將方差分析(AN0VA，p《0.05)應(yīng)用于獲自這些重量的數(shù)據(jù)。應(yīng)用用于Windows的程序SYSTAT7.0以執(zhí)行統(tǒng)計學(xué)計算。在每種評估中鮮重的平均值(每株植物)的結(jié)果及其顯著性概括在表4中。表4.在30株植物中的測量的平均值<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>在植物生長7天后，對于其中使用菌株C-924的處理，在莖鮮重、葉鮮重和植物總重量的增加方面觀察到顯著差異。因此，作出下述結(jié)論用包含菌株C-924的組合物進(jìn)行的處理在剌激植物生長方面產(chǎn)生令人滿意的結(jié)果。實施例6.微代謝冢村氏菌菌株C-924對于幼苗條件下的番茄(西紅柿(LycopersiconesculentumMill.)變禾中FA-180)植物的生長的效應(yīng)。相應(yīng)地，采用適合幼苗發(fā)育的溫室。作為用于幼苗的基質(zhì)，使用蚯蚓腐殖質(zhì)(50%)、泥炭(25%)和沸石(25%)的混合物。在種植發(fā)芽前的種子之前3天，采用兩種對于基質(zhì)的處理a)以20mL/100kg基質(zhì)，用微代謝冢村氏菌菌株C-924的濃縮懸浮液(5.0X10"cfu/mL)進(jìn)行處理。使用手工噴灑泵，向其中添加10L水以幫助使細(xì)菌懸浮液分布均勻。b)對照處理，其中僅使用水。在播種的第22天時，當(dāng)小植株即將進(jìn)行移植時，測量每種處理的40株植物的高度。所述植物以IO株一組位于在隨機選擇的苗床的不同位置處。表5顯示了高度平均值/植物。在所述兩種處理中獲得的大小之間觀察到顯著差異(P《0.05，AN0VA)，并且察覺到菌株C-924的明確影響。對于在高有機物質(zhì)基質(zhì)上的番茄幼苗來說，所述菌株的增強效應(yīng)是重大的。表5.在40株植物中的測量的平均值<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>實施例7.在田間條件下，微代謝冢村氏菌菌株C-924對于番茄(西紅柿變種FA-180)植物的生長和其他物候?qū)W參數(shù)以及發(fā)育的效應(yīng)。使用具有"非碳酸鹽化的棕壤(NonCarbonatedBrownSoil)"(InstitutodeSuelos，1999."Nuevaclasificaci6ngen6ticadelossuelosdeCuba".MinisteriodelaAgricultura.EditorialAGRINFOR，Cuba)的溫室(0.09公頃的面積)。所述土壤具有X頃通過灌溉系統(tǒng)施加的微代謝冢村氏菌菌株C-924的濃縮懸浮液X頃通過灌溉系統(tǒng)施加的微代謝冢村氏菌菌株C-924的濃縮懸浮液3%的不穩(wěn)定有機物質(zhì)和12%的總有機物質(zhì)的含量。其后，將溫室分成16個地塊，在其中建立具有4種處理和相同數(shù)目的重復(fù)的實驗設(shè)計，具體如下用以10L/公(5.0X10"cfu/mL)進(jìn)行處理。這在移植前7天進(jìn)行。用以4L/公(5.0X10"cfu/mL)進(jìn)行處理。這在移植前7天進(jìn)行?；瘜W(xué)處理600kg/公頃的Basamid(棉隆)。對照(既無無化學(xué)處理也無生物學(xué)處理)。借助于與滴灌系統(tǒng)相連接的輔助泵來進(jìn)行使用菌株C-924的兩種處理，其中采用1L/平方米的總灌溉輸出，并且根據(jù)對于溫室中的灌溉而建立的參數(shù)(CasanovaA.，1999."Guiat6cnicaparalaproducci6nprotegidadehortalizasenCasasdeCultivotropicalconefectodesombrilla".MINAGRI，InstitutodeInvestigacionesHorticolas"LilianaDimitrova"，Cuba)。在移植后15天，進(jìn)行測量和計數(shù)(10株植物/地塊)，包括下列參數(shù)植物的高度(cm)。葉的數(shù)目/植物。*莖基部的厚度(mm)。*花序的數(shù)目/植物?；ǖ臄?shù)目/植物。表6顯示了結(jié)果的概括。事實上，明確確定了，高度、葉的數(shù)目和花的數(shù)目在用菌株C-924進(jìn)行的兩種處理(采用兩種不同的劑量)中顯著更佳。因此，這種生物肥料試劑的增強特性是不容置疑的。表6.在10株植物中的測量的平均值<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>具有不同字母的平均值(對于每種參數(shù)或測量)顯著不同，根據(jù)Tukey's檢驗(p《0.05)。實施例8.在云豆(菜豆(PhaseolusvulgarisL.))的培養(yǎng)中，微代謝冢村氏菌菌株C-924與豌豆根瘤菌的比較和相互作用。每種處理包括5次重復(fù)以及4株植物/重復(fù)。以在容量為1L的罐中3cm的深度，依照l粒種子/穴，4穴/罐，播種下種子。對于每個實驗單位(罐)，使用1.2kg的"碳酸鹽化的棕壤(CarbonatedBr謹(jǐn)Soil)"，具有3.74%的不穩(wěn)定有機物質(zhì)(總共14.2%)和19.14mgP205/100g土壤的可溶性磷(InstitutodeSuelos，1999."N譜aclasificaci6ngen6ticadelossuelosdeCuba，，.MinisteriodelaAgricultura.EditorialAGRINFOR，Cuba)。實驗在半控制條件下在溫室中進(jìn)行。處理如下l-無接種的對照。2-在播種之前7天和之后7天接種微代謝冢村氏菌菌株C_924。所施用的劑量為lOOmL/罐，具有1X109cfu/mL的濃度。3-接種與先前經(jīng)篩分的腐殖質(zhì)相混合的豌豆根瘤菌(具有在固溶體中2.5X108cfu/mL的濃度)。劑量為1kg生物肥料/45kg種子。4-處理2和3的組合。根據(jù)"InstitutodeSuelos"(Cuba)的農(nóng)用化學(xué)品建議，根據(jù)土壤的P205和&0含量對每個罐進(jìn)行必要的施肥。所使用的載體為尿素、三元過磷酸鈣(TripleSuperPhosphate,TSP)和氯化鉀(KCl)，分別用于氮、磷和鉀。在磷和鉀的情況下在播種前4天進(jìn)行施肥，而在尿素的情況下在發(fā)芽后15天施加。對于這種培養(yǎng)，以217kg/公頃的尿素、119.5kg/公頃的TSP和60kg/公頃的KCl進(jìn)行施肥。所評估的物候?qū)W變量是葉的數(shù)目(每7天)以及干重(MINAG，1988.Suelos.AndlisisQuimico."Determinaci6ndepesoseco，materiaorgdnicaylosindicesdelgradodeacidez"NRAG.892y878，Cuba)。通過ANOVA(簡單分類)對所述變量進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)評估。應(yīng)用Duncan's多重比較檢驗，以便比較所述處理的平均值。應(yīng)用統(tǒng)計包SPSS版本8.0(1997)。所述測量的結(jié)果概括在表7中。表7.在菜豆的培養(yǎng)中，對于所述物候?qū)W參數(shù)而言，施用所接種的菌株的結(jié)果處理葉的數(shù)目，36天干物質(zhì)(％)，43天對照7.(T5.91bC-92412.10a6.25ab豌豆根瘤菌10.60b6.57aC-924+豌豆根瘤菌10.10b6.62a具有不同字母的平均值在內(nèi)部(在每個測量中)顯著不同，根據(jù)Duncan's多范圍檢驗，對于P《0.05。關(guān)于葉的數(shù)目，在第36天時，通過施用微代謝冢村氏菌菌株C-924而獲得了最佳結(jié)果，存在有與其余處理的顯著差異。在使用兩種菌株的情況下，這個參數(shù)類似于使用豌豆根瘤菌進(jìn)行的處理，但是結(jié)果不同于對照。關(guān)于干物質(zhì)百分比，在聯(lián)合施用微代謝冢村氏菌菌株C-924和豌豆根瘤菌時觀察到更大的值。但是，從統(tǒng)計學(xué)上來說，所述聯(lián)合施用與其中施用所述生物肥料的處理和其中12無接種的對照并無不同。這個事實是由于土壤中存在有豌豆根瘤菌的天然菌株及其對于菜豆培養(yǎng)的生長的正面效應(yīng)。實施例9.在玉米(玉蜀黍(Zeamaiz))的培養(yǎng)中，微代謝冢村氏菌菌株C-924與褐球固氮菌和熒光假單胞菌的比較和相互作用。每種處理包括5次重復(fù)以及4株植物/重復(fù)。以在容量為1L的罐中3cm的深度，依照l粒種子/穴，4穴/罐，播種下種子。對于每個實驗單位(罐)，使用1.2kg的"碳酸鹽化的棕壤"，具有3.74%的不穩(wěn)定有機物質(zhì)(總共14.2%)和19.14mg&05/1008土壤的可溶性憐(InstitutodeSuelos，1999."Nuevaclasificaci6ngen6ticadelossuelosdeCuba，，.MinisteriodelaAgricultura.EditorialAGRINFOR，Cuba)。實驗在半控制條件下在溫室中進(jìn)行。處理如下1.無接種的對照。2.微代謝冢村氏菌菌株C-924:在播種之前7天和之后7天接種，根據(jù)在田間進(jìn)行施用。所施用的劑量為100mL/罐，具有IX109cfu/mL的濃度。3.與先前經(jīng)篩分的腐殖質(zhì)相混合的褐球固氮菌(具有在固溶體中4.5Xl(Tcfu/mL的濃度)。所使用的劑量為2kg/公頃。4.與先前經(jīng)篩分的腐殖質(zhì)相混合的熒光假單胞菌(具有在固溶體中2.7X1(Tcfu/mL的濃度)。所使用的劑量為2kg/公頃。5.處理2和3的組合。6.處理2和4的組合。根據(jù)"InstitutodeSuelos"(Cuba)的農(nóng)用化學(xué)品建議，根據(jù)土壤的&05和1(20含量對每個罐進(jìn)行必要的施肥。所使用的載體為尿素、三元過磷酸鈣(TSP)和氯化鉀(KC1)，分別用于氮、磷和鉀。在磷和鉀的情況下在播種前4天進(jìn)行施肥，而在尿素的情況下在發(fā)芽后15天施加。對于玉米的培養(yǎng)，以185kg/公頃的尿素、121kg/公頃的TSP和45kg/公頃的KC1進(jìn)行施肥。所評估的物候?qū)W變量是莖的直徑、植物的高度和葉的數(shù)目(每7天)，以及干重(MINAG，1988.Suelo.Anc5lisisQuimico."Determinaci6ndepesoseco，materiaorgc5nicaylosindicesdelgradodeacidez，，.NRAG.892y878，Cuba)。所述測量的結(jié)果概括在表8中。表8.在玉米的培養(yǎng)中，對于所述物候?qū)W參數(shù)和干物質(zhì)而言，施用所接種的菌株的結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>具有不同字母的平均值在內(nèi)部顯著不同，根據(jù)Duncan's多范圍檢驗，對于p《0.05。在其中單獨地或與其他生長促進(jìn)劑相組合地施用微代謝冢村氏菌菌株C-924的處理中，對于每一個所研究的物候?qū)W參數(shù)觀察到最佳值。關(guān)于葉的數(shù)目，施用單獨的C-924的結(jié)果以統(tǒng)計學(xué)上顯著的方式(Duncan's檢驗，p《0.05)優(yōu)于其余處理。在施用微代謝冢村氏菌菌株C-924的過程中在培養(yǎng)發(fā)育方面的最佳結(jié)果表明，另外的元素對于植物的生長作出了貢獻(xiàn)，這是由于在有機物質(zhì)降解過程中釋放出的氮化的化合物。關(guān)于玉米植物的干物質(zhì)百分比，在研究完成時，觀察到用一種或其他微生物接種的所有變化形式顯示出相似的值，但優(yōu)于無接種的對照。這證明了所研究的生物肥料在培養(yǎng)生長中的功效(Haggag.W.M，2002.SustainableAgricultureManagementofPlantDiseases.OnlineJournalofBiologicalScience,2:280-284)。實施例10.在萵苣(Lactucasativa)的培養(yǎng)中，微代謝冢村氏菌菌株C_924與叢枝菌根的相互作用。將"鐵酸鹽性紫紅壤(FerriticPurpleRedsoil)，，(InstitutodeSuelos，1999."Nuevaclasificaci6ngen6ticadelossuelosdeCuba，，.MinisteriodelaAgricultura.Ed:AGRINFOR，Cuba)用于這個實驗。所述土壤具有分配在容量為1L的罐中的2.9%的不穩(wěn)定有機物質(zhì)和11.8%的總有機物質(zhì)。采用萵苣變種BlackSimpson的發(fā)芽前的種子。以2X1012cfu/mL，以濃縮的可濕性粉末的形式使用菌株C_924。在種子播種前7天，使用濃度為3X107cfu/mL的水性懸浮液將其進(jìn)行接種。每日進(jìn)行適當(dāng)?shù)墓喔?，以便不超過土壤的濕度保留能力。叢枝菌根(AM)束球囊霉和明球囊霉事先在"InstitutoNacionaldeCienciasAgricolasdeCuba"配制。它們在播種時以200g/m2(20g/罐)的劑量進(jìn)行施用。采用具有4次重復(fù)(罐)的6種處理的實驗設(shè)計，所述重復(fù)中的每一次使用4株萵苣植物。所述植物在半控制條件下在溫室中維持30天。處理如下處理1:無接種的土壤(對照)。處理2:用C-924接種的土壤。處理3:用束球囊霉和C-924接種的土壤。14處理4:用束球囊霉接種的土壤。處理5:用明球囊霉和C-924接種的土壤。處理6:用明球囊霉接種的土壤。在播種30天后，測定在所有處理中每株植物的葉鮮重。結(jié)果概括在表9中。如果比較相應(yīng)于分開地施用每種AM、施用C-924以及施用相同AM和C_924的組合的處理，觀察到，在用所述組合進(jìn)行處理的植物中獲得了最佳結(jié)果。在這兩種情況下，微代謝冢村氏菌菌株C-924+明球囊霉的組合以及微代謝冢村氏菌菌株C-924+束球囊霉的組合在植物的葉重量的增加方面顯示出比其中分開地使用相同AM的處理優(yōu)異的結(jié)果。表9.在每種處理中萵苣植物的地上部分的重量平均值的比較<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>具有不同字母的平均值呈現(xiàn)出顯著的差異，p《0.05(Tukey)。實施例11.在溫室中培養(yǎng)的黃瓜(黃瓜變種Poinset)中微代謝冢村氏菌菌株C-924和束球囊霉之間的相容性試驗。準(zhǔn)備具有"非碳酸鹽化的棕壤"(InstitutodeSuelos，1999.Nuevaclasificaci6ngen6ticadelossuelosdeCuba.MinisteriodelaAgricultura.EditorialAGRINFOR，Cuba)的2個溫室。所述土壤具有3.1%的不穩(wěn)定有機物質(zhì)和12.3%的總有機物質(zhì)的含量。進(jìn)行采用相同大小的地塊(30m2)的實驗設(shè)計；以下述方式進(jìn)行具有4次重復(fù)的4種處理處理1:用束球囊霉和C-924接種的土壤。處理2:用束球囊霉接種的土壤。處理3:用C-924接種的土壤。處理4:無接種的土壤(對照)。在播種前7天以及在首次施用后以21天間隔的其他兩個時刻，根據(jù)實施例10中所采用的相等的劑量/m2，施用菌株C-924和AM。對于每種處理，對產(chǎn)量進(jìn)行評估，所述產(chǎn)量表示為在培養(yǎng)周期(98天)過程中收獲的商品果實的重量。結(jié)果顯示在表10中。相對于對照組而言，在用微代謝冢村氏菌菌株C-924進(jìn)行處理的植物以及用束球囊霉進(jìn)行處理的植物中，產(chǎn)生了果實重量的顯著增加。此外，聯(lián)合施用這兩種微生物導(dǎo)致相比于分開地施用所述微生物而言更大的果實重量。這個差異是統(tǒng)計學(xué)上顯著的。表10.在溫室中在聯(lián)合施加C-924和菌根生成性真菌束球囊霉的情況下產(chǎn)量的表現(xiàn)處理果實重量的平均值/地塊(kg)束球囊霉+C-924501.5a束球囊霉448.5b微代謝冢村氏菌菌株C-924443.0b對照303.5C具有不同字母的平均值呈現(xiàn)出顯著的差異，p《0.05(Tukey)。1權(quán)利要求用于刺激植物的生長和物候?qū)W發(fā)育的生物肥料組合物，其特征在于，所述生物肥料組合物在合適的載體中包含至少一種微代謝冢村氏菌(Tsukamurellapaurometabola)菌株、源自其的突變體或者源自所述菌株的代謝物。2.根據(jù)權(quán)利要求l的生物肥料組合物，其特征在于，所述微代謝冢村氏菌菌株是菌株C-924。3.根據(jù)權(quán)利要求2的生物肥料組合物，其特征在于，在所述組合物中微代謝冢村氏菌菌株C-924的有效量為109-1012菌落形成單位(cfu)/毫升或克培養(yǎng)基。4.根據(jù)權(quán)利要求1的生物肥料組合物，其特征在于，所述代謝物可以通過天然、重組或合成方式獲得。5.根據(jù)權(quán)利要求1的生物肥料組合物，其特征在于，所述載體為有機肥料、預(yù)包裝的土壤、種子覆土、粉末、粒化物、霧化物、懸浮液或液體，或者以膠囊包封形式的這些變化形式中的任一種。6.根據(jù)權(quán)利要求l的生物肥料組合物，其特征在于，所述微代謝冢村氏菌菌株在合適的載體中與其他生物肥料微生物例如枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、豌豆根瘤菌(Rhizobiumleguminosarum)、褐球固氮菌(Azotobacterchroococcum)、熒光假單胞菌(Pseudomonasfluorescens)、束5求囊霉(Glomusfasciculatum)禾口明5求囊霉(Glomusclarum)，或源自所述生物體的突變體，以及通過天然、重組或合成方式獲自所述菌株的任何有效成分或代謝物相組合或混合。7.用于剌激植物生長的方法，其特征在于，所述方法包括a)獲得生物肥料試劑，其包含微代謝冢村氏菌菌株的培養(yǎng)物或者通過天然、重組或合成方式而獲得的源自所述菌株的代謝物，b)使土壤或者天然或人工基質(zhì)與有效量的所述生物肥料試劑或源自所述菌株的代謝物相接觸。8.根據(jù)權(quán)利要求7的用于剌激植物生長的方法，其特征在于，所述微代謝冢村氏菌菌株是菌株C-924。9.根據(jù)權(quán)利要求7的用于剌激植物生長的方法，其特征在于，在水性懸浮液中的待施用于土壤或基質(zhì)的生物肥料試劑的有效量處于大約106-109cfU/毫升懸浮液的濃度。10.根據(jù)權(quán)利要求9的用于剌激植物生長的方法，其特征在于，將所述生物肥料試劑至少一次施用在土壤中或者與基質(zhì)相混合。全文摘要本發(fā)明涉及用于刺激植物發(fā)育的組合物，其包含至少一種微代謝冢村氏菌(Tsukamurel1apaurometabola)菌株，其是通過促進(jìn)氮和磷的同化來優(yōu)化植物對于有機物質(zhì)的利用的生物肥料試劑。當(dāng)直接施用于土壤或者包含有機物質(zhì)的天然或人工基質(zhì)中時，或者當(dāng)施用于包含有機補充物的任何類型的土壤或基質(zhì)中時，所述試劑能夠增加植物的生長和發(fā)育。文檔編號C05F11/00GK101720312SQ200880022812公開日2010年6月2日申請日期2008年4月29日優(yōu)先權(quán)日2007年4月30日發(fā)明者A·T·赫爾南德斯加西亞,C·G·博洛托諾德羅,E·皮芒泰爾巴斯克斯,I·桑切斯歐提斯,J·梅納坎普斯,M·加西亞西沃里奧,M·馬林布魯佐斯,S·岡薩雷斯布蘭克,Y·拉米雷斯努內(nèi)斯申請人:遺傳工程與生物技術(shù)中心