專利名稱：：產(chǎn)率相關(guān)性狀增強(qiáng)的植物及制備其的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明總體上涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，并且涉及通過在植物中調(diào)節(jié)編碼NITR(亞硝酸還原酶)的核酸的表達(dá)來(lái)改善多種植物生長(zhǎng)特征的方法。本發(fā)明也涉及具有調(diào)節(jié)的編碼NITR的核酸表達(dá)的植物，該植物相對(duì)于對(duì)應(yīng)的野生型植物或其他對(duì)照植物具有改良的生長(zhǎng)特征。此外，本發(fā)明還涉及通過在植物中調(diào)節(jié)編碼ASNS(天冬酰胺合成酶)的核酸表達(dá)來(lái)改善多種植物生長(zhǎng)特征的一種方法。本發(fā)明也涉及具有調(diào)節(jié)的編碼ASNS的核酸表達(dá)的植物，該植物相對(duì)于對(duì)應(yīng)的野生型植物或其他對(duì)照植物具有改良的生長(zhǎng)特征。本發(fā)明還提供在本發(fā)明方法中有用的構(gòu)建體。
背景技術(shù)：
：不斷增長(zhǎng)的世界人口和逐漸減少的農(nóng)業(yè)可用耕地助長(zhǎng)了提高農(nóng)業(yè)效率研究之勢(shì)。傳統(tǒng)的作物和園藝學(xué)改良方法利用選育技術(shù)來(lái)鑒定具有期望特性的植物。然而，此類選育技術(shù)有若干缺陷，即這些技術(shù)一般為勞動(dòng)密集型的，而且產(chǎn)生的植物通常含有異質(zhì)的遺傳組分，該異質(zhì)遺傳組分不一定總是導(dǎo)致期望性狀從親本植物發(fā)生傳遞。分子生物學(xué)的進(jìn)展已經(jīng)使人類能夠修飾動(dòng)物和植物的種質(zhì)。植物遺傳工程需要分離和操作遺傳物質(zhì)(一般為DNA或RNA的形式)以及隨后將遺傳物質(zhì)引入植物。這類技術(shù)能夠提供具多種改良的經(jīng)濟(jì)、農(nóng)業(yè)或園藝性狀的作物或植物。具有特別經(jīng)濟(jì)意義的一種性狀是增加的產(chǎn)率。產(chǎn)率通常定義為作物可測(cè)量經(jīng)濟(jì)價(jià)值的產(chǎn)出。這可以以數(shù)量和/或質(zhì)量的方式進(jìn)行定義。產(chǎn)率直接取決于若干因素，例如器官的數(shù)量和大小、植物構(gòu)造(例如，分枝的數(shù)量)、種子產(chǎn)量、葉子衰老等等。根的發(fā)育、營(yíng)養(yǎng)吸收、脅迫耐受性和早期活力也是決定產(chǎn)率的重要因素。因此優(yōu)化上述因素可以促進(jìn)作物產(chǎn)率的增加。種子產(chǎn)率是特別重要的性狀，這是因?yàn)樵S多植物的種子對(duì)于人類和動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)而言至關(guān)重要。諸如玉米、稻、小麥、蕓苔(canola)和大豆等作物占人類總卡路里攝取量的一半以上，不論是通過種子本身的直接消耗，還是通過由加工的種子所飼養(yǎng)的肉類產(chǎn)品的消耗。它們也是工業(yè)加工所用的糖類、油類和多類代謝物的來(lái)源。種子含有胚(新的枝條和根的來(lái)源)和胚乳(發(fā)芽和幼苗早期生長(zhǎng)過程中胚生長(zhǎng)的營(yíng)養(yǎng)源)。種子的發(fā)育涉及許多基因，并且需要代謝物自根、葉和莖轉(zhuǎn)移至正在生長(zhǎng)的種子。特別是胚乳，同化糖類、油類和蛋白質(zhì)的代謝前體，將其合成為貯存性高分子，以充盈籽粒。對(duì)于許多作物而言，另一重要的性狀是早期活力(earlyvigour)。改良早期活力是溫帶和熱帶稻類栽培種的現(xiàn)代稻類育種項(xiàng)目的重要目標(biāo)。長(zhǎng)根對(duì)于水栽稻的恰當(dāng)土壤錨固至關(guān)重要。在直接向澇地里播種稻米的情況下，以及在植物必須迅速穿過水出苗的情況下，較長(zhǎng)的枝條與活力有關(guān)。在進(jìn)行條播的情況下，較長(zhǎng)的中胚軸和胚芽鞘對(duì)于優(yōu)良的出苗至關(guān)重要。改造植物早期活力的能力在農(nóng)業(yè)上將具有極其重要的意義。例如，一直以來(lái)早期活力弱限制了在歐洲大西洋地區(qū)引入基于玉米帶種質(zhì)的玉米(玉蜀黍，ZeamaysL.)雜交種。5另一重要的性狀在于改良的非生物脅迫耐受性。非生物脅迫是全世界作物損失的主要原因，使大多數(shù)主要作物植物平均產(chǎn)率降低50%以上(Wang等，Planta(2003)218:1-14)。非生物脅迫可由干旱、鹽度、極端溫度、化學(xué)毒性及氧化脅迫引起。提高植物非生物脅迫耐受性的能力將對(duì)全世界農(nóng)場(chǎng)主帶來(lái)重大的經(jīng)濟(jì)利益，并將使人們能夠在不利條件下、在否則將不可能進(jìn)行作物栽培的地區(qū)進(jìn)行作物栽培。因此通過優(yōu)化上述因素之一可以增加作物產(chǎn)率。視最終用途而定，可能更優(yōu)先修飾某些產(chǎn)率性狀。例如，對(duì)于諸如飼料或木材生產(chǎn)或者生物燃料資源等應(yīng)用，可能期望植物營(yíng)養(yǎng)部分的增長(zhǎng)，而對(duì)于諸如面粉、淀粉或油料生產(chǎn)等應(yīng)用，可能特別期望種子參數(shù)的增長(zhǎng)。即便是在種子參數(shù)之中，視用途而定，一些參數(shù)也可能比另一些更優(yōu)先被修飾。多種機(jī)制可促成增加的種子產(chǎn)率，無(wú)論形式是增加的種子大小、還是增加的種子數(shù)量。增加植物產(chǎn)率(種子產(chǎn)率和/或生物量)的一種方法可以是通過修飾植物的內(nèi)在生長(zhǎng)機(jī)制，如細(xì)胞周期或者參與植物生長(zhǎng)或防御機(jī)制的多種信號(hào)傳遞路徑。令人驚訝地是，已發(fā)現(xiàn)調(diào)節(jié)NITR多肽或ASNS多肽編碼核酸的表達(dá)可以導(dǎo)致植物相對(duì)于對(duì)照植物具有增強(qiáng)的產(chǎn)率相關(guān)性狀。
發(fā)明內(nèi)容根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，提供了一種相對(duì)于對(duì)照植物改善植物產(chǎn)率相關(guān)性狀的方法，包括在植物中調(diào)節(jié)編碼NITR多肽的核酸的表達(dá)。改良的產(chǎn)率相關(guān)性狀包括增加的生物量、增加的早期活力及增加的種子產(chǎn)率中的一種或多種。根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方案，提供了一種相對(duì)于對(duì)照植物改善植物產(chǎn)率相關(guān)性狀的方法，包括在植物中調(diào)節(jié)編碼ASNS多肽的核酸的表達(dá)。改良的產(chǎn)率相關(guān)性狀包括增加的生物量、增加的早期活力及增加的種子產(chǎn)率中的一種或多種。定義多肽/g白質(zhì)術(shù)語(yǔ)"多肽"和"蛋白質(zhì)"在文中互換使用，是指通過肽鍵連接起來(lái)的、任意長(zhǎng)度的氨基酸多聚體。多核苷酸/核酸/核酸序列/核苷酸序列術(shù)語(yǔ)"多核苷酸"、"核酸序列"、"核苷酸序列"、"核酸"、"核酸分子"在文中互換使用，是指任何長(zhǎng)度的無(wú)支鏈形式的多聚核苷酸，所述核苷酸或者為核糖核苷酸或者為脫氧核糖核苷酸或者為兩者的組合。對(duì)照植物選擇合適的對(duì)照植物是實(shí)驗(yàn)設(shè)置的常規(guī)部分，并且可以包括相應(yīng)的野生型植物或不含目的基因的相應(yīng)植物。對(duì)照植物通常與待評(píng)估植物為相同的植物物種，或者甚至為同一品種。對(duì)照植物還可以是待評(píng)估植物的無(wú)效合子(皿llizygote)。無(wú)效合子是由于分離而丟掉轉(zhuǎn)基因的個(gè)體。如本文所用的"對(duì)照植物"不僅指完整植物，而且指植物部分，包括種子和種子部分。同源物蛋白質(zhì)的"同源物"包括肽、寡肽、多肽、蛋白質(zhì)和酶，其相對(duì)于所討論的未修飾蛋白質(zhì)具有氨基酸取代、缺失和/或插入，并且具有與其源自的該未修飾蛋白質(zhì)相似的生物活性和功能活性。缺失是指從蛋白質(zhì)中除去一個(gè)或多個(gè)氨基酸。插入是指在蛋白質(zhì)的預(yù)定位置引入一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基。插入可以包括單個(gè)或多個(gè)氨基酸的N-末端和/或C-末端融合以及序列內(nèi)插入。一般氨基酸序列內(nèi)部的插入將小于N-或C-末端的融合，數(shù)量級(jí)約1到10個(gè)殘基。N-或C-末端融合蛋白質(zhì)或肽的實(shí)例包括如在酵母雙雜交系統(tǒng)中應(yīng)用的轉(zhuǎn)錄激活因子的結(jié)合結(jié)構(gòu)域或激活結(jié)構(gòu)域、噬菌體外殼蛋白、(組氨酸)_6-標(biāo)簽、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶標(biāo)簽、蛋白質(zhì)A、麥芽糖結(jié)合蛋白、二氫葉酸還原酶、Tag100表位、c-myc表位、FIAG⑧表位、lacZ、CMP(鈣調(diào)蛋白結(jié)合肽)、HA表位、蛋白質(zhì)C表位和VSV表位。取代是指蛋白質(zhì)中的氨基酸用具有相似性質(zhì)(如相似的疏水性、親水性、抗原性、形成或打破a螺旋結(jié)構(gòu)或13片層結(jié)構(gòu)的傾向性)的其他氨基酸替換。氨基酸取代通常是單個(gè)殘基的取代，但是視施加于多肽上的功能性限制而定也可以發(fā)生成簇取代；取代通常在大約1到10個(gè)氨基酸殘基數(shù)量級(jí)。氨基酸取代優(yōu)選為保守氨基酸取代。保守取代表在本領(lǐng)域眾所周知(參見例如Creighton(1984)Proteins.W.H.FreemanandCompany(編輯)和下表1)。表1:保守氨基酸取代的實(shí)例殘基保守取代殘基保守取代AlaSerLeulie;ValArgLysLysArg;GlnAsnGin;HisMetLeu;IleAspGluPheMet山eusTyrGinAsnSerThr;GlyCysSerThrSer;ValGluAspTrpTyrGlyProTyrTrpsPheHisAsn;GlnVallie山eulieLeu;Val可通過本領(lǐng)域眾所周知的肽合成技術(shù)，如固相肽合成法等，或通過重組DNA操作，容易地進(jìn)行氨基酸取代、缺失和/或插入。用于產(chǎn)生蛋白質(zhì)的取代、插入或缺失變體的DNA7序列操作方法是本領(lǐng)域眾所周知的。例如，本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知在DNA預(yù)定位置進(jìn)行取代突變的技術(shù)，包括M13誘變、T7-Gen體外誘變(USB，Cleveland,OH)、QuickChange定點(diǎn)誘變(Stratagene，SanDiego，CA)、PCR介導(dǎo)的定點(diǎn)誘變或其他定點(diǎn)誘變方案。衍牛物"衍生物"包括肽、寡肽、多肽，與蛋白質(zhì)(如目的蛋白質(zhì))的天然形式的氨基酸序列相比，其可以包括用非天然產(chǎn)生的氨基酸殘基進(jìn)行的氨基酸取代、或者添加非天然產(chǎn)生的氨基酸殘基。蛋白質(zhì)的"衍生物"還包括肽、寡肽、多肽，與天然多肽的氨基酸序列相比，其可以包括天然改變的(糖基化、?；?、異戊二烯化、磷酸化、豆蔻酰化、硫酸化等)或非天然改變的氨基酸殘基。衍生物與其源自的氨基酸序列相比，還可以包括一個(gè)或多個(gè)非氨基酸替代或添加，例如共價(jià)或非共價(jià)地結(jié)合于氨基酸序列的報(bào)告分子或其他配體，如與之結(jié)合有利于衍生物檢測(cè)的報(bào)告分子，以及相對(duì)于天然蛋白質(zhì)的氨基酸序列而言非天然產(chǎn)生的氨基酸殘基。此外，"衍生物"還包括天然產(chǎn)生形式的蛋白質(zhì)與標(biāo)簽肽如FLAG、HIS6或硫氧還蛋白的融合物(關(guān)于標(biāo)簽肽的綜述，請(qǐng)參見Terpe，A卯l.Microbiol.Biotechnol.60，523-533,2003)。胃細(xì)垂/絲,凈勿直系同源物和旁系同源物涵蓋用于描述基因祖先關(guān)系的進(jìn)化概念。旁系同源物為相同物種內(nèi)的基因，其源自于祖先基因的復(fù)制；而直系同源物為來(lái)自不同生物體的基因，其起源于物種形成，并且也源自于共同的祖先基因。結(jié)構(gòu)域術(shù)語(yǔ)"結(jié)構(gòu)域"是指在進(jìn)化相關(guān)蛋白質(zhì)序列的比對(duì)中，在特定位置上保守的一組氨基酸。盡管其他位置上的氨基酸可能因同源物不同而改變，但是在特定位置上高度保守的氨基酸則意味著對(duì)于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、穩(wěn)定性或功能而言很可能是必不可少的氨基酸。"結(jié)構(gòu)域"因其在所比對(duì)的家族蛋白質(zhì)同源物序列中高度保守而得以鑒定，能夠用作為標(biāo)識(shí)符以確定任何所討論的多肽是否屬于先前鑒定到的多肽家族。某序/共有序列/標(biāo)簽序列術(shù)語(yǔ)"基序"或"共有序列"或"標(biāo)簽序列"(signature)是指進(jìn)化相關(guān)蛋白質(zhì)序列中短的保守區(qū)域?；虺３Ｊ歉叨缺Ｊ氐慕Y(jié)構(gòu)域部分，但也可能僅僅包括部分結(jié)構(gòu)域，或者位于保守結(jié)構(gòu)域之外(若基序的所有氨基酸都落在所定義的結(jié)構(gòu)域之外的話)。!^;本文定義的術(shù)語(yǔ)"雜交"指其中基本同源互補(bǔ)的核苷酸序列彼此退火的過程。雜交過程能夠完全在溶液中發(fā)生，即互補(bǔ)的兩核酸都處在溶液中。雜交過程也能夠這樣進(jìn)行，即互補(bǔ)核酸之一固定于基質(zhì)上，如磁珠、瓊脂糖珠或任何其它樹脂上。此外，雜交過程也能夠這樣進(jìn)行，即其中互補(bǔ)核酸之一固定在固相支持物如硝酸纖維素或尼龍膜上，或者通過例如照相平板印刷術(shù)固定在例如硅質(zhì)玻璃支持物上(后者稱為核酸陣列或微陣列，或稱為核酸芯片)。為了使雜交發(fā)生，通常使核酸分子熱變性或化學(xué)變性，以使雙鏈解鏈成兩條單鏈，和/或除去單鏈核酸中的發(fā)夾結(jié)構(gòu)或其它二級(jí)結(jié)構(gòu)。術(shù)語(yǔ)"嚴(yán)格性"是指發(fā)生雜交的條件。雜交的嚴(yán)格性受諸如溫度、鹽濃度、離子強(qiáng)度和雜交緩沖液組成等條件的影響。通常，對(duì)于特定序列而言，在確定的離子強(qiáng)度和PH值下，低嚴(yán)格條件選擇為比熱解鏈溫度(TJ低大約3(TC。中等嚴(yán)格條件為溫度比Tm低2(TC，而高嚴(yán)格條件為溫度比Tm低l(TC。高嚴(yán)格雜交條件通常用于分離與靶核酸序列具有高序列相似性的雜交序列。不過，由于遺傳密碼的簡(jiǎn)并性，核酸可以在序列上有偏差而依然編碼基本上相同的多肽。因此有時(shí)可能需要中等嚴(yán)格雜交條件來(lái)鑒定這樣的核酸分子。Tm是在確定的離子強(qiáng)度和pH值下，50X的靶序列與完全匹配的探針雜交的溫度。Tm取決于溶液條件和探針的堿基組成及長(zhǎng)度。例如，較長(zhǎng)的序列在較高溫度下特異性雜交。在低于Tm值大約16t:到32t:獲得最大雜交速率。在雜交溶液中存在一價(jià)陽(yáng)離子會(huì)減少兩核酸鏈之間的靜電排斥作用，從而促進(jìn)雜交體形成；當(dāng)鈉濃度高達(dá)0.4M時(shí)，這一作用可見(對(duì)于更高的濃度，此效應(yīng)可以忽略不計(jì))。每個(gè)百分點(diǎn)的甲酰胺可使DNA-DNA和DNA-RNA雙鏈體的解鏈溫度降低0.6到0.7t:，加入50%甲酰胺能夠使雜交在30到45t:完成，盡管這將降低雜交速率。堿基對(duì)錯(cuò)配降低雜交速率和雙鏈體的熱穩(wěn)定性。平均而言，對(duì)于大的探針，每個(gè)百分點(diǎn)堿基錯(cuò)配使Tm值下降約TC。依賴于雜交體類型，Tm值可以利用下列公式計(jì)算l)DNA-DNA雜交體(Meinkoth和Wahl，Anal.Biochem.，138:267-284，1984):Tm=81.5°C+16.6Xlog10[Na+]a+0.41X%[G/Cb]_500X[Lc]—丄-0.61X%甲酰胺2)DNA-RNA或RNA-RNA雜交體Tm=79.8+18.5(log10[Na+]a)+0.58(%G/Cb)+ll.8(%G/Cb)2—820/Lc3)寡DNA或寡RNAd雜交體<20個(gè)核苷酸Tm=2(ln)20-35個(gè)核苷酸Tm=22+1.46(ln)a或?qū)τ谄渌粌r(jià)陽(yáng)離子，但是僅在0.01-0.4M范圍內(nèi)精確。b僅對(duì)于在30%到75%范圍內(nèi)的％GC精確。eL=雙鏈體的堿基對(duì)長(zhǎng)度。d寡，寡核苷酸；ln，=引物的有效長(zhǎng)度=2X(G/C數(shù))+(A/T數(shù))。非特異性結(jié)合可以通過許多已知技術(shù)中的任一來(lái)控制，例如用含蛋白質(zhì)的溶液封閉膜，在雜交緩沖液中添加異源RNA、DNA和SDS，以及用RNA酶處理。對(duì)于非同源探針，可以通過改變?nèi)缦聴l件之一來(lái)進(jìn)行系列雜交(i)逐漸降低退火溫度(例如從6『C降至42t:)，或(ii)逐漸降低甲酰胺濃度(例如從50%降至0%)。熟練技術(shù)人員知曉可以在雜交過程中改變的多種參數(shù)，從而保持或者改變嚴(yán)格條件。除雜交條件外，雜交特異性通常還是雜交后洗滌的函數(shù)。為了除去非特異雜交產(chǎn)生的背景，用稀釋的鹽溶液洗滌樣品。這類洗滌的關(guān)鍵因素包括最終洗滌溶液的離子強(qiáng)度和溫度鹽濃度越低、洗滌溫度越高，洗滌的嚴(yán)格性就越高。洗滌條件通常在等于或低于雜交嚴(yán)格性的條件下進(jìn)行。陽(yáng)性雜交給出至少為背景兩倍的信號(hào)。一般按如上來(lái)設(shè)置適用于核酸雜交試驗(yàn)或基因擴(kuò)增檢測(cè)操作的適宜嚴(yán)格條件。也可以選擇更高或更低的嚴(yán)格條件。熟練技術(shù)人員知曉可以在洗滌過程中改變的多種參數(shù)，從而保持或者改變嚴(yán)格條件。例如，長(zhǎng)于50個(gè)核苷酸的DNA雜交體的典型的高嚴(yán)格雜交條件包括在1XSSC中于65t:雜交或者在1XSSC和50%甲酰胺中于42t:雜交，接著在0.3XSSC中于65t:洗滌。長(zhǎng)于50個(gè)核苷酸的DNA雜交體的中等嚴(yán)格雜交條件的實(shí)例包括在4XSSC中于5(TC雜交或者在6XSSC和50%甲酰胺中于4(TC雜交，接著在2XSSC中于5(TC洗滌。雜交體的長(zhǎng)度是針對(duì)雜交核酸預(yù)期的長(zhǎng)度。當(dāng)已知序列的核酸進(jìn)行雜交時(shí)，雜交體的長(zhǎng)度可以通過比對(duì)序9列并鑒定本文所述的保守區(qū)域進(jìn)行確定。IXSSC是O.15MNaCl和15mM檸檬酸鈉；雜交溶液和洗滌溶液可以另外地包括5XDenhardt's試劑、0.5_1.0%SDS、100yg/ml片段化的變性鮭精DNA、0.5%焦磷酸鈉。為了定義嚴(yán)格性水平，可以參考Sambrook等(2001)的《分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》，第三版，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版，冷泉港，紐約，或者CurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWiley&Sons,N.Y.(1989及年度更新資料)。煎接變體本文所用的術(shù)語(yǔ)"剪接變體"包括這樣的核酸序列變體，其中選擇的內(nèi)含子和/或外顯子已被切除、替換、置換或添加，或者其中內(nèi)含子已被縮短或增長(zhǎng)。這樣的變體基本上保持了蛋白質(zhì)的生物活性；這可以通過選擇性地保留蛋白質(zhì)的功能性區(qū)段來(lái)實(shí)現(xiàn)。這樣的剪接變體可以是天然的或人工的。預(yù)測(cè)和分離這類剪接變體的方法是本領(lǐng)域眾所周知的(參見例如Foissac禾PSchiex(2005)BMCBioinformatics6:25)。等位某因變體等位基因或等位基因變體為處于相同的染色體位置上的給定基因的可選形式。等位基因變體包括單核苷酸多態(tài)性(SNP)，以及小的插入/缺失多態(tài)性(INDEL)。INDEL的大小通常小于100bp。SNP和INDEL在大多數(shù)生物體的天然存在的多態(tài)性品系中形成最大的一組序列變體。基因改組/定向進(jìn)化基因改組或定向進(jìn)化為重復(fù)DNA改組，繼之適當(dāng)篩選和/或選擇，以產(chǎn)生編碼具有修飾生物活性的蛋白質(zhì)的核酸變體或其部分(Castle等(2004)Science304(5674):1151-4;美國(guó)專利5，811，238和6，395，547)。i周控元件/控制序列/啟動(dòng)子術(shù)語(yǔ)"調(diào)控元件"、"控制序列"和"啟動(dòng)子"在文中均可互換使用，按廣義來(lái)理解，指能夠?qū)崿F(xiàn)與之相連的序列表達(dá)的調(diào)控核酸序列。術(shù)語(yǔ)"啟動(dòng)子"通常是指位于基因轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)上游的核酸控制序列，其參與RNA聚合酶和其他蛋白質(zhì)的識(shí)別和結(jié)合，由此指導(dǎo)有效連接的核酸進(jìn)行轉(zhuǎn)錄。上述術(shù)語(yǔ)包括源自經(jīng)典真核生物基因組基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列(包括精確轉(zhuǎn)錄起始所必需的TATA盒，以及具有或沒有CCAAT盒序列)，以及另外的調(diào)控元件(即上游激活序列、增強(qiáng)子和沉默子)，它們通過應(yīng)答發(fā)育剌激和/或外部剌激或以組織特異的方式改變基因表達(dá)。所述術(shù)語(yǔ)還包括經(jīng)典原核生物基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列，在此情況下其可以包括-35盒序列和/或-10盒轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列。術(shù)語(yǔ)"調(diào)控元件"也包括合成的融合分子或衍生物，其賦予、激活或增強(qiáng)細(xì)胞、組織或器官中核酸分子的表達(dá)。"植物啟動(dòng)子"包含能夠介導(dǎo)編碼序列區(qū)段在植物細(xì)胞中表達(dá)的調(diào)控元件。從而，植物啟動(dòng)子無(wú)需為植物來(lái)源的，而是可以來(lái)源于病毒或微生物，例如，來(lái)源于攻擊植物細(xì)胞的病毒。"植物啟動(dòng)子"也可以來(lái)源于植物細(xì)胞，例如，來(lái)源于待被欲在本發(fā)明方法中表達(dá)的以及本文所述的核酸序列轉(zhuǎn)化的植物。這對(duì)于其他"植物"調(diào)控信號(hào)同樣適用，例如"植物"終止子的情況。位于可用于本發(fā)明方法的核苷酸序列上游的啟動(dòng)子可以通過一個(gè)或多個(gè)核苷酸取代、插入和/或缺失進(jìn)行修飾，而不會(huì)干擾啟動(dòng)子、開放讀框(0RF)或者3'調(diào)控區(qū)如終止子或遠(yuǎn)離0RF的其他3'調(diào)控區(qū)的功能或活性。此外還有可能通過修飾啟動(dòng)子的序列而增強(qiáng)其活性，或者將其完全替換為活性更強(qiáng)的啟動(dòng)子、甚至是來(lái)自異源生物體的啟動(dòng)子。為在植物中表達(dá)，核酸分子必須如上文所述的那樣，有效連接于或者包含適宜的啟動(dòng)子，其中所述啟動(dòng)子將在正確的時(shí)間點(diǎn)以所需的空間表達(dá)模式表達(dá)所述基因。為鑒定功能上等同的啟動(dòng)子，可以例如通過將啟動(dòng)子與報(bào)告基因有效連接、測(cè)定所述報(bào)告基因在植物多種組織中的表達(dá)水平和模式，來(lái)分析候選啟動(dòng)子的啟動(dòng)子強(qiáng)度和/或表達(dá)模式。眾所周知的適宜報(bào)告基因包括例如e-葡糖醛酸糖苷酶或P-半乳糖苷酶。通過測(cè)量e-葡糖醛酸糖苷酶或P-半乳糖苷酶的酶活性可以確定啟動(dòng)子活性。然后可以將該啟動(dòng)子強(qiáng)度和/或表達(dá)模式與參照啟動(dòng)子(如本發(fā)明方法中所用的啟動(dòng)子)相比較?？蛇x地，可以利用本領(lǐng)域公知的方法，如Northern印跡(RNA分析)結(jié)合放射自顯影圖的光密度測(cè)量分析、定量實(shí)時(shí)PCR或RT-PCR(Heid等，1996GenomeMethods6:986-994)，通過定量mRNA水平或者將本發(fā)明方法所用核酸的mRNA水平與持家基因如18SrRNA的mRNA水平進(jìn)行比較，來(lái)測(cè)定啟動(dòng)子強(qiáng)度。通常，"弱啟動(dòng)子"旨在表示驅(qū)動(dòng)編碼序列低水平表達(dá)的啟動(dòng)子。"低水平"旨在表示每個(gè)細(xì)胞大約1/10，000個(gè)轉(zhuǎn)錄物到大約1/100，000個(gè)轉(zhuǎn)錄物、到大約1/500，0000個(gè)轉(zhuǎn)錄物的水平。相反，"強(qiáng)啟動(dòng)子"驅(qū)動(dòng)編碼序列高水平表達(dá)，或者說(shuō)以每個(gè)細(xì)胞大約1/10個(gè)轉(zhuǎn)錄物到大約1/100個(gè)轉(zhuǎn)錄物、到大約1/1000個(gè)轉(zhuǎn)錄物的水平表達(dá)。通常，"中等強(qiáng)度啟動(dòng)子"旨在表示與強(qiáng)啟動(dòng)子相比驅(qū)動(dòng)編碼序列以較低的水平表達(dá)的啟動(dòng)子，特別地，所述水平在所有情況下均低于35SCaMV啟動(dòng)子控制下獲得的表達(dá)水平。有效連接本文所用的術(shù)語(yǔ)"有效連接"是指啟動(dòng)子序列和目的基因之間的功能性連接，從而啟動(dòng)子序列能夠起始目的基因的轉(zhuǎn)錄。組成型啟動(dòng)子"組成型啟動(dòng)子"是指在生長(zhǎng)和發(fā)育的大多數(shù)但不必是所有階段，并且在大多數(shù)環(huán)境條件下在至少一種細(xì)胞、組織或器官中轉(zhuǎn)錄激活的啟動(dòng)子。下表2a給出了組成型啟動(dòng)子的實(shí)例。表2a:組成型啟動(dòng)子的實(shí)例<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>基因來(lái)源參考文獻(xiàn)稻親環(huán)蛋白Buchholz等，PlantMolBiol.25(5):837-43，1994玉米H3組蛋白L印etit等，Mol.Gen.Genet.231:276-285，1992苜蓿H3組蛋白Wu等，PlantMol.Biol.11:641-649，1988肌動(dòng)蛋白2An等，PlantJ.10(1);107-121,199634SFMVSanger等，Plant.Mol.Biol.，14，1990:433-443核酮糖二磷酸羧化/加氧酶小亞基US4，962，028ocsLeisner(1988)ProcNatlAcadSciUSA85(5):2553SAD1Jain等，CropScience，39(6)，1999:1696SAD2Jain等，CropScience,39(6)，1999:1696NosShaw等(1984)NucleicAcidsRes.12(20):7831-7846V-ATPaseW001/14572Super啟動(dòng)子W095/14098G-盒蛋白質(zhì)W094/12015遍在啟動(dòng)子遍在啟動(dòng)子在生物體的基本上所有組織或細(xì)胞中都有活性。發(fā)育i周控型啟動(dòng)子發(fā)育調(diào)控型啟動(dòng)子在某些發(fā)育階段或在經(jīng)歷發(fā)育改變的植物部分中有活性。i秀導(dǎo)型啟動(dòng)子誘導(dǎo)型啟動(dòng)子將響應(yīng)于化學(xué)(有關(guān)綜述請(qǐng)參見Gatz1997，An皿.Rev.PlantPhysiol.PlantMol.Biol.，48:89-108)、環(huán)境或物理剌激而具有誘導(dǎo)的或增加的轉(zhuǎn)錄起始；或者可以是"脅迫誘導(dǎo)型"，即在植物接觸各種脅迫條件時(shí)激活；或者是"病原體誘導(dǎo)型"，即在植物接觸各種病原體時(shí)激活。器官特異件/飽鄰特異件啟動(dòng)子器官特異性或組織特異性的啟動(dòng)子是能夠在某些器官或組織，如在葉、根、種子等12組織中優(yōu)先起始轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子。例如，"根特異性啟動(dòng)子"是主要在植物根中被轉(zhuǎn)錄激活的啟動(dòng)子，基本上排除了在任何其他植物部分的激活，但仍允許在這些其他植物部分中的任何滲漏表達(dá)。能夠僅在某些細(xì)胞中起始轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子在文中稱為"細(xì)胞特異性"啟動(dòng)子。下表2b給出了根特異性啟動(dòng)子的實(shí)例。表2b:根特異性啟動(dòng)子的實(shí)例<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>種子特異性啟動(dòng)子主要在種子組織中，但不必僅在種子組織中(滲漏表達(dá)的情況)轉(zhuǎn)錄激活。種子特異性啟動(dòng)可以在種子發(fā)育和/或發(fā)芽期間激活。下表2c至表2f給出了種子特異性啟動(dòng)子的實(shí)例。更多的種子特異性啟動(dòng)子實(shí)例可參見QingQu和Takaiwa(PlantBiotechnol.J.2，113-125，2004)，其中揭示的內(nèi)容在此納入本文作為參考就如同陳述了其全部?jī)?nèi)容那樣。表2。種子特異性啟動(dòng)子的實(shí)例<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>基因來(lái)源參考文獻(xiàn)小麥LMW和HMW麥谷蛋白-1MolGenGenet216:81-90，1989;NAR17:461-2，1989小麥SPAAlbani等，PlantCe11，9:171-184，1997小麥a，13，Y_麥醇溶蛋白EMBOJ.3:1409-15，1984大麥Itrl啟動(dòng)子Diaz等(1995)MolGenGenet248(5):592-8大麥Bl，C，D，大麥醇溶蛋白TheorApplGen98:1253-62,1999;PlantJ4:343-55，1993;MolGenGenet250:750-60,1996大麥DOFMena等，ThePlantJournal,116(1):53-62，1998blz2EP99106056.7合成啟動(dòng)子Vicente-Carbajosa等，PlantJ.13:629-640，1998.稻的谷醇溶蛋白NRP33Wu等，PlantCellPhysiology39(8)885-889，1998稻a-球蛋白Glb-1Wu等，PlantCellPhysiology39(8)885-889，1998稻OSHlSato等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，93:8117-8122，1996稻a-球蛋白R(shí)EB/OHP-1Nakase等PlantMol.Biol.33:513-522，1997稻ADP-葡萄糖焦磷酸化酶TransRes6:157-68，1997玉米ESR基因家族PlantJ12:235-46，1997高粱a-高粱醇溶蛋白DeRose等，PlantMol.Biol32:1029-35，1996Postma-Haarsma等，PlantMol.Biol.39:257-71，199915<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>基因來(lái)源參考文獻(xiàn)谷蛋白(稻)Takaiwa等(1986)MolGenGenet208:15-22;Takaiwa等(1987)卿SLetts.221:43-47玉米醇溶蛋白Matzke等，(1990)PlantMolBio114(3):323-32小麥LMW和H麗麥谷蛋白-1Colot等(1989)MolGenGenet216:81-90，Anderson等(1989)NAR17:461-2小麥SPAAlbani等(1997)PlantCe119:171-184小麥的麥醇溶蛋白R(shí)afalski等(1984)EMB03:1409-15大麥Itrl啟動(dòng)子Diaz等(1995)MolGenGenet248(5):592-8大麥B1，C，D大麥醇溶蛋白Cho等(1999)TheorApplGenet98:1253-62;Muller等(1993)PlantJ4:343-55;Sorenson等(1996)MolGenGenet250:750-60大麥DOFMena等，(1998)PlantJ116(1):53-62blz2Onate等(1999)JBiolChem274(14):9175-82合成啟動(dòng)子Vicente-Carbajosa等(1998)PlantJ13:629-640稻的谷醇溶蛋白NRP33Wu等，(1998)PlantCellPhysio139(8)885-889稻球蛋白Glb-1Wu等(1998)PlantCellPhysio139(8)885-889稻球蛋白R(shí)EB/OHP-lNakase等(1997)PlantMolecBio133:513-522稻ADP-葡萄糖焦磷酸化酶Russell等(1997)TransRes6:157-68玉米ESR基因家族0psah1-Ferstad等(1997)PlantJ12:235-46高粱的高粱醇溶蛋白DeRose等(1996)PlantMolBio132:1029-35表2e:胚特異性啟動(dòng)子的實(shí)例17基因來(lái)源參考文獻(xiàn)稻0SH1Sato等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，93:8117-8122，1996■XPostma-Haarsma等，PlantMol.Biol.39:257-71，1999PR00151W02004/070039PR00175W02004/070039PR0005W02004/070039PR00095W02004/070039表2f:糊粉特異性啟動(dòng)子的實(shí)例基因來(lái)源參考文獻(xiàn)a_淀粉酶(Amy32b)Lanahan等，PlantCe114:203-211，1992;Skriver等，ProcNatlAcadSciUSA88:7266-7270，1991組織蛋白酶P-樣基因Cejudo等，PlantMolBio120:849-856，1992大麥Ltp2Kalla等，PlantJ.6:849-60，1994Chi26Leah等，PlantJ.4:579-89，1994玉米B-PeruSelinger等，Genetics149;1125-38，1998如文中所定義的綠色組織特異性啟動(dòng)子是主要在綠色組織中轉(zhuǎn)錄激活的啟動(dòng)子，基本上排除了在任何其他植物部分的激活，但仍允許有在這些其他植物部分中的任何滲漏表達(dá)。下表2g給出了可用于本發(fā)明方法的綠色組織特異性啟動(dòng)子的實(shí)例。表2g:綠色組織特異性啟動(dòng)子的實(shí)例18<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>組織特異性啟動(dòng)子的另一實(shí)例是分生組織特異性啟動(dòng)子，其主要在分生組織中轉(zhuǎn)錄激活，基本上排除了在任何其他植物部分的激活，但仍允許有在這些其他植物部分中的任何滲漏表達(dá)。下表2h給出了可用于本發(fā)明方法的綠色分生組織特異性啟動(dòng)子的實(shí)例。表2h:分生組織特異性啟動(dòng)子的實(shí)例<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>終止子術(shù)語(yǔ)"終止子"包括如下控制序列，其為位于轉(zhuǎn)錄單位末端的DNA序列，發(fā)送對(duì)初級(jí)轉(zhuǎn)錄物進(jìn)行3'加工和多聚腺苷酸化以及終止轉(zhuǎn)錄的信號(hào)。終止子可以源自天然基因、多種其他植物基因、或T-DNA。例如，待加入的終止子可以源自胭脂堿合酶或章魚堿合酶基因、或可選地源自其它植物基因、或次優(yōu)選地源自任何其它真核基因。調(diào)節(jié)與表達(dá)或基因表達(dá)相關(guān)聯(lián)時(shí)，術(shù)語(yǔ)"調(diào)節(jié)"是指與對(duì)照植物相比，所述基因表達(dá)的表達(dá)水平被改變的過程，所述表達(dá)水平可以增加或降低。原始未調(diào)節(jié)的表達(dá)可以是結(jié)構(gòu)RNA(rRNA、tRNA)或隨后進(jìn)行翻譯的mRNA的任何類型的表達(dá)。術(shù)語(yǔ)"調(diào)節(jié)活性"應(yīng)理解為對(duì)本發(fā)明核酸序列或編碼蛋白質(zhì)的表達(dá)的如下任何改變，所述改變導(dǎo)致植物產(chǎn)率增加和/或生長(zhǎng)增加。表汰術(shù)語(yǔ)"表達(dá)"或"基因表達(dá)"是指一種或多種特定基因或特定遺傳構(gòu)建體的轉(zhuǎn)錄。術(shù)語(yǔ)"表達(dá)"或"基因表達(dá)"特別指一種或多種基因或遺傳構(gòu)建體轉(zhuǎn)錄為結(jié)構(gòu)RNA(rRNA、tRNA)或mRNA，后者隨后翻譯或不翻譯為蛋白質(zhì)。該過程包括DNA的轉(zhuǎn)錄、以及所產(chǎn)生mRNA產(chǎn)物的加工。增加的表汰/過表汰如本文所用的術(shù)語(yǔ)"增加的表達(dá)"或"過表達(dá)"表示超出原始野生型表達(dá)水平的任何形式的表達(dá)。增加基因或基因產(chǎn)物表達(dá)的方法在本領(lǐng)域有充分的記載，這包括，例如通過適當(dāng)?shù)膯?dòng)子、轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子或翻譯增強(qiáng)子的使用而驅(qū)動(dòng)的過表達(dá)?？梢詫⒂米鲉?dòng)子或增強(qiáng)子元件的分離的核酸引入適當(dāng)位置(一般是非異源形式多核苷酸的上游)，從而上調(diào)目的多肽編碼核酸的表達(dá)。例如，可以通過突變、缺失和/或取代，體內(nèi)地改變內(nèi)源啟動(dòng)子(見Kmiec，US5，565，350;Zarling等，W09322443)，或者將分離的啟動(dòng)子引入植物細(xì)胞中使其相對(duì)于本發(fā)明基因具有恰當(dāng)?shù)姆较蚝途嚯x，從而控制基因的表達(dá)。如果期望多肽表達(dá)，通常期望在多核苷酸編碼區(qū)的3'末端納入多聚腺苷酸化區(qū)域。多聚腺苷酸化區(qū)域可以源自天然基因、多種其它植物基因或T-DNA。例如，待加入的3'末端序列可以源自胭脂堿合酶或章魚堿合酶基因、或可選地源自其他植物基因、或次優(yōu)選地源自任何其它真核基因。也可以在5'非翻譯區(qū)(UTR)或部分編碼區(qū)的編碼序列中加入內(nèi)含子序列，來(lái)增加在胞質(zhì)中累積的成熟信使的量。已顯示，在植物和動(dòng)物表達(dá)構(gòu)建體的轉(zhuǎn)錄單位中納入可剪接內(nèi)含子可以在mRNA和蛋白質(zhì)水平使基因表達(dá)增加高達(dá)1000倍(Buchman和Berg(1988)Mol.Cellbiol.8:4395-4405;Callis等(1987)GenesDev.1:1183-1200)。通常這類內(nèi)含子被放置在轉(zhuǎn)錄單位5'末端附近時(shí)，其增強(qiáng)基因表達(dá)的作用最大。玉米內(nèi)含子Adhl-S內(nèi)含子1、2和6以及Bronze-l內(nèi)含子的使用是本領(lǐng)域公知的。一般信息請(qǐng)參見TheMaizeHandbook,第116章，F(xiàn)reeling和Walbot編輯，Springer,N.Y.(1994)。內(nèi)源基因本文述及的"內(nèi)源"基因不僅指見于植物之中的天然形式的所討論基因(即未經(jīng)人為干預(yù))，而且指隨后(重新)引入到植物中的分離形式的相同基因(或基本上同源的核酸/基因)(轉(zhuǎn)基因)。例如，含有這樣的轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因植物可以發(fā)生轉(zhuǎn)基因表達(dá)的大幅下降和/或內(nèi)源基因表達(dá)的大幅下降。分離的基因可以從生物體中分離，或者可以是人工例如通過化學(xué)合成制備的。降低的表達(dá)本文述及的"降低的表達(dá)"或者表達(dá)"下降或基本上消除"應(yīng)理解為表示內(nèi)源基因表達(dá)和/或多肽水平和/或多肽活性相對(duì)于對(duì)照植物降低。所述下降或基本上消除按照遞增的優(yōu)選順序是與對(duì)照植物相比，下降至少10%、20%、30%、40%或50%、60%、70%、80%、85%、90%或95%、96%、97%、98%、99%或更多。為了降低或者基本上消除植物中內(nèi)源基因的表達(dá)，需要一段足夠長(zhǎng)度的基本上連續(xù)核苷酸的核酸序列。為了實(shí)施基因沉默，這可以少到20，19，18，17，16，15，14，13，12，11，IO或更少個(gè)核苷酸，備選地可以多到整個(gè)基因(包括5'和/或3'UTR，可以是部分也可以是全部)。該基本上連續(xù)的核苷酸鏈可以來(lái)自編碼目的蛋白質(zhì)(靶基因)的核酸，或者來(lái)自任何能編碼目的蛋白質(zhì)的直系同源物，旁系同源物或同源物的核酸。優(yōu)選地，該基本連續(xù)的核苷酸鏈能與靶基因(有義或反義鏈)形成氫鍵，更優(yōu)選地，該基本連續(xù)的核苷酸鏈按遞增的優(yōu)選順序與靶基因(有義或反義鏈)具有50%，60%，70%，80%，85%，90%，95%，96%，97%，98%，99%，100%序列同一性。編碼(功能性)多肽的核酸序列對(duì)于本文所討論的多種用于降低或基本上消除內(nèi)源基因表達(dá)的方法不是必需的。降低或基本上消除表達(dá)可利用常規(guī)工具和技術(shù)實(shí)現(xiàn)。降低或基本消除內(nèi)源基因表達(dá)的一個(gè)優(yōu)選方法是在植物中引入和表達(dá)遺傳構(gòu)建體，在該遺傳構(gòu)建體中核酸(在這種情況下，一段基本連續(xù)的核苷酸鏈，其來(lái)自目的基因，或者來(lái)自任何能編碼任何目的蛋白質(zhì)的直系同源物，旁系同源物或同源物的核酸)被克隆為由間隔序列(非編碼DNA)分隔開的反向重復(fù)序列(部分地或者全部地)。在這種優(yōu)選的方法中，內(nèi)源基因的表達(dá)通過RNA-介導(dǎo)的沉默，被降低或基本消除，在該RNA-介導(dǎo)的沉默中使用核酸或其部分(在這種情況下，一段基本上連續(xù)的核苷酸鏈，其來(lái)自目的基因，或者來(lái)自任何能編碼目的蛋白質(zhì)的直系同源物，旁系同源物或同源物的核酸)的反向重復(fù)——優(yōu)選能形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)——來(lái)實(shí)現(xiàn)。該反向重復(fù)被克隆在含有控制序列的表達(dá)載體上。非編碼DNA核酸序列(間隔序列，例如基質(zhì)附著區(qū)片段(MAR)，內(nèi)含子，多接頭等)被放置在形成該反向重復(fù)的兩個(gè)反向核酸之間。該反向重復(fù)序列轉(zhuǎn)錄后，形成具有自互補(bǔ)結(jié)構(gòu)的嵌合RNA(部分或者全部)。該雙鏈RNA結(jié)構(gòu)稱為發(fā)夾RNA(hpRNA)。發(fā)夾RNA被植物加工為siRNAs，siRNAs整合進(jìn)入RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物(RISC)中。RISC進(jìn)一步斷裂mRNA轉(zhuǎn)錄物，由此實(shí)質(zhì)性地降低待翻譯成多肽的mRNA轉(zhuǎn)錄物的數(shù)量。有關(guān)其它一般細(xì)節(jié)，敬請(qǐng)參見例如，Grierson等(1998)W098/53083;Waterhouse等(1999)W099/53050)。本發(fā)明方法的實(shí)施不依賴于在植物中引入和表達(dá)這樣的遺傳構(gòu)建體，在該遺傳構(gòu)建體中核酸被克隆為反向重復(fù)；而是可以使用眾所周知的"基因沉默"方法中的任何一種或多種來(lái)獲得相同的效果。用于降低內(nèi)源基因表達(dá)的一種此類方法是RNA介導(dǎo)的基因表達(dá)沉默(下調(diào))。這種情況下的沉默在植物中由與靶內(nèi)源基因基本相似的雙鏈RNA序列(dsRNA)觸發(fā)。該dsRNA進(jìn)一步被植物加工成大約20到大約26個(gè)核苷酸，稱為小干擾RNA(siRNAs)。siRNAs整合進(jìn)RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物(RISC)中，該沉默復(fù)合物斷裂內(nèi)源耙基因的mRNA轉(zhuǎn)錄物，由此實(shí)質(zhì)性地降低待翻譯成多肽的mRNA轉(zhuǎn)錄物的數(shù)量。優(yōu)選地，該雙鏈RNA序列對(duì)應(yīng)于靶基因。另一個(gè)RNA沉默方法的實(shí)例涉及向植物中以有義方向?qū)牒怂嵝蛄谢蛘咂洳糠?在這種情況下，一段基本連續(xù)的核苷酸鏈，其來(lái)自目的基因，或者來(lái)自任何能編碼目的蛋白質(zhì)的直系同源物，旁系同源物或同源物的核酸)。"有義方向"指DNA序列與其mRNA轉(zhuǎn)錄物是同源的。因此導(dǎo)入植物中的將是核酸序列的至少一個(gè)拷貝。該額外的核酸序列將降低此內(nèi)源基因的表達(dá)，造成被稱為共抑制(co-su卯ression)的現(xiàn)象。如果在植物中導(dǎo)入核酸序列的幾個(gè)額外拷貝，基因表達(dá)的降低將會(huì)更加明顯，原因是高轉(zhuǎn)錄水平和共抑制的觸發(fā)之間存在正相關(guān)。另一個(gè)RNA沉默方法的實(shí)例涉及反義核酸序列的使用。反義核酸序列包括與編碼蛋白質(zhì)的"有義"核酸序列互補(bǔ)，即，與雙鏈cDNA分子的編碼鏈互補(bǔ)，或者與mRNA轉(zhuǎn)錄序列互補(bǔ)，的核苷酸序列。反義核酸序列優(yōu)選與要沉默的內(nèi)源基因互補(bǔ)?；パa(bǔ)可位于基因的"編碼區(qū)"和/或"非編碼區(qū)"。術(shù)語(yǔ)"編碼區(qū)"指包含可翻譯成氨基酸殘基的密碼子的核苷酸序列區(qū)域。術(shù)語(yǔ)"非編碼區(qū)"指位于編碼區(qū)兩側(cè)的5'和3'序列，該區(qū)可轉(zhuǎn)錄但不翻譯成氨基酸(也稱為5'和3'非翻譯區(qū))。反義核酸序列可以根據(jù)Watson和Crick堿基配對(duì)規(guī)則設(shè)計(jì)。反義核酸序列可以與整個(gè)核酸序列(在此情況下，一段基本上連續(xù)的核苷酸鏈，其來(lái)自目的基因、或來(lái)自任何能夠編碼目的蛋白的直向同源物、旁系同源物或同源物的核酸)互補(bǔ)，不過也可以是僅與核酸序列的一部分(包括mRNA5'和3'UTR)反義的寡核苷酸。例如，反義寡核苷酸序列可以與圍繞編碼多肽的mRNA轉(zhuǎn)錄物的翻譯起始位點(diǎn)的區(qū)域互補(bǔ)。合適的反義寡核苷酸序列的長(zhǎng)度是本領(lǐng)域已知的并且可以從長(zhǎng)度約50、45、40、35、30、25、20、15或10個(gè)核苷酸或更少的核苷酸開始。本發(fā)明的反義核酸序列可以利用本領(lǐng)域已知方法，使用化學(xué)合成和酶連接反應(yīng)而構(gòu)建。例如，反義核酸序列(例如反義寡核苷酸序列)可以使用天然存在的核苷酸或多種修飾的核苷酸化學(xué)地合成，其中所述修飾的核苷酸被設(shè)計(jì)旨在增加分子的生物學(xué)穩(wěn)定性或增加反義核酸序列與有義核酸序列之間所形成雙鏈體的物理穩(wěn)定性，例如，可以使用硫代磷酸酯衍生物和吖啶取代的核苷酸?？梢杂脕?lái)產(chǎn)生反義核酸序列的修飾核苷酸的實(shí)例是本領(lǐng)域眾所周知的。已知的核苷酸修飾包括甲基化、環(huán)化和'加帽'及用類似物(如肌苷)取代一個(gè)或多個(gè)天然存在的核苷酸。其它的核苷酸修飾是本領(lǐng)域眾所周知的。這種反義核酸序列可以使用核酸序列已經(jīng)以反義方向亞克隆入其中(即從插入的核酸中轉(zhuǎn)錄的RNA將與目的靶核酸呈反義方向)的表達(dá)載體，以生物學(xué)方式產(chǎn)生。優(yōu)選地，反義核酸序列在植物中的產(chǎn)生借助穩(wěn)定整合的核酸構(gòu)建體進(jìn)行，其中所述的核酸構(gòu)建體包含啟動(dòng)子、有效連接的反義寡核苷酸和終止子。用于本發(fā)明方法中實(shí)現(xiàn)沉默的核酸分子(無(wú)論向植物中導(dǎo)入或在原位(insitu)產(chǎn)生)將與編碼多肽的mRNA轉(zhuǎn)錄物和/或基因組DNA雜交或結(jié)合，由此通過例如抑制轉(zhuǎn)錄和/或翻譯而抑制蛋白質(zhì)表達(dá)。雜交可以是常規(guī)核苷酸互補(bǔ)以形成穩(wěn)定雙鏈體，或在結(jié)合DNA雙鏈體的反義核酸序列的情況下，為在雙螺旋大溝內(nèi)的特異相互作用。反義核酸序列可以通過轉(zhuǎn)化或在特定組織部位直接注射而導(dǎo)入植物。備選地，反義核酸序列可以被修飾以靶向所選擇的細(xì)胞，并且隨后系統(tǒng)性施用。例如，對(duì)于系統(tǒng)性施用，反義核酸序列可以被修飾以便它們特異結(jié)合表達(dá)在所選擇的細(xì)胞表面上的受體或抗原，例如使反義核酸序列與可以和細(xì)胞表面受體或抗原結(jié)合的肽或抗體連接。反義核酸序列也可以使用本文中所述的載體送遞至細(xì)胞內(nèi)。根據(jù)又一個(gè)方面，反義核酸序列是a-異頭核酸序列。a異頭核酸序列與互補(bǔ)性RNA形成特定雙鏈雜交分子，其中與慣常b-單元相反，所述鏈相互平行(Gaultier等(1987)NuclAcRes15:6625-6641)。反義核酸序列也可以包含2'_o_甲基核糖核苷酸(Inoue等(1987)NuclAcRes15，6131-6148)或嵌合RNA-DNA類似物(Inoue等(1987)FEBSLett.215,327-330)。22內(nèi)源基因表達(dá)的降低或基本去除也可以使用核酶而進(jìn)行。核酶是具有核糖核酸酶活性的催化性RNA分子，能夠切割與其具有互補(bǔ)區(qū)域的單鏈核酸序列，如mRNA。因此，核酶(例如錘頭核酶(在Haselhoff和Gerlach(1988)Nature334,585-591中描述)可以用來(lái)催化性地切割編碼多肽的mRNA轉(zhuǎn)錄物，由此實(shí)質(zhì)性地降低待翻譯成多肽的mRNA轉(zhuǎn)錄物的數(shù)目?？梢栽O(shè)計(jì)對(duì)核酸序列具特異性的核酶(見例如Cech等美國(guó)專利號(hào)4，987，071;和Cech等美國(guó)專利號(hào)5，116，742)。備選地，可以使用對(duì)應(yīng)于核酸序列的mRNA轉(zhuǎn)錄物，從RNA分子庫(kù)中選出具有特異性核糖核酸酶活性的催化性RNA(Bartel和Szostak(1993)Science261，1411-1418)。核酶用于植物中基因沉默的用途是本領(lǐng)域已知的(例如Atkins等(1994)W094/00012;Lenne等(1995)W095/03404;Lutziger等(2000)W000/00619;Prinsen等(1997)WO97/13865和Scott等(1997)WO97/38116)?；虺聊部梢酝ㄟ^插入誘變(例如T-DNA插入或轉(zhuǎn)座子插入)或通過如Angell和Baulcombe((1999)PlantJ.20(3):357-62)、(AmpliconVIGSW098/36083)或Baulcombe(WO99/15682)及其它人描述的策略而實(shí)現(xiàn)。當(dāng)在內(nèi)源基因上存在突變和/或在隨后導(dǎo)入植物的分離的基因/核酸上存在突變時(shí)，基因沉默也可發(fā)生。降低或基本消除可以由無(wú)功能的多肽引起。例如，多肽可以與多種相互作用性蛋白質(zhì)結(jié)合；由此通過一個(gè)或多個(gè)突變和/或截短可以提供仍能夠結(jié)合相互作用性蛋白質(zhì)(如受體蛋白質(zhì))但不能表現(xiàn)其正常功能(如起信號(hào)作用的配體)的多肽。另一種基因沉默的方法是靶定與基因調(diào)節(jié)區(qū)(例如啟動(dòng)子和/或增強(qiáng)子)互補(bǔ)的核酸序列以形成阻止基因在靶細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄的三螺旋結(jié)構(gòu)。見Helene，C.，AnticancerDrugRes.6,569-84，1991;Helene等，Ann.N.Y.Acad.Sci.660，27-361992和Maher，L.J.Bioassays14，807-15，1992。其它方法，如使用針對(duì)內(nèi)源性多肽的抗體以抑制此多肽在植物中的功能，或干擾所述多肽參與的信號(hào)途徑，對(duì)于技術(shù)人員將是眾所周知的。尤其可以構(gòu)思的是，人造分子可以用于抑制靶多肽的生物學(xué)功能，或用于干擾靶多肽參與的信號(hào)途徑。備選地，可以建立篩選程序以在植物群體中鑒定基因的天然變體，所述變體編碼具有降低活性的多肽。此類天然變體也可以用于例如進(jìn)行同源重組。人工和/或天然的微RNA(miRNA)可以用來(lái)敲除基因表達(dá)和/或mRNA翻譯。內(nèi)源性miRNA是通常19-24個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的單鏈小RNA。它們的主要功能是調(diào)節(jié)基因表達(dá)和/或mRNA翻譯。大多數(shù)的植物微RNA(miRNA)與其靶序列具有完全的或接近完全的互補(bǔ)性。然而，存在具有多達(dá)5個(gè)錯(cuò)配的天然靶標(biāo)。它們由切酶家族的雙鏈特異性RNA酶從具有特征性折回結(jié)構(gòu)的較長(zhǎng)非編碼性RNA中加工而來(lái)。加工后，它們通過與RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物(RISC)的主要成分Argonaute蛋白質(zhì)結(jié)合而摻入該復(fù)合體。MiRNA充當(dāng)RISC的特異性成分，因?yàn)樗鼈兛梢耘c細(xì)胞質(zhì)中的靶核酸(大多是mRNA)堿基配對(duì)。后續(xù)的調(diào)節(jié)事件包括耙mRNA的切割和破壞和/或翻譯抑制。因此，miRNA過表達(dá)的效應(yīng)常常反映為耙基因降低的mRNA水平?？梢蕴禺惖剡z傳構(gòu)建通常21個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的人工微RNA(amiRNAs)，以負(fù)調(diào)節(jié)單個(gè)或多個(gè)目的基因的基因表達(dá)。植物微RNA靶的選擇的決定因素是本領(lǐng)域眾所周知的。用于靶識(shí)別的經(jīng)驗(yàn)參數(shù)已經(jīng)確定并且可以用來(lái)輔助設(shè)計(jì)特定的amiRNA(Schwab等，Dev.Cell8，517-527，2005)。用于設(shè)計(jì)并產(chǎn)生amiRNA及其前體的便利工具也是公眾可獲得的(Schwab等，PlantCell,18，1121-1133，2006)。為最佳性能，用于在植物中降低內(nèi)源基因表達(dá)的基因沉默技術(shù)需要使用來(lái)自單子葉植物的核酸序列以轉(zhuǎn)化單子葉植物，和使用來(lái)自雙子葉植物的核酸序列以轉(zhuǎn)化雙子葉植物。優(yōu)選地，將來(lái)自任何給定植物物種的核酸序列導(dǎo)入同一個(gè)物種內(nèi)。例如，將來(lái)自稻的核酸序列轉(zhuǎn)化至稻植物。然而，并非絕對(duì)要求待導(dǎo)入的核酸序列起源于與該核酸序列將要導(dǎo)入的植物相同的植物物種。只要內(nèi)源性靶基因與待導(dǎo)入的核酸之間存在相當(dāng)大的同源性就足夠了。上文描述了用于降低或基本消除內(nèi)源基因在植物中表達(dá)的多種方法的實(shí)例。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠容易地適應(yīng)性調(diào)整前述用于沉默的方法，以例如通過利用合適啟動(dòng)子而降低內(nèi)源基因在整株植物或在其部分中的表達(dá)?？稍枔駱?biāo)記(某因)/報(bào)告某因"可選擇標(biāo)記"、"可選擇標(biāo)記基因"或"報(bào)告基因"包括賦予細(xì)胞表型的任何基因，該基因在細(xì)胞中的表達(dá)有利于鑒定和/或選擇被本發(fā)明的核酸構(gòu)建體轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化了的細(xì)胞。這些標(biāo)記基因通過各種不同的原理使得能夠鑒定核酸分子的成功轉(zhuǎn)移。適宜的標(biāo)記可以選自賦予抗生素或除草劑抗性的標(biāo)記，其引入新的代謝性狀或允許可視選擇?？蛇x擇標(biāo)記基因的實(shí)例包括賦予抗生素抗性的基因(例如磷酸化新霉素和卡那霉素的nptll，或磷酸化潮霉素的hpt，或賦予例如對(duì)博來(lái)霉素、鏈霉素、四環(huán)素、氯霉素、氨芐青霉素、慶大霉素、遺傳霉素(G418)、壯觀霉素或殺稻瘟素抗性的基因)、賦予除草劑抗性的基因(例如提供抗,:83813@抗性的bar;提供抗草甘膦抗性的aroA或gox，或賦予例如對(duì)咪唑啉酮、膦絲菌素或磺酰脲抗性的基因)、或者提供代謝性狀的基因(如允許植物使用甘露糖作為唯一碳源的manA，或?qū)е履咎抢玫哪咎钱悩?gòu)酶，或抗?fàn)I養(yǎng)標(biāo)記如對(duì)2-脫氧葡萄糖的抗性)。可視標(biāo)記基因的表達(dá)導(dǎo)致形成顏色(例如P-葡糖醛酸糖苷酶GUS，或P-半乳糖苷酶及其有色底物，例如X-Gal)、發(fā)光(如螢光素/螢光素酶系統(tǒng))或熒光(綠色熒光蛋白GFP及其衍生物)。這里僅僅是列出了一小部分可用的標(biāo)記。技術(shù)人員對(duì)這類標(biāo)記極為熟悉。取決于生物體和選擇方法，優(yōu)選不同的標(biāo)記。已知，取決于所用的表達(dá)載體和所用的轉(zhuǎn)染技術(shù)，當(dāng)核酸向植物細(xì)胞進(jìn)行穩(wěn)定或瞬時(shí)整合時(shí)，僅少數(shù)細(xì)胞能攝入外來(lái)DNA，并將其整合入基因組(如果期望的話)。為鑒定并選擇這些整合體，通常將編碼可選擇標(biāo)記(如上文所述的那些)的基因與目的基因一起引入宿主細(xì)胞中。這些標(biāo)記能夠例如在如下突變體中使用，在所述突變體中這些基因例如通過常規(guī)方法缺失而沒有功能。此外，編碼可選擇標(biāo)記的核酸分子與編碼本發(fā)明多肽或用于本發(fā)明方法的序列可以在同一個(gè)載體中引入宿主細(xì)胞，或者在分開的載體中引入。已由所引入的核酸穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞可以例如通過選擇(例如，整合有可選擇標(biāo)記的細(xì)胞存活而其他細(xì)胞死去)予以鑒定。由于一旦成功引入核酸后，將不再需要或不期望轉(zhuǎn)基因宿主細(xì)胞中存在標(biāo)記基因，特別是抗生素和除草劑抗性基因，所以根據(jù)本發(fā)明引入核酸的方法有利地采用能夠除去或切除這些標(biāo)記基因的技術(shù)。一種這樣的方法是稱為共轉(zhuǎn)化的方法。共轉(zhuǎn)化法采用兩個(gè)載體同時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)化，一個(gè)載體攜帶根據(jù)本發(fā)明的核酸，而第二個(gè)攜帶標(biāo)記基因。很大比例的轉(zhuǎn)化體將接收或者對(duì)于植物而言(高達(dá)40%或以上的轉(zhuǎn)化體)含有兩個(gè)載體。對(duì)于農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化體通常只接收載體的一部分，即被T-DNA側(cè)翼包圍的序列，其通常是表達(dá)盒。隨后可通過雜交(cross)從轉(zhuǎn)化植物中除去標(biāo)記基因。在另一種方法中，利用整合進(jìn)轉(zhuǎn)座子的標(biāo)記基因與期望的核酸一起進(jìn)行轉(zhuǎn)化(稱為Ac/Ds技術(shù))。轉(zhuǎn)化體可與轉(zhuǎn)座酶來(lái)源雜交，或者用賦予轉(zhuǎn)座酶表達(dá)的核酸構(gòu)建體瞬時(shí)或穩(wěn)定轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化體。一旦成功進(jìn)行了轉(zhuǎn)化，在有些情況下(約10%)，轉(zhuǎn)座子將跳離宿主細(xì)胞基因組并丟失。在另一些情況下，轉(zhuǎn)座子跳至不同的位置。在這些情況下，必須通過雜交消除標(biāo)記基因。在微生物學(xué)中，研發(fā)了可以或便于檢測(cè)此類事件的技術(shù)。另一有利的方法有賴于稱為重組系統(tǒng)的方法，其優(yōu)勢(shì)在于可以免除雜交消除步驟。最著名的這類系統(tǒng)稱為Cre/lox系統(tǒng)。Crel為重組酶，其切除位于loxP序列之間的序列。如果標(biāo)記基因整合在loxP序列之間，一旦成功進(jìn)行了轉(zhuǎn)化，可以通過重組酶的表達(dá)而將標(biāo)記基因除去。其他重組系統(tǒng)有HIN/HIX、FLP/FRT及REP/STB系統(tǒng)(Tribble等，J.Biol.Chem.，275，2000:22255-22267;Velmurugan等，J.CellBiol.，149，2000:553-566)。根據(jù)本發(fā)明的核酸序列可以位點(diǎn)特異性地整合進(jìn)植物基因組。這些方法自然也可以應(yīng)用于微生物如酵母、真菌或細(xì)菌。織,/肖細(xì)/翻出于本發(fā)明的目的，"轉(zhuǎn)基因的"、"轉(zhuǎn)基因"或"重組"當(dāng)與例如，核酸序列，含有所述核酸序列的表達(dá)盒、基因構(gòu)建體或載體，或用根據(jù)本發(fā)明的核酸序列、表達(dá)盒或載體轉(zhuǎn)化的生物體相關(guān)時(shí)，是指所有這些構(gòu)建體通過重組方法產(chǎn)生，其中(a)編碼可用于本發(fā)明方法的蛋白質(zhì)的核酸序列，或(b)與本發(fā)明核酸序列有效連接的遺傳控制序列，例如啟動(dòng)子，或(c)(a)和(b)不存在于其天然遺傳環(huán)境中，或者已通過重組方法修飾，該修飾可以為例如一個(gè)或多個(gè)核苷酸殘基的取代、添加、缺失、倒位或插入。天然遺傳環(huán)境應(yīng)理解為指在起源植物中的天然基因組或染色體座位或存在于基因組文庫(kù)之中。在基因組文庫(kù)的情況下，優(yōu)選至少是部分地保持核酸序列的天然遺傳環(huán)境。該環(huán)境至少位于核酸序列一側(cè)，具有至少為50bp序列長(zhǎng)度、優(yōu)選至少500bp、特別優(yōu)選至少1000bp、最優(yōu)選至少5000bp。當(dāng)天然存在的表達(dá)盒——例如編碼可用于本發(fā)明方法的多肽的相應(yīng)核酸序列與該核酸序列的天然啟動(dòng)子之間的天然組合——經(jīng)非天然的合成("人工")方法如誘變處理而被修飾時(shí)，此表達(dá)盒成為轉(zhuǎn)基因表達(dá)盒。例如，合適的方法描述在US5，565，350或W000/15815中。因此，如上文所述，為了本發(fā)明目的，轉(zhuǎn)基因植物應(yīng)理解為表示在所述植物的基因組中，本發(fā)明方法中所用的核酸不在其天然基因座上，該核酸可以為同源或異源表達(dá)。不過，正如所提到的那樣，轉(zhuǎn)基因也表示當(dāng)在植物基因組中，根據(jù)本發(fā)明的核酸或本發(fā)明方法中所用的核酸位于其天然位置上時(shí)，所述序列已相對(duì)于天然序列被修飾，和/或該天然序列的調(diào)控序列已被修飾。轉(zhuǎn)基因優(yōu)選指根據(jù)本發(fā)明的核酸在基因組中于非天然的座位上表達(dá)，即同源表達(dá)，或者優(yōu)選發(fā)生核酸的異源表達(dá)。優(yōu)選的轉(zhuǎn)基因植物在文中述及。本文述及的術(shù)語(yǔ)"引入"或"轉(zhuǎn)化"包括將外源多核苷酸轉(zhuǎn)移進(jìn)宿主細(xì)胞，不考慮轉(zhuǎn)移所用的方法?？梢允褂帽景l(fā)明的遺傳構(gòu)建體轉(zhuǎn)化能夠通過器官發(fā)生或者胚胎發(fā)生隨后進(jìn)行克隆繁殖的植物組織，并從其再生整個(gè)植物。具體選擇的組織將因可得的和最適于待轉(zhuǎn)化的具體物種的克隆繁殖系統(tǒng)而變。示例性的組織靶標(biāo)包括葉盤、花粉、胚、子葉、下胚軸、雌配子、愈傷組織、既有的分生組織(例如頂端分生組織、腋芽和根分生組織)，以及誘導(dǎo)的分生組織(例如子葉分生組織和下胚軸分生組織)?？蓪⒍嗪塑账崴矔r(shí)或穩(wěn)定地導(dǎo)入宿主細(xì)胞，其可保持非整合狀態(tài)例如作為質(zhì)粒?？蛇x擇地，可將其整合入宿主基因組。然后以本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法將所得的轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞用于再生轉(zhuǎn)化的植物。外來(lái)基因轉(zhuǎn)移進(jìn)入植物基因組中稱為轉(zhuǎn)化。植物物種的轉(zhuǎn)化現(xiàn)在是相當(dāng)常規(guī)的技術(shù)。有利地，可使用幾種轉(zhuǎn)化方法中的任一方法將目的基因?qū)脒m宜的祖先細(xì)胞?？梢岳棉D(zhuǎn)化方法以及由植物組織或植物細(xì)胞再生植物的方法來(lái)進(jìn)行瞬時(shí)或穩(wěn)定轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化方法包括脂質(zhì)體的使用、電穿孔、增加游離DNA攝取的化學(xué)物質(zhì)、DNA至植物的直接注射、基因槍轟擊(particleg皿bombardment)、使用病毒或花粉的轉(zhuǎn)化以及顯微注射。方法可選自用于原生質(zhì)體的鈣/聚乙二醇方法(Krens，F(xiàn).A.等人，(1982)Nature296，72-74;NegrutiuI等人(1987)PlantMolBiol8:363-373)、原生質(zhì)體的電穿孔(ShillitoR.D.等人(1985)Bio/Techno13，1099-1102)、至植物材料內(nèi)的顯微注射(CrosswayA等人，(1986)Mol.GenGenet202:179-185);DNA或RNA包被的微粒轟擊(KleinTM等人，(1987)Nature327:70);使用(非整合型)病毒的感染等。優(yōu)選通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物，包括轉(zhuǎn)基因作物植物。一種有利的轉(zhuǎn)化法是植物原位(inplanta)轉(zhuǎn)化。為此，可以例如使農(nóng)桿菌作用于植物種子，或用農(nóng)桿菌接種植物分生組織。根據(jù)本發(fā)明，證明使轉(zhuǎn)化了的農(nóng)桿菌懸液作用于完整植株或至少花原基尤為有利。隨后培養(yǎng)植物，直至獲得所處理植物的種子(Clough和Bent，PlantJ.(1998)16,735-743)。農(nóng)桿菌介導(dǎo)的稻轉(zhuǎn)化方法包括眾所周知的稻轉(zhuǎn)化方法，例如在任一如下文獻(xiàn)中描述的方法歐洲專利申請(qǐng)EP1198985A1,Aldemita和Hodges(Planta，199:612-617，1996);Chan等(PlantMol.Biol.22(3)491-506，1993)，Hiei等(PlantJ.6(2):271-282，1994)，其公開的內(nèi)容在此并入本文作為參考就如同陳述了其全部?jī)?nèi)容那樣。至于玉米轉(zhuǎn)化，優(yōu)選的方法如Ishida等(Nat.Biotechnol.14(6):745-50,1996)或Frame等(PlantPhysiol.129(1):13-22,2002)中所述，其公開的內(nèi)容全部地并入本文作為參考。作為舉例說(shuō)明，所述方法還由B.Jenes等，TechniquesforGeneTransfer，在TransgenicPlants,巻1，EngineeringandUtilization,編車茸S.D.K皿g禾口R.Wu，AcademicPress(1993)128-143以及PotrykusA匪.Rev.PlantPhysiol.PlantMolec.Biol.42(1991)205-225)中進(jìn)一步描述。優(yōu)選將待表達(dá)的核酸或構(gòu)建體克隆到載體中，所述載體適用于轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)，例如pBinl9(Bevan等，Nucl.AcidsRes.12(1984)8711)。然后以已知的方式利用由這樣的載體轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌來(lái)轉(zhuǎn)化植物，例如用作模式植物的植物，像擬南芥(Arabidopsisthaliana，其在本發(fā)明范圍內(nèi)不視為作物植物)；或者作物植物，例如作為舉例的煙草植物，例如通過在農(nóng)桿菌溶液中浸沒擦傷的葉子或切碎的葉子，然后在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)之。通過根癌農(nóng)桿菌的植物轉(zhuǎn)化例如已由H6fgen和Willmitzer在Nucl.AcidRes.(1988)16,9877描述，或者尤其是可從F.F.White,VectorsforGeneTransferinHigherPlants在TransgenicPlants,巻1，EngineeringandUtilization,編車茸S.D.K皿g禾口R.Wu，AcademicPress,1993，第15-38頁(yè)獲知。除了體細(xì)胞(其隨后必須再生為完整植株)轉(zhuǎn)化以外，還可以轉(zhuǎn)化植物分生組織的細(xì)胞，特別是可以發(fā)育成配子的那些細(xì)胞。在這種情況下，轉(zhuǎn)化的配子循著天然植物的發(fā)育而產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物。因此，例如，可以用農(nóng)桿菌處理擬南芥的種子，并從一定比例經(jīng)轉(zhuǎn)化因而是轉(zhuǎn)基因的發(fā)育植物收獲種子[Feldman，KA和MarksMD(1987).Mo1Gen26Genet208:274-289;FeldmannK(1992).在CKoncz，N_HChua禾PJShell編輯MethodsinArabidopsisResearch.WordScientific,Singapore,第274-289頁(yè)]?？蛇x的方法基于反復(fù)去除花序以及使蓮座中心切割部位與轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌一起孵育，由此在隨后的時(shí)間點(diǎn)同樣能夠獲得轉(zhuǎn)化的種子(Chang(1994).PlantJ.5:551-558;Katavic(1994)MolGenGenet，245:363-370)。然而，一種特別有效的方法是真空滲入法，及其改良方法如"花器浸蘸法"(floraldip)。對(duì)于擬南芥的真空滲入，用農(nóng)桿菌懸液在減壓下處理完整植株[Bechthold，N(1993).CRAcadSciParisLifeSci，316:1194-1199]，而對(duì)于"花器浸蘸法"，將發(fā)育中的花組織與表面活性劑處理的農(nóng)桿菌懸液短暫孵育[Clough，SJ和Bent，AF(1998).ThePlantJ.16，735-743]。在兩種情況下均收獲一定比例的轉(zhuǎn)基因種子，這些種子可通過在上述選擇性條件下培養(yǎng)而與非轉(zhuǎn)基因種子區(qū)分開來(lái)。另外，質(zhì)體的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化是有利的，因?yàn)橘|(zhì)體在多數(shù)作物中為母系遺傳，從而降低或消除了轉(zhuǎn)基因通過花粉傳播的風(fēng)險(xiǎn)。葉綠體基因組的轉(zhuǎn)化通常通過Klaus等，2004[NatureBiotechnology22(2)，225-229]中系統(tǒng)性展示的方法實(shí)現(xiàn)。簡(jiǎn)言之，將待轉(zhuǎn)化的序列與可選擇的標(biāo)記基因一起克隆到同源于葉綠體基因組的側(cè)翼序列之間。這些同源側(cè)翼序列指導(dǎo)轉(zhuǎn)基因位點(diǎn)特異性整合到質(zhì)體基因組中。質(zhì)體轉(zhuǎn)化已在許多不同的植物物種中描述，且綜述由Bock(2001)Transgenicplastidsinbasicresearchandplantbiotechnology.JMolBiol.2001年9月21日；312(3):425-38或Maliga，P(2003)Progresstowardscommercializationofplastidtransformationtechnology.TrendsBiotechnol.21，20-28給出。最近報(bào)道了形式為無(wú)標(biāo)記的質(zhì)體轉(zhuǎn)化體的其他生物技術(shù)方法，所述轉(zhuǎn)化體可以利用瞬時(shí)共整合的標(biāo)記基因產(chǎn)生(Klaus等，2004，NatureBiotechnology22(2)，225-229)。T-DNA激活標(biāo)簽T-DNA激活標(biāo)簽(Hayashi等Science(1992)1350-1353)包括將通常含有啟動(dòng)子(也可以是翻譯增強(qiáng)子或內(nèi)含子)的T-DNA插入在目的基因的基因組區(qū)或基因編碼區(qū)上游或下游lOkb處，從而在構(gòu)型上使啟動(dòng)子能夠指導(dǎo)靶向基因的表達(dá)。通常天然啟動(dòng)子對(duì)靶向基因表達(dá)的調(diào)控被破壞，基因由新引入的啟動(dòng)子控制。啟動(dòng)子一般包含于T-DNA中?？梢岳纾ㄟ^農(nóng)桿菌感染將此T-DNA隨機(jī)插入植物基因組中，并導(dǎo)致插入T-DNA附近的基因的表達(dá)被修飾。得到的轉(zhuǎn)基因植物將由于緊靠引入的啟動(dòng)子的基因的修飾表達(dá)而表現(xiàn)出顯性表型。TILLING術(shù)語(yǔ)"TILLING"為"耙向誘導(dǎo)的基因組局部損傷"(TargetedInducedLocalLesionsInGenomes)的縮寫，是一種用于產(chǎn)生和/或鑒定編碼具有修飾的表達(dá)和/或活性的蛋白質(zhì)的核酸的誘變技術(shù)。TILLING還允許選擇攜帶此類突變變體的植物。這些突變變體可以在強(qiáng)度、位置或時(shí)間(例如，如果突變影響啟動(dòng)子的話)上呈現(xiàn)出修飾的表達(dá)。這些突變變體可以比其天然形式基因呈現(xiàn)更高的活性。TILLING將高密度誘變和高通量篩選方法結(jié)合在一起。TILLING—般遵循的步驟有(a)EMS誘變(RedeiGP和KonczC，(1992)InMethodsinArabidopsisResearch,KonczC，ChuaNH，SchellJ編輯，新力口坡，WorldScientificPublishingCo，第16-82頁(yè)；Feldmann等，(1994)InMeyerowitzEM，SomervilleCR編輯，Arabidopsis.冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，冷泉港，紐約，第137-172頁(yè);LightnerJ禾口CasparT，(1998)InJMartinez-Z即ater，JSalinas編車茸，MethodsonMolecularBiology,82巻HumanaPress,Totowa，NJ，第91-104頁(yè))；(b)個(gè)體的DNA制備和合并(pooling);(c)目的區(qū)域的PCR擴(kuò)增；(d)變性和退火以使異源雙鏈體能夠形成；(e)DHPLC，其中合并物中異源雙鏈體的存在在色譜圖中檢測(cè)為額外的峰；(f)突變個(gè)體的鑒定；和(g)突變PCR產(chǎn)物的測(cè)序。用于TILLING的方法在本領(lǐng)域內(nèi)是眾所周知的(McCallum等人，(2000)NatBiotechnol18:455—457;由Stemple(2004)NatRevGenet5(2):145-50進(jìn)行綜述)。同源重組同源重組允許向基因組中的指定選擇位置引入所選的核酸。同源重組是生物科學(xué)中常規(guī)用于低等生物體如酵母或苔蘚劍葉蘚屬(physcomitrella)的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)。在植物中進(jìn)行同源重組的方法已經(jīng)不僅在模式植物中描述(Offringa等(1990)EMB0J.9(10):3077-84)，而且也在作物植物，如稻中描述(Terada等(2002)NatBiotech20(10):1030-4;Iida和Terada(2004)CurrOpinBiotechnol15(2):132-8)，而且也存在著不考慮耙生物體的一般通用的方法(Miller等，NatureBiotechnol.25，778-785，2007)。產(chǎn)率術(shù)語(yǔ)"產(chǎn)率"通常表示具有經(jīng)濟(jì)價(jià)值的可測(cè)量產(chǎn)出，其一般與指定的作物、面積和時(shí)期相關(guān)。各植物部分基于其數(shù)量、大小和/或重量直接貢獻(xiàn)于產(chǎn)率，或者實(shí)際產(chǎn)率是每平方米作物的年產(chǎn)率，用總產(chǎn)量(包括收獲的產(chǎn)量和估定的產(chǎn)量)除以種植的平方米來(lái)確定。術(shù)語(yǔ)植物的"產(chǎn)率"可以與該植物的營(yíng)養(yǎng)性生物質(zhì)(根和/或枝條的生物質(zhì))、繁殖器官、和/或繁殖體(如種子)相關(guān)。早期活力"早期活力"是指活躍健康且很好均衡的生長(zhǎng)，特別是在植物生長(zhǎng)的早期階段，其可以由增強(qiáng)的植物適度(fitness)引起，例如，由植物更好地適應(yīng)其環(huán)境(即優(yōu)化能源資源的利用以及在枝條和根之間的分配)引起。具有早期活力的植物也可以顯示出增加的幼苗存活和更佳的作物齊苗(establisment)，這往往產(chǎn)生高度均一的田地(作物以齊整的方式生長(zhǎng)，即大多數(shù)植物基本上同時(shí)達(dá)到發(fā)育的各階段)，以及常常更優(yōu)更高的產(chǎn)率。因此，早期活力可以通過測(cè)量多種因素來(lái)確定，如千粒重、萌發(fā)率、出苗率、幼苗生長(zhǎng)、幼苗高度、根長(zhǎng)度、根和枝條生物量，等等。增加/提高/增強(qiáng)術(shù)語(yǔ)"增加"、"提高"或"增強(qiáng)"可互換，且在本發(fā)明意義上表示與文中所定義的對(duì)照植物相比，產(chǎn)率和/或生長(zhǎng)多出至少3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%或10%，優(yōu)選至少15%或20%，更優(yōu)選25%、30%、35%或40%。種子產(chǎn)率增加的種子產(chǎn)率可表現(xiàn)為如下一個(gè)或多個(gè)方面a)種子生物量(種子總重量)的增加，這可以是以單粒種子和/或每植株和/或每平方米為基礎(chǔ)的增加；b)每植株的花數(shù)的增加；c)增加的(飽滿)種子數(shù)；d)增加的種子飽滿率(其表達(dá)為飽滿種子數(shù)與種子總數(shù)的比率)；e)增加的收獲指數(shù)，其表達(dá)為可收獲部分如種子的產(chǎn)率除以總生物量的比率；f)增加的千粒重(TKW)，這通過計(jì)數(shù)飽滿種子數(shù)和它們的總重量外推得到。TKW增加可來(lái)自于種子大小和/或種子重量的增加，并且也可來(lái)自胚和/或胚乳大小的增加。種子產(chǎn)率的增加也可表現(xiàn)為種子大小和/或種子體積的增加。此外，種子產(chǎn)率的增加也可表現(xiàn)為種子面積和/或種子長(zhǎng)度和/或種子寬度和/或種子周長(zhǎng)的增加。增加的產(chǎn)率也可以導(dǎo)致改變的構(gòu)造，或可以因改變的構(gòu)造而發(fā)生。綠度指數(shù)(greennessindex)如本文所用的"綠度指數(shù)"根據(jù)植物的數(shù)字圖像計(jì)算。對(duì)于圖像中屬于植物目標(biāo)的每一個(gè)像素，計(jì)算綠色值相對(duì)于紅色值(在用于編碼顏色的RGB模型中)之比。綠度指數(shù)表達(dá)為綠紅比超過給定閾值的像素百分比。在正常生長(zhǎng)條件下、在鹽脅迫生長(zhǎng)條件下、在養(yǎng)分可利用度下降的生長(zhǎng)條件下，在開花前末次成像中測(cè)量植物的綠度指數(shù)。相反，在干旱脅迫生長(zhǎng)條件下，在干旱后的首次成像中測(cè)量植物的綠度指數(shù)。腦本文所用術(shù)語(yǔ)"植物"涵蓋整株植物、植物的祖先和后代以及植物部分，包括種子、枝條、莖、葉、根(包括塊莖)、花以及組織和器官，其中上述每一種都包含目的基因/核酸。術(shù)語(yǔ)"植物"也包括植物細(xì)胞、懸浮培養(yǎng)物、愈傷組織、胚、分生組織區(qū)、配子體、孢子體、花粉和小孢子，同樣其中上述每一種都包含目的基因/核酸。尤其可用于本發(fā)明方法的植物包括屬于植物界(Viridiplantae)超家族的所有植物，尤其是單子葉植物和雙子葉植物，包括飼料或豆科牧草、觀賞植物、糧食作物、喬木或灌木，選自槭樹屬物種(Acerspp.)、獼猴桃屬物種(Actinidiaspp.)、秋葵屬物禾中(Abelmoschusspp.)、金J麻(Agavesisalana)、冰草屬物禾中(Agropyronspp.)、甸蓬剪股穎(Agrostisstolonifera)、蔥屬物禾中(Alliumspp.)、覓屬物禾中(Amaranthusspp.)、濱草(Ammophilaarenaria)、鳳梨(Ananascomosus)、番蒸枝屬物禾中(Annonaspp.)、存菜(Apiumgraveolens)、落花生屬物禾中(Arachisspp.)、木波羅屬物禾中(Artocarpusspp.)、石習(xí)禾白(Asparagusofficinalis)、燕麥屬物禾中(Avenaspp.)(如燕麥(Avenasativa)、里予燕麥(Avenafatua)、比贊燕麥(Avenabyzantina)、Avenafatuavar.sativa、雜禾中燕麥(Avenahybrida))、陽(yáng)t兆(Averrhoacarambola)、筋竹屬物禾中(Bambusasp.)、冬瓜(Benincasahispida)、巴西栗(Bertholletiaexcelsea)、舌甘菜(Betavulgaris)、蕓苔屬物禾中(Brassicaspp.)(如歐洲油菜(Brassicanapus)、甘藍(lán)型油菜(Brassicarapassp.)[蕓苔、油菜禾子油菜、蕪菁])、Cadabafarinosa、大口十茶(Camelliasinensis)、美人薫(Carmaindica)、大麻(Carmabissativa)、辣椒屬物禾中(C即sicumspp.)、笞草(Carexelata)、番木瓜(Caricap即aya)、大果假虎剌(Carissamacrocarpa)、山核桃屬物禾中(Caryaspp.)、紅花(Carthamustinctorius)、栗屬物禾中(Castaneaspp.)、爪哇木棉(Ceibapentandra)、苦苣(Cichoriumendivia)、樟屬物禾中(Ci皿amomumspp.)、西瓜(Citrulluslanatus)、柑橘屬物種(Citrusspp.)、椰子屬物種(Cocosspp.)、咖啡屬物種(Coffeaspp.)、芋(Colocasiaesculenta)、可拉屬(Colaspp.)、黃麻屬物種(Corchorussp.)、完姜(Coriandrumsativum)、棒屬物禾中(Corylusspp.)、山植屬物禾中(Crataegusspp.)、番紅花(Crocussativus)、南瓜屬物禾中(Cucurbitaspp.)、香瓜屬物禾中(Cucumisspp.)、菜莉?qū)傥锖讨?Cyna:raspp.)、胡蘿卜(Daucuscarota)、山馬蟲黃屬物禾中(Desmodiumspp.)、龍目艮(Dimocarpuslongan)、著菊屬物禾中(Dioscoreaspp.)、棉樹屬物種(Diospyrosspp.)、稗屬物種(Echinochloaspp.)、油棕屬(Elaeis)(如非洲油棕(Elaeisguineensis)、美洲|油綜(Elaeisoleifera))、移子(Eleusinecoracana)、苔鼓(Eragrostistef)、庶茅屬物禾中(Erianthussp.)、批把(Eriobotryaj即onica)、按屬物禾中(Eucalyptussp)、纟工仔果(Eugeniauniflora)、養(yǎng)麥屬物禾中(Fagopyrumspp.)、山毛棒屬物禾中(Fagusspp.)、蘋狀羊茅(Festucaarundinacea)、無(wú)花果(Ficuscarica)、金枯屬物禾中(Fortimellaspp.)、草毒屬物禾中(Fragariaspp.)、銀杏(Ginkgobiloba)、大豆屬物禾中(Glycinespp.)(如大豆(Glycinemax)、黃豆(Sojahispida)或大豆(Sojamax))、陸地棉(Gossypiumhirsutum)、向曰奏屬物禾中(Helianthusspp.)(如向曰奏(Helianthusannus))、營(yíng)草(Hemerocallisfulva)、木樓屬物禾中(Hibiscusspp.)、大麥屬物禾中(Hordeumspp.)(如大麥(Hordeumvulgare))、甘著(Ipomoeabatatas)、核t兆屬物禾中(Juglansspp.)、萬(wàn)昔(Xactucasativa)、山黨豆屬物禾中(Xathyrusspp.)、兵豆(Lensculinaris)、亞麻(Xi皿musitatissimum)、蒸枝(Xitchichinensis)、百脈根屬物禾中(Lotusspp.)、梭角絲瓜(Xuffaacutangula)、習(xí)習(xí)扇豆屬物禾中(Uipinusspp.)、地楊梅(Uizulasylvatica)、番莉?qū)傥锖讨?Xycopersiconspp.)(如番莉(Xycopersiconesculentum、LycopersiconLycopersicum、Lycopersiconpyriforme)、硬皮豆屬物禾中(Macrotylomaspp.)、蘋果屬物禾中(Malusspp.)、西印度櫻桃(Malpighiaemarginata)、曼密蘋果(Mammeaamericana)、芒果(Mangiferaindica)、木著屬物禾中(Manihotspp.)、人心果(Manilkaraz即ota)、紫花首菅(Medicagosativa)、草木梶屬物禾中(Melilotusspp.)、薄荷屬物禾中(Menthaspp.)、芒(Miscanthussinensis)、苦瓜屬物禾中(Momordicaspp.)、黑桑(Morusnigra)、色薫屬物種(Musaspp.)、煙草屬物種(Nicotianaspp.)、木犀欖屬物種(Oleaspp.)、仙人掌屬物禾中(Opimtiaspp.)、Ornithopusspp.、禾舀屬物禾中(Oryzaspp.)(如禾舀(Oryzasativa)，闊口十稻(0ryzalatifolia))、黍糜(Pani固miliaceum)、柳枝稷(Pani固virgatum)、雞蛋果(Passifloraedulis)、歐防風(fēng)(Pastin織sativa)、狼尾草屬(Pe皿isetumsp.)、鍔梨屬物禾中(Perseaspp.)、香存(Petroselinumcrispum)、薦草(Phalarisarimdinacea)、菜豆屬物禾中(Phaseolusspp.)、梯牧草(Phleumpratense)、刺奏屬物禾中(Phoenixspp.)、南方戸蘋(Phragmitesaustralis)、酸獎(jiǎng)屬物禾中(Physalisspp.)、松屬物禾中(Pinusspp.)、阿月渾子(Pistaciavera)、豌豆屬物種(Pisumspp.)、早熟禾屬物禾中(Poas卯.)、楊屬物禾中(Populusspp.)、牧豆樹屬物禾中(Prosopisspp.)、李屬物禾中(Primusspp.)、番石槽屬物禾中(Psidiumspp.)、石槽(Pimicagranatum)、西洋梨(Pyruscommunis)、棟屬物禾中(Quercusspp.)、蘿卜(R即hanussativus)、波口十大黃(Rheumrhabarbarum)、茶薦子屬物禾中(Ribesspp.)、菌麻(Ricinuscommunis)、懸鉤子屬物禾中(Rubusspp.)、甘庶屬物禾中(Saccharumspp.)、賴卩屬物禾中(Salixsp.)、接骨木屬物禾中(Sambucusspp.)、黑麥(Secalecereale)、胡麻屬物種(Sesamumspp.)、白芥屬物種(Sinapissp.)、茄屬物禾中(Solariumspp.)(如馬鈴著(Solariumtuberosum)、紅莉(Solariumintegrifolium)或番棉(Solariumlycopersicum))、兩色蜀泰(Sorghumbicolor)、疲菜屬物禾中(Spinacias卯.)、蒲桃屬物種(Syzygiumspp.)、萬(wàn)壽菊屬物種(Tagetess卯.)、酸豆(Tamarindusindica)、可可樹(Theobromacacao)、車軸草屬物禾中(Trifoliumspp.)、鴨茅狀摩擦禾(Tripsacumdactyloides)、小黑麥(Triticosecalerimpaui)、小麥屬物禾中(Triticumspp.)(如小麥(Triticumaestivum)、硬茅立小麥(Triticumdurum)、圓維小麥(Triticumturgidum)、Triticumhyber皿m、馬卡小麥(Triticummacha)、面包小麥(Triticumsativum)、一茅立小麥(Triticummonococcum)或普通小麥(Triticumvulgare))、小金蓮花(Tropaeolumminus)、旱金蓮(Tropaeolummajus)、越枯屬物禾中(Vacciniumspp.)、野豌豆屬物種(Viciaspp.)、豇豆屬物種(Vignas卯.)、香堇菜(Violaodorata)、葡萄屬物種(Vitiss卯.)、玉蜀黍(Zeamays)、北美洲野生稻(Zizaniapalustris)、棗屬物種(Ziziphusspp.)等等。發(fā)明詳述INITR現(xiàn)已令人驚訝地發(fā)現(xiàn)，在植物中調(diào)節(jié)編碼NITR多肽的核酸表達(dá)，可以使這些植物相對(duì)于對(duì)照植物具有增強(qiáng)的產(chǎn)率相關(guān)性狀。根據(jù)第一種實(shí)施方案，本發(fā)明提供了相對(duì)于對(duì)照植物增強(qiáng)植物的產(chǎn)率相關(guān)性狀的方法，包括調(diào)節(jié)植物中編碼NITR多肽的核酸的表達(dá)。調(diào)節(jié)(優(yōu)選增加)NITR多肽編碼核酸表達(dá)的一個(gè)優(yōu)選方法是在植物中引入和表達(dá)編碼NITR多肽的核酸。下文述及的任何"可用于本發(fā)明方法的蛋白質(zhì)"應(yīng)理解為表示如本文所定義的NITR多肽。下文述及的任何"可用于本發(fā)明方法的核酸"應(yīng)理解為表示能夠編碼這樣的NITR多肽的核酸。待引入植物(從而可用于實(shí)施本發(fā)明方法)的核酸是編碼現(xiàn)在將要描述的此類蛋白質(zhì)的任何核酸，下文也稱為"NITR核酸"或"NITR基因"。如本文定義的術(shù)語(yǔ)"NITR多肽"指SEQIDNO:2表示的亞硝酸還原酶蛋白質(zhì)以及其同源物(直系同源物和旁系同源物)。亞硝酸還原酶屬于酶分類EC1.7.7.l，并且催化亞硝酸還原為銨。優(yōu)選SEQIDNO:2的同源物具有NIR—SIR結(jié)構(gòu)域。NIR_SIR結(jié)構(gòu)域(PfamentryPF01077,亞硝酸和亞硫酸還原酶4Fe-4S區(qū)域)在本領(lǐng)域眾所周知，易于被該領(lǐng)域的技術(shù)人員鑒定。優(yōu)選NITR多肽也含有一個(gè)或多個(gè)如下結(jié)構(gòu)域InterPro:IPR005117(亞硝酸/亞硫酸還原酶，血紅素蛋白P_組分，鐵氧還蛋白樣)PFAM:PF03460(NIR_SIR_ferr)InterPro:IPR006066(亞硝酸和亞硫酸還原酶鐵_硫/siroheme結(jié)合位點(diǎn))PRINTS:PR00397(SIROHAEM)PROSITE:PS00365(NIR_SIR)InterPro:IPR006067(亞硝酸和亞硫酸還原酶4Fe_4S區(qū)域)GENE3D:G3DSA:3.30.413.10(G3DSA:3.30.413.10)可選地，NITR蛋白質(zhì)同源物按照遞增的優(yōu)選順序與SEQIDN0:2所示的氨基酸序列具有至少25%，26%，27%，28%，29%，30%，31%，32%，33%，34%，35%，36%，37%，38%，39%，40%，41%，42%，43%，44%，45%，46%，47%，48%，49%，50%，51%，52%，53%，54%，55%，56%，57%，58%，59%，60%，61%，62%，63%，64%，65%，66%，67%，68%，69%，70%，71%，72%，73%，74%，75%，76%，77%，78%，79%，80%，81%，82%，83%，84%，85%，86%，87%，88%，89%，90%，91%，92%，93%，94%，95%，96%，97%，98%，或99%的總體序列同一性前提是所述同源蛋白質(zhì)包含上文所列的保守結(jié)構(gòu)域。總體序列同一性利用全局比對(duì)算法，如GAP程序(GCGWisconsinPackage,Accelrys)中的NeedlemanW皿sch算法來(lái)確定，優(yōu)選采用默認(rèn)參數(shù)，并且優(yōu)選使用成熟蛋白質(zhì)的序列(即，不考慮分泌信號(hào)或轉(zhuǎn)運(yùn)肽)。當(dāng)僅考慮保守結(jié)構(gòu)域或基序時(shí)，此時(shí)的序列同一性與總體序列同一性相比通常要更高。優(yōu)選地，當(dāng)用于系統(tǒng)發(fā)生樹的構(gòu)建時(shí)，該多肽序列，例如圖3描述的多肽序列，與含有SEQIDNO:2表示的氨基酸序列的NITR多肽群聚類，而不與亞硫酸還原酶或其他任何群聚類。術(shù)語(yǔ)"結(jié)構(gòu)域"和"基序"在本文"定義"部分進(jìn)行了定義。存在用于鑒定結(jié)構(gòu)域的專家數(shù)據(jù)庫(kù)，例如SMART(Schultz等(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA95,5857-5864;Letunic等(2002)NucleicAcidsRes30，242-244)、InterPro(Mulder等，(2003)Nucl.Acids.Res.31，315-318)、Prosite(Bucher禾口Bairoch(1994)，Ageneralizedprofilesyntaxforbiomolecularsequencesmotifsanditsfunctioninautomaticsequenceinterpretation.(In)ISMB-94;第二屆分子生物學(xué)智能系統(tǒng)國(guó)際會(huì)議記錄(Proceedings2ndInternationalConferenceonIntelligentSystemsforMolecularBiology)AltmanR.，BrutlagD.，KarpP.，LathropR.，SearlsD.編輯，53-61頁(yè)，AAAIPress,MenloPark;Hulo等，Nucl.Acids.Res.32:D134_D137，(2004))或者Pfam(Bateman等，NucleicAcidsResearch30(1):276-280(2002)。進(jìn)行蛋白質(zhì)序列芯片(insilico)分析的一組工具可以從ExPASy蛋白質(zhì)組學(xué)服務(wù)器獲得(瑞士生物信息學(xué)研究所(SwissInstituteofBioinformatics)(Gasteiger等ExPASy:theproteomicsserverforin_depthproteinknowledgeandanalysis.NucleicAcidsRes31:3784-3788(2003"。也可以利用常規(guī)技術(shù)如通過序列比對(duì)鑒定結(jié)構(gòu)域或基序。為比較而進(jìn)行序列比對(duì)的方法是本領(lǐng)域眾所周知的，此類方法包括GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA和TFASTA。GAP使用Needleman和Wunsch的算法((1970)J.Mol.Biol.48:443-453)來(lái)尋找可以使匹配數(shù)最大化且空位數(shù)最小化的兩序列間的全局比對(duì)(即跨越全序列)。BLAST算法(Altschul等(1990)JMolBiol215:403-10)計(jì)算序列同一性百分比，并對(duì)兩序列之間的相似性進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。執(zhí)行BLAST分析的軟件可通過美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心(NCBI)公開地獲得。例如，同源物可以使用ClustalW多重序列比對(duì)算法(1.83版)，采用默認(rèn)的成對(duì)比對(duì)參數(shù)以及百分比的記分方法而容易地鑒定。利用可獲自MatGAT軟件包(Campanella等BMCBioinformatics.2003年7月10日4:29.MatGAT:anapplicationthatgeneratessimilarity/identitymatricesusingproteinorDNAsequences)的萬(wàn)法之一，也可以確定全局相似性和同一性百分比。可以進(jìn)行微小的人工編輯以優(yōu)化保守基序之間的比對(duì)，這對(duì)于所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員而言將是顯而易見的。此外，除了利用全長(zhǎng)序列進(jìn)行同源物鑒定以外，還可以利用特定的結(jié)構(gòu)域?？梢岳蒙鲜龀绦虿捎媚J(rèn)參數(shù)針對(duì)完整核酸或氨基酸序列或者針對(duì)選擇的結(jié)構(gòu)域或保守基序來(lái)確定序列同一此外，NITR多肽(至少其天然形式)，就SEQIDNO:2及其同源物而言，典型地具有氧化還原酶活性。本領(lǐng)域公知測(cè)定氧化還原酶活性的工具和技術(shù)，參見例如Ferrari和Varner，PlantPhysiol.，47(6)，790-794(1971)。亞硝酸還原酶群與亞硫酸還原酶(EC1.8.1.2，Hilz等，Biochem.Z.332，151-166，1959)—起催化如下反應(yīng):硫化氫+3NADP++3H20=亞硫酸+3NADPH+3H+然而，應(yīng)注意亞硫酸還原酶群不包含在本發(fā)明所用的NITR多肽術(shù)語(yǔ)中。本發(fā)明以SEQIDNO:1所示的核酸序列轉(zhuǎn)化植物來(lái)進(jìn)行舉例說(shuō)明，其編碼SEQID性值。NO:2多肽序列。然而，本發(fā)明的實(shí)施并不局限于這些序列；本發(fā)明的方法可以有利地利用本文所定義的任何NITR編碼核酸或NITR多肽(其中排除亞硫酸還原酶)來(lái)實(shí)施。編碼NIRT多肽的核酸的實(shí)例可在本領(lǐng)取所知的數(shù)據(jù)庫(kù)中找到(例如提供在表2或序列表中的那些)。這樣的核酸可用于實(shí)施本發(fā)明的方法。直系同源物和旁系同源物，術(shù)語(yǔ)"直系同源物"和"旁系同源物"如本文所定義，可以通過進(jìn)行所謂的交互BLAST搜索容易地得到鑒定。通常，這包括以查詢序列(例如，利用SEQIDNO:2)針對(duì)任何序列數(shù)據(jù)庫(kù)如可公共獲得的NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST的第一BLAST。當(dāng)從核苷酸序列開始時(shí)，通常使用BLASTN或TBLASTX(利用標(biāo)準(zhǔn)默認(rèn)值)，而當(dāng)從蛋白質(zhì)序列開始時(shí)，則使用BLASTP或TBLASTN(利用標(biāo)準(zhǔn)默認(rèn)值)。BLAST結(jié)果可以任選地過濾。接著使用過濾的結(jié)果或者未過濾的結(jié)果中的全長(zhǎng)序列針對(duì)查詢序列來(lái)源生物的序列進(jìn)行反向BLAST(第二BLAST)(在查詢序列為SEQIDNO:l或SEQIDNO:2的情況下，第二BLAST將針對(duì)擬南芥序列進(jìn)行)。然后比較第一和第二BLAST的結(jié)果。如果第一BLAST中分值靠前的命中事件(high-rankinghit)與查詢序列源自相同物種，而反向BLAST理想地導(dǎo)致查詢序列處于最高命中事件之列，則找到了旁系同源物；如果第一BLAST中分值靠前的命中事件與查詢序列源自不同物種，且優(yōu)選地在反向BLAST時(shí)導(dǎo)致查詢序列處于最高命中事件之列，則找到了直系同源物。分值靠前的命中事件是E值低的命中事件。E值越低，分值越具有顯著性(或者換句話說(shuō)，偶然發(fā)現(xiàn)此命中事件的幾率越低)。E值的計(jì)算是本領(lǐng)域眾所周知的。除了E值之外，還可以對(duì)比較進(jìn)行同一性百分比記分。同一性百分比是指兩比較核酸(或多肽)序列之間在特定長(zhǎng)度上的相同核苷酸(或氨基酸)數(shù)。在大家族的情況下，可以使用ClustalW，繼之以鄰接樹，來(lái)輔助對(duì)相關(guān)基因聚類的可視化，和鑒定直系同源物和旁系同源物。編碼SEQIDNO:2的同源物和衍生物的核酸變體也可用于實(shí)施本發(fā)明的方法，術(shù)語(yǔ)"同源物"和"衍生物"如本文所定義。同樣可用于本發(fā)明方法的有編碼SEQIDN0:2的直系同源物或者旁系同源物的同源物和衍生物的核酸?？捎糜诒景l(fā)明方法的同源物和衍生物與其源自的未修飾蛋白質(zhì)具有基本上相同的生物活性和功能活性?？捎糜趯?shí)施本發(fā)明方法的其他核酸變體包括編碼NITR多肽的核酸的部分，與編碼NITR多肽的核酸雜交的核酸，編碼NITR多肽的核酸的剪接變體，編碼NITR多肽的核酸的等位基因變體以及通過基因改組獲得的編碼NITR多肽的核酸的變體。術(shù)語(yǔ)雜交序列、剪接變體、等位基因變體和基因改組如本文所述。編碼NITR多肽的核酸無(wú)需是全長(zhǎng)核酸，因?yàn)楸景l(fā)明方法的實(shí)施不依賴于全長(zhǎng)核酸序列的使用。根據(jù)本發(fā)明，提供了增強(qiáng)植物產(chǎn)率相關(guān)性狀的方法，包括在植物中引入和表達(dá)SEQIDNO:1的一部分、或者編碼SEQIDNO:2的直系同源物、旁系同源物或同源物的核酸的一部分。核酸的"部分"可以例如，通過對(duì)核酸進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)缺失來(lái)制備。"部分"可以以分離的形式使用，或者可將其與其他編碼(或非編碼)序列融合，以便例如，產(chǎn)生組合了若干活性的蛋白質(zhì)。當(dāng)與其他編碼序列融合時(shí)，經(jīng)翻譯后所產(chǎn)生的多肽可能比針對(duì)該蛋白質(zhì)部分所預(yù)測(cè)到的要大。可用于本發(fā)明方法的"部分"編碼如本文所定義的NITR多肽，并與SEQIDN0:2給出的氨基酸序列具有基本上相同的生物活性。優(yōu)選"部分"是SEQIDNO:l給出的任一核酸的部分，或是編碼SEQIDNO:l給出的任一氨基酸序列的直系同源物或旁系同源物的核酸的部分。優(yōu)選"部分"長(zhǎng)至少500，600，700，800，900，1000，1100，1200，1300，1400，1450，1500，1550，1600，1650，1700，1750個(gè)連續(xù)核苷酸，所述連續(xù)核苷酸來(lái)自SEQIDN0:l，或者編碼SEQIDN0:2的直系同源物或旁系同源物的核酸。最優(yōu)選"部分"是SEQIDNO:1的核酸的部分。可用于本發(fā)明方法的另一類核酸變體為在降低的嚴(yán)格條件下，優(yōu)選在嚴(yán)格條件下，能夠與編碼如本文所定義的NITR多肽的核酸，或者本文所定義的"部分"雜交的核酸。根據(jù)本發(fā)明，提供了增強(qiáng)植物產(chǎn)率相關(guān)性狀的方法，包括在植物中引入和表達(dá)能夠與SEQIDNO:1雜交的核酸，或者包括在植物中引入和表達(dá)能夠與編碼SEQIDNO:1的直系同源物、旁系同源物或同源物的核酸雜交的核酸?？捎糜诒景l(fā)明方法的雜交序列編碼如本文所定義的NITR多肽，與SEQIDNO:2給出的氨基酸序列具有基本上相同的生物活性。優(yōu)選雜交序列能夠與SEQIDNO:l雜交、或與任一前述序列的部分雜交，其中部分如上文所定義，或者雜交序列能夠與編碼SEQIDNO:2的直系同源物或旁系同源物的核酸雜交?？捎糜诒景l(fā)明方法的另一類核酸變體為編碼前文所定義的NITR多肽的剪接變體，其中剪接變體如本文所定義。根據(jù)本發(fā)明，提供了增強(qiáng)植物產(chǎn)率相關(guān)性狀的方法，包括在植物中引入和表達(dá)SEQIDNO:1的剪接變體、或編碼SEQIDNO:2的直系同源物、旁系同源物或同源物的核酸的剪接變體?？捎糜趯?shí)施本發(fā)明方法的另一類核酸變體為編碼前文所定義的NITR多肽的核酸的等位基因變體，其中等位基因變體如本文所定義。根據(jù)本發(fā)明，提供了增強(qiáng)植物產(chǎn)率相關(guān)性狀的方法，包括在植物中引入和表達(dá)SEQIDNO:l的等位基因變體，或者包括在植物中引入和表達(dá)編碼SEQIDNO:2所示任一氨基酸序列的直系同源物、旁系同源物或同源物的核酸的等位基因變體?？捎糜诒景l(fā)明方法的等位基因變體與SEQIDNO:2的NITR多肽具有基本上相同的生物活性。等位基因變體天然存在，并且對(duì)這些天然等位基因的應(yīng)用包括在本發(fā)明的方法中?；蚋慕M或者定向進(jìn)化也可用于產(chǎn)生編碼如此所定義的NITR多肽的核酸的變體；其中術(shù)語(yǔ)"基因改組"如本文所定義。根據(jù)本發(fā)明，提供了增強(qiáng)植物產(chǎn)率相關(guān)性狀的方法，包括在植物中引入和表達(dá)SEQIDNO:1的變體，或者包括在植物中引入和表達(dá)編碼SEQIDNO:2的直系同源物、旁系同源物或同源物的核酸的變體，其中所述變體核酸通過基因改組獲得。此外，還可利用定點(diǎn)誘變獲得核酸變體。若干方法可用來(lái)實(shí)現(xiàn)定點(diǎn)誘變，最常見的是基于PCR的方法(CurrentProtocolsinMolecularBiology.Wiley編輯)。編碼NITR多肽的核酸可以來(lái)自任何天然或人工的來(lái)源?？梢酝ㄟ^有意的人為操作在組成和/或基因組環(huán)境上修飾核酸，使之不同于天然形式。優(yōu)選NITR多肽編碼核酸來(lái)自植物。對(duì)于SEQIDN0:1的情況，NITR多肽編碼核酸優(yōu)選來(lái)自單子葉植物，更優(yōu)選來(lái)自十字花科(Brassicaceae)，最優(yōu)選核酸來(lái)自擬南芥。實(shí)施本發(fā)明的方法產(chǎn)生具有增強(qiáng)的產(chǎn)率相關(guān)性狀的植物。特別地，實(shí)施本發(fā)明的方法產(chǎn)生相對(duì)于對(duì)照植物具有增加的早期活力和增加的產(chǎn)率的植物，尤其是具有增加的生物量和增加的種子產(chǎn)率。術(shù)語(yǔ)"產(chǎn)率"和"種子產(chǎn)率"在本文"定義"部分有更詳細(xì)的說(shuō)明。本文所述及的增強(qiáng)的產(chǎn)率相關(guān)性狀應(yīng)理解為表示植物的一個(gè)或多個(gè)部分的早期活力和/或生物量(重量)的增加，所述部分可以包括地上(可收獲)部分和/或地下(可收獲)部分。特別地，這樣的可收獲部分為生物量和/或種子，并且實(shí)施本發(fā)明的方法使得植物相對(duì)于對(duì)照植物的早期活力，生物量或種子產(chǎn)率具有增加的早期活力，生物量和/或種子產(chǎn)率。以玉米為例，產(chǎn)率增加可以表現(xiàn)為如下一個(gè)或多個(gè)方面每平方米建植(established))的植物數(shù)的增加；每株植物的穗數(shù)的增加；行數(shù)、行粒數(shù)、粒重、千粒重、穗長(zhǎng)度/直徑的增加；種子飽滿率(其為飽滿種子數(shù)除以種子總數(shù)并乘以100)的增加，等等。以稻為例，產(chǎn)率增加可以表現(xiàn)為如下一個(gè)或多個(gè)方面的增加每平方米的植物數(shù)、每株植物的圓錐花序數(shù)、每圓錐花序的小穗數(shù)、每圓錐花序的花朵(小花)數(shù)(其表達(dá)為飽滿種子數(shù)占主圓錐花序(primarypanicles)數(shù)的比率)、種子飽滿率(其為飽滿種子數(shù)除以種子總數(shù)并乘以100)的增加、千粒重的增加，等等。本發(fā)明提供了增加植物相對(duì)于對(duì)照植物的產(chǎn)率、特別是生物量和/或種子產(chǎn)率的方法，所述方法包括在植物中調(diào)節(jié)，優(yōu)選增加，編碼本文所定義的NITR多肽的核酸的表達(dá)。由于本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物具有增加的產(chǎn)率，這些植物可能呈現(xiàn)出，相對(duì)于對(duì)照植物在其生命周期相應(yīng)階段的生長(zhǎng)速率而言，增加的生長(zhǎng)速率(至少在其部分生命周期中)。增加的生長(zhǎng)速率可以是對(duì)植物的一個(gè)或多個(gè)部分(包括種子)特異的，或者可以基本上遍及整株植物。具有增加生長(zhǎng)速率的植物可以具有更短的生命周期。植物的生命周期可以理解為表示從成熟干種子生長(zhǎng)至植物產(chǎn)生類似于起始材料的成熟干種子的階段所需的時(shí)間。此生命周期可以受到諸如早期活力、生長(zhǎng)速率、綠度指數(shù)、開花時(shí)間和種子成熟速度等因素的影響。生長(zhǎng)速率的增加可以出現(xiàn)在植物生命周期的一個(gè)或多個(gè)階段，或者出現(xiàn)在基本上整個(gè)植物生命周期的過程中。在植物生命周期的早期階段，生長(zhǎng)速率的增加可以反映出增強(qiáng)的活力。生長(zhǎng)速率的增加可以改變植物的收獲周期，使植物能夠比原來(lái)可能的情況更晚播種和/或更快收獲(類似的效果可以通過較早的開花時(shí)間獲得)。如果生長(zhǎng)速率充分增加，可以允許再播種同種植物物種的種子(例如完全在一個(gè)常規(guī)的生長(zhǎng)期內(nèi)，播種和收獲稻類植物、接著再播種和收獲稻類植物)。與此類似，如果生長(zhǎng)速率充分地增加，可以允許再播種不同植物物種的種子(例如播種和收獲玉米植物，隨后，例如，播種和任選地收獲大豆、馬鈴薯或任何其他適合的植物)。在一些作物植物的情況下，也可能可以從同一砧木得到額外次數(shù)的收獲。改變植物的收獲周期可以導(dǎo)致每平方米年生物量產(chǎn)量的增加(這是由于(比方說(shuō)在一年中)任何特定植物可以生長(zhǎng)和收獲的次數(shù)的增加)。與野生型對(duì)應(yīng)物相比，生長(zhǎng)速率的增加還可能允許在更廣闊的地域栽培轉(zhuǎn)基因植物，這是因?yàn)榉N植作物的地域限制通常由種植時(shí)(早季)或收獲時(shí)(晚季)不利的環(huán)境條件所決定。如果縮短收獲周期，就可以避免這類不利條件?？梢酝ㄟ^從生長(zhǎng)曲線獲得多種參數(shù)來(lái)確定生長(zhǎng)速率，這類參數(shù)可以是T-Mid(植物達(dá)到其最大大小的50%所需的時(shí)間)和T-90(植物達(dá)到其最大大小90%所需的時(shí)間)等等。根據(jù)本發(fā)明一個(gè)優(yōu)選的方面，實(shí)施本發(fā)明的方法產(chǎn)生相對(duì)于對(duì)照植物具有增加的生長(zhǎng)速率的植物。因此，本發(fā)明提供了增加植物生長(zhǎng)速率的方法，所述方法包括調(diào)節(jié)，更優(yōu)選增加，植物中編碼本文所定義的NITR多肽的核酸的表達(dá)。在一個(gè)特定的實(shí)施方案中，實(shí)施本發(fā)明方法導(dǎo)致具有增加的早期活力的植物。與對(duì)照植物相比，產(chǎn)率和/或生長(zhǎng)速率的增加可以發(fā)生在植物處于非脅迫條件下或是植物暴露于各種脅迫下。植物通常通過更緩慢地生長(zhǎng)來(lái)對(duì)暴露于脅迫作出反應(yīng)。在重度的脅迫條件下，植物甚至可能完全停止生長(zhǎng)。另一方面，輕度的脅迫在此處定義為植物暴露于該脅迫后、不導(dǎo)致植物停止生長(zhǎng)和喪失重新生長(zhǎng)的能力的任何脅迫。在本發(fā)明的意義上，輕度脅迫導(dǎo)致受脅迫的植物與在非脅迫條件下的對(duì)照植物相比，生長(zhǎng)減少不足40%、35%或30%，優(yōu)選不足25%、20%或15%，更優(yōu)選不足14%、13%、12%、11%或10%或更低。由于農(nóng)業(yè)實(shí)踐(灌溉、施肥、農(nóng)藥處理)的進(jìn)步，在栽培的作物植物中通常不會(huì)遇到重度脅迫。因此，由輕度脅迫誘導(dǎo)的減弱的生長(zhǎng)通常是農(nóng)業(yè)上不期望的特征。輕度脅迫可以是植物接觸到的日常生物和/或非生物(環(huán)境)脅迫。非生物脅迫可以由干旱或過多的水、缺氧脅迫、鹽脅迫、化學(xué)毒性、氧化脅迫和熱、冷或冰凍溫度引起。非生物脅迫可以是由水脅迫(特別由于干旱)、鹽脅迫、氧化脅迫或離子脅迫引起的滲透脅迫。生物脅迫通常是由病原體例如細(xì)菌、病毒、真菌和昆蟲引起的脅迫。特別地，可以在非脅迫條件下或在輕度干旱條件下實(shí)施本發(fā)明的方法，以產(chǎn)生相對(duì)于對(duì)照植物具有增加的產(chǎn)率的植物。如Wang等(Planta(2003)218:1-14)所報(bào)道的那樣，非生物脅迫引起一系列的形態(tài)學(xué)、生理學(xué)、生物化學(xué)和分子變化，對(duì)植物生長(zhǎng)和生產(chǎn)力造成不利影響。已知干旱、鹽度、極端溫度和氧化脅迫相互聯(lián)系，并可以通過相似的機(jī)制誘發(fā)生長(zhǎng)和細(xì)胞損害。Rabbani等(PlantPhysiol(2003)133:1755-1767)描述了干旱脅迫和高鹽度脅迫之間存在著的一種特別高程度的"對(duì)話(cross-talk)"。例如，干旱和/或鹽度主要表現(xiàn)為滲透脅迫，導(dǎo)致破壞細(xì)胞中的穩(wěn)態(tài)和離子分布。氧化脅迫通常與高溫或低溫、鹽度或干旱脅迫相伴，可以引起功能及結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的變性。所以，這些多種多樣的環(huán)境脅迫通常激活相似的細(xì)胞信號(hào)傳遞路徑和細(xì)胞應(yīng)答，如應(yīng)激蛋白的產(chǎn)生、抗氧化劑的上調(diào)、相容溶質(zhì)的累積以及生長(zhǎng)阻抑。如本文所用的術(shù)語(yǔ)"非脅迫"條件為那些允許植物最佳生長(zhǎng)的環(huán)境條件。本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉給定區(qū)域的正常土壤條件和氣候條件。實(shí)施本發(fā)明的方法產(chǎn)生在非脅迫條件下或在輕度干旱條件下生長(zhǎng)時(shí)相對(duì)于在相當(dāng)條件下生長(zhǎng)的對(duì)照植物具有增加的產(chǎn)率和/或增加的早期活力的植物。因此，根據(jù)本發(fā)明，提供了增加在非脅迫條件下或在輕度干旱條件下生長(zhǎng)的植物的產(chǎn)率和/或早期活力的方法，所述方法包括增加植物中編碼NITR多肽的核酸的表達(dá)。實(shí)施本發(fā)明的方法產(chǎn)生在營(yíng)養(yǎng)不足條件下、特別是在氮缺乏條件下生長(zhǎng)時(shí)相對(duì)于在相當(dāng)條件下生長(zhǎng)的對(duì)照植物具有增加的產(chǎn)率的植物。因此，根據(jù)本發(fā)明，提供了增加在營(yíng)養(yǎng)不足條件下生長(zhǎng)的植物的產(chǎn)率的方法，所述方法包括增加植物中編碼NITR多肽的核酸的表達(dá)。營(yíng)養(yǎng)不足可以因諸如氮、磷及其他含磷化合物、鉀、鈣、鎘、鎂、錳、鐵和硼等養(yǎng)分的缺乏所致。實(shí)施本發(fā)明的方法產(chǎn)生在鹽脅迫條件下生長(zhǎng)時(shí)相對(duì)于在相當(dāng)條件下生長(zhǎng)的對(duì)照植物具有增加的產(chǎn)率的植物。因此，根據(jù)本發(fā)明，提供了增加在鹽脅迫條件下生長(zhǎng)的植物的產(chǎn)率的方法，所述方法包括調(diào)節(jié)植物中編碼POI多肽的核酸的表達(dá)。術(shù)語(yǔ)鹽脅迫不限于食鹽(NaCl)，而可以是NaCl，KC1，LiCl，MgCl2，CaCl2等中的任一種或多種。本發(fā)明包括可由根據(jù)本發(fā)明的方法獲得的植物或其部分(包括種子)。所述植物或其部分含有編碼如上文所定義的NITR多肽的核酸轉(zhuǎn)基因。本發(fā)明還提供遺傳構(gòu)建體和載體，以利于在植物中引入和/或表達(dá)編碼NITR多肽的核酸?？梢詫⒒驑?gòu)建體插入適于轉(zhuǎn)化進(jìn)入植物并適于在轉(zhuǎn)化的細(xì)胞中表達(dá)目的基因的載體中，該載體可以是可商購(gòu)的載體。本發(fā)明還提供了如本文所定義的基因構(gòu)建體在本發(fā)明方法中的用途。更具體地，本發(fā)明提供這樣的構(gòu)建體，其含有(a)編碼如上文所定義的NITR多肽的核酸；(b)—個(gè)或多個(gè)能夠驅(qū)動(dòng)(a)中核酸序列表達(dá)的控制序列；和任選的(c)轉(zhuǎn)錄終止序列。優(yōu)選地，編碼NITR多肽的核酸如上文所定義。術(shù)語(yǔ)"控制序列"和"終止序列"如本文所定義?？梢允褂煤腥魏紊鲜龊怂岬妮d體轉(zhuǎn)化植物。技術(shù)人員充分知曉載體中必須存在的遺傳元件，以便成功進(jìn)行轉(zhuǎn)化、選擇并繁殖含目的序列的宿主細(xì)胞。將目的序列有效連接于一個(gè)或多個(gè)控制序列(至少連接于啟動(dòng)子)。有利地，可以使用任何類型的天然或合成啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)核酸序列的表達(dá)。組成型啟動(dòng)子在本發(fā)明方法中特別有用。優(yōu)選所述組成型啟動(dòng)子還是遍在啟動(dòng)子。關(guān)于各種啟動(dòng)子類型的定義，敬請(qǐng)參見本文"定義"部分。應(yīng)當(dāng)清楚本發(fā)明的可實(shí)施性并不受限于SEQIDNO:1所示的NITR多肽編碼核酸，而且本發(fā)明的可實(shí)施性也不受限于由組成型的特定啟動(dòng)子所驅(qū)動(dòng)的NITR多肽編碼核酸的表達(dá)。組成型啟動(dòng)子優(yōu)選為植物來(lái)源的中度強(qiáng)度的啟動(dòng)子，優(yōu)選為G0S2啟動(dòng)子，更優(yōu)選來(lái)自稻的G0S2啟動(dòng)子。還優(yōu)選組成型啟動(dòng)子為基本上類似于SEQIDN0:3的核酸序列，最優(yōu)選組成型啟動(dòng)子如SEQIDN0:3所示。有關(guān)組成型啟動(dòng)子的更多實(shí)例，敬請(qǐng)參見本文"定義"部分表2。任選的，還可以在引入植物的構(gòu)建體中使用一個(gè)或多個(gè)終止子序列。另外的調(diào)控元件可以包括轉(zhuǎn)錄和翻譯的增強(qiáng)子。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)知道適合用于進(jìn)行本發(fā)明的終止子和增強(qiáng)子的序列。如"定義"部分所說(shuō)明的那樣，也可以向5'非翻譯區(qū)(UTR)或在編碼序列中加入內(nèi)含子序列，以增加在胞質(zhì)中累積的成熟信使的量。其他控制序列(除啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、沉默子、內(nèi)含子序列、3'UTR和/或5'UTR區(qū)域之外)可以是蛋白質(zhì)和/或RNA穩(wěn)定元件。這類序列為本領(lǐng)域技術(shù)人員公知或者可以容易地獲得。本發(fā)明的遺傳構(gòu)建體可以還包括對(duì)于在特定細(xì)胞類型中維持和/或復(fù)制所需的復(fù)制起點(diǎn)序列。一個(gè)實(shí)例是當(dāng)需要將遺傳構(gòu)建體作為附加型遺傳元件(如質(zhì)粒或粘粒分子)在細(xì)菌細(xì)胞中維持的情況。優(yōu)選的復(fù)制起點(diǎn)包括但不限于fl-ori和colEl。為檢測(cè)本發(fā)明方法中所用核酸序列的成功轉(zhuǎn)移和/或選擇含有這些核酸的轉(zhuǎn)基因植物，有利的是使用標(biāo)記基因(或報(bào)告基因)。因此，遺傳構(gòu)建體可以任選地含有可選擇標(biāo)記基因。可選擇標(biāo)記在本文"定義"部分有更詳細(xì)的說(shuō)明。標(biāo)記基因一旦不再需要，可以從轉(zhuǎn)基因細(xì)胞中除去或切除之。進(jìn)行標(biāo)記去除的技術(shù)在本領(lǐng)域公知，有用的技術(shù)在上文"定義"部分有說(shuō)明。本發(fā)明還提供了產(chǎn)生相對(duì)于對(duì)照植物具有增強(qiáng)的產(chǎn)率相關(guān)性狀的轉(zhuǎn)基因植物的方法，包括在植物中引入和表達(dá)任何編碼如前文所定義的NITR多肽的核酸。更具體地，本發(fā)明提供了產(chǎn)生具有增強(qiáng)的產(chǎn)率相關(guān)性狀、特別是增加的早期活力和/或產(chǎn)率的轉(zhuǎn)基因植物的方法，所述方法包括(i)向植物或植物細(xì)胞中引入和表達(dá)NITR多肽編碼核酸；禾口(ii)在促進(jìn)植物生長(zhǎng)和發(fā)育的條件下培養(yǎng)植物細(xì)胞。(i)中的核酸可以是任何能夠編碼如本文所定義的NITR多肽的核酸?？梢詫⒑怂嶂苯右胫参锛?xì)胞或植物本身(包括引入組織、器官或植物的任何其它部分)。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的方面，優(yōu)選通過轉(zhuǎn)化將核酸引入植物。術(shù)語(yǔ)"轉(zhuǎn)化"在本文"定義"部分有更詳細(xì)的說(shuō)明。遺傳修飾的植物細(xì)胞可以通過技術(shù)人員熟悉的所有方法再生。合適的方法可見于上述S.D.Kung和R.Wu、Potrykus或者H6fgen和Willmitzer的出版物。通常在轉(zhuǎn)化以后，選出存在一個(gè)或多個(gè)標(biāo)記的植物細(xì)胞或細(xì)胞群，所述標(biāo)記由與目的基因共轉(zhuǎn)移的植物可表達(dá)基因編碼，繼之將轉(zhuǎn)化的材料再生成整個(gè)植物。為選擇轉(zhuǎn)化的植物，通常將在轉(zhuǎn)化過程中獲得的植物材料置于選擇性條件下，從而可將轉(zhuǎn)化的植物與非轉(zhuǎn)化植物區(qū)分開來(lái)。例如，可以種植以上述方式獲得的種子，并在最初的生長(zhǎng)期之后，通過噴霧對(duì)其進(jìn)行合適的選擇。另一可能方案是使用合適的選擇劑，將種子，酌情在消毒之后，種在瓊脂板上，從而僅轉(zhuǎn)化的種子能夠長(zhǎng)成植物?？蛇x地，針對(duì)轉(zhuǎn)化的植物篩選可選擇標(biāo)記如上文所述標(biāo)記的存在。DNA轉(zhuǎn)移和再生之后，還可評(píng)價(jià)推定轉(zhuǎn)化的植物，例如用Southern分析(DNA印跡)，評(píng)價(jià)目的基因的存在、拷貝數(shù)和/或基因組構(gòu)造?？蛇x的或額外地，可用Northern和/或Western分析(蛋白質(zhì)印跡)監(jiān)測(cè)新引入的DNA的表達(dá)水平，這兩種技術(shù)都是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知的。產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化植物可以通過多種方式繁殖，如通過克隆繁殖或經(jīng)典的育種技術(shù)。例如，第一代(或T1)轉(zhuǎn)化的植物可自交，選擇純合的第二代(或T2)轉(zhuǎn)化體，而T2植物可進(jìn)一步通過經(jīng)典育種技術(shù)繁殖。產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化生物體可以有多種形式。例如，它們可以是轉(zhuǎn)化細(xì)胞和非轉(zhuǎn)化細(xì)胞的嵌合體；克隆轉(zhuǎn)化體(例如所有細(xì)胞經(jīng)轉(zhuǎn)化含有表達(dá)盒)；轉(zhuǎn)化和非轉(zhuǎn)化組織的嫁接體(例如在植物中，轉(zhuǎn)化的砧木嫁接到非轉(zhuǎn)化的接穗上)。本發(fā)明顯然延及由本文所述任何方法產(chǎn)生的任何植物細(xì)胞或植物，以及所有的植物部分及繁殖體。本發(fā)明還延及由任何上述方法產(chǎn)生的原代轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的細(xì)胞、組織、器官或整個(gè)植物的后代，唯一的要求是所述后代呈現(xiàn)出與在本發(fā)明方法中產(chǎn)生的親本相同的基因型和/或表型特征。本發(fā)明也包括含有分離的編碼上文所定義的NITR多肽的核酸的宿主細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的宿主細(xì)胞是植物細(xì)胞。對(duì)于用于本發(fā)明方法的核酸或載體、表達(dá)盒或構(gòu)建體或載體，其宿主植物原則上有利地為能夠合成在本發(fā)明方法中使用的多肽的所有植物。本發(fā)明的方法有利地適用于任何植物。尤其可用于本發(fā)明方法的植物包括屬于植物界超家族的所有植物，尤其是單子葉植物和雙子葉植物，包括飼料或豆科牧草、觀賞植物、糧食作物、喬木或灌木。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案，植物為作物植物。作物植物的實(shí)例包括大豆、向日葵、蕓苔(canola)、苜蓿、油菜籽、棉花、番茄、馬鈴薯和煙草。還優(yōu)選植物是單子葉植物。單子葉植物的實(shí)例包括甘蔗。更優(yōu)選植物是谷類。谷類的實(shí)例包括稻、玉米、小麥、大麥、粟、黑麥、黑小麥、高粱、二粒小麥(emmer)、斯佩耳特小麥(spelt)、裸麥(secale)、單粒小麥(einkorn)、埃塞俄比亞畫眉草(teff)、買羅高粱(milo)和燕麥。本發(fā)明也延及植物的可收獲部分，例如但不限于種子、葉、果實(shí)、花、莖、根、根莖、塊莖和球莖，該可收獲部分含有編碼NITR多肽的重組核酸。本發(fā)明還涉及由這樣的植物的可收獲部分衍生的、優(yōu)選直接衍生的產(chǎn)品，如干丸(pellet)或干粉、油類、脂肪和脂肪酸、淀粉或蛋白質(zhì)。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的方面，受調(diào)節(jié)的表達(dá)是增加的表達(dá)。增加核酸或基因或基因產(chǎn)物表達(dá)的方法在本領(lǐng)域有充分的記錄，并且實(shí)例在"定義"部分提供。如上文所述，調(diào)節(jié)(優(yōu)選，增加)編碼NITR多肽的核酸的表達(dá)的優(yōu)選方法是在植物中引入和表達(dá)編碼NITR多肽的核酸；然而，實(shí)施所述方法的效果，即增強(qiáng)產(chǎn)率相關(guān)性狀，也可以利用其他眾所周知的技術(shù)實(shí)現(xiàn)，包括但不限于T-DNA激活標(biāo)簽、TILLING、同源重組。這些技術(shù)的說(shuō)明在"定義"部分提供。本發(fā)明還包括編碼如本文所述的NITR多肽的核酸以及這些NITR多肽在增強(qiáng)植物任一上述產(chǎn)率相關(guān)性狀中的用途?？梢栽谟N程序中使用編碼本文所述NITR多肽的核酸或所述NITR多肽本身，其中鑒定可能與NITR多肽編碼基因遺傳連鎖的DNA標(biāo)記。可以使用所述核酸/基因或所述NITR多肽本身定義分子標(biāo)記。接著可以將此DNA或蛋白質(zhì)標(biāo)記在育種程序中使用，以選擇如上文在本發(fā)明的方法中定義的具有增強(qiáng)的產(chǎn)率相關(guān)性狀的植物。NITR多肽編碼核酸/基因的等位基因變體也可以用于標(biāo)記輔助的育種程序。這類育種程序有時(shí)需要使用例如EMS誘變，通過植物誘變處理引入等位基因變異；可選的，此類程序可以以一組無(wú)意產(chǎn)生的所謂"天然"起源的等位基因變體開始。然后通過例如PCR進(jìn)行等位基因變體的鑒定。隨后是選擇步驟，用以選擇所討論序列的、提供增加的產(chǎn)率的、優(yōu)良等位基因變體。一般通過監(jiān)測(cè)含有所討論序列的不同等位基因變體的植物的生長(zhǎng)行為來(lái)進(jìn)行選擇?？梢栽跍厥一蛱锏刂斜O(jiān)測(cè)生長(zhǎng)行為。其它任選的步驟包括將經(jīng)鑒定含有優(yōu)良等位基因變體的植物與另一植物雜交。例如，可使用這種方法產(chǎn)生感興趣表型特征的組合。NITR多肽編碼核酸還可以作為探針，用于對(duì)包含其的基因進(jìn)行遺傳和物理作圖以及用作與那些基因連鎖的性狀的標(biāo)志物。這樣的信息可以在植物育種中使用，以培育具有所期望表型的株系。NITR多肽編碼核酸的這類應(yīng)用僅需要長(zhǎng)度至少15個(gè)核苷酸的核酸序列。NITR多肽編碼核酸可以用作限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLP)標(biāo)記?？捎肗ITR多肽編碼核酸探測(cè)限制酶切消化的植物基因組DNA的Southern印跡(SambrookJ，F(xiàn)ritschEF和ManiatisT(1989)《分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》)。隨后使用計(jì)算機(jī)程序如M即Maker(Lander等(1987)Genomics1:174-181)對(duì)產(chǎn)生的帶型進(jìn)行遺傳分析，以構(gòu)建遺傳圖譜。另外，可以使用核酸探測(cè)含有一組個(gè)體的限制性內(nèi)切酶處理的基因組DNA的Southern印跡，所述一組個(gè)體為一個(gè)確定的遺傳雜交的親本和子代。記錄DNA多態(tài)性的分離，并用于計(jì)算NITR多肽編碼核酸在先前用此群體獲得的遺傳圖譜中的位置(Botstein等(1980)Am.J.Hum.Genet.32:314-331)。在遺傳作圖中使用的植物基因衍生探針的產(chǎn)生和應(yīng)用描述于Bematzky和Tanksley(1986)PlantMol.Biol.R印orter4:37-41中。眾多出版物中描述過用上述方法或其變通形式對(duì)特定cDNA克隆進(jìn)行遺傳作圖。例如，可以使用F2雜交群體、回交群體、隨機(jī)交配群體、近等基因系和其它個(gè)體組作圖。這類方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的。核酸探針也可以用來(lái)進(jìn)行物理作圖(即在物理圖譜上安置序列；參見Hoheisel等In:Non-mammalianGenomicAnalysis:APracticalGuide,Academicpress1996，第319-346頁(yè)，及其中引用的參考文獻(xiàn))。在另一個(gè)實(shí)施方案中，核酸探針可用于進(jìn)行直接熒光原位雜交(FISH)作圖(Trask(1991)TrendsGenet.7:149-154)。盡管目前FISH作圖的方法傾向使用大的克隆(幾個(gè)kb到幾百個(gè)kb;參見Laan等(1995)GenomeRes.5:13-20)，但是靈敏性的提高可以允許在FISH作圖中應(yīng)用較短的探針。用于遺傳和物理作圖的多種基于核酸擴(kuò)增的方法可以使用所述核酸進(jìn)行。實(shí)例包括等位基因特異性擴(kuò)增(Kazazian(1989)J.Lab.Clin.Medll:95-96)、PCR擴(kuò)增片段的多態(tài)性(CAPS;Sheffield等(1993)Genomics16:325-332)、等位基因特異性連接(Landegren等(1988)Science241:1077-1080)、核苷酸延伸反應(yīng)(Sokolov(1990)NucleicAcidRes.18:3671)、放射雜交作圖(Walter等(1997)Nat.Genet.7:22-28)和Happy作圖(Dear和Cook(1989)NucleicAcidRes.17:6795-6807)。為實(shí)施這些方法，使用核酸序列設(shè)計(jì)和產(chǎn)生用于擴(kuò)增反應(yīng)或引物延伸反應(yīng)的引物對(duì)。這類引物的設(shè)計(jì)是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的。在采用基于PCR的遺傳作圖的方法中，可能需要鑒定用于作圖雜交的親本之間在相應(yīng)于本發(fā)明核酸序列的區(qū)域中的DNA序列差異。但是，通常這對(duì)作圖方法不是必要的。根據(jù)本發(fā)明的方法得到如前文所述具有增強(qiáng)的產(chǎn)率相關(guān)性狀的植物。這些性狀還可以組合其它經(jīng)濟(jì)上有利的性狀，如其它產(chǎn)率增強(qiáng)性狀、對(duì)其他非生物和生物脅迫的耐受性、改變多種構(gòu)造特征和/或生物化學(xué)和/或生理學(xué)特征的性狀。IIASNS現(xiàn)已令人驚訝地發(fā)現(xiàn)，在植物中調(diào)節(jié)編碼ASNS多肽的核酸表達(dá)，可以使這些植物相對(duì)于對(duì)照植物具有增強(qiáng)的產(chǎn)率相關(guān)性狀。根據(jù)第一種實(shí)施方案，本發(fā)明提供了相對(duì)于對(duì)照植物增強(qiáng)植物的產(chǎn)率相關(guān)性狀的方法，包括調(diào)節(jié)植物中編碼ASNS多肽的核酸的表達(dá)。調(diào)節(jié)(優(yōu)選，增加)編碼ASNS多肽的核酸表達(dá)的一個(gè)優(yōu)選方法是在植物中引入和表達(dá)編碼ASNS多肽的核酸。下文述及的任何"可用于本發(fā)明方法的蛋白質(zhì)"應(yīng)理解為表示如本文所定義的ASNS多肽。下文述及的任何"可用于本發(fā)明方法的核酸"應(yīng)理解為表示能夠編碼這樣的ASNS多肽的核酸。待引入植物(從而可用于實(shí)施本發(fā)明方法)的核酸是編碼現(xiàn)在將要描述的此類蛋白質(zhì)的任何核酸，下文也稱為"ASNS核酸"或"ASNS基因"。如本文定義的"ASNS多肽"指SEQIDNO:63表示的天冬酰胺合成酶以及其同源物(直系同源物和旁系同源物)。與野生型序列(0s06g0265000，SEQIDNO:67)相比，SEQIDNO:63含有兩個(gè)突變R382G和S165G(Fig.6)。位于SEQIDNO:67的位點(diǎn)382的精氨酸在天冬酰胺合成酶中是高度保守的，并且可能是一個(gè)大的a-螺旋的部分，該螺旋界定出于2個(gè)活性位點(diǎn)之間的分子隧道。該精氨酸也接近AMP結(jié)合位點(diǎn)。根據(jù)來(lái)自于大腸桿菌(E.coli.)的結(jié)構(gòu)，在位點(diǎn)165的絲氨酸可能位于扭曲的a-螺旋區(qū)域中，于谷氨酰胺結(jié)合位點(diǎn)的外側(cè)面。據(jù)推測(cè)，S165G突變可能對(duì)該區(qū)域的結(jié)構(gòu)具有很小的影響。因此，用于本發(fā)明方法的ASNS多肽優(yōu)選具有對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:67的R382的精氨酸殘基的替代，替代為可以扭曲該a-螺旋的氨基酸，優(yōu)選甘氨酸?？蛇x地，用于本發(fā)明方法的ASNS多肽還具有對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:67的S165的絲氨酸殘基的替代，替代為另一氨基酸，優(yōu)選甘氨酸。對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:67的R382的精氨酸殘基或者對(duì)應(yīng)于S165的絲氨酸殘40基能通過與SEQIDNO:67的氨基酸序列進(jìn)行序列比對(duì)而鑒定，參加例如圖4的多重比對(duì)。這種比對(duì)方法在本領(lǐng)域眾所周知。優(yōu)選SEQIDNO:63的同源物具有Asn_合成酶結(jié)構(gòu)域。Asn—合成酶結(jié)構(gòu)域(PfamentryPF00733)在本領(lǐng)域眾所周知，易于被該領(lǐng)域的技術(shù)人員鑒定。除了Asn—合成酶結(jié)構(gòu)域，ASNS多肽優(yōu)選還有谷氨酰胺氨基轉(zhuǎn)移酶II類結(jié)構(gòu)域(InterProIPR000583;GATase_2(HMMPfamentryPF00310)，GATase_類型JI(PROSITEentryPS00443))和/或天冬酰胺合成酶、谷氨酰胺水解結(jié)構(gòu)域(aSn_Synth_AEB:天冬酰胺合成酶(glutami(TIGRFAMsentryTIGR01536)))?？蛇x地，ASNS蛋白質(zhì)同源物按照遞增的優(yōu)選順序與SEQIDNO:63所示的氨基酸序列具有至少25%，26%，27%，28%，29%，30%，31%，32%，33%，34%，35%，36%，37%，38%，39%，40%，41%，42%，43%，44%，45%，46%，47%，48%，49%，50%，51%，52%，53%，54%，55%，56%，57%，58%，59%，60%，61%，62%，63%，64%，65%，66%，67%，68%，69%，70%，71%，72%，73%，74%，75%，76%，77%，78%，79%，80%，81%，82%，83%，84%，85%，86%，87%，88%，89%，90%，91%，92%，93%，94%，95%，96%，97%，98%，或99%的總體序列同一性，前提是同源蛋白質(zhì)含有如上所描述的保守基序和對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:67的R382的精氨酸殘基的替代。總體序列同一性利用全局比對(duì)算法，如GAP程序(GCGWisconsinPackage,Accelrys)中的NeedlemanWunsch算法來(lái)確定，優(yōu)選采用默認(rèn)參數(shù)。當(dāng)僅考慮保守結(jié)構(gòu)域或基序時(shí)，此時(shí)的序列同一性與總體序列同一性相比通常要更高。術(shù)語(yǔ)"結(jié)構(gòu)域"和"基序"在本文"定義"部分進(jìn)行了定義。存在用于鑒定結(jié)構(gòu)域的專家數(shù)據(jù)庫(kù)，例如SMART(Schultz等(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA95,5857-5864;Letunic等(2002)NucleicAcidsRes30，242-244)、InterPro(Mulder等，(2003)Nucl.Acids.Res.31，315-318)、Prosite(Bucher禾口Bairoch(1994)，Ageneralizedprofilesyntaxforbiomolecularsequencesmotifsanditsfunctioninautomaticsequenceinterpretation.(In)ISMB-94;第二屆分子生物學(xué)智能系統(tǒng)國(guó)際會(huì)議記錄(Proceedings2ndInternationalConferenceonIntelligentSystemsforMolecularBiology)AltmanR.，BrutlagD.，KarpP.，LathropR.，SearlsD.編輯，53-61頁(yè)，AAAIPress,MenloPark;Hulo等，Nucl.Acids.Res.32:D134_D137，(2004))或者Pfam(Bateman等，NucleicAcidsResearch30(1):276-280(2002)。進(jìn)行蛋白質(zhì)序列芯片(insilico)分析的一組工具可以從ExPASy蛋白質(zhì)組學(xué)服務(wù)器獲得(瑞士生物信息學(xué)研究所(SwissInstituteofBioinformatics)(Gasteiger等ExPASy:theproteomicsserverforin_depthproteinknowledgeandanalysis.NucleicAcidsRes31:3784-3788(2003))。也可以利用常規(guī)技術(shù)如通過序列比對(duì)鑒定結(jié)構(gòu)域或基序。為比較而進(jìn)行序列比對(duì)的方法是本領(lǐng)域眾所周知的，此類方法包括GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA和TFASTA。GAP使用Needleman和Wunsch的算法((1970)J.Mol.Biol.48:443-453)來(lái)尋找可以使匹配數(shù)最大化且空位數(shù)最小化的兩序列間的全局(即跨越全序列)比對(duì)。BLAST算法(Altschul等(1990)JMolBiol215:403-10)計(jì)算序列同一性百分比，并對(duì)兩序列之間的相似性進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。執(zhí)行BLAST分析的軟件可通過美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心(NCBI)公開地獲得。例如，同源物可以使用ClustalW多重序列比對(duì)算法(1.83版)，采用默認(rèn)的成對(duì)比對(duì)參數(shù)以及百分比的記分方法而容易地鑒定。利用可獲自MatGAT軟件包(Campanella等BMCBioinformatics.2003年7月10日4:29.MatGAT:anapplicationthatgeneratessimilarity/identitymatricesusingproteinorDNAsequences)的萬(wàn)法之一，也可以確定全局相似性和同一性百分比。可以進(jìn)行微小的人工編輯以優(yōu)化保守基序之間的比對(duì)，這對(duì)于所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員而言將是顯而易見的。此外，除了利用全長(zhǎng)序列進(jìn)行同源物鑒定以外，還可以利用特定的結(jié)構(gòu)域?？梢岳蒙鲜龀绦虿捎媚J(rèn)參數(shù)針對(duì)完整核酸或氨基酸序列或者針對(duì)選擇的結(jié)構(gòu)域或保守基序來(lái)確定序列同一性值。對(duì)于局部比對(duì)，Smith-Waterman算法特別有用(SmithTF，WatermanMS(1981)J.Mol.Biol147(1);195-7)。此外，ASNS多肽(至少其天然形式)，就SEQIDNO:63及其同源物而言，一般具有天冬酰胺合成酶活性(Pattersonand0rr，J.Biol.Chem.243，376-380，1968;EnzymeCatalogue6.3.5.4，反應(yīng)式ATP+L-天冬氨酸+L-谷氨酰胺+H20=AMP+二磷酸+L_天冬酰胺+L_谷氨酸)。本領(lǐng)域公知測(cè)定天冬酰胺合成酶活性的工具和技術(shù)。本發(fā)明以SEQIDNO:62所示的核酸序列轉(zhuǎn)化植物來(lái)進(jìn)行舉例說(shuō)明，其編碼SEQIDNO:63的多肽序列。然而，本發(fā)明的實(shí)施并不局限于這些序列；本發(fā)明的方法可以有利地利用本文所定義的任何ASNS編碼核酸或ASNS多肽來(lái)實(shí)施。編碼ASNS多肽的核酸的實(shí)例可在本領(lǐng)取所知的數(shù)據(jù)庫(kù)中找到，其中一些列于圖5中。這樣的核酸可用于實(shí)施本發(fā)明的方法。直系同源物和旁系同源物，術(shù)語(yǔ)"直系同源物"和"旁系同源物"如本文所定義，可以通過進(jìn)行所謂的交互BLAST搜索容易地得到鑒定。通常，這包括以查詢序列(例如，利用SEQIDNO:63)針對(duì)任何序列數(shù)據(jù)庫(kù)如可公共獲得的NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST的第一BLAST。當(dāng)從核苷酸序列開始時(shí)，通常使用BLASTN或TBLASTX(利用標(biāo)準(zhǔn)默認(rèn)值)，而當(dāng)從蛋白質(zhì)序列開始時(shí)，則使用BLASTP或TBLASTN(利用標(biāo)準(zhǔn)默認(rèn)值)。BLAST結(jié)果可以任選地過濾。接著使用過濾的結(jié)果或者未過濾的結(jié)果中的全長(zhǎng)序列針對(duì)查詢序列來(lái)源生物的序列進(jìn)行反向BLAST(第二BLAST)(在查詢序列為SEQIDN0:62或SEQIDNO:63的情況下，第二BLAST將針對(duì)稻序列進(jìn)行)。然后比較第一和第二BLAST的結(jié)果。如果第一BLAST中分值靠前的命中事件來(lái)自查詢序列源自的相同物種，而反向BLAST理想地導(dǎo)致查詢序列處于最高命中事件之列，則找到了旁系同源物；如果第一BLAST中分值靠前的命中事件不來(lái)自查詢序列源自的相同物種，且優(yōu)選地在反向BLAST時(shí)導(dǎo)致查詢序列處于最高命中事件之列，則找到了直系同源物。SEQIDNO:63或SEQIDNO:67的直系同源物和旁系同源物的實(shí)例列于圖5中。分值靠前的命中事件是E值低的命中事件。E值越低，分值越具有顯著性(或者換句話說(shuō)，偶然發(fā)現(xiàn)此命中事件的幾率越低)。E值的計(jì)算是本領(lǐng)域眾所周知的。除了E值之外，還對(duì)比較進(jìn)行同一性百分比記分。同一性百分比是指兩比較核酸(或多肽)序列之間在特定長(zhǎng)度上的相同核苷酸(或氨基酸)數(shù)。在大家族的情況下可以使用ClustalW，繼之以鄰接樹來(lái)輔助對(duì)相關(guān)基因聚類的可視化，和鑒定直系同源物和旁系同源物。編碼SEQIDNO:63的同源物和衍生物的核酸變體也可用于實(shí)施本發(fā)明的方法，術(shù)語(yǔ)"同源物"和"衍生物"如本文所定義。同樣可用于本發(fā)明方法的有編碼SEQIDNO:63的直系同源物或者旁系同源物的同源物和衍生物的核酸?？捎糜诒景l(fā)明方法的同源物和衍生物與其源自的未修飾蛋白質(zhì)具有基本上相同的生物活性和功能活性?？捎糜趯?shí)施本發(fā)明方法的其他核酸變體包括編碼ASNS多肽的核酸的部分，與編碼ASNS多肽的核酸雜交的核酸，編碼ASNS多肽的核酸的剪接變體，編碼ASNS多肽的核酸的等位基因變體以及通過基因改組獲得的編碼ASNS多肽的核酸的變體。術(shù)語(yǔ)雜交序列、剪接變體、等位基因變體和基因改組如本文所述。編碼ASNS多肽的核酸無(wú)需是全長(zhǎng)核酸，因?yàn)楸景l(fā)明方法的實(shí)施不依賴于全長(zhǎng)核酸序列的使用。根據(jù)本發(fā)明，提供了增強(qiáng)植物產(chǎn)率相關(guān)性狀的方法，包括在植物中引入和表達(dá)SEQIDNO:62的一部分、或者編碼SEQIDNO:63的直系同源物、旁系同源物或同源物的核酸的一部分。核酸的"部分"可以例如，通過對(duì)核酸進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)缺失來(lái)制備。"部分"可以以分離的形式使用，或者可將其融合至其他編碼(或非編碼)序列，以便例如，產(chǎn)生組合了若干活性的蛋白質(zhì)。當(dāng)融合至其他編碼序列時(shí)，經(jīng)翻譯后所產(chǎn)生的多肽可能比針對(duì)該蛋白質(zhì)部分所預(yù)測(cè)到的要大。可用于本發(fā)明方法的"部分"編碼如本文所定義的目多肽，并與SEQIDNO:63給出的氨基酸序列具有基本上相同的生物活性。優(yōu)選"部分"是SEQIDN0:62給出的任一核酸的部分，或是編碼SEQIDN0:62給出的任一氨基酸序列的直系同源物或旁系同源物的核酸的部分。優(yōu)選"部分"長(zhǎng)至少800,900，1000，1100，1200，1300，1400，1450，1500，1550，1600，1650，1700，1750個(gè)連續(xù)核苷酸，所述連續(xù)核苷酸來(lái)自SEQIDNO:62、或者編碼SEQIDNO:63的直系同源物或旁系同源物的核酸。最優(yōu)選"部分"是SEQIDNO:62的核酸的部分?？捎糜诒景l(fā)明方法的另一類核酸變體為在降低的嚴(yán)格條件下，優(yōu)選在嚴(yán)格條件下，能夠與編碼如本文所定義的ASNS多肽的核酸，或者本文所定義的"部分"雜交的核酸。根據(jù)本發(fā)明，提供了增強(qiáng)植物產(chǎn)率相關(guān)性狀的方法，包括在植物中引入和表達(dá)能夠與SEQIDNO:62雜交的核酸，或者包括在植物中引入和表達(dá)能夠與編碼SEQIDNO:62的直系同源物、旁系同源物或同源物的核酸雜交的核酸?？捎糜诒景l(fā)明方法的雜交序列編碼如本文所定義的ASNS多肽，與SEQIDNO:63給出的氨基酸序列具有基本上相同的生物活性。優(yōu)選雜交序列能夠與SEQIDN0:62雜交、或與任一前述序列的部分雜交，其中部分如上文所定義，或者雜交序列能夠與編碼SEQIDNO:63的直系同源物或旁系同源物的核酸雜交?？捎糜诒景l(fā)明方法的另一類核酸變體為編碼前文所定義的ASNS多肽的剪接變體，其中剪接變體如本文所定義。根據(jù)本發(fā)明，提供了增強(qiáng)植物產(chǎn)率相關(guān)性狀的方法，包括在植物中引入和表達(dá)SEQIDNO:62的剪接變體、或編碼SEQIDNO:63的直系同源物、旁系同源物或同源物的核酸的剪接變體。可用于實(shí)施本發(fā)明方法的另一類核酸變體為編碼前文所定義的ASNS多肽的核酸的等位基因變體，其中等位基因變體如本文所定義。根據(jù)本發(fā)明，提供了增強(qiáng)植物產(chǎn)率相關(guān)性狀的方法，包括在植物中引入和表達(dá)SEQIDNO:62的等位基因變體，或者包括在植物中引入和表達(dá)編碼SEQIDNO:63所示氨基酸序列的直系同源物、旁系同源物或同源物的核酸的等位基因變體。可用于本發(fā)明方法的等位基因變體與SEQIDNO:63的ASNS多肽具有基本上相同的生物活性。等位基因變體天然存在，并且這些天然等位基因的應(yīng)用包括在本發(fā)明的方法中?；蚋慕M或者定向進(jìn)化也可用于產(chǎn)生編碼上文所定義的ASNS多肽的核酸的變體；其中術(shù)語(yǔ)"基因改組"如本文所定義。根據(jù)本發(fā)明，提供了增強(qiáng)植物產(chǎn)率相關(guān)性狀的方法，包括在植物中引入和表達(dá)SEQIDN0:62的變體，或者包括在植物中引入和表達(dá)編碼SEQIDNO:63的直系同源物、旁系同源物或同源物的核酸的變體，其中所述變體核酸通過基因改組獲得。此外，還可利用定點(diǎn)誘變獲得核酸變體。若干方法可用來(lái)實(shí)現(xiàn)定點(diǎn)誘變，最常見的是基于PCR的方法(CurrentProtocolsinMolecularBiology.Wiley編輯)。編碼ASNS多肽的核酸可以來(lái)自任何天然或人工的來(lái)源?？梢酝ㄟ^有意的人為操作在組成和/或基因組環(huán)境上修飾核酸，使之不同于天然形式。優(yōu)選ASNS多肽編碼核酸來(lái)自植物。對(duì)于SEQIDN0:62的情況，ASNS多肽編碼核酸優(yōu)選來(lái)自單子葉植物，更優(yōu)選來(lái)自禾本科(Poaceae)，最優(yōu)選核酸來(lái)自稻(0ryzasativa)。實(shí)施本發(fā)明的方法導(dǎo)致植物具有增強(qiáng)的產(chǎn)率相關(guān)性狀。特別地，實(shí)施本發(fā)明的方法導(dǎo)致植物相對(duì)于對(duì)照植物具有增加的早期活力和增加的產(chǎn)率，尤其是增加的生物量和增加的種子產(chǎn)率。術(shù)語(yǔ)"產(chǎn)率"和"種子產(chǎn)率"在本文"定義"部分有更詳細(xì)的說(shuō)明。本文所述及的增強(qiáng)的產(chǎn)率相關(guān)性狀應(yīng)理解為表示植物的一個(gè)或多個(gè)部分的早期活力和/或生物量(重量)的增加，所述部分可以包括地上(可收獲)部分和/或地下(可收獲)部分。特別地，這樣的可收獲部分為生物量和/或種子，并且實(shí)施本發(fā)明的方法使得植物相對(duì)于對(duì)照植物的早期活力，生物量或種子產(chǎn)率具有增加的早期活力，生物量和/或種子產(chǎn)率。以玉米為例，產(chǎn)率增加可以表現(xiàn)為如下一個(gè)或多個(gè)方面每平方米建植(established))的植物數(shù)的增加；每株植物的穗數(shù)的增加；行數(shù)、行粒數(shù)、粒重、千粒重、穗長(zhǎng)度/直徑的增加；種子飽滿率(其為飽滿種子數(shù)除以種子總數(shù)并乘以100)的增加，等等。以稻為例，產(chǎn)率增加可以表現(xiàn)為如下一個(gè)或多個(gè)方面的增加每平方米的植物數(shù)、每株植物的圓錐花序數(shù)、每圓錐花序的小穗數(shù)、每圓錐花序的花朵(小花)數(shù)(其表達(dá)為飽滿種子數(shù)占主圓錐花序(primarypanicles)數(shù)的比率)、種子飽滿率(其為飽滿種子數(shù)除以種子總數(shù)并乘以100)的增加、千粒重的增加，等等。本發(fā)明提供了增加植物相對(duì)于對(duì)照植物的產(chǎn)率、特別是生物量和/或種子產(chǎn)率的方法，所述方法包括調(diào)節(jié)，優(yōu)選增加，植物中編碼本文所定義的ASNS多肽的核酸的表達(dá)。由于本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物具有增加的產(chǎn)率，這些植物可呈現(xiàn)出，相對(duì)于對(duì)照植物在其生命周期相應(yīng)階段的生長(zhǎng)速率而言，增加的生長(zhǎng)速率(至少在其部分生命周期中)。增加的生長(zhǎng)速率可以是對(duì)植物的一個(gè)或多個(gè)部分(包括種子)特異的，或者可以基本上遍及整株植物。具有增加生長(zhǎng)速率的植物可以具有更短的生命周期。植物的生命周期可以理解為表示從成熟干種子生長(zhǎng)至植物產(chǎn)生類似于起始材料的成熟干種子的階段所需的時(shí)間。此生命周期可以受到諸如早期活力、生長(zhǎng)速率、綠度指數(shù)、開花時(shí)間和種子成熟速度等因素的影響。生長(zhǎng)速率的增加可以出現(xiàn)在植物生命周期的一個(gè)或多個(gè)階段，或者出現(xiàn)在基本上整個(gè)植物生命周期的過程中。在植物生命周期的早期階段，生長(zhǎng)速率的增加可以反映為增強(qiáng)的活力。生長(zhǎng)速率的增加可以改變植物的收獲周期，使植物能夠比原來(lái)可能的情況更晚播種和/或更快收獲(類似的效果可以通過較早的開花時(shí)間獲得)。如果生長(zhǎng)44速率充分增加，可以允許再播種同種植物物種的種子(例如完全在一個(gè)常規(guī)的生長(zhǎng)期內(nèi)，播種和收獲稻類植物、接著再播種和收獲稻類植物)。與此類似，如果生長(zhǎng)速率充分地增加，可以允許再播種不同植物物種的種子(例如播種和收獲玉米植物，隨后，例如，播種和任選地收獲大豆、馬鈴薯或任何其他適合的植物)。在一些作物植物的情況下，也可能可以從同一砧木得到額外次數(shù)的收獲。改變植物的收獲周期可以導(dǎo)致每平方米年生物量產(chǎn)量的增加(這是由于(比方說(shuō)在一年中)任何特定植物可以生長(zhǎng)和收獲的次數(shù)的增加)。與野生型對(duì)應(yīng)物相比，生長(zhǎng)速率的增加還可能允許在更廣闊的地域栽培轉(zhuǎn)基因植物，這是因?yàn)榉N植作物的地域限制通常由種植時(shí)(早季)或收獲時(shí)(晚季)不利的環(huán)境條件所決定。如果縮短收獲周期，就可以避免這類不利條件?？梢酝ㄟ^從生長(zhǎng)曲線獲得多種參數(shù)來(lái)確定生長(zhǎng)速率，這類參數(shù)可以是T-Mid(植物達(dá)到其最大大小的50%所需的時(shí)間)和T-90(植物達(dá)到其最大大小90%所需的時(shí)間)等等。根據(jù)本發(fā)明一個(gè)優(yōu)選的方面，實(shí)施本發(fā)明的方法產(chǎn)生相對(duì)于對(duì)照植物具有增加的生長(zhǎng)速率的植物。因此，本發(fā)明提供了增加植物生長(zhǎng)速率的方法，所述方法包括調(diào)節(jié)，更優(yōu)選增加，植物中編碼本文所定義的ASNS多肽的核酸的表達(dá)。在一個(gè)特定的實(shí)施方案中，實(shí)施本發(fā)明方法導(dǎo)致具有增加的早期活力的植物。與對(duì)照植物相比，產(chǎn)率和/或生長(zhǎng)速率的增加可以發(fā)生在植物處于非脅迫條件下或是植物暴露于各種脅迫時(shí)。植物通常通過更緩慢地生長(zhǎng)來(lái)對(duì)暴露于脅迫作出反應(yīng)。在重度的脅迫條件下，植物甚至可能完全停止生長(zhǎng)。另一方面，輕度的脅迫在此處定義為植物暴露于該脅迫后、不導(dǎo)致植物停止生長(zhǎng)和喪失重新生長(zhǎng)的能力的任何脅迫。在本發(fā)明的意義上，輕度脅迫導(dǎo)致受脅迫的植物與在非脅迫條件下的對(duì)照植物相比，生長(zhǎng)減少不足40%、35%或30%，優(yōu)選不足25%、20%或15%，更優(yōu)選不足14%、13%、12%、11%或10%或更低。由于農(nóng)業(yè)實(shí)踐(灌溉、施肥、農(nóng)藥處理)的進(jìn)步，在栽培的作物植物中通常不會(huì)遇到重度脅迫。因此，由輕度脅迫誘導(dǎo)的減弱的生長(zhǎng)通常是農(nóng)業(yè)上不期望的特征。輕度脅迫可以是植物接觸到的日常生物和/或非生物(環(huán)境)脅迫。非生物脅迫可以由干旱或過多的水、缺氧脅迫、鹽脅迫、化學(xué)毒性、氧化脅迫和熱、冷或冰凍溫度引起。非生物脅迫可以是由水脅迫(特別由于干旱)、鹽脅迫、氧化脅迫或離子脅迫引起的滲透脅迫。生物脅迫通常是由病原體例如細(xì)菌、病毒、真菌和昆蟲引起的脅迫。特別地，可以在非脅迫條件下或在輕度干旱條件下實(shí)施本發(fā)明的方法，以產(chǎn)生相對(duì)于對(duì)照植物具有增加的產(chǎn)率的植物。如Wang等(Planta(2003)218:1-14)所報(bào)道的那樣，非生物脅迫引起一系列的形態(tài)學(xué)、生理學(xué)、生物化學(xué)和分子變化，對(duì)植物生長(zhǎng)和生產(chǎn)力造成不利影響。已知干旱、鹽度、極端溫度和氧化脅迫相互聯(lián)系，并可以通過相似的機(jī)制誘發(fā)生長(zhǎng)和細(xì)胞損害。Rabbani等(PlantPhysiol(2003)133:1755-1767)描述了在干旱脅迫和高鹽度脅迫之間的特別高程度的"對(duì)話(cross-talk)"。例如，干旱和/或鹽度主要表現(xiàn)為滲透脅迫，導(dǎo)致破壞細(xì)胞中的穩(wěn)態(tài)和離子分布。氧化脅迫通常與高溫或低溫、鹽度或干旱脅迫相伴，可以引起功能及結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的變性。所以，這些多種多樣的環(huán)境脅迫通常激活相似的細(xì)胞信號(hào)傳遞路徑和細(xì)胞應(yīng)答，如應(yīng)激蛋白的產(chǎn)生、抗氧化劑的上調(diào)、相容溶質(zhì)的累積以及生長(zhǎng)阻抑。如本文所用的術(shù)語(yǔ)"非脅迫"條件為那些允許植物最佳生長(zhǎng)的環(huán)境條件。本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉給定區(qū)域的正常土壤條件和氣候條件。實(shí)施本發(fā)明的方法產(chǎn)生在非脅迫條件下或在輕度干旱條件下生長(zhǎng)時(shí)相對(duì)于在相當(dāng)條件下生長(zhǎng)的對(duì)照植物具有增加的產(chǎn)率和/或增加的早期活力的植物。因此，根據(jù)本發(fā)明，提供了增加在非脅迫條件下或在輕度干旱條件下生長(zhǎng)的植物的產(chǎn)率和/或早期活力的方法，所述方法包括增加植物中編碼ASNS多肽的核酸的表達(dá)。實(shí)施本發(fā)明的方法產(chǎn)生在營(yíng)養(yǎng)不足條件下、特別是在氮缺乏條件下生長(zhǎng)時(shí)相對(duì)于在相當(dāng)條件下生長(zhǎng)的對(duì)照植物具有增加的產(chǎn)率的植物。因此，根據(jù)本發(fā)明，提供了增加在營(yíng)養(yǎng)不足條件下生長(zhǎng)的植物的產(chǎn)率的方法，所述方法包括增加植物中編碼ASNS多肽的核酸的表達(dá)。營(yíng)養(yǎng)不足可以因諸如氮、磷及其他含磷化合物、鉀、鈣、鎘、鎂、錳、鐵和硼等養(yǎng)分的缺乏所致。實(shí)施本發(fā)明的方法產(chǎn)生在鹽脅迫條件下生長(zhǎng)時(shí)相對(duì)于在相當(dāng)條件下生長(zhǎng)的對(duì)照植物具有增加的產(chǎn)率的植物。因此，根據(jù)本發(fā)明，提供了增加在鹽脅迫條件下生長(zhǎng)的植物的產(chǎn)率的方法，所述方法包括調(diào)節(jié)植物中編碼ASNS多肽的核酸的表達(dá)。術(shù)語(yǔ)鹽脅迫不限于食鹽(NaCl)，而可以是NaCl，KC1，LiCl，MgCl2，CaCl2等中的任一種或多種。本發(fā)明包括可由根據(jù)本發(fā)明的方法獲得的植物或其部分(包括種子)。所述植物或其部分含有編碼如上文所定義的ASNS多肽的核酸轉(zhuǎn)基因。本發(fā)明還提供遺傳構(gòu)建體和載體，以利于在植物中引入和/或表達(dá)編碼ASNS多肽的核酸。可以將基因構(gòu)建體插入適于轉(zhuǎn)化進(jìn)入植物并適于在轉(zhuǎn)化的細(xì)胞中表達(dá)目的基因的載體中，該載體可以是可商購(gòu)的載體。本發(fā)明還提供了如本文所定義的基因構(gòu)建體在本發(fā)明方法中的用途。更具體地，本發(fā)明提供這樣的構(gòu)建體，其含有(a)編碼如上文所定義的ASNS多肽的核酸；(b)—個(gè)或多個(gè)能夠驅(qū)動(dòng)(a)中核酸序列表達(dá)的控制序列；和任選的[O315](c)轉(zhuǎn)錄終止序列。優(yōu)選地，編碼ASNS多肽的核酸如上文所定義。術(shù)語(yǔ)"控制序列"和"終止序列"如本文所定義。可以使用含有任何上述核酸的載體轉(zhuǎn)化植物。技術(shù)人員充分知曉載體中必須存在的遺傳元件，以便成功進(jìn)行轉(zhuǎn)化、選擇并繁殖含目的序列的宿主細(xì)胞。將目的序列有效連接于一個(gè)或多個(gè)控制序列(至少連接于啟動(dòng)子)。有利地，可以使用任何類型的天然或合成啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)核酸序列的表達(dá)，但優(yōu)選地，啟動(dòng)子為植物來(lái)源的。組成型啟動(dòng)子在本發(fā)明方法中特別有用。優(yōu)選所述組成型啟動(dòng)子還是中等強(qiáng)度的遍在啟動(dòng)子。關(guān)于各種啟動(dòng)子類型的定義，敬請(qǐng)參見本文"定義"部分。應(yīng)當(dāng)清楚本發(fā)明的可實(shí)施性并不受限于SEQIDN0:62所示的ASNS多肽編碼核酸，而且本發(fā)明的可實(shí)施性也不受限于由組成型的特定啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的ASNS多肽編碼核酸的表達(dá)。組成型啟動(dòng)子優(yōu)選為G0S2啟動(dòng)子，更優(yōu)選來(lái)自稻的G0S2啟動(dòng)子。還優(yōu)選組成型啟動(dòng)子為基本上類似于SEQIDNO:64的核酸序列，最優(yōu)選組成型啟動(dòng)子如SEQIDNO:64所示。有關(guān)組成型啟動(dòng)子的更多實(shí)例，敬請(qǐng)參見本文"定義"部分表2。任選的，還可以在引入植物的構(gòu)建體中使用一個(gè)或多個(gè)終止子序列。另外的調(diào)控元件可以包括轉(zhuǎn)錄和翻譯的增強(qiáng)子。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)知道適合用于進(jìn)行本發(fā)明的終止子和增強(qiáng)子的序列。如"定義"部分所說(shuō)明的那樣，也可以向5'非翻譯區(qū)(UTR)或在編碼序46列中加入內(nèi)含子序列，以增加在胞質(zhì)中累積的成熟信使的量。其他控制序列(除啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、沉默子、內(nèi)含子序列、3'UTR和/或5'UTR區(qū)域之外)可以是蛋白質(zhì)和/或RNA穩(wěn)定元件。這類序列為本領(lǐng)域技術(shù)人員公知或者可以容易地獲得。本發(fā)明的遺傳構(gòu)建體還可以包括對(duì)于在特定細(xì)胞類型中維持和/或復(fù)制所需的復(fù)制起點(diǎn)序列。一個(gè)實(shí)例是當(dāng)需要將遺傳構(gòu)建體作為附加型遺傳元件(如質(zhì)粒或粘粒分子)在細(xì)菌細(xì)胞中維持的情況。優(yōu)選的復(fù)制起點(diǎn)包括但不限于fl-ori和colEl。為檢測(cè)本發(fā)明方法中所用核酸序列的成功轉(zhuǎn)移和/或選擇含有這些核酸的轉(zhuǎn)基因植物，有利的是使用標(biāo)記基因(或報(bào)告基因)。因此，遺傳構(gòu)建體可以任選地含有可選擇標(biāo)記基因?？蛇x擇標(biāo)記在本文"定義"部分有更詳細(xì)的說(shuō)明。標(biāo)記基因一旦不再需要，可以從轉(zhuǎn)基因細(xì)胞中除去或切除之。進(jìn)行標(biāo)記去除的技術(shù)在本領(lǐng)域公知，有用的技術(shù)在上文"定義"部分有說(shuō)明。本發(fā)明還提供了產(chǎn)生相對(duì)于對(duì)照植物具有增強(qiáng)的產(chǎn)率相關(guān)性狀的轉(zhuǎn)基因植物的方法，包括在植物中引入和表達(dá)任何編碼如前文所定義的ASNS多肽的核酸。更具體地，本發(fā)明提供了產(chǎn)生具有增強(qiáng)的產(chǎn)率相關(guān)性狀、特別是增加的早期活力和/或產(chǎn)率的轉(zhuǎn)基因植物的方法，所述方法包括(i)向植物或植物細(xì)胞中引入和表達(dá)ASNS多肽編碼核酸；禾口(ii)在促進(jìn)植物生長(zhǎng)和發(fā)育的條件下培養(yǎng)植物細(xì)胞。(i)中的核酸可以是任何能夠編碼如本文所定義的ASNS多肽的核酸。可以將核酸直接引入植物細(xì)胞或植物本身(包括引入組織、器官或植物的任何其它部分)。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的方面，優(yōu)選通過轉(zhuǎn)化將核酸引入植物。術(shù)語(yǔ)"轉(zhuǎn)化"在本文"定義"部分有更詳細(xì)的說(shuō)明。遺傳修飾的植物細(xì)胞可以通過技術(shù)人員熟悉的所有方法再生。合適的方法可見于上述S.D.Kung和R.Wu、Potrykus或者H6fgen:和Willmitzer的出版物。通常在轉(zhuǎn)化以后，選出存在一個(gè)或多個(gè)標(biāo)記的植物細(xì)胞或細(xì)胞群，所述標(biāo)記由與目的基因共轉(zhuǎn)移的植物可表達(dá)基因編碼，繼之將轉(zhuǎn)化的材料再生成整個(gè)植物。為選擇轉(zhuǎn)化的植物，通常將在轉(zhuǎn)化過程中獲得的植物材料置于選擇性條件下，從而可將轉(zhuǎn)化的植物與非轉(zhuǎn)化植物區(qū)分開來(lái)。例如，可以種植以上述方式獲得的種子，并在最初的生長(zhǎng)期之后，通過噴霧對(duì)其進(jìn)行合適的選擇。另一可能方案是，將種子，酌情在消毒之后，種在使用合適選擇劑的瓊脂板上，從而僅轉(zhuǎn)化的種子能夠長(zhǎng)成植物。可選地，針對(duì)轉(zhuǎn)化的植物篩選可選擇標(biāo)記如上文所述標(biāo)記的存在。DNA轉(zhuǎn)移和再生之后，還可評(píng)價(jià)推定轉(zhuǎn)化的植物，例如用Southern分析(DNA印跡)，評(píng)價(jià)目的基因的存在、拷貝數(shù)和/或基因組構(gòu)造。可選的或額外地，可用Northern和/或Western分析(蛋白質(zhì)印跡)監(jiān)測(cè)新引入的DNA的表達(dá)水平，這兩種技術(shù)都是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知的。產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化植物可以通過多種方式繁殖，如通過克隆繁殖或經(jīng)典的育種技術(shù)。例如，第一代(或T1)轉(zhuǎn)化的植物可自交，選擇純合的第二代(或T2)轉(zhuǎn)化體，而T2植物可進(jìn)一步通過經(jīng)典育種技術(shù)繁殖。產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化生物體可以有多種形式。例如，它們可以是轉(zhuǎn)化細(xì)胞和非轉(zhuǎn)化細(xì)胞的嵌合體；克隆轉(zhuǎn)化體(例如所有細(xì)胞經(jīng)轉(zhuǎn)化含有表達(dá)盒)；轉(zhuǎn)化和非轉(zhuǎn)化組織的嫁接體(例如在植物中，轉(zhuǎn)化的砧木嫁接到非轉(zhuǎn)化的接穗上)。本發(fā)明顯然延及由本文所述任何方法產(chǎn)生的任何植物細(xì)胞或植物，以及所有的植物部分及繁殖體。本發(fā)明還延及由任何上述方法產(chǎn)生的原代轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的細(xì)胞、組織、器官或整個(gè)植物的后代，唯一的要求是所述后代呈現(xiàn)出與在本發(fā)明方法中產(chǎn)生的親本相同的基因型和/或表型特征。本發(fā)明也包括含有分離的編碼上文所定義的ASNS多肽的核酸的宿主細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的宿主細(xì)胞是植物細(xì)胞。對(duì)于用于本發(fā)明方法的核酸或載體、表達(dá)盒或構(gòu)建體或載體，其宿主植物原則上有利地為能夠合成在本發(fā)明方法中使用的多肽的所有植物。本發(fā)明的方法有利地適用于任何植物。尤其可用于本發(fā)明方法的植物包括屬于植物界超家族的所有植物，尤其是單子葉植物和雙子葉植物，包括飼料或豆科牧草、觀賞植物、糧食作物、喬木或灌木。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案，植物為作物植物。作物植物的實(shí)例包括大豆、向日葵、蕓苔(canola)、苜蓿、油菜籽、棉花、番茄、馬鈴薯和煙草。還優(yōu)選植物是單子葉植物。單子葉植物的實(shí)例包括甘蔗。更優(yōu)選植物是谷類。谷類的實(shí)例包括稻、玉米、小麥、大麥、粟、黑麥、黑小麥、高粱、二粒小麥、斯佩耳特小麥、裸麥、單粒小麥、埃塞俄比亞畫眉草、買羅高粱和燕麥。本發(fā)明也延及植物的可收獲部分，例如但不限于種子、葉、果實(shí)、花、莖、根、根莖、塊莖和球莖。本發(fā)明還涉及由這樣的植物的可收獲部分衍生的、優(yōu)選直接衍生的產(chǎn)品，如干丸(pellet)或干粉、油類、脂肪和脂肪酸、淀粉或蛋白質(zhì)。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的方面，受調(diào)節(jié)的表達(dá)是增加的表達(dá)。增加核酸或基因或基因產(chǎn)物表達(dá)的方法在本領(lǐng)域有充分的記錄，并且實(shí)例在"定義"部分提供。如上文所述，調(diào)節(jié)(優(yōu)選，增加)編碼ASNS多肽的核酸的表達(dá)的優(yōu)選方法是在植物中引入和表達(dá)編碼ASNS多肽的核酸；然而，實(shí)施所述方法的效果，即增強(qiáng)產(chǎn)率相關(guān)性狀，也可以利用其他眾所周知的技術(shù)實(shí)現(xiàn)，包括但不限于T-DNA激活標(biāo)簽、TILLING、同源重組。這些技術(shù)的說(shuō)明在"定義"部分提供。本發(fā)明還包括編碼如本文所述的ASNS多肽的核酸以及這些ASNS多肽在增強(qiáng)植物任一上述產(chǎn)率相關(guān)性狀中的用途。可以在育種程序中使用編碼本文所述ASNS多肽的核酸或所述ASNS多肽本身，其中鑒定可能與ASNS多肽編碼基因遺傳連鎖的DNA標(biāo)記。可以使用所述核酸/基因或所述ASNS多肽本身定義分子標(biāo)記。接著可以將此DNA或蛋白質(zhì)標(biāo)記在育種程序中使用，以選擇如上文在本發(fā)明的方法中定義的具有增強(qiáng)的產(chǎn)率相關(guān)性狀的植物。ASNS多肽編碼核酸/基因的等位基因變體也可以用于標(biāo)記輔助的育種程序。這類育種程序有時(shí)需要使用例如EMS誘變，通過植物誘變處理引入等位基因變異；可選的，此類程序可以以一組無(wú)意產(chǎn)生的所謂"天然"起源的等位基因變體開始。然后通過例如PCR進(jìn)行等位基因變體的鑒定。隨后是選擇步驟，用以選擇所討論序列的、提供增加的產(chǎn)率的、優(yōu)良等位基因變體。一般通過監(jiān)測(cè)含有所討論序列的不同等位基因變體的植物的生長(zhǎng)行為來(lái)進(jìn)行選擇?？梢栽跍厥一蛱锏刂斜O(jiān)測(cè)生長(zhǎng)行為。其它任選的步驟包括將經(jīng)鑒定含有優(yōu)良等位基因變體的植物與另一植物雜交。例如，可使用這種方法產(chǎn)生感興趣表型特征的組合。ASNS多肽編碼核酸還可以作為探針，用于對(duì)包含其的基因進(jìn)行遺傳和物理作圖以及用作與那些基因連鎖的性狀的標(biāo)志物。這樣的信息可以在植物育種中使用，以培育具有所期望表型的株系。ASNS多肽編碼核酸的這類應(yīng)用僅需要長(zhǎng)度至少15個(gè)核苷酸的核酸序列。ASNS多肽編碼核酸可以用作限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLP)標(biāo)記?？捎肁SNS多肽編碼核酸探測(cè)限制酶切消化的植物基因組DNA的Southern印跡(SambrookJ，F(xiàn)ritschEF和ManiatisT(1989)《分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》)。隨后使用計(jì)算機(jī)程序如M即Maker(Lander等(1987)Genomics1:174-181)對(duì)產(chǎn)生的帶型進(jìn)行遺傳分析，以構(gòu)建遺傳圖譜。另外，可以使用核酸探測(cè)含有一組個(gè)體的限制性內(nèi)切酶處理的基因組DNA的Southern印跡，所述一組個(gè)體為一個(gè)確定的遺傳雜交的親本和子代。記錄DNA多態(tài)性的分離，并用于計(jì)算ASNS多肽編碼核酸在先前用此群體獲得的遺傳圖譜中的位置(Botstein等(1980)Am.J.Hum.Genet.32:314-331)。用于遺傳作圖的植物基因衍生探針的產(chǎn)生和應(yīng)用描述于Bematzky和Tanksley(1986)PlantMol.Biol.R印orter4:37-41中。眾多出版物中描述過用上述方法或其變通形式對(duì)特定cDNA克隆進(jìn)行遺傳作圖。例如，可以使用F2雜交群體、回交群體、隨機(jī)交配群體、近等基因系和其它個(gè)體組作圖。這類方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的。核酸探針也可以用來(lái)進(jìn)行物理作圖(即在物理圖譜上安置序列；參見Hoheisel等In:Non-mammalianGenomicAnalysis:APracticalGuide,Academicpress1996，第319-346頁(yè)，及其中引用的參考文獻(xiàn))。在另一個(gè)實(shí)施方案中，核酸探針可用于進(jìn)行直接熒光原位雜交(FISH)作圖(Trask(1991)TrendsGenet.7:149-154)。盡管目前FISH作圖的方法傾向使用大的克隆(幾個(gè)kb到幾百個(gè)kb;參見Laan等(1995)GenomeRes.5:13-20)，但是靈敏性的提高可以允許在FISH作圖中應(yīng)用較短的探針。用于遺傳和物理作圖的多種基于核酸擴(kuò)增的方法可以使用所述核酸進(jìn)行。實(shí)例包括等位基因特異性擴(kuò)增(Kazazian(1989)J.Lab.Clin.Medll:95-96)、PCR擴(kuò)增片段的多態(tài)性(CAPS;Sheffield等(1993)Genomics16:325-332)、等位基因特異性連接(Landegren等(1988)Science241:1077-1080)、核苷酸延伸反應(yīng)(Sokolov(1990)NucleicAcidRes.18:3671)、放射雜交作圖(Walter等(1997)Nat.Genet.7:22-28)和Happy作圖(Dear和Cook(1989)NucleicAcidRes.17:6795-6807)。為實(shí)施這些方法，使用核酸序列設(shè)計(jì)和產(chǎn)生用于擴(kuò)增反應(yīng)或引物延伸反應(yīng)的引物對(duì)。這類引物的設(shè)計(jì)是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的。在采用基于PCR的遺傳作圖的方法中，可能需要鑒定用于作圖雜交的親本之間在相應(yīng)于本發(fā)明核酸序列的區(qū)域中的DNA序列差異。但是，通常這對(duì)作圖方法不是必要的。根據(jù)本發(fā)明的方法得到如前文所述具有增強(qiáng)的產(chǎn)率相關(guān)性狀的植物。這些性狀還可以組合其它經(jīng)濟(jì)上有利的性狀，如其它產(chǎn)率增強(qiáng)性狀、對(duì)其他非生物和生物脅迫的耐受性、改變多種構(gòu)造特征和/或生物化學(xué)和/或生理學(xué)特征的性狀?，F(xiàn)參考以下附圖描述本發(fā)明，其中圖1顯示了雙元載體(binaryvector)，用于在稻中于稻G0S2啟動(dòng)子控制之下(pG0S2::NITR)增加NITR編碼核酸的表達(dá)。圖2詳述了用于實(shí)施本發(fā)明方法的序列實(shí)例。圖3給出了表2所列NITR蛋白序列的系統(tǒng)發(fā)生樹，在該系統(tǒng)發(fā)生樹中外群是由SEQIDN0:9(雷氏衣藻(C.reinhardtii)59303)，SEQIDNO:11(雷氏衣藻192232)禾PSEQIDNO:33(擬南芥At5g04590)示例的亞硫酸還原酶。圖4顯示了雙元載體，用于在稻中于稻G0S2啟動(dòng)子控制之下(pG0S2::ASNS)增加ASNS編碼核酸的表達(dá)。圖5詳述了用于實(shí)施本發(fā)明方法的序列實(shí)例。圖6顯示SEQIDNO:63和SEQIDNO:67的比對(duì)。指出S165G和R382G突變。圖7顯示ASNS多肽實(shí)例的多重比對(duì)。星號(hào)表示在所有序列中相同的氨基酸，冒號(hào)表示高度保守的殘基，圓點(diǎn)表示保守殘基。對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:67的R382的精氨酸殘基以粗體顯示。實(shí)施例現(xiàn)參考以下實(shí)施例描述本發(fā)明，所述實(shí)施例僅意在舉例說(shuō)明。如下實(shí)施例并非旨在完全界定或以其他方式限制本發(fā)明的范圍。DNA操作除非另外說(shuō)明，重組DNA技術(shù)根據(jù)描述于(Sambrook(2001)《分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》，第三版，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版，冷泉港，紐約)或者Ausubel等(1994)，CurrentProtocolsinMolecularBiology,CurrentProtocols第一巻禾口第二巻的標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行。植物分子操作的標(biāo)準(zhǔn)材料和方法由R.D.D.Croy描述于PlantMolecularBiologyLabfase(1993)，由BIOSScientificPublicationsLtd(UK)禾PBlackwellScientificPublications(UK)出版。實(shí)施例1:與本發(fā)明方法所用核酸序列相關(guān)的序列的鑒定利用數(shù)據(jù)庫(kù)序列搜索工具，如基本局部比對(duì)工具(BLAST)(Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215:403-410;和Altschul等(1997)NucleicAcidsRes.25:3389-3402)，在美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心(NCBI)Entrez核苷酸數(shù)據(jù)庫(kù)維護(hù)的序列中，鑒定與用于本發(fā)明方法的核酸序列相關(guān)的序列(全長(zhǎng)cDNA、EST或基因組序列)。該程序通過將核酸或多肽序列與序列數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比較，以及通過計(jì)算匹配的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，來(lái)尋找序列之間具有局部相似性的區(qū)域。例如，將TBLASTN算法用于本發(fā)明所用核酸編碼的多肽，使用默認(rèn)設(shè)置，開啟過濾器以濾過低復(fù)雜度序列。此分析的輸出結(jié)果顯示為兩兩比較，并根據(jù)概率分值(E值)排序，其中分值反映特定比對(duì)偶然發(fā)生的概率(E值越低，命中事件的顯著性越高)。除了E值之外，還對(duì)比較進(jìn)行同一性百分比記分。同一性百分比是指兩比較核酸(或多肽)序列之間在特定長(zhǎng)度上的相同核苷酸(或氨基酸)數(shù)。在有些情況下，可以調(diào)整默認(rèn)參數(shù)以更改搜索的嚴(yán)格度。例如可以增加E值以顯示較不嚴(yán)格的匹配。以此方式，可以鑒定短的幾乎精確的匹配。在一些情況下，相關(guān)序列可能由研究機(jī)構(gòu)如基因組研究所(InstituteforGenomicResearch,TIGR)實(shí)驗(yàn)性地進(jìn)行了裝配并向公眾公開?？梢岳谜婧嘶蛑毕低次?EukaryoticGeneOrthologs，EGO)數(shù)據(jù)庫(kù)，通過關(guān)鍵詞搜索，或是采用BLAST算法運(yùn)用目的核酸或多肽序列，鑒定這樣的相關(guān)序列。實(shí)施例2:NITR多肽序列的比對(duì)來(lái)自VectorNTI包(英駿公司，Invitrogen)的AlignX程序基于流行的漸進(jìn)式比對(duì)ClustalW算法(Thompson等(1997)NucleicAcidsRes25:4876-4882;Chenna等(2003)NucleicAcidsRes31:3497-3500)，用于對(duì)多肽序列實(shí)施比對(duì)。默認(rèn)值為空位開放50罰分10，空位延伸罰分0，l，而選擇的權(quán)重矩陣為Blosum62(如果比對(duì)多肽的話)?？梢赃M(jìn)行微小的人工編輯以進(jìn)一步優(yōu)化比對(duì)。利用VectorNTI(英駿公司)的AlignX程序提供的鄰接聚類算法，構(gòu)建NITR多肽的系統(tǒng)發(fā)生樹。為構(gòu)建圖3的系統(tǒng)發(fā)生樹，利用MUSCLE(Edgar(2004)，NucleicAcidsResearch32(5):1792-97)比對(duì)了圖2的蛋白質(zhì)。利用QuickTree(Howeetal.(2002)，Bioinformatics18(11):1546-7)計(jì)算了鄰接樹。針對(duì)100次bootstrap重復(fù)，顯示主要分枝的支持值(support)。用Dendroscope(Husonetal.(2007)，BMCBioinformatics8(1):460)繪制了環(huán)狀系統(tǒng)發(fā)生圖。實(shí)施例3:用于實(shí)施本發(fā)明方法的多肽序列之間全局同一性百分比的計(jì)算用于實(shí)施本發(fā)明方法的全長(zhǎng)多肽序列之間的全局相似性和同一性百分比利用本領(lǐng)域可得方法之一，即MatGAT(矩陣全局比對(duì)工具)軟件(BMCBioinformatics.20034:29.MatGAT:anapplicationthatgeneratessimilarity/identitymatricesusingproteinorDNAsequences.C咖panellaJJ，BitinckaL，SmalleyJ5由Ledi0nBitincka托管的軟件)，確定。MatGAT軟件無(wú)需對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)比對(duì)，即可產(chǎn)生DNA或蛋白質(zhì)序列的相似性/同一性矩陣。該程序利用Myers和Miller全局比對(duì)算法(空位開放罰分為12，而空位延伸罰分為2)進(jìn)行一系列的兩兩比對(duì)，利用例如Blosum62(對(duì)于多肽而言)計(jì)算相似性和同一性，然后將結(jié)果排列成距離矩陣。序列相似性示于對(duì)角線下半部，而序列同一性示于對(duì)角線上半部。比較中所用的參數(shù)為記分失巨陣Blosum62首個(gè)空位12延伸空位2也可以產(chǎn)生局部比對(duì)特定結(jié)構(gòu)域的MATGAT表，或特定結(jié)構(gòu)域之間％同一性/相似性的數(shù)據(jù)。實(shí)施例4:用于實(shí)施本發(fā)明方法的多肽序列中所含結(jié)構(gòu)域的鑒定蛋白質(zhì)家族、結(jié)構(gòu)域和位點(diǎn)整合資源(IntegratedResourceofProteinFamilies,DomainsandSites(InterPro))數(shù)據(jù)庫(kù)是進(jìn)行基于文本以及序列的搜索的常用標(biāo)簽數(shù)據(jù)庫(kù)的整合界面。InterPro數(shù)據(jù)庫(kù)將這些數(shù)據(jù)庫(kù)結(jié)合起來(lái)，其中這些數(shù)據(jù)庫(kù)利用不同的方法學(xué)和有關(guān)已充分表征的蛋白質(zhì)的不同程度生物信息以產(chǎn)生蛋白質(zhì)標(biāo)簽。合作數(shù)據(jù)庫(kù)包括SWISS-PROT、PROSITE、TrEMBL、PRINTS、ProDom和Pfam、Smart和TIGRFAMs。Pfam是一個(gè)大的多重序列比對(duì)和隱形Markov模型集，覆蓋許多常見蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域及家族。Pfam由位于英國(guó)的桑格研究所(SangerInstitute)服務(wù)器托管。Interpro由位于英國(guó)的歐洲生物信息學(xué)研究所(EuropeanBioinformaticsInstitute)托管。使用代表NITR的蛋白質(zhì)序列作為查詢序列搜索InterPro數(shù)據(jù)庫(kù)。實(shí)施例5:用于實(shí)施本發(fā)明方法的多肽序列的拓?fù)漕A(yù)測(cè)TargetP1.1預(yù)測(cè)真核蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位?；谌缦氯我籒_端前序列的預(yù)測(cè)性存在，進(jìn)行定位確定葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽(cTP)、線粒體靶向肽(mTP)或分泌途徑信號(hào)肽(SP)。最終預(yù)測(cè)所基于的分值并非真正的概率，加起來(lái)不一定為1。不過，根據(jù)TargetP，得分最高的定位是最可能的，且分值之間的關(guān)系(可靠性級(jí)別)可作為所述預(yù)測(cè)的可靠性的指標(biāo)。可靠性級(jí)別(RC)范圍從1到5，其中1表示最強(qiáng)的預(yù)測(cè)。TargetP由丹麥技術(shù)大學(xué)(TechnicalUniversityofDenmark)的月艮務(wù)器維護(hù)。對(duì)于經(jīng)預(yù)測(cè)含有N-端前序列的序列，還可以預(yù)測(cè)潛在的切割位點(diǎn)。選擇了多種參數(shù)，例如生物體類型(非植物或植物)、截?cái)嘀翟O(shè)置(無(wú)、預(yù)先規(guī)定的截?cái)嘀翟O(shè)置或者用戶指定的截?cái)嘀翟O(shè)置)以及切割位點(diǎn)的預(yù)測(cè)計(jì)算(是或否)。使用SEQIDN0:2所示的蛋白質(zhì)序列查詢TargetP1.1。選擇"植物"生物體類型，未規(guī)定截?cái)嘀?，并要求轉(zhuǎn)運(yùn)肽的預(yù)測(cè)長(zhǎng)度。該蛋白質(zhì)具有預(yù)測(cè)的葉綠體中定位(概率0.793，可靠性級(jí)別3)?？梢岳迷S多其他的算法進(jìn)行這樣的分析，包括參ChloroP1.1，由丹麥技術(shù)大學(xué)服務(wù)器托管；參蛋白質(zhì)尋覓亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)軟件(ProteinProwlerSubcellularLocalisationPredictor)，1.2版，由澳大利亞布里斯班昆士蘭大學(xué)分子生物禾斗學(xué)石開究所(InstituteforMolecularBioscience,UniversityofQueensland,Brisbane,Australia)的服務(wù)器托管；參PENCEProteomeAnalystPA-G0SUB2.5，由加拿大大阿爾貝塔埃德蒙頓阿爾貝i荅大學(xué)(UniversityofAlberta，Edmonton,Alberta，Canada)的月艮務(wù)器托管；參TMHMM，由丹麥技術(shù)大學(xué)服務(wù)器托管。實(shí)施例6:本發(fā)明方法所用核酸序列的克隆SEQIDNO:1的克隆使用訂制的擬南芥幼苗cDNA文庫(kù)(在pCMVSport6.0中；Invitrogen，Paisley，UK)作為模板，通過PCR，擴(kuò)增用于本發(fā)明方法中的NITR編碼核酸序列SEQIDNO:1。在標(biāo)準(zhǔn)條件下使用HifiTaqDNA聚合酶，用200ng的模板于50PCRmix中進(jìn)行PCR。所用的引物為prm07073(SEQIDNO:4;有義，起始密碼子為粗體)5'-ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttaaacaatgacttctttctctctcactt-3'禾口prm07074(SEQIDN0:5;反義，互補(bǔ))5'-ggggaccactttgtacaagaaagctgggtcaatagcttttgaatcaatct-3'，其包括用于Gateway重組的AttB位點(diǎn)。同樣利用標(biāo)準(zhǔn)方法純化擴(kuò)增的PCR片段。接著進(jìn)行Gateway操作的第一步，即BP反應(yīng)，在此期間PCR片段與pD0NR201質(zhì)粒體內(nèi)重組，產(chǎn)生Gateway術(shù)語(yǔ)所稱的"進(jìn)入(entry)克隆"。作為Gateway⑧技術(shù)一部分的質(zhì)粒pD0NR201購(gòu)自英駿公司(Invitrogen)。隨后包含SEQIDNO:1的進(jìn)入克隆與用于稻轉(zhuǎn)化的目的載體(destinationvector)—起用于LR反應(yīng)。此載體在T-DNA邊界內(nèi)包含如下功能性元件植物可選擇標(biāo)記；可篩選標(biāo)記表達(dá)盒；旨在與已克隆到進(jìn)入克隆中的目的核酸序列進(jìn)行LR體內(nèi)重組的Gateway盒。用于種子特異性表達(dá)的稻G0S2啟動(dòng)子(SEQIDNO:3)位于此Gateway盒的上游。在LR重組步驟之后，根據(jù)本領(lǐng)域眾所周知的方法將所產(chǎn)生的表達(dá)載體pG0S2::NITR(圖1)轉(zhuǎn)化進(jìn)農(nóng)桿菌菌株LBA4044。實(shí)施例7:植物轉(zhuǎn)化稻轉(zhuǎn)化使用包含表達(dá)載體的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化稻植物。使梗稻栽培種日本晴(ricej即onicacultivarNipponbare)的成熟干種子脫殼。通過在70%的乙醇中孵育1分鐘，然后在O.2%HgCl2中孵育30分鐘，之后用無(wú)菌蒸餾水洗滌6次，每次15分鐘來(lái)進(jìn)行消毒。然后在包含2，4-D的培養(yǎng)基(愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基)中萌發(fā)無(wú)菌種子。在黑暗中孵育4周后，切取盾片來(lái)源的胚發(fā)生愈傷組織，然后在相同的培養(yǎng)基上進(jìn)行繁殖。2周后，通過在相同的培養(yǎng)基上傳代培養(yǎng)再另外2周來(lái)繁殖或增殖愈傷組織。在共培養(yǎng)前3天在新鮮培養(yǎng)基上傳代培養(yǎng)胚發(fā)生愈傷組織塊(以增強(qiáng)細(xì)胞分裂活性)。包含表達(dá)載體的農(nóng)桿菌株系LBA4404用于共培養(yǎng)。將農(nóng)桿菌接種在具有適宜的抗生素的AB培養(yǎng)基上，在2『C培養(yǎng)3天。然后收集細(xì)菌，將其懸浮在液體共培養(yǎng)培養(yǎng)基中至大約為1的密度(0D6。。)。然后將懸浮液轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)皿(Petridish)，將愈傷組織浸漬在懸浮液中15分鐘。然后將愈傷組織在濾紙上吸干，之后轉(zhuǎn)移至固化的共培養(yǎng)培養(yǎng)基，在25t:在黑暗中孵育3天。然后在選擇劑存在的情況下在2『C在黑暗中，在包含2，4-D的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)共培養(yǎng)的愈傷組織4周。在此期間，產(chǎn)生了快速生長(zhǎng)的抗性愈傷組織島。在將該物質(zhì)轉(zhuǎn)移至再生培養(yǎng)基和在光照下孵育后，胚發(fā)生潛力被釋放，在接下來(lái)的4至5周中發(fā)育出芽。將芽從愈傷組織切下，然后在包含生長(zhǎng)素的培養(yǎng)基上孵育2至3周，然后將它們從所述培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至土壤中。在溫室中在高濕度和短日照下生長(zhǎng)出變硬的芽(shoot)?！獋€(gè)構(gòu)建體產(chǎn)生了大約35個(gè)獨(dú)立的T0稻轉(zhuǎn)化體。將原代轉(zhuǎn)化體從組織培養(yǎng)室轉(zhuǎn)移至溫室。在進(jìn)行確認(rèn)T-DNA插入物的拷貝數(shù)的定量PCR分析后，只保留展示對(duì)選擇劑具抗性的單拷貝轉(zhuǎn)基因植物用于T1種子的收獲。然后在移植后3至5個(gè)月收獲種子。該方法以50%多的比率產(chǎn)生了單基因座轉(zhuǎn)化體(Aldemita和Hodges1996，Chan等人1993，Hiei等人1994)。玉米的轉(zhuǎn)化使用由Ishida等人(1996)NatureBiotech14(6):745-50描述的方法的改進(jìn)方法，進(jìn)行玉米(Zeamays)的轉(zhuǎn)化。在玉米中轉(zhuǎn)化是基因型依賴性的，只有特定的基因型易于進(jìn)行轉(zhuǎn)化和再生。近交系A(chǔ)188(University(^Minnesota)或以A188作為親本的雜種是用于轉(zhuǎn)化的良好供體材料來(lái)源，但也可成功地使用其他基因型。在授粉后大約11天(DAP)，當(dāng)未成熟的胚的長(zhǎng)度為大約1至1.2mm時(shí)，從玉米植物收獲穗子。將未成熟的胚與包含表達(dá)載體的根癌農(nóng)桿菌共培養(yǎng)，通過器官發(fā)生再生轉(zhuǎn)基因植物。將切離的胚培養(yǎng)在包含選擇劑(例如咪唑啉酮，但可使用不同的選擇標(biāo)記)的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，然后培養(yǎng)在玉米再生培養(yǎng)基上。在光照的情況下在25t:孵育培養(yǎng)皿2至3周，或直至芽產(chǎn)生。將綠色的芽從各胚胎轉(zhuǎn)移至玉米生根培養(yǎng)基，在25t:孵育2-3周，直至根產(chǎn)生。然后將生根的芽移植至溫室土壤中。從展示對(duì)選擇劑具有抗性的且包含單拷貝T-DNA插入物的植物產(chǎn)生T1種子。小麥轉(zhuǎn)化使用由Ishida等人(1996)NatureBiotech14(6):745-50描述的方法進(jìn)行小麥的轉(zhuǎn)化。通常將栽培品種Bobwhite(可從CI匪YT，Mexico獲得)用于轉(zhuǎn)化。將未成熟的胚與包含表達(dá)載體的根癌農(nóng)桿菌共培養(yǎng)，通過器官發(fā)生再生轉(zhuǎn)基因植物。在與農(nóng)桿菌孵育后，將胚在包含選擇劑(例如咪唑啉酮，但可使用不同的選擇標(biāo)記)的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上進(jìn)行體外培養(yǎng)，然后在再生培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)。在光照的情況下在25t:孵育培養(yǎng)皿2至3周，或直至芽產(chǎn)生。將綠色的芽從各胚轉(zhuǎn)移至生根培養(yǎng)基，在25t:孵育2-3周，直至根產(chǎn)生。將生根的芽移植至溫室土壤中。從展示對(duì)選擇劑具有抗性的且包含單拷貝T-DNA插入物的53植物產(chǎn)生T1種子。大豆轉(zhuǎn)化按照TexasA&M專利US5，164，310中描述的方法的改進(jìn)方法，轉(zhuǎn)化大豆。幾種商品化大豆品種易于通過該方法進(jìn)行轉(zhuǎn)化。通常將栽培品種Jack(可從IllinoisSeedfoundation獲得)用于轉(zhuǎn)化。對(duì)大豆種子消毒以便體外播種。從7日齡幼苗切取下胚軸、胚根和一片子葉。讓上胚軸和剩下的子葉進(jìn)一步生長(zhǎng)產(chǎn)生腋節(jié)(axillarynode)。切取這些腋節(jié)，將其與包含表達(dá)載體的根癌農(nóng)桿菌一起孵育。在共培養(yǎng)處理后，洗滌外植體，然后轉(zhuǎn)移至選擇培養(yǎng)基。切取再生的芽，將其置于芽伸長(zhǎng)培養(yǎng)基上。將長(zhǎng)度不超過lcm的芽置于生根培養(yǎng)基上直至根產(chǎn)生。將生根的芽轉(zhuǎn)移至溫室的土壤中。從展示對(duì)選擇劑具有抗性的且包含單拷貝T-DNA插入物的植物產(chǎn)生Tl種子。油菜(rapeseed)/蕓苔(Canola)的轉(zhuǎn)化5-6日齡幼苗的子葉柄和下胚軸用作組織培養(yǎng)的外植體，按照Babic等人(1998，PlantCellR印17:183-188)對(duì)其進(jìn)行轉(zhuǎn)化。商業(yè)栽培品種Westar(AgricultureCanada)是用于轉(zhuǎn)化的標(biāo)準(zhǔn)品種，但也可使用其他品種。對(duì)Canola種子進(jìn)行表面消毒以進(jìn)行體外播種。從體外幼苗切取具有附著的子葉的子葉柄外植體，然后通過將子葉柄外植體的切口末端浸入細(xì)菌懸浮液中接種農(nóng)桿菌(包含表達(dá)載體)。然后將外植體在23t:、16小時(shí)光照下，在包含3mg/1BAP、3X蔗糖、0.7XPhytagar的MSBAP-3培養(yǎng)基上培養(yǎng)2天。在與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)2天后，將子葉柄外植體轉(zhuǎn)移至包含3mg/lBAP、頭孢氨噻肟、羧芐青霉素或替卡西林_克拉維酸(timentin)(300mg/l)的MSBAP-3培養(yǎng)基上培養(yǎng)7天，然后在具有頭孢氨噻肟(cefotaxime)、羧芐青霉素或替卡西林_克拉維酸和選擇劑的MSBAP-3培養(yǎng)基上培養(yǎng)直至芽再生。當(dāng)芽的長(zhǎng)度為5-10mm時(shí)，將其切離，然后轉(zhuǎn)移至芽伸長(zhǎng)培養(yǎng)基(MSBAP-0.5，包含0.5mg/BAP)。將長(zhǎng)度大約2cm的芽轉(zhuǎn)移至生根培養(yǎng)基(MSO)以進(jìn)行根誘導(dǎo)。將生根的芽移植至溫室的土壤中。從展示對(duì)選擇劑具有抗性的且包含單拷貝T-DNA插入物的植物產(chǎn)生T1種子。苜蓿轉(zhuǎn)化使用(McKersie等人，1999PlantPhysiol119:839-847)的方法轉(zhuǎn)化苜蓿(Medicagosativa)的再生克隆。苜蓿的再生和轉(zhuǎn)化是基因型依賴性的，因而需要再生的植物。已描述了用于獲得再生植物的方法。例如，這些再生植物可選自栽培品種Rangelander(AgricultureCanada)或由BrownDCW禾口AAtanassov(1985.PlantCellTissueOrganCulture4:111-112)描述的任何其他商業(yè)苜蓿品種?？蛇x擇地，已選擇RA3品禾中(UniversityofWisconsin)用于組織培養(yǎng)(Walker等人，1978AmJBot65:654-659)。將子葉柄外植體與包含表達(dá)載體的根癌農(nóng)桿菌C58C1pMP90(McKersie等人，1999PlantPhysiol119:839-847)或LBA4404的過夜培養(yǎng)物共培養(yǎng)。將外植體在黑暗中在包含288mg/LPro、53mg/L硫代脯氨酸、4.35g/LK2S0jP100ym乙酰丁香酮的SH誘導(dǎo)培養(yǎng)基上共培養(yǎng)3天。在一半濃度的Murashige-Skoog培養(yǎng)基(Murashige和Skoog，1962)中洗滌外植體，然后將其種在不含乙酰丁香酮但具有適宜的選擇劑和適宜的抗生素(以抑制農(nóng)桿菌的生長(zhǎng))的相同SH誘導(dǎo)培養(yǎng)基上。在幾周后，將體細(xì)胞胚轉(zhuǎn)移至不含生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑、無(wú)抗生素但含有50g/L蔗糖的B0i2Y發(fā)育培養(yǎng)基中。隨后在一半濃度的Murashige-Skoog培養(yǎng)基上萌發(fā)體細(xì)胞胚。將生根的幼苗移植入花盆和生長(zhǎng)在溫室中。從展示對(duì)選擇劑具有抗性的且包含單拷貝T-DNA插入物的植物產(chǎn)生Tl種子。實(shí)施例8:表型評(píng)估方法8.1評(píng)估設(shè)置產(chǎn)生了大約35個(gè)獨(dú)立的TO稻轉(zhuǎn)化體。原代轉(zhuǎn)化體由組織培養(yǎng)室轉(zhuǎn)移到溫室生長(zhǎng)并收獲T1種子。保留了5個(gè)事件，在這些事件中Tl后代發(fā)生轉(zhuǎn)基因存在/缺乏的3:l分離。通過監(jiān)測(cè)可視標(biāo)記的表達(dá)，在這些事件之每一個(gè)中各選出大約IO個(gè)含轉(zhuǎn)基因的TI幼苗(雜合子和純合子)，以及大約10個(gè)缺少轉(zhuǎn)基因的Tl幼苗(無(wú)效合子)。轉(zhuǎn)基因植物和相應(yīng)的無(wú)效合子在隨機(jī)位置上并排生長(zhǎng)。溫室條件為短白晝(12小時(shí)光照)，日間2『C，夜間22t:，相對(duì)濕度70%。干旱篩選在正常條件下在花盆土中培養(yǎng)來(lái)自T2種子的植物，直到進(jìn)入抽穗期。然后將其轉(zhuǎn)移到限制灌溉的"干燥"區(qū)域。向隨機(jī)選擇的花盆中插入濕度探測(cè)儀，以監(jiān)測(cè)土壤水含量(SWC)。當(dāng)SWC低于一定的閾值時(shí)，自動(dòng)向植物持續(xù)補(bǔ)水，直到再次達(dá)到正常水平。然后將植物再次重新轉(zhuǎn)移到正常條件下。其余的栽培(植物成熟、種子收獲)與不在非生物脅迫條件下培養(yǎng)的植物相同。如針對(duì)正常條件下的生長(zhǎng)所詳述的那樣，記錄生長(zhǎng)和產(chǎn)率參數(shù)。氮利用效率篩選在除營(yíng)養(yǎng)液以外正常的條件下在花盆土中培養(yǎng)來(lái)自T2種子的稻植物。從植物移植到成熟，用特定的營(yíng)養(yǎng)液對(duì)花盆進(jìn)行澆灌，所述營(yíng)養(yǎng)液的氮(N)含量降低，通常低7到8倍。其余的栽培(植物成熟、種子收獲)與不在非生物脅迫條件下培養(yǎng)的植物相同。如針對(duì)正常條件下的生長(zhǎng)所詳述的那樣，記錄生長(zhǎng)和產(chǎn)率參數(shù)。鹽脅迫篩選在由椰子纖維和argex(3:1的比率)組成的基質(zhì)上培養(yǎng)植物。在將小植物移植在溫室中后于前兩周使用正常的營(yíng)養(yǎng)液。此頭兩周后，在營(yíng)養(yǎng)液中加入25mM的鹽(NaCl)，直到植物收獲。然后測(cè)定種子相關(guān)參數(shù)。8.2統(tǒng)計(jì)分析F檢驗(yàn)利用雙因素ANOVA(方差分析)作為統(tǒng)計(jì)模型，對(duì)植物表型特征進(jìn)行總體評(píng)估。對(duì)用本發(fā)明基因轉(zhuǎn)化的所有事件的所有植株的測(cè)量到所有參數(shù)進(jìn)行F檢驗(yàn)。進(jìn)行F檢驗(yàn)以檢查基因在所有轉(zhuǎn)化事件上的效應(yīng)，并檢驗(yàn)基因的總體效應(yīng)，亦稱為"整體基因效應(yīng)"(globalgeneeffect)。真實(shí)整體基因效應(yīng)的顯著性閾值設(shè)置為F檢驗(yàn)的5%概率水平。顯著性F檢驗(yàn)值指向基因效應(yīng)，意味著不僅僅只是基因的存在或位置引起表型差異。由于進(jìn)行了具有重疊事件的兩個(gè)實(shí)驗(yàn)，因此進(jìn)行組合分析。這可用于在兩個(gè)實(shí)驗(yàn)上檢查效應(yīng)的一致性，并且如果情況果真如此，這可用于將來(lái)自兩個(gè)實(shí)驗(yàn)的證據(jù)累積起來(lái)以增加結(jié)論的可信度。使用的方法是考慮到數(shù)據(jù)的多層結(jié)構(gòu)(即實(shí)驗(yàn)-事件-分離子)的混合模型方法。通過比較似然比檢驗(yàn)與卡方分布來(lái)獲得P值。8.3測(cè)暈的參數(shù)生物量相關(guān)參數(shù)測(cè)量從播種期到成熟期，植物數(shù)次通過數(shù)碼成像箱。在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)上對(duì)每株植物從至少6個(gè)不同的角度獲取數(shù)碼圖像(2048X1536像素，1千6百萬(wàn)色素)。植物地上面積(或者說(shuō)葉生物量)通過計(jì)數(shù)數(shù)碼圖像上區(qū)別于背景的來(lái)自于地上55植物部分的像素的總數(shù)而確定。此值為同一時(shí)間點(diǎn)從不同的角度拍攝的照片的平均值，并通過校準(zhǔn)換算為以平方毫米表示的物理表面值。實(shí)驗(yàn)表明通過這種方法測(cè)量的地上植物面積與植物地上部分的生物量相關(guān)。所述地上面積為在植物達(dá)到其最大葉生物量的時(shí)間點(diǎn)測(cè)量的面積。早期活力為萌發(fā)后3周的植物(幼苗)地上面積。根生物量的增加表達(dá)為總根生物量(測(cè)量為植物生命期中觀察到的最大根生物量)的增加；或者表達(dá)為根/條指數(shù)(測(cè)量為根和枝條活躍生長(zhǎng)期中根質(zhì)量和枝條質(zhì)量之間的比)的增加。通過計(jì)數(shù)區(qū)別于背景的來(lái)自于地上植物部分的像素的總數(shù)，確定早期活力。該值為同一時(shí)間點(diǎn)從不同的角度拍攝的照片的平均值，并通過校準(zhǔn)換算為以每平方毫米表示的物理表面值。以下描述的結(jié)果為針對(duì)萌發(fā)后3周的植物的結(jié)果。種子相關(guān)參數(shù)測(cè)量收獲成熟的主圓錐花序、計(jì)數(shù)、裝袋、貼上條形碼標(biāo)記，然后在烤箱中于37t:干燥三天。隨后將圓錐花序脫粒，收集并計(jì)數(shù)所有的種子。使用鼓風(fēng)裝置將飽滿谷殼和空殼分開。棄去空殼，再次計(jì)數(shù)剩下的部分。在分析天平上稱重飽滿的谷殼。通過計(jì)數(shù)在分離步驟之后剩下的飽滿谷殼數(shù)確定飽滿種子數(shù)。通過稱量從植物收獲的所有飽滿谷殼來(lái)測(cè)量種子總產(chǎn)率。通過計(jì)數(shù)從植物收獲的谷殼數(shù)來(lái)測(cè)量每株植物的種子總數(shù)。收獲指數(shù)(HI)在本發(fā)明中定義為種子總產(chǎn)率和地上面積(mm2)之間的比值再乘以因子106。每圓錐花序的花總數(shù)在本發(fā)明中定義為種子總數(shù)與成熟的主圓錐花序數(shù)之間的比值。實(shí)施例9:轉(zhuǎn)基因植物的表型評(píng)估結(jié)果在G0S2啟動(dòng)子控制下表達(dá)SEQIDNO:1所示NITR核酸的轉(zhuǎn)基因稻植物，當(dāng)在氮缺乏的脅迫條件下生長(zhǎng)時(shí)，在生物量(根和枝條)、早期活力、種子總重量、飽滿種子數(shù)、收獲指數(shù)、種子總數(shù)和每圓錐花序的花數(shù)方面，顯示出超過5%的增加。當(dāng)在兩代(T1和T2)上評(píng)估時(shí)，得到了下述數(shù)據(jù)(表3):表3:與對(duì)照植物相比表達(dá)NITR核酸的轉(zhuǎn)基因植物的產(chǎn)率增力B。對(duì)于每一個(gè)參數(shù)，p值《0.05。<table>tableseeoriginaldocumentpage56</column></row><table>實(shí)施例10:與本發(fā)明方法所用核酸序列相關(guān)的序列的鑒定利用數(shù)據(jù)庫(kù)序列搜索工具，如基本局部比對(duì)工具(BLAST)(Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215:403-410;和Altschul等(1997)NucleicAcidsRes.25:3389-3402)，在美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心(NCBI)Entrez核苷酸數(shù)據(jù)庫(kù)維護(hù)的序列中，鑒定與用于本發(fā)明方法的核酸序列相關(guān)的序列(全長(zhǎng)cDNA、EST或基因組序列)。該程序通過將核酸或多肽序列與序列數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比較，以及通過計(jì)算匹配的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，來(lái)尋找序列之間具有局部相似性的區(qū)域。例如，對(duì)本發(fā)明所用核酸編碼的多肽運(yùn)用TBLASTN算法，使用默認(rèn)設(shè)置，開啟過濾器以濾過低復(fù)雜度序列。分析的輸出結(jié)果顯示為兩兩比較，并根據(jù)概率分值(E值)排序，其中分值反映特定比對(duì)偶然發(fā)生的概率(E值越低，命中事件的顯著性越高)。除了E值之外，還對(duì)比較進(jìn)行同一性百分比記分。同一性百分比是指兩比較核酸(或多肽)序列之間在特定長(zhǎng)度上的相同核苷酸(或氨基酸)數(shù)。在有些情況下，可以調(diào)整默認(rèn)參數(shù)以更改搜索的嚴(yán)格度。例如可以增加E值以顯示較不嚴(yán)格的匹配。以此方式，可以鑒定短的幾乎精確的匹配。在一些情況下，相關(guān)序列可能由研究機(jī)構(gòu)如基因組研究所(InstituteforGenomicResearch,TIGR)實(shí)驗(yàn)性地進(jìn)行了裝配并向公眾公開?？梢岳谜婧嘶蛑毕低次?EukaryoticGeneOrthologs，EGO)數(shù)據(jù)庫(kù)，通過關(guān)鍵詞搜索，或是采用BLAST算法運(yùn)用目的核酸或多肽序列，鑒定這樣的相關(guān)序列。實(shí)施例11:ASNS多肽序列的比對(duì)來(lái)自VectorNTI包(英駿公司，Invitrogen)的AlignX程序基于流行的漸進(jìn)式比對(duì)ClustalW算法(Thompson等(1997)NucleicAcidsRes25:4876-4882;Chenna等(2003)NucleicAcidsRes31:3497-3500)，用于對(duì)多肽序列實(shí)施比對(duì)。默認(rèn)值為空位開放罰分10，空位延伸罰分0，l，而選擇的權(quán)重矩陣為Blosum62(如果比對(duì)多肽的話)?？梢赃M(jìn)行微小的人工編輯以進(jìn)一步優(yōu)化比對(duì)。對(duì)于圖4的比對(duì)，使用了ClustalW2.0算法以及默認(rèn)參數(shù)(矩陣Go皿et;空位開放罰分10;空位延伸罰分0.1)。利用VectorNTI(英駿公司)的AlignX程序提供的鄰接聚類算法，構(gòu)建ASNS多肽的系統(tǒng)發(fā)生樹。實(shí)施例12:用于實(shí)施本發(fā)明方法的多肽序列之間全局同一性百分比的計(jì)算用于實(shí)施本發(fā)明方法的全長(zhǎng)多肽序列之間的全局相似性和同一性百分比利用本領(lǐng)域可得方法之一，即MatGAT(矩陣全局比對(duì)工具)軟件(BMCBioinformatics.20034:29.MatGAT:anapplicationthatgeneratessimilarity/identitymatricesusingproteinorDNAsequences.C咖panellaJJ，BitinckaL，SmalleyJ5由Ledi0nBitincka托管的軟件)，確定。MatGAT軟件無(wú)需對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)比對(duì)，即可產(chǎn)生DNA或蛋白質(zhì)序列的相似性/同一性矩陣。該程序利用Myers和Miller全局比對(duì)算法(空位開放罰分為12，而空位延伸罰分為2)進(jìn)行一系列的兩兩比對(duì)，利用例如Blosum62(對(duì)于多肽而言)計(jì)算相似性和同一性，然后將結(jié)果排列成距離矩陣。序列相似性示于對(duì)角線下半部，而序列同一性示于對(duì)角線上半部。比較中所用的參數(shù)為記分矩陣Blos咖62首個(gè)空位12延伸空位2也可以產(chǎn)生局部比對(duì)特定結(jié)構(gòu)域的MATGAT表，或特定結(jié)構(gòu)域之間％同一性/相似性的數(shù)據(jù)。實(shí)施例13:用于實(shí)施本發(fā)明方法的多肽序列中所含結(jié)構(gòu)域的鑒定蛋白質(zhì)家族、結(jié)構(gòu)域和位點(diǎn)整合資源(IntegratedResourceofProteinFamilies,DomainsandSites(InterPro))數(shù)據(jù)庫(kù)是進(jìn)行基于文本以及序列的搜索的常用標(biāo)簽數(shù)據(jù)庫(kù)的整合界面。InterPro數(shù)據(jù)庫(kù)將這些數(shù)據(jù)庫(kù)結(jié)合起來(lái)，其中這些數(shù)據(jù)庫(kù)利用不同的方法學(xué)和有關(guān)已充分表征的蛋白質(zhì)的不同程度生物信息以產(chǎn)生蛋白質(zhì)標(biāo)簽。合作數(shù)據(jù)庫(kù)包括SWISS-PROT、PROSITE、TrEMBL、PRINTS、ProDom和Pfam、Smart和TIGRFAMs。Pfam是一個(gè)大的多重序列比對(duì)和隱形Markov模型集，覆蓋許多常見蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域及家族。Pfam由位于英國(guó)的桑格研究所(SangerInstitute)服務(wù)器托管。Interpro由位于英國(guó)的歐洲生物信息學(xué)研究所(EuropeanBioinformaticsInstitute)托管。使用SEQIDNO:63所示的蛋白質(zhì)序列作為查詢序列搜索InterPro數(shù)據(jù)庫(kù)。實(shí)施例14:用于實(shí)施本發(fā)明方法的多肽序列的拓?fù)漕A(yù)測(cè)TargetP1.1預(yù)測(cè)真核蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位。基于如下任一N_端前序列的預(yù)測(cè)性存在，進(jìn)行定位確定葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽(cTP)、線粒體靶向肽(mTP)或分泌途徑信號(hào)肽(SP)。最終預(yù)測(cè)所基于的分值并非真正的概率，它們加起來(lái)不一定為1。不過，根據(jù)TargetP，得分最高的定位是最可能的，且分值之間的關(guān)系(可靠性級(jí)別)可作為所述預(yù)測(cè)的可靠性的指標(biāo)?？煽啃约?jí)別(RC)范圍從1到5，其中1表示最強(qiáng)的預(yù)測(cè)。TargetP由丹麥技術(shù)大學(xué)(TechnicalUniversityofDenmark)的月艮務(wù)器維護(hù)。對(duì)于經(jīng)預(yù)測(cè)含有N-端前序列的序列，還可以預(yù)測(cè)潛在的切割位點(diǎn)。選擇了多種參數(shù)，例如生物體類型(非植物或植物)、截?cái)嘀翟O(shè)置(無(wú)、預(yù)先規(guī)定的截?cái)嘀翟O(shè)置或者用戶指定的截?cái)嘀翟O(shè)置)以及切割位點(diǎn)的預(yù)測(cè)計(jì)算(是或否)。使用SEQIDNO:63所示的蛋白質(zhì)序列查詢TargetP1.1。選擇"植物"生物體類型，未規(guī)定截?cái)嘀?，并要求轉(zhuǎn)運(yùn)肽的預(yù)測(cè)長(zhǎng)度。通過TargetP未預(yù)測(cè)出明確的亞細(xì)胞定位，但是SubLoc(Hua和Sun，Bioinformatics)預(yù)測(cè)出細(xì)胞質(zhì)定位?？梢岳迷S多其他的算法進(jìn)行這樣的分析，包括參ChloroP1.l，由丹麥技術(shù)大學(xué)服務(wù)器托管；參蛋白質(zhì)尋覓亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)軟件1.2版，由澳大利亞布里斯班昆士蘭大學(xué)分子生物科學(xué)研究所的服務(wù)器托管；參PENCEProteomeAnalystPA-G0SUB2.5，由加拿大大阿爾貝塔埃德蒙頓阿爾貝塔大學(xué)的服務(wù)器托管；參TMHMM，由丹麥技術(shù)大學(xué)服務(wù)器托管。實(shí)施例15:本發(fā)明方法所用核酸序列的克隆SEQIDNO:62的克隆使用訂制的稻幼苗cDNA文庫(kù)(在pCMVSport6.0中；Invitrogen，Paisley,UK)作為模板，通過PCR，擴(kuò)增用于本發(fā)明方法中的核酸序列SEQIDNO:64。在標(biāo)準(zhǔn)條件下使用HifiTaqDNA聚合酶，用200ng的模板于50iUPCRmix中進(jìn)行PCR。所用的引物為prm06049(SEQIDNO:65;有義，起始密碼子為粗體)5'-gggg織agtttgt織aa腿gcaggcttaaacaatgtgtggcatcctcgccgtgctcg-3'和prm06050(SEQIDNO:66;反義，互補(bǔ))5，_ggggaccactttgtacaagaaagctgggtgcgacgatagaaagttaaacggcag-3'，其包括用于Gateway重組的AttB位點(diǎn)。同樣利用標(biāo)準(zhǔn)方法純化擴(kuò)增的PCR片段。接著進(jìn)行Gateway操作的第一步，即BP反應(yīng)，在此期間PCR片段與pD0NR201質(zhì)粒體內(nèi)重組，產(chǎn)生Gateway術(shù)語(yǔ)所稱的"進(jìn)入(entry)克隆"。作為Gateway，技術(shù)一部分的質(zhì)粒pD0NR201購(gòu)自英駿公司(Invitrogen)。隨后包含SEQIDNO:62的進(jìn)入克隆與用于稻轉(zhuǎn)化的目的載體(destinationvector)—起用于LR反應(yīng)。此載體在T-DNA邊界內(nèi)包含如下功能性元件植物可選擇標(biāo)記；可篩選標(biāo)記表達(dá)盒；旨在與已克隆到進(jìn)入克隆中的目的核酸序列進(jìn)行LR體內(nèi)重組的Gateway盒。用于種子特異性表達(dá)的稻G0S2啟動(dòng)子(SEQIDNO:64)位于此Gateway盒的上游。在LR重組步驟之后，根據(jù)本領(lǐng)域眾所周知的方法將所產(chǎn)生的表達(dá)載體pG0S2::ASNS(圖4)轉(zhuǎn)化進(jìn)農(nóng)桿菌菌株LBA4044。實(shí)施例16:植物轉(zhuǎn)化稻轉(zhuǎn)化使用包含表達(dá)載體的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化稻植物。使梗稻栽培種日本晴(ricej即onicacultivarNipponbare)的成熟干種子脫殼。通過在70%的乙醇中孵育1分鐘，然后在O.2%HgCl2中孵育30分鐘，之后用無(wú)菌蒸餾水洗滌6次，每次15分鐘來(lái)進(jìn)行消毒。然后在包含2，4-D的培養(yǎng)基(愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基)中萌發(fā)無(wú)菌種子。在黑暗中孵育4周后，切取盾片來(lái)源的胚發(fā)生愈傷組織，然后在相同的培養(yǎng)基上進(jìn)行繁殖。2周后，通過在相同的培養(yǎng)基上傳代培養(yǎng)再另外2周來(lái)繁殖或增殖愈傷組織。在共培養(yǎng)前3天在新鮮培養(yǎng)基上傳代培養(yǎng)胚發(fā)生愈傷組織塊(以增強(qiáng)細(xì)胞分裂活性)。包含表達(dá)載體的農(nóng)桿菌株系LBA4404用于共培養(yǎng)。將農(nóng)桿菌接種在具有適宜的抗生素的AB培養(yǎng)基上，在2『C培養(yǎng)3天。然后收集細(xì)菌，將其懸浮在液體共培養(yǎng)培養(yǎng)基中至大約為1的密度(0D6。。)。然后將懸浮液轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)皿(Petridish)，將愈傷組織浸漬在懸浮液中15分鐘。然后將愈傷組織在濾紙上吸干，之后轉(zhuǎn)移至固化的共培養(yǎng)培養(yǎng)基，在25t:在黑暗中孵育3天。然后在選擇劑存在的情況下在2『C在黑暗中，在包含2，4-D的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)共培養(yǎng)的愈傷組織4周。在此期間，產(chǎn)生了快速生長(zhǎng)的抗性愈傷組織島。在將該物質(zhì)轉(zhuǎn)移至再生培養(yǎng)基和在光照下孵育后，胚發(fā)生潛力被釋放，在接下來(lái)的4至5周中發(fā)育出芽。將芽從愈傷組織切下，然后在包含生長(zhǎng)素的培養(yǎng)基上孵育2至3周，然后將它們從所述培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至土壤中。在溫室中在高濕度和短日照下生長(zhǎng)出變硬的芽(shoot)?！獋€(gè)構(gòu)建體產(chǎn)生了大約35個(gè)獨(dú)立的T0稻轉(zhuǎn)化體。將原代轉(zhuǎn)化體從組織培養(yǎng)室轉(zhuǎn)移至溫室。在進(jìn)行確認(rèn)T-DNA插入物的拷貝數(shù)的定量PCR分析后，只保留展示對(duì)選擇劑具抗性的單拷貝轉(zhuǎn)基因植物用于T1種子的收獲。然后在移植后3至5個(gè)月收獲種子。該方法以50%多的比率產(chǎn)生了單基因座轉(zhuǎn)化體(Aldemita和Hodges1996，Chan等人1993，Hiei等人1994)。玉米的轉(zhuǎn)化使用由Ishida等人(1996)NatureBiotech14(6):745-50描述的方法的改進(jìn)方法，進(jìn)行玉米(Zeamays)的轉(zhuǎn)化。在玉米中轉(zhuǎn)化是基因型依賴性的，只有特定的基因型易于進(jìn)行轉(zhuǎn)化和再生。近交系A(chǔ)188(University(^Minnesota)或以A188作為親本的雜種是用于轉(zhuǎn)化的良好供體材料來(lái)源，但也可成功地使用其他基因型。在授粉后大約11天(DAP)，當(dāng)未成熟的胚的長(zhǎng)度為大約1至1.2mm時(shí)，從玉米植物收獲穗子。將未成熟的胚與包含表達(dá)載體的根癌農(nóng)桿菌共培養(yǎng)，通過器官發(fā)生再生轉(zhuǎn)基因植物。將切離的胚培養(yǎng)在包含選擇59劑(例如咪唑啉酮，但可使用不同的選擇標(biāo)記)的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基，然后是玉米再生培養(yǎng)基上。在光照的情況下在25t:孵育培養(yǎng)皿2至3周，或直至芽產(chǎn)生。將綠色的芽從各胚胎轉(zhuǎn)移至玉米生根培養(yǎng)基，在25t:孵育2-3周，直至根產(chǎn)生。然后將生根的芽移植至溫室土壤中。從展示對(duì)選擇劑具有抗性的且包含單拷貝T-DNA插入物的植物產(chǎn)生Tl種子。小麥轉(zhuǎn)化使用由Ishida等人(1996)NatureBiotech14(6):745-50描述的方法進(jìn)行小麥的轉(zhuǎn)化。通常將栽培品種Bobwhite(可從CI匪YT，Mexico獲得)用于轉(zhuǎn)化。將未成熟的胚與包含表達(dá)載體的根癌農(nóng)桿菌共培養(yǎng)，通過器官發(fā)生再生轉(zhuǎn)基因植物。在與農(nóng)桿菌孵育后，將胚體外培養(yǎng)在包含選擇劑(例如咪唑啉酮，但可使用不同的選擇標(biāo)記)的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基，然后是再生培養(yǎng)基上。在光照的情況下在25t:孵育培養(yǎng)皿2至3周，或直至芽產(chǎn)生。將綠色的芽從各胚轉(zhuǎn)移至生根培養(yǎng)基，在25t:孵育2-3周，直至根產(chǎn)生。將生根的芽移植至溫室土壤中。從展示對(duì)選擇劑具有抗性的且包含單拷貝T-DNA插入物的植物產(chǎn)生T1種子。大豆轉(zhuǎn)化按照TexasA&M專利US5，164，310中描述的方法的改進(jìn)方法，轉(zhuǎn)化大豆。幾種商品化大豆品種易于通過該方法進(jìn)行轉(zhuǎn)化。通常將栽培品種Jack(可從IllinoisSeedfoundation獲得)用于轉(zhuǎn)化。對(duì)大豆種子消毒以便體外播種。從7日齡幼苗切取下胚軸、胚根和一片子葉。讓上胚軸和剩下的子葉進(jìn)一步生長(zhǎng)產(chǎn)生腋節(jié)(axillarynode)。切取這些腋節(jié)，將其與包含表達(dá)載體的根癌農(nóng)桿菌一起孵育。在共培養(yǎng)處理后，洗滌外植體，然后轉(zhuǎn)移至選擇培養(yǎng)基。切取再生的芽，將其置于芽伸長(zhǎng)培養(yǎng)基上。將長(zhǎng)度不超過lcm的芽置于生根培養(yǎng)基上直至根產(chǎn)生。將生根的芽轉(zhuǎn)移至溫室的土壤中。從展示對(duì)選擇劑具有抗性的且包含單拷貝T-DNA插入物的植物產(chǎn)生Tl種子。油菜(rapeseed)/蕓苔(Canola)的轉(zhuǎn)化5-6日齡幼苗的子葉柄和下胚軸用作組織培養(yǎng)的外植體，按照Babic等人(1998，PlantCellR印17:183-188)對(duì)其進(jìn)行轉(zhuǎn)化。商業(yè)栽培品種Westar(AgricultureCanada)是用于轉(zhuǎn)化的標(biāo)準(zhǔn)品種，但也可使用其他品種。對(duì)Canola種子進(jìn)行表面消毒以進(jìn)行體外播種。從體外幼苗切取具有附著的子葉的子葉柄外植體，然后通過將子葉柄外植體的切口末端浸入細(xì)菌懸浮液中接種農(nóng)桿菌(包含表達(dá)載體)。然后將外植體在23t:、16小時(shí)光照下，在包含3mg/1BAP、3X蔗糖、0.7%Phytagar的MSBAP-3培養(yǎng)基上培養(yǎng)2天。在與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)2天后，將子葉柄外植體轉(zhuǎn)移至包含3mg/lBAP、頭孢氨噻肟、羧芐青霉素或替卡西林_克拉維酸(timentin)(300mg/l)的MSBAP-3培養(yǎng)基上培養(yǎng)7天，然后在具有頭孢氨噻肟(cefotaxime)、羧芐青霉素或替卡西林_克拉維酸和選擇劑的MSBAP-3培養(yǎng)基上培養(yǎng)直至芽再生。當(dāng)芽的長(zhǎng)度為5-10mm時(shí)，將其切離，然后轉(zhuǎn)移至芽伸長(zhǎng)培養(yǎng)基(MSBAP-0.5，包含0.5mg/lBAP)。將長(zhǎng)度大約2cm的芽轉(zhuǎn)移至生根培養(yǎng)基(MS0)以進(jìn)行根誘導(dǎo)。將生根的芽移植至溫室的土壤中。從展示對(duì)選擇劑具有抗性的且包含單拷貝T-DNA插入物的植物產(chǎn)生Tl種子。苜蓿轉(zhuǎn)化使用(McKersie等人，1999PlantPhysiol119:839-847)的方法轉(zhuǎn)化苜蓿(Medicagosativa)的再生克隆。苜蓿的再生和轉(zhuǎn)化是基因型依賴性的，因而需要再生的植物。已描述了用于獲得再生植物的方法。例如，這些再生植物可選自栽培品種Rangelander(AgricultureCanada)或由BrownDCW禾口AAtanassov(1985.PlantCellTissueOrganCulture4:111-112)描述的任何其他商業(yè)苜蓿品種?？蛇x擇地，RA3品種(UniversityofWisconsin)已選擇用于組織培養(yǎng)(Walker等人，1978AmJBot65:654-659)。將子葉柄外植體與包含表達(dá)載體的根癌農(nóng)桿菌C58ClpMP90(McKersie等人，1999PlantPhysiol119:839-847)或LBA4404的過夜培養(yǎng)物共培養(yǎng)。將外植體在黑暗中在包含288mg/LPro、53mg/L硫代脯氨酸、4.35g/LK2S04和100ym乙酰丁香酮的SH誘導(dǎo)培養(yǎng)基上共培養(yǎng)3天。在一半濃度的Murashige-Skoog培養(yǎng)基(Murashige和Skoog，1962)中洗滌外植體，然后將其種在不含乙酰丁香酮但具有適宜的選擇劑和適宜的抗生素(以抑制農(nóng)桿菌的生長(zhǎng))的相同SH誘導(dǎo)培養(yǎng)基上。在幾周后，將體細(xì)胞胚轉(zhuǎn)移至不含生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑、無(wú)抗生素但含有50g/L蔗糖的B0i2Y發(fā)育培養(yǎng)基中。隨后在一半濃度的Murashige-Skoog培養(yǎng)基上萌發(fā)體細(xì)胞胚。將生根的幼苗移植入花盆和生長(zhǎng)在溫室中。從展示對(duì)選擇劑具有抗性的且包含單拷貝T-DNA插入物的植物產(chǎn)生Tl種子。實(shí)施例17:表型評(píng)估方法17.1評(píng)估設(shè)置產(chǎn)生了大約35個(gè)獨(dú)立的TO稻轉(zhuǎn)化體。原代轉(zhuǎn)化體由組織培養(yǎng)室轉(zhuǎn)移到溫室生長(zhǎng)并收獲T1種子。保留了6個(gè)事件，在這些事件中Tl后代發(fā)生轉(zhuǎn)基因存在/缺乏的3:l分離。通過監(jiān)測(cè)可視標(biāo)記的表達(dá)，在這些事件之每一個(gè)中各選出大約10個(gè)含轉(zhuǎn)基因的T1幼苗(雜合子和純合子)，以及大約10個(gè)缺少轉(zhuǎn)基因的Tl幼苗(無(wú)效合子)。轉(zhuǎn)基因植物和相應(yīng)的無(wú)效合子在隨機(jī)位置上并排生長(zhǎng)。溫室條件為短白晝(12小時(shí)光照)，日間2『C，夜間22t:，相對(duì)濕度70%。進(jìn)一步在T2代中評(píng)價(jià)了4個(gè)Tl事件，所用評(píng)價(jià)程序與用于Tl代的相同，但是每事件有更多的個(gè)體。干旱篩選在正常條件下在花盆土中培養(yǎng)來(lái)自T2種子的植物，直到進(jìn)入抽穗期。然后將其轉(zhuǎn)移到限制灌溉的"干燥"區(qū)域。向隨機(jī)選擇的花盆中插入濕度探測(cè)儀，以監(jiān)測(cè)土壤水含量(SWC)。當(dāng)SWC低于一定的閾值時(shí)，自動(dòng)向植物持續(xù)補(bǔ)水，直到再次達(dá)到正常水平。然后將植物再次重新轉(zhuǎn)移到正常條件下。其余的栽培(植物成熟、種子收獲)與不在非生物脅迫條件下培養(yǎng)的植物相同。如針對(duì)正常條件下的生長(zhǎng)所詳述的那樣，記錄生長(zhǎng)和產(chǎn)率參數(shù)。氮利用效率篩選在除營(yíng)養(yǎng)液以外正常的條件下在花盆土中培養(yǎng)來(lái)自T2種子的稻植物。從植物移植到成熟，用特定的營(yíng)養(yǎng)液對(duì)花盆進(jìn)行澆灌，所述營(yíng)養(yǎng)液的氮(N)含量降低，通常低7到8倍。其余的栽培(植物成熟、種子收獲)與不在非生物脅迫條件下培養(yǎng)的植物相同。如針對(duì)正常條件下的生長(zhǎng)所詳述的那樣，記錄生長(zhǎng)和產(chǎn)率參數(shù)。鹽脅迫篩選在由椰子纖維和argex(3:1的比率)組成的基質(zhì)上培養(yǎng)植物。在將小植物移植在溫室中后于前兩周使用正常的營(yíng)養(yǎng)液。此頭兩周后，在營(yíng)養(yǎng)液中加入25mM的鹽(NaCl)，直到植物收獲。然后測(cè)定種子相關(guān)參數(shù)。17.2統(tǒng)計(jì)分析F檢驗(yàn)61利用雙因素ANOVA(方差分析)作為統(tǒng)計(jì)模型，對(duì)植物表型特征進(jìn)行總體評(píng)估。對(duì)用本發(fā)明基因轉(zhuǎn)化的所有事件的所有植株的測(cè)量到所有參數(shù)進(jìn)行F檢驗(yàn)。進(jìn)行F檢驗(yàn)以檢查基因在所有轉(zhuǎn)化事件上的效應(yīng)，并檢驗(yàn)基因的總體效應(yīng)，亦稱為"整體基因效應(yīng)"(globalgeneeffect)。真實(shí)整體基因效應(yīng)的顯著性閾值設(shè)置為F檢驗(yàn)的5%概率水平。顯著性F檢驗(yàn)值指向基因效應(yīng)，意味著不僅僅只是基因的存在或位置引起表型差異。由于進(jìn)行了具有重疊事件的兩個(gè)實(shí)驗(yàn)，因此進(jìn)行組合分析。這可用于檢查效應(yīng)在兩個(gè)實(shí)驗(yàn)上的一致性，并且如果情況果真如此，這可用于將來(lái)自兩個(gè)實(shí)驗(yàn)的證據(jù)累積起來(lái)以增加結(jié)論的可信度。使用的方法是考慮到數(shù)據(jù)的多層結(jié)構(gòu)(即實(shí)驗(yàn)-事件-分離子)的混合模型方法。通過比較似然比檢驗(yàn)與卡方分布來(lái)獲得P值。17.3測(cè)l量的參數(shù)生物量相關(guān)參數(shù)測(cè)量從播種期到成熟期，植物數(shù)次通過數(shù)碼成像箱。在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)上對(duì)每株植物從至少6個(gè)不同的角度獲取數(shù)碼圖像(2048X1536像素，1千6百萬(wàn)色素)。植物地上面積(或者說(shuō)葉生物量)通過計(jì)數(shù)數(shù)碼圖像上區(qū)別于背景的來(lái)自于地上植物部分的像素的總數(shù)而確定。此值為同一時(shí)間點(diǎn)從不同的角度拍攝的照片的平均值，并通過校準(zhǔn)換算為以平方毫米表示的物理表面值。實(shí)驗(yàn)表明通過這種方法測(cè)量的地上植物面積與植物地上部分的生物量相關(guān)。所述地上面積為在植物達(dá)到其最大葉生物量的時(shí)間點(diǎn)測(cè)量的面積。早期活力為萌發(fā)后3周的植物(幼苗)地上面積。通過計(jì)數(shù)區(qū)別于背景的來(lái)自于地上植物部分的像素的總數(shù)，確定早期活力。該值為同一時(shí)間點(diǎn)從不同的角度拍攝的照片的平均值，并通過校準(zhǔn)換算為以每平方毫米表示的物理表面值。以下描述的結(jié)果為針對(duì)萌發(fā)后3周的植物的結(jié)果。種子相關(guān)參數(shù)測(cè)量收獲成熟的主圓錐花序、計(jì)數(shù)、裝袋、貼上條形碼標(biāo)記，然后在烤箱中于37t:干燥三天。隨后將圓錐花序脫粒，收集并計(jì)數(shù)所有的種子。使用鼓風(fēng)裝置將飽滿谷殼和空殼分開。棄去空殼，再次計(jì)數(shù)剩下的部分。在分析天平上稱重飽滿的谷殼。通過計(jì)數(shù)在分離步驟之后剩下的飽滿谷殼數(shù)，確定飽滿種子數(shù)。通過稱量從植物收獲的所有飽滿谷殼來(lái)測(cè)量種子總產(chǎn)率。通過計(jì)數(shù)從植物收獲的谷殼數(shù)來(lái)測(cè)量每株植物的種子總數(shù)。千粒重(TKW)通過計(jì)數(shù)飽滿種子數(shù)和它們的總重量外推得到。收獲指數(shù)(HI)在本發(fā)明中定義為種子總產(chǎn)率和地上面積(mm2)之間的比值再乘以因子106。每圓錐花序的花總數(shù)在本發(fā)明中定義為種子總數(shù)與成熟的主圓錐花序數(shù)之間的比值。種子飽滿率在本發(fā)明中定義為飽滿種子數(shù)與種子(或小花)總數(shù)的比率(以百分?jǐn)?shù)表示)。根生物量的增加表達(dá)為根的粗度，其為在植物的生命期中觀察到的在某個(gè)粗度閾值之上的最大根生物量(通過根成像系統(tǒng)觀察)。實(shí)施例18:轉(zhuǎn)基因植物的表型評(píng)估結(jié)果在G0S2啟動(dòng)子控制下表達(dá)SEQIDNO:62所示ASNS核酸的轉(zhuǎn)基因稻植物，在生長(zhǎng)于非脅迫條件或降低的氮可利用度條件下時(shí)，在至少一個(gè)下列參數(shù)上表現(xiàn)出了超過5%的增加早期活力、種子總重量、飽滿種子數(shù)、飽滿率、每圓錐花序的花數(shù)、收獲指數(shù)、種子總數(shù)和根粗權(quán)利要求相對(duì)于對(duì)照植物增強(qiáng)植物的產(chǎn)率相關(guān)性狀的方法，包括在植物中調(diào)節(jié)編碼NITR的核酸的表達(dá)，其中所述NITR由SEQIDNO2表示或者是其直系同源物或旁系同源物，其中所述植物生長(zhǎng)于氮缺乏的條件下。2.根據(jù)權(quán)利要求l的方法，其中所述調(diào)節(jié)的表達(dá)通過在植物中引入和表達(dá)編碼所述NITR多肽的核酸而實(shí)現(xiàn)。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其中所述編碼所述NITR多肽的核酸是SEQIDNO:l的部分，或者是能與該核酸雜交的核酸。4.根據(jù)任何前述權(quán)利要求的方法，其中所述核酸序列編碼SEQIDN0:2。5.根據(jù)任何前述權(quán)利要求的方法，其中所述增強(qiáng)的產(chǎn)率相關(guān)性狀包括相對(duì)于對(duì)照植物增加的早期活力和/或增加的產(chǎn)率，優(yōu)選增加的生物量和/或種子產(chǎn)率。6.根據(jù)權(quán)利要求2到5中任一項(xiàng)的方法，其中所述核酸有效連接組成型啟動(dòng)子，優(yōu)選G0S2啟動(dòng)子，最優(yōu)選來(lái)自稻的GOS2啟動(dòng)子。7.根據(jù)權(quán)利要求1到6中任一項(xiàng)的方法，其中所述編碼NITR多肽的核酸是植物來(lái)源的，優(yōu)選來(lái)自單子葉植物，還優(yōu)選來(lái)自十字花科，更優(yōu)選來(lái)自擬南芥屬，最優(yōu)選來(lái)自擬南芥。8.可以通過任何前述權(quán)利要求的方法獲得的植物或其部分，包括種子，其中所述植物或其部分含有編碼NITR多肽的重組核酸。9.構(gòu)建體，含有(a)編碼如權(quán)利要求1所定義的NITR多肽的核酸；(b)能夠驅(qū)動(dòng)(a)中核酸序列表達(dá)的一個(gè)或多個(gè)控制序列；和任選的(c)轉(zhuǎn)錄終止序列。10.根據(jù)權(quán)利要求9的構(gòu)建體，其中所述控制序列之一為組成型啟動(dòng)子，優(yōu)選G0S2啟動(dòng)子，最優(yōu)選來(lái)自稻的G0S2啟動(dòng)子。11.根據(jù)權(quán)利要求9或10的構(gòu)建體在制備相對(duì)于對(duì)照植物具有增強(qiáng)的產(chǎn)率相關(guān)性狀的植物的方法中的用途，其中所述增強(qiáng)的產(chǎn)率相關(guān)性狀特別是增加的早期活力和/或增加的種子產(chǎn)率。12.由根據(jù)權(quán)利要求9或10的構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的植物、植物部分或植物細(xì)胞。13.產(chǎn)生相對(duì)于對(duì)照植物具有增強(qiáng)的早期活力和/或增加的產(chǎn)率，特別是增加的生物量和/或增加的種子產(chǎn)率的轉(zhuǎn)基因植物的方法，包括(i)在植物中引入和表達(dá)編碼如權(quán)利要求1所定義的NITR多肽的核酸；禾口(ii)在促進(jìn)植物生長(zhǎng)和發(fā)育的條件下培養(yǎng)植物細(xì)胞。14.由于編碼如權(quán)利要求1所定義的NITR多肽的核酸的增加表達(dá)而相對(duì)于對(duì)照植物具有增加的產(chǎn)率相關(guān)性狀，特別是增加的早期活力、增加的生物量和/或增加的種子產(chǎn)率的轉(zhuǎn)基因植物，或源自所述轉(zhuǎn)基因植物的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞。15.根據(jù)權(quán)利要求8、12或14的轉(zhuǎn)基因植物或源自所述轉(zhuǎn)基因植物的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞，其中所述植物是作物植物或單子葉植物或谷類，如稻、玉米、小麥、大麥、粟、黑麥、黑小麥、高粱、二粒小麥、斯佩耳特小麥、裸麥、單粒小麥、埃塞俄比亞畫眉草、買羅高粱和燕麥。16.根據(jù)權(quán)利要求15的植物的可收獲部分，其中所述可收獲部分優(yōu)選為枝條生物量，根生物量和/或種子。17.源自根據(jù)權(quán)利要求15的植物和/或根據(jù)權(quán)利要求16的植物可收獲部分的產(chǎn)品。18.編碼NITR多肽的核酸在相對(duì)于對(duì)照植物增加植物的產(chǎn)率相關(guān)性狀，特別是增加如下一個(gè)或多個(gè)性狀中的用途早期活力，種子產(chǎn)率，根生物量和枝條生物量。19.相對(duì)于對(duì)照植物增強(qiáng)植物的產(chǎn)率相關(guān)性狀的方法，包括在植物中調(diào)節(jié)編碼ASNS的核酸的表達(dá)，其中所述ASNS由SEQIDNO:63表示或者是其直系同源物或旁系同源物。20.根據(jù)權(quán)利要求19的方法，其中所述調(diào)節(jié)的表達(dá)通過在植物中引入和表達(dá)編碼所述ASNS多肽的核酸而實(shí)現(xiàn)。21.根據(jù)權(quán)利要求19或20的方法，其中所述編碼所述ASNS多肽的核酸是SEQIDNO:62的部分，或者是能與該核酸雜交的核酸。22.根據(jù)權(quán)利要求19到21中任一項(xiàng)的方法，其中所述核酸序列編碼SEQIDNO:63。23.根據(jù)權(quán)利要求19到22中任一項(xiàng)的方法，其中所述增強(qiáng)的產(chǎn)率相關(guān)性狀包括相對(duì)于對(duì)照植物增加的早期活力和/或增加的產(chǎn)率，優(yōu)選增加的根粗度和/或增加的種子產(chǎn)率。24.根據(jù)權(quán)利要求19到23中任一項(xiàng)的方法，其中所述增強(qiáng)的產(chǎn)率相關(guān)性狀在非脅迫條件下或在降低的養(yǎng)分可利用度條件下獲得。25.根據(jù)權(quán)利要求20到24中任一項(xiàng)的方法，其中所述核酸有效連接組成型啟動(dòng)子，優(yōu)選G0S2啟動(dòng)子，最優(yōu)選來(lái)自稻的G0S2啟動(dòng)子。26.根據(jù)權(quán)利要求19到25中任一項(xiàng)的方法，其中所述編碼ASNS多肽的核酸是植物來(lái)源的，優(yōu)選來(lái)自單子葉植物，還優(yōu)選來(lái)自禾本科，更優(yōu)選來(lái)自稻屬，最優(yōu)選來(lái)自稻。27.可以通過任何前述權(quán)利要求的方法獲得的植物或其部分，其中所述植物或其部分含有編碼ASNS多肽的重組核酸。28.構(gòu)建體，含有(i)編碼如權(quán)利要求19所定義的ASNS多肽的核酸；(ii)能夠驅(qū)動(dòng)(a)中核酸序列表達(dá)的一個(gè)或多個(gè)控制序列；和任選的(iii)轉(zhuǎn)錄終止序列。29.根據(jù)權(quán)利要求28的構(gòu)建體，其中所述控制序列之一為組成型啟動(dòng)子，優(yōu)選G0S2啟動(dòng)子，最優(yōu)選來(lái)自稻的G0S2啟動(dòng)子。30.根據(jù)權(quán)利要求28或29的構(gòu)建體在制備相對(duì)于對(duì)照植物具有增強(qiáng)的產(chǎn)率相關(guān)性狀的植物的方法中的用途，其中所述增強(qiáng)的產(chǎn)率相關(guān)性狀特別是增加的早期活力和增加的產(chǎn)率。31.由根據(jù)權(quán)利要求28或29的構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的植物、植物部分或植物細(xì)胞。32.產(chǎn)生相對(duì)于對(duì)照植物具有增加的產(chǎn)率，特別是增加的生物量和/或增加的種子產(chǎn)率，的轉(zhuǎn)基因植物的方法，包括(i)在植物中引入和表達(dá)編碼如權(quán)利要求19所定義的ASNS多肽的核酸；禾口(ii)在促進(jìn)植物生長(zhǎng)和發(fā)育的條件下培養(yǎng)植物細(xì)胞。33.由于編碼如權(quán)利要求19所定義的ASNS多肽的核酸的增加表達(dá)而相對(duì)于對(duì)照植物具有增加的產(chǎn)率相關(guān)性狀，特別是增加的早期活力、增加的根粗度和/或增加的種子產(chǎn)率的轉(zhuǎn)基因植物，或源自所述轉(zhuǎn)基因植物的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞。34.根據(jù)權(quán)利要求27、31或33的轉(zhuǎn)基因植物或源自所述轉(zhuǎn)基因植物的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞，其中所述植物是作物植物或單子葉植物或谷類，如稻、玉米、小麥、大麥、粟、黑麥、黑小麥、高粱和燕麥。35.根據(jù)權(quán)利要求34的植物的可收獲部分，其中所述可收獲部分優(yōu)選為根生物量和/或種子。36.源自根據(jù)權(quán)利要求34的植物和/或根據(jù)權(quán)利要求35的植物可收獲部分的產(chǎn)品。37.編碼ASNS多肽的核酸在相對(duì)于對(duì)照植物增加植物的產(chǎn)率相關(guān)性狀，特別是增加如下一個(gè)或多個(gè)性狀中的用途早期活力，種子產(chǎn)率和根生物量。全文摘要本發(fā)明一般地涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，涉及增強(qiáng)植物多種經(jīng)濟(jì)學(xué)重要的產(chǎn)率相關(guān)性狀的方法。更具體地，本發(fā)明涉及通過調(diào)節(jié)植物中NITR(亞硝酸還原酶)多肽或者ASNS(天冬酰胺合成酶)多肽編碼核酸的表達(dá)來(lái)增強(qiáng)植物的產(chǎn)率相關(guān)性狀的方法。本發(fā)明還涉及具有調(diào)節(jié)的NITR多肽或者ASNS多肽編碼核酸表達(dá)的植物，所述植物相對(duì)于對(duì)照植物具有增強(qiáng)的產(chǎn)率相關(guān)性狀。本發(fā)明還提供了在本發(fā)明方法中有用的包含NITR編碼核酸或者ASNS編碼核酸的構(gòu)建體。文檔編號(hào)A01H5/00GK101778942SQ200880101028公開日2010年7月14日申請(qǐng)日期2008年7月31日優(yōu)先權(quán)日2007年7月31日發(fā)明者Y·海茨費(fèi)爾德申請(qǐng)人:巴斯夫植物科學(xué)有限公司