專利名稱：提高黃瓜作物產(chǎn)量的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及作物育種，具體地，本發(fā)明涉及提高黃瓜作物產(chǎn)量的方法。本發(fā)明進一 步涉及提高了農(nóng)作物產(chǎn)量的黃瓜作物及所述作物的種子。
背景技術(shù)：
黃瓜(Cucumis sativu)是世界上主要的蔬菜農(nóng)作物，也是葫蘆科 (Cucurbitaceae)中最重要的農(nóng)作物物種之一。其可以作為蔬菜食用，生食、炒食或做成 腌制的黃瓜均可。100多個品種產(chǎn)生的長橢圓形果實的大小可以從小的加工腌漬類型 (Picklers)到大的鮮食切片類型(slicers)，栽培品種的顏色可以從黃色或褐色到深綠 色?，F(xiàn)在栽培的黃瓜通常都無籽，雖然它們通常被認為不如大多數(shù)其他水果營養(yǎng)豐富，但新 鮮的黃瓜富含維生素々、81、85、86、89、(和1(，及礦物質(zhì)。大多數(shù)溫室品種不經(jīng)過授粉產(chǎn)生 果實，且開花的都是雌性(即只產(chǎn)生雌花)。溫室黃瓜的產(chǎn)量潛力高，是因為在每個葉基處生出的一朵或多朵花都將發(fā)育成果 實。整個果實通長的直徑一致時采收的果實，才能滿足上市成熟度的要求。一般開花后12 至15天就能采收或進行上市銷售。相較于大多數(shù)農(nóng)作物，黃瓜能迅速到達采收期。事實上， 許多品種的黃瓜在播種50-60天后即可準備采收。黃瓜藤開花結(jié)果量多豐富，當(dāng)頻繁采收 時(每2至3天)、特別是果實完全成熟前，促進新花萌發(fā)，采收期可持續(xù)10至12周的時 間。盡管也有三輪作的，但兩輪作是最常見的。黃瓜產(chǎn)量主要取決于采收期的長短、個體作物的空間、修剪操作、可獲取的光照、 當(dāng)時的溫度、特殊品種，以及良好的營養(yǎng)和蟲害管理。溫室中在給定區(qū)域生長的作物數(shù)量由 光照條件和培育作物的方法決定。須避免葉片重疊及被相鄰作物遮擋，夏季的光照條件與 冬季的條件相比，應(yīng)允許更高的作物密度。作物可以采取垂直培育或以傘狀培育。種植密 度一般為每平方米2株?？紤]到這些變化因素，每個采收期每株作物的平均作物產(chǎn)量可達 10-50根黃瓜。在采收中期，傘形培育的農(nóng)作物產(chǎn)量范圍可在每周每株作物0. 5-1. 5kg果實 之間。提高目前黃瓜雜交的產(chǎn)量，尤其是表示為kg果實/株作物的產(chǎn)量，對現(xiàn)代黃瓜育 種者來說是個挑戰(zhàn)。因此，傳統(tǒng)的育種方法遠不能產(chǎn)生明顯提高農(nóng)作物產(chǎn)量的結(jié)果。例如， 由于改進了培養(yǎng)技術(shù)，選擇用于提高產(chǎn)量和增強抗病性，I960至1980年間美國加工黃瓜的 平均產(chǎn)量幾乎翻了一番。然而，在過去20年里，沒有取得明顯的提高?？刹扇追N途徑之 一來解決這個問題。一種提高產(chǎn)量的方法基于進一步改善營養(yǎng)和蟲害管理。然而，在現(xiàn)代可控的生產(chǎn) 環(huán)境下，這些參數(shù)常常已經(jīng)被最優(yōu)化了。另一個方法包括改善育種系。作物育種者和尤其是種子公司，采用優(yōu)良的育種系， 一般稱為“優(yōu)良系”，以提供質(zhì)量穩(wěn)定的產(chǎn)品。優(yōu)良系是多年的同系繁殖的結(jié)果，結(jié)合了多種 優(yōu)良特性，如高產(chǎn)、果實品質(zhì)，以及抗蟲害、疾病或非生物應(yīng)力。這些優(yōu)良系的平均產(chǎn)量普遍 比原始野生(地方品種，landrace)的高，許多現(xiàn)代黃瓜都是原始野生品種的后代。優(yōu)良系可以直接用作農(nóng)作物植物，也可以用來產(chǎn)生所謂的Fl代或單雜交種，單雜交種由兩個(純 合系或自交系)優(yōu)良系雜交產(chǎn)生。因此，F(xiàn)l代雜種將兩個親本的遺傳特性結(jié)合到單一植株 中。雜交的另外一個好處是，它們表現(xiàn)出雜種活力或雜種優(yōu)勢，令人不甚理解的現(xiàn)象是，雜 交作物生長的比每個(自交系)親本都好，并表現(xiàn)出較高的產(chǎn)量。回交或系譜選擇是育種方法之一，育種者通過這種方法將理想的農(nóng)藝性狀添加到 他們的優(yōu)良育種系中。該方法包括將育種系與能表達理想性狀的系雜交，然后將表達性狀 的子代作物與輪回親本回交。結(jié)果，在育種程序中親本個體的篩選基于其祖先的表現(xiàn)。這 些方法在培育高質(zhì)量遺傳性狀方面非常有效，即性狀被劃分為正面的或負面的。然而，種植 者關(guān)心的諸多性狀，如產(chǎn)量、早熟性和質(zhì)量，都是定量繼承的且遺傳力較低。如果缺乏合適 的性狀來源，就無法進行改善。回交篩選對于改善育種系是一種可替代的育種方法，該方法包括進行系統(tǒng)試驗， 篩選理想的后代，然后重組所選個體以形成新的種群。已經(jīng)證明回交篩選能有效改善低遺 傳力的數(shù)量性狀，如黃瓜的產(chǎn)量。然而，回交篩選在育種程序中不能增加各種性狀下的遺傳 基礎(chǔ)，因此，其潛力是有限的。隨著時間的推移，僅實現(xiàn)了輕微的改善。這就需要其他的方法來提高黃瓜的產(chǎn)量。本發(fā)明的目的是提供具有提高了作物產(chǎn) 量的黃瓜作物的生產(chǎn)方法。本發(fā)明的另一個目的是提供具有提高了作物產(chǎn)量的經(jīng)培育的黃 瓜作物。發(fā)明概述本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)在方法中可以用特殊的野生黃瓜品種來提高黃瓜培育品種的產(chǎn)量。 在研究基因滲入系(IL)基因庫時得出這一發(fā)現(xiàn)，其采用如下方式開展將來自供體作物的 野生黃瓜(Cucumus sativus)登錄號為PI 169383 (見圖2)的染色體片段通過基因滲入進 入到作為受體的市售黃瓜雜種(也為C. sativus)親本之一的作物相應(yīng)的染色體位置。開發(fā) 的IL-基因庫的表型在某些基因滲入系中表現(xiàn)出產(chǎn)量顯著增加。詳細的圖譜的研究顯示， 改善的產(chǎn)量特征與連鎖群4中來自PI 169383的三個片段有關(guān)。這些片段在栽培黃瓜作物 相應(yīng)染色體中的基因滲入導(dǎo)致所述栽培黃瓜作物后代產(chǎn)量上的增加?；驖B入片段的特征 在于數(shù)量性狀位點(QTLs)，這些QTL在黃瓜基因組的位置由7AFLP-標(biāo)記物來定義。進一步 地，基因滲入的表型在雜合情況和雜種情況中執(zhí)行。結(jié)果載于下文所述的實施例?；谶@一發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明人提供一種與提高產(chǎn)量相關(guān)的具有令人滿意的表型特征的 新型遺傳基礎(chǔ)。該遺傳基礎(chǔ)存在于野生黃瓜(Cucumus sativus)登錄號為PI 169383。雖然增加產(chǎn)量的表型性質(zhì)下的基因或相關(guān)序列尚(還)未被確認，但該基因或相 關(guān)序列的基因組位置(即位點)已確定。這有利于育種的過程，其中基因或調(diào)控序列被引 入理想的黃瓜育種系。一方面，本發(fā)明提供黃瓜育種系的作物，該作物具有來自黃瓜登錄號為PI 169383 的基因滲入，其中所述的基因滲入是在與提高所述作物產(chǎn)量相關(guān)的連鎖群3和/或4的基 因滲入，其中相對于缺少所述滲入的所述黃瓜育種的作物而言，本發(fā)明所述的作物顯示出 產(chǎn)量增加。優(yōu)選地，所述產(chǎn)量增加是指總單株果重更高。例如，本發(fā)明人將來自黃瓜登錄號為PI 169383的作物作為基因滲入的供體系， 與黃瓜系Pyr42的作物雜交，其代表性的種子樣本已保藏于英國蘇格蘭阿伯丁的英國食品 工業(yè)與海洋細菌菌種保藏中心(NCIMB，National Collections of Industrial, Food andMarineBacterial)，登錄號為 NCIMB 41594，保藏參考號為(cbpositorsreference) Pyr42。 采用Pyr42作為輪回親本回交所得的子代。研究發(fā)現(xiàn)，相對于缺少所述基因滲入的Pyr42 系作物，含有基因滲入(本文中被稱為產(chǎn)量_提高的QTL)的作物所提供的作物產(chǎn)量得到提高ο在本發(fā)明的各個方面，相較于缺少所述基因滲入的所述黃瓜育種株作物，優(yōu)選地， 產(chǎn)量增加是指總單株果重至少增加3-5%，更優(yōu)選地，至少增加10%。在涉及總單株果重時，優(yōu)選地，意思是以每采收期每株植物生產(chǎn)的適銷果實總重 量為參考。黃瓜應(yīng)在達到上市重量時采收，能生產(chǎn)出高產(chǎn)量的上市重量果實的作物優(yōu)于 能生產(chǎn)出高產(chǎn)量的低于上市重量果實的作物。適銷果實的重量取決于黃瓜的種類。鮮食 切片類型(Slicers)和貝特阿勒法類型(Beit Alpha)的適銷重量要高于加工腌漬類型 (Picklers)。優(yōu)選地，本發(fā)明所指的產(chǎn)量增加涉及鮮食切片類型(Slicers)、貝特阿勒法類 型(BeitAlpha)和長黃瓜(長荷蘭黃瓜或歐洲溫室黃瓜)的產(chǎn)量增加，更優(yōu)選地，涉及長黃 瓜。優(yōu)選地，本發(fā)明的黃瓜果實的長度為26cm，更有選地為27、28、29、30、31、32、33、34、35、 36、37、38、39、40、41、42、43、44或45cm。本發(fā)明的作物果實的長度/直徑比優(yōu)選地為4、5、6、 7,8,9或更大，諸如25。優(yōu)選地，本發(fā)明作物的適銷果實的重量在150-900g之間，更優(yōu)選地， 在200-800g之間，更優(yōu)選地，在250-600g之間。適銷果實的典型的重量很大程度上取決于 黃瓜的種類。對于美國鮮食切片類型(American slicer)，適銷果實的重量約為150_230g， 而對于歐洲溫室黃瓜，適銷果實的重量典型地約為300-700g。對于貝特阿勒法類型，適銷果 實的重量約為90-200g。典型地，貝特阿勒法黃瓜的長度為12-18cm。對于加工腌漬類型， 適銷果實的重量約為80-110g。典型地，加工黃瓜的長度約為9-12cm。這些果實的重量是 在商業(yè)生長條件下得到的，其中作物經(jīng)過修剪和采收以得到最佳性狀。在這些條件下，達到 了本發(fā)明預(yù)期的適銷果實的重量。在一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的黃瓜育種系的作物基本上已經(jīng)從黃瓜登錄號 為PI 169383獲得了特定的基因滲入，其中所述基因滲入位于包括與提高產(chǎn)量相關(guān)的QTL 的連鎖群3和/或4。盡管獲取該基因滲入的植物可能已經(jīng)從供體獲得其他的基因滲入，但 優(yōu)選的是大多數(shù)受體基因組是不變的，因此，該育種系植物的表型基本上是保守的。這不能 通過將作物系PI 169383與黃瓜育種系作物簡單雜交而獲得，這是因為那將不能夠?qū)е卤?文所限定的產(chǎn)量QTL的基因滲入，而僅僅是在具有來自PI 169383的一系列染色體的雜種 中以及來自所述黃瓜育種系的作物的其他雜種中。與之相反，在PI169383中的與提高產(chǎn)量 相關(guān)的連鎖群3和/或4上的片段可以被基因滲入至黃瓜育種系作物的基因組中，這是通 過以下完成的，將所述作物雜交，隨后進行一步或多步自交和/或回交(至所述黃瓜育種系 的另一作物作為回歸親本)并且從所述自交和/或回交的后代群體選擇作物，所述后代群 體使用標(biāo)記輔助選擇基因滲入。在優(yōu)選的實施方案中，所述在連鎖群3和/或4上的基因滲入包括在選自所述群的連鎖群4上的至少一個片段，該片段由以下組成i)與 AFLP 標(biāo)記 E12/M24-F-063-P2、E11/M62-F-200-P1 相關(guān)的片段；ii)與 AFLP 標(biāo)記 E12/M24-F-177-P2、E12/M24-F-176-P1、E25/M13-F-128-P2 相關(guān) 的片段；iii)與AFLP標(biāo)記E21/M16-F-080-P2相關(guān)的片段；和/或連鎖群3的染色體替換。
在圖1中表示出以厘摩表示的基因距離并確定在研究中的種群。這些值與其他種 群不同。因此，這些標(biāo)記本身提供了 QTL的位置的最佳定義。該圖還表示哪個標(biāo)記不定義 與提高產(chǎn)量相關(guān)的片段。通過連續(xù)的回交至所述輪回親本的步驟，可以將具有所述基因滲入的黃瓜育種系 的作物引入優(yōu)良系中，以便使所述系越來越純或近交。因此，本發(fā)明也提供具有提高產(chǎn)量的 優(yōu)良系。所述優(yōu)良系具有來自黃瓜登錄號為PI 169383的基因滲入，其中所述基因滲入是 與提高產(chǎn)量相關(guān)的連鎖群3和/或4上的基因滲入。另一方面，本發(fā)明提供通過將本發(fā)明的黃瓜育種系的作物的雜交或自交產(chǎn)生的黃 瓜種子。優(yōu)選地，所述種子是雜交種子，尤其是Fl雜交種子。例如，這種雜交種子可以通過 本發(fā)明的兩種優(yōu)良系雜交來產(chǎn)生。在另一方面，本發(fā)明提供通過種植本發(fā)明的種子所生產(chǎn)的黃瓜作物。在另一方面， 本發(fā)明提供該作物的作物部位。優(yōu)選地，所述作物部位為黃瓜果實或種子。在另一方面，本發(fā)明提供用于生產(chǎn)雜種黃瓜種子的方法，該方法包括將本發(fā)明 的黃瓜育種系(優(yōu)選地為優(yōu)良系)作物，該黃瓜具有從如上定義的來自黃瓜登錄號為PI 169383的基因滲入，與另一個黃瓜作物雜交，并采收所得的雜種黃瓜種子。在優(yōu)選的實施方 案中，所述另一個黃瓜作物是黃瓜育種系的作物，更優(yōu)選地為(不同)優(yōu)良系的作物。所述 另一個黃瓜作物優(yōu)選地為具有來自如上所定義黃瓜登錄號為PI 169383的基因滲入。在另一方面，本發(fā)明提供由本發(fā)明的方法所生產(chǎn)的雜種黃瓜種子。該雜種黃瓜種 子的特征在于其含有來自在黃瓜的育種系(優(yōu)選地為優(yōu)良系)的基因組背景中的如上定義 的黃瓜登錄號為PI 169383的基因滲入，其是以雜合或純合的方式，其中所述基因滲入優(yōu) 選地由上文描述的AFLP標(biāo)記所定義。當(dāng)發(fā)芽時，該雜種種子將提供雜種黃瓜，該黃瓜具有 一般雜交的全部特征，其是將本發(fā)明的黃瓜的育種系(優(yōu)選地為優(yōu)良系)的作物與上述另 一個黃瓜作物進行雜交(即其將產(chǎn)生具有顯著商業(yè)市場價值的作物)，但其產(chǎn)量更高。純合 和雜合作物均是本發(fā)明的部分，因為產(chǎn)量特征是附加特征，也在雜合作物中表達。在另一方面，本發(fā)明提供通過種植本發(fā)明的雜種黃瓜種子而生產(chǎn)的雜種黃瓜作 物。在另一方面，本發(fā)明提供本發(fā)明的雜種黃瓜作物的作物部分。在另一方面，本發(fā)明提供用于提高黃瓜育種系的作物的產(chǎn)量的方法，所述方法包 括以下步驟a)將黃瓜育種系的作物與黃瓜系PI 169383的作物雜交；b)選擇由所述雜交得到的來自黃瓜登錄號為PI 169383的具有在與提高產(chǎn)量相 關(guān)的連鎖群4上的基因滲入的后代黃瓜作物；c)將選自步驟(b)的使用所述黃瓜育種系作為輪回親本的所述后代黃瓜作物自 交和/或回交；d)選擇由在步驟(c)中得到的來自黃瓜登錄號為PI 169383的具有在與提高產(chǎn)量 相關(guān)的連鎖群4上的基因滲入的后代黃瓜作物；e)重復(fù)所述自交和/或回交步驟，以及選擇步驟(C)和(d)以提供對于所述基因 滲入基本上純合的黃瓜育種系的作物；其中在步驟(b)或(d)中所進行的至少一種選擇由標(biāo)記輔助的選擇來完成。
在這種方法的一個優(yōu)選的實施方案中，所述黃瓜育種系是優(yōu)良系。在另一方面，本發(fā)明提供用于提高黃瓜雜交Fl代的產(chǎn)量的方法，所述方法包括以 下方法a)將至少一個所述黃瓜雜交Fl代的第一親本系與黃瓜系PI169383的作物雜交；b)選擇由所述雜交得到的來自黃瓜登錄號為PI 169383的具有在與提高產(chǎn)量相 關(guān)的連鎖群4上的基因滲入的后代黃瓜作物；c)將選自步驟(b)的使用所述黃瓜雜交Fl代的親本系作為輪回親本的所述后代 黃瓜作物自交和/或回交；d)選擇由在步驟(c)中得到的來自黃瓜登錄品種PI 169383的具有在與提高產(chǎn)量 相關(guān)的連鎖群4上的基因滲入的后代黃瓜作物；e)重復(fù)所述自交和/或回交步驟，以及選擇步驟(C)和⑷以提供對于所述基因 滲入基本上純合的所述黃瓜雜交Fl代的親本系；f)使用在步驟(e)中得到的作為親本系的用于具有提高產(chǎn)量的Fl雜種的生產(chǎn)的 所述親本系；其中在步驟(b)或(d)中所進行的至少一種選擇由標(biāo)記輔助的選擇來完成。在上述方法的優(yōu)選的實施方案中，所述標(biāo)記輔助的選擇過程包括用于如下 AFLP 標(biāo)記的選擇E12/M24-F-063-P2、E11/M62-F-200-P1、E12/M24-F-177-P2、E12/ M24-F-176-P1、E25/M13-F-128-P2 和 E21/M16-F-080-P2。在另一方面，本發(fā)明提供通過本發(fā)明的方法所獲得的黃瓜育種系或黃瓜雜交Fl 代。在另一方面，本發(fā)明提供包含與提高黃瓜產(chǎn)量相關(guān)的QTL的分離出的核酸序列， 其中所述QTL定義如下i)與 AFLP 標(biāo)記 E12/M24-F-063-P2、Ell/M62-F-200-Pl 相關(guān)的連鎖群 4 上的片段；ii)與 AFLP 標(biāo)記 E12/M24-F-177-P2、E12/M24-F-176-P1、E25/M13-F-128-P2 相關(guān) 的連鎖群4上的片段；iii)與AFLP標(biāo)記E21/M16-F-080-P2相關(guān)的連鎖群4上的片段。在另一方面，本發(fā)明提供基因標(biāo)記的使用，該基因標(biāo)記選自由如下AFLP標(biāo)記組成 的組E12/M24-F-063-P2、Ell/M62-F-200-Pl、E12/M24-F-177-P2、E12/M24-F-176-Pl、E25/ M13-F-128-P2和E21/M16-F-080-P2，用于檢測與提高黃瓜作物產(chǎn)量相關(guān)的QTL。在另一方面，本發(fā)明提供用于選擇黃瓜作物或其部位(包括種子)的方法，該方法 包括以下步驟(a)提供通過將黃瓜育種系的作物與黃瓜系PI 169383的作物雜交得到的后代黃 瓜作物或其部位，獲得來自所述雜交的種子并將所述種子種植至后代作物；(b)針對來自黃瓜登錄號為PI 169383的基因滲入片段檢測所述后代黃瓜作物或 其部位，其種子的代表樣本已經(jīng)保藏在蘇格蘭阿伯丁的NCIMB，其登錄號為NCIMB 41532和 保藏參考號為PI169383，其中所述基因滲入是與所述作物的產(chǎn)量提高相關(guān)的連鎖群4上的 基因滲入；(c)選擇基于來源于所述檢測信息的所述后代黃瓜作物或其部位；以及(d)任選地使用所述信息用于進一步的育種考慮。


圖1表明連鎖群4的基因圖譜(總長度100. IcM)，提供標(biāo)記及其相對于彼此的各 自位置的特性，并且也表明與基因滲入片段相關(guān)(在左側(cè)表明)，其對于產(chǎn)量具有(+)或不 具有(_)作用(與表2比較)。被發(fā)現(xiàn)在連鎖群4上的對于產(chǎn)量具有作用的三個片段在圖 下方用“ + ”表示。圖2表明近似于商品品種(在左邊，標(biāo)注“IL 06AB”)的從IL獲得的果實以及所 述供體PI169383(在右邊，標(biāo)注“Donor 06AB”)的圖片。所述果實從作物的腋下(armpit)獲得。圖3表明所選的黃瓜作物的基因組的AFLP圖譜的AFLP凝膠的部分(省略)圖像 (47個泳道各不相同)，用本文所定義的引物組合E12/M24擴增。用相鄰的箭頭(左側(cè))表 示具有176和177堿基對的長度的片段，并表明二等位基因標(biāo)記E12/M24-F-177-P2/E12/ M24-F-176-P1。凝膠從頂端跑至底端。圖4表明所選的黃瓜作物的基因組的AFLP圖譜的AFLP凝膠的部分(省略)圖像 (49泳道各不相同)，用本文所定義的引物組合E11/M62擴增。表明標(biāo)記E11/M62-F-200-P1 的200堿基對的片段用箭頭(左側(cè))表示。圖5表示Cucumis sativus的對于染色體3 (連鎖群3)的連鎖圖。該申請也涵蓋 染色體3的染色體替換的使用。在這樣的替換系中，全部的核DNA源于所述輪回親本，除了 以在連鎖群3中的標(biāo)記為特征的染色體。所有的與標(biāo)記關(guān)聯(lián)的DNA在該連鎖圖中列出，該 圖是優(yōu)選地獨特并在遺傳上是關(guān)聯(lián)的，源于供體親本PI169383。發(fā)明詳述定義本文使用的術(shù)語“黃瓜”是指Cucumis sativus L.品種，包括Cucumissativus L. var. hardwickii (Royle)或雜草黃瓜(weedy cucumber)、Cucumis sativus L. var. sativus或栽培黃瓜、Cucumis sativus L. var. sativus (中國種群)或網(wǎng)狀的黃色黃瓜、 Cucumis sativus L.(小黃瓜禾中群)或力口工黃瓜、Cucumis sativus L. var. sativus ( Bp 度種群)或白色條紋黃瓜、Cucumis sativus L. var. sativus (日本種群)或日本黃瓜、 Cucumis sativus L. var. sativus ()Cucumissativus L. var. sativus (俄羅斯種群)或俄羅斯黃瓜、Cucumis sativus L. var. sativus (無籽種群)或 無籽黃瓜、Cucumis sativus L. var. sativus (標(biāo)準種群)或普通黃瓜/溫室黃瓜、Cucumis sativus L. var. sikkimensisHook. f.或掠色網(wǎng)狀黃瓜禾口 Cucumis sativus L. var. xishuangbannanesisined或西雙版納黃瓜。從植物學(xué)上講，Cucumis sativus L.這個名 稱是指野生品種，但在種子和蔬菜貿(mào)易上，它可作為任何較長植物名稱的同義詞，分類學(xué) 者可以將其應(yīng)用到栽培品種上?；趲缀?500個登錄品種都錄入USDA GRIN數(shù)據(jù)庫，所 以一般常用“C. sativus L. var. sativus”。然而，如果因為分類學(xué)者不贊成將栽培作物 (domesticatedplants)稱為植物學(xué)品種“var”，那么這個名稱未來可以改變。術(shù)語“黃瓜” 包括提到的(美國和歐洲)加工腌漬類型、(美國和歐洲)鮮食切片類型、歐洲溫室類型 (單性著果的)、中東(Beit Alpha類型)和東部棚載類型的(Burpless)黃瓜。術(shù)語歐洲、 美國、中東或東部不限于指本發(fā)明黃瓜的地區(qū)來源或生產(chǎn)地區(qū)，但僅指黃瓜育種領(lǐng)域中通用的涉及的市場類型。Cucumis sativus var. sativus登錄號為PI 169383保留在美國愛荷華州埃姆斯 的北中部地區(qū)植物引種站(USDA，ARS, NCRPIS, Iowa StateUniversity, Regional Plant Introduction Station)，該登錄品種的種子免費發(fā)行。該登錄品種的生物狀態(tài)為“野生”。 該植物品種首先采集于土耳其的伊斯坦布爾。其果實成熟時為典型的黃色，由于低產(chǎn)量和 綠色果實的一般要求，其商業(yè)價值有限。在涉及本發(fā)明的作物時，沒有旨在提及黃瓜登錄號 為PI 169383，因此本發(fā)明不要求保護這種作物。關(guān)于該登錄品種的更多信息可從種質(zhì)資源 信息網(wǎng)(GRIN) (USDA，ARS，國家遺傳資源計劃)的在線數(shù)據(jù)庫獲得。國家種質(zhì)資源實驗室， 貝茨維爾，馬里蘭州(http://www. ars-grin. gov) (2007年8月8日))。本發(fā)明的申請人/ 代理人已于2007年12月17日將代表性的黃瓜登錄號為PI 169383的種子樣本保藏于蘇 格蘭阿伯丁的NCIMB，登錄號為NCIMB 41532，保藏參考號為PI169383。本文中使用的術(shù)語“雜交”是指由雄性作物(或配子)對雌性作物(或配子)進 行受精。術(shù)語“配子”是指作物通過有絲分裂從配子體產(chǎn)生的單倍體生殖細胞(卵子或精 子)且包含有性繁殖，在有性繁殖期間，兩個性別相反的配子融合形成二倍體接合子。該術(shù) 語一般包含花粉(含有精子細胞)和胚珠(含有卵子)。因此“雜交”一般是指一個個體的 胚珠與來自另一個個體的花粉受精，而“自體受精”是指一個個體的胚珠與來自相同個體的 花粉受精。當(dāng)本文中提及雜交完成基因組區(qū)域或片段的基因滲入時，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可 以理解為了完成一株作物染色體的某一部分到另一株作物染色體的基因滲入，由于親本系 中產(chǎn)生配子的交換事件的發(fā)生率，要求兩株親本系的基因組的任意部分在雜交中都可以進 行重組。因此，兩株親本的基因組必須通過雜交在一個單細胞中結(jié)合，從所述細胞產(chǎn)生配子 后，配子在受精中融合將導(dǎo)致基因滲入事件的發(fā)生。本文中使用的術(shù)語“雜種”意思是兩株遺傳學(xué)上不同的個體之間雜交的任何子代， 更優(yōu)選地，該術(shù)語是指不會從種子中復(fù)制出真實親本的兩(優(yōu)良)育種系之間的雜交。本 發(fā)明的雜種黃瓜優(yōu)選地表現(xiàn)出強烈的雌性特征。本發(fā)明使用的術(shù)語“育種系”是指具有商業(yè)價值或農(nóng)藝上令人滿意的特征的栽培 黃瓜系，與野生品種或地方品種(landrace)相反。特別地，所述育種系的特征在于具有優(yōu) 異的果實質(zhì)量(直的、圓柱形的和塊狀形狀以及均一的深綠色)。該術(shù)語包括優(yōu)良育種系或 優(yōu)良系，這表示實質(zhì)上純合的、通常自交的、用于產(chǎn)生Fl代雜種的作物系。本發(fā)明所述的育 種系優(yōu)選地具有抗白粉病的特性。本發(fā)明所用的術(shù)語“產(chǎn)量”是指果實產(chǎn)量(黃瓜)，也可以用每采收期每平方米區(qū) 域的總果實重量(kg)、每采收期每平方米的總果實重量(kg)，或其結(jié)合表示的產(chǎn)量。術(shù)語 “采收期”是指第一批適銷果實產(chǎn)生和生產(chǎn)階段結(jié)束的時間段，此間需要農(nóng)作物復(fù)壯，對溫 室黃瓜而言時間跨度一般為12周。本文使用的術(shù)語“等位基因”是指一個基因的一或多種可替代形態(tài)的任一個，其中 等位基因涉及至少一個性狀或特征。在二倍體細胞或有機體中，所給基因的兩個等位基因 位于一對同源染色體的相應(yīng)位點。因為本發(fā)明涉及QTLs，即可以含有一或多個基因的基因 組區(qū)域，也可以是調(diào)控序列，在某些示例中更精確地是指“單體型”(即染色體片段的一個等 位基因)而不是“等位基因”，然而，在那些示例中，術(shù)語“等位基因”應(yīng)被理解為包括“單體 型”。
本文中定義的“基因”是指遺傳單元(通常由DNA序列表示)，在染色體上占據(jù)特 定位置，含有遺傳指令用于作物中特定的表型特征或性狀。QTL(數(shù)量性狀位點)是遺傳單 元(通常由一或多個分子基因組標(biāo)記物表示)，在染色體上占據(jù)特定位置，含有遺傳指令用 于作物中特定的表型特征或性狀。與基因相比，QTL的精確的界線尚不明了，但可由本領(lǐng)域 的技術(shù)人員通過使用遺傳圖譜領(lǐng)域中已知的精確的圖譜技術(shù)和后續(xù)的DNA序列路線來獲 知不包含不適當(dāng)?shù)慕缦?。QTL編碼至少一個單獨表達或與其他基因聯(lián)合表達的基因，結(jié)果得 到被表達的表型性狀，或者編碼至少一個調(diào)控區(qū)域，該區(qū)域控制至少一個基因的表達，該基 因單獨或與其他基因聯(lián)合表達，結(jié)果得到被表達的表型性狀。QTL可以通過用一或多個分子 基因組標(biāo)記物表示其在含有QTL的基因滲入的供體基因組中的遺傳位置來定義。一或多個 標(biāo)記物依次表示特定的位點。位點之間的距離通常由相同染色體上位點間交換的頻率來測 量。進一步分離的兩個位點是，交換最有可能發(fā)生在它們之間的那兩個位點。相反地，如果 兩個位點相鄰，交換就很少發(fā)生在它們之間。結(jié)果，一厘摩(cM)相當(dāng)于位點(標(biāo)記物)間 的1 %重組。當(dāng)QTL可以用多個標(biāo)記物表示時，終點標(biāo)記物間的遺傳距離就表示QTL的大 小。定義QTL的標(biāo)記物可以是鏈接到QTL的標(biāo)記物或者是與QTL連鎖不平衡的標(biāo)記物。本文所使用的“分子基因組標(biāo)記物”或簡稱“標(biāo)記物”是指方法中使用的用于視 覺上區(qū)分核酸序列特征的指示劑。這些指示劑的示例為限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)標(biāo) 記物，擴增片段長度多態(tài)性(AFLP)標(biāo)記物，單核苷酸多態(tài)性(SNPs)，插入突變，微衛(wèi)星標(biāo)記 (SSRs)，序列-特征擴增區(qū)(SCARs)，酶切擴增多態(tài)性序列(CAPS)標(biāo)記物或同工酶標(biāo)記物 或各標(biāo)記物的結(jié)合，此處所述的標(biāo)記物定義一個特殊基因和染色體位置。因此本文定義的 “分子標(biāo)記物連接到QTL”是指SNPs、插入突變以及更常用的AFLP標(biāo)記物或本領(lǐng)域中使用的 任何其他類型的標(biāo)記物。本文所稱的AFLP標(biāo)記物中，所述標(biāo)記物是指側(cè)面由兩個AFLP-引 物連接的黃瓜_特異性DNA序列，該引物由“核引物’ 和M組成，與限制性內(nèi)切酶EcoRI和 MseI 的限制性位點相對應(yīng)，(Vos et al.，1995，Nucleic Acids Res. 23 4407-4414 ；Bai et al. 2003，Mol. plant microbe interactions 16 :169_176)，后接 2 或 3 個額外的選擇性堿 基作為指示，每個堿基后邊是識別選擇性核苷酸的2位代碼，“核引物”通過選擇性核苷酸 擴展(11 :AA ；12 =AC ；13 -M ；14 :AT ；15 :CA ；16 :CC ；17 :CG ；18 :CT ；21 :GG ；22 :GT ；24 :TC ； 25 =TG ；60 =CTC ；62 =CTT)。因此，E12/M24-F-063-P2 代表通過使用擴增引物 EcoRI+AC 和 Msel+TC產(chǎn)生總長度為63bp的片段而獲得的標(biāo)記物。片段的長度可取決于檢測片段的方 法，加上或減去幾個堿基即接近其真實的長度。在定義本發(fā)明提供的標(biāo)記物時，應(yīng)在連鎖圖 譜中在所述標(biāo)記物的染色體位置上制定一個相對于其他標(biāo)記物的參考。因此，標(biāo)記物E12/ M24-F-063-P2由其引物序列及其作為擴增產(chǎn)物的長度，和其相對于E11/M62-F-200-P1和/ 或E12/M24-F-177-P2的位置或者，如本文提供的，由其相對于如圖1所述的以cM表示的相 應(yīng)距離的其他標(biāo)記物的位置共同來定義。本文中“位點”被定義為所給基因占據(jù)所給作物物種的染色體的位置。本文中所使用的術(shù)語“雜合子”意思是不同等位基因位于同源染色體的相應(yīng)位點 時存在的遺傳情況。本文中所使用的術(shù)語“純合子”意思是相同等位基因位于同源染色體的相應(yīng)位點 時存在的遺傳情況。本文使用的術(shù)語“基因滲入系”，簡稱IL，是指的具有明確的染色體片段的系(優(yōu)選地一個明確的染色體片段，取決于標(biāo)記物_分辨率)，該染色體片段來源于另外的一致背 景的供體親本，典型地含有大于95%的受體基因組(通常將育種系的基因組用于受體和輪 回親本)。ILs有助于QTLs的鑒定，原因在于IL基因庫中不同ILs之間的表型變異(一起 覆蓋了供體的整個基因組)，輪回親本與基因滲入片段直接相關(guān)?；驖B入系是典型的純合 子。 本文使用的術(shù)語“純自交系”或“自交系”是指通過重復(fù)自交獲得的實質(zhì)上純合的 作物或作物系?！爸亟M事件”是指減數(shù)分裂交換事件。本文使用的術(shù)語“基因滲入”是指基因組片段通過與那些個體、物種、品種或栽培 品種雜交，從一個個體、物種、品種或栽培品種轉(zhuǎn)移至另一個個體、物種、品種或栽培品種的
基因組中。本文使用的術(shù)語“進行基因滲入”、“基因滲入”和“基因滲入的”是指自然的和人 工的過程，借此，個體基因或全部性狀通過與那些個體、物種、品種或栽培品種雜交，從一個 個體、物種、品種或栽培品種轉(zhuǎn)移至另一個個體、物種、品種或栽培品種的基因組。在植物育 種中，該過程通常包括與輪回親本自交或回交來提供不斷增加的純合子作物，這些作物具 有本質(zhì)上輪回親本的特征以及基因滲入的基因或性狀。術(shù)語“回交”是指源于兩株親本系雜交的作物與其中一株親本系雜交的過程，其中 回交中使用的親本系是指輪回親本。重復(fù)回交的結(jié)果產(chǎn)生越來越多的純合子或自交系的基 因組。術(shù)語“自交”是指自體受精的過程，其中個體是自體授粉或者對其自身的花粉受 Ib ο本文使用的“基因工程”、“轉(zhuǎn)移”和“基因修飾”是同義詞，是將分離的或克隆的基 因轉(zhuǎn)移至DNA，通常為另一個有機體的染色體DNA或基因組。本文使用的術(shù)語“分子標(biāo)記物”是指方法中使用的用于視覺上區(qū)分核酸序列特征 的指示劑。這些指示劑的示例為限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)標(biāo)記物，擴增片段長度多態(tài) 性(AFLP)標(biāo)記物，單核苷酸多態(tài)性(SNPs)，微衛(wèi)星標(biāo)記(例如SSRs)，序列-特征擴增區(qū) (SCAR)標(biāo)記物，酶切擴增多態(tài)性序列(CAPS)標(biāo)記物或同工酶標(biāo)記物或各標(biāo)記物的結(jié)合，此 處所述的標(biāo)記物定義一個特殊基因和染色體位置。本文使用的術(shù)語“作物部位”表示黃瓜作物的一部分，包括單細胞和細胞組織，諸 如作物、細胞團塊和組織培養(yǎng)物中完整的作物細胞，黃瓜作物可以從中再生。作物部位的示 例包括但不限于，來自花粉、胚珠、葉子、胚、根、根尖、花藥、花、果實、莖、嫩枝和種子的單細 胞或組織；以及花粉、胚珠、葉子、胚、根、根尖、花藥、花、果實、莖、嫩枝、幼芽、根莖、種子、原 生質(zhì)體、愈傷組織等等。本發(fā)明所用的作物部位可以是新鮮的和/或在本發(fā)明的某些方面 可以是經(jīng)加工的形式。本文使用的術(shù)語“種群”意思是享有共同遺傳起源的作物的遺傳異質(zhì)集群 (genetically heterogeneous collection)。本文使用的術(shù)語“品種”是指一組相似作物，其結(jié)構(gòu)或遺傳特征和/或表現(xiàn)可與其 他相同物種的品種區(qū)分開。本文使用的術(shù)語“栽培品種”(用于栽培的品種)表示不屬于天然正常發(fā)現(xiàn)的品種，而是經(jīng)過人類栽培，即具有生物學(xué)狀態(tài)而非“野生”狀態(tài)，其中“野生”狀態(tài)是指原始 非-栽培的、或者作物或登錄品種的天然狀態(tài)。術(shù)語“品種”包括但不限于半-天然的、 半_野生的、雜草、傳統(tǒng)的培養(yǎng)品種、地方品種、育種材料、研究材料、育種者的系、合成的種 群、雜種、原始群體(founder stock)/基礎(chǔ)種群、自交系(雜種栽培品種的親本)、分離的種 群、突變體/遺傳群體和高級的/改進的栽培品種。本文中使用的術(shù)語“優(yōu)良背景”用于指明QTL或基因滲入的遺傳背景是育種系。本 發(fā)明的示例中，天然背景是黃瓜登錄號為PI 169383的遺傳背景。一種涉及將含有QTL的 DNA從黃瓜登錄號為PI 169383的連鎖群(染色體)4轉(zhuǎn)移到育種系作物染色體4的相同位 置的方法，可以使QTL不在其天然遺傳背景中，而在優(yōu)良背景中。該術(shù)語既包括了雜合子的 情況也包括了純合子的情況。優(yōu)選的實施方案詳述牛產(chǎn)高產(chǎn)量作物本文確定的基因滲入的效果是高產(chǎn)量的果實重量。這與Shetty等(Crop Science 42:2174-2183(2002))公開的內(nèi)容不同，他們研究的是高數(shù)量果實之間的關(guān)系。Shetty等 沒有公開PI 169383實際的產(chǎn)量數(shù)據(jù)，但僅有其表現(xiàn)的推斷。此外，Shetty等對比了基因 庫登錄品種，包括晚熟的、低產(chǎn)量的、全雌性自交系的PI 169383。例如，自交系之一是WI 2757，每公頃可生產(chǎn)27. 000適銷果實(見Shetty等，表5)，相當(dāng)于每平方米2. 7適銷果實。 與之相比，發(fā)現(xiàn)本研究中的PI 169383每平方米可生產(chǎn)3. 4適銷果實，鑒于本研究使用的自 交系具有較高的產(chǎn)量，每平方米適銷果實為7或更高。作為他們實驗設(shè)置的結(jié)果，Shetty等 認為PI 169383是高產(chǎn)量的登錄品種。然而，當(dāng)與正常高產(chǎn)量的自交系相比，就每平方米單 株果重和單株果數(shù)而言，PI 169383是低產(chǎn)量的登錄品種?？梢酝ㄟ^本發(fā)明實施例中提供 的數(shù)據(jù)進行強調(diào)，將Shetty等的觀察結(jié)果進行恰當(dāng)?shù)耐敢暺饰?，表明與栽培黃瓜相比，PI 169383的果實產(chǎn)量也較低。但即使認為PI 169383在黃瓜數(shù)量基數(shù)上具有高產(chǎn)量百分比， 但還是預(yù)料不到PI 169383中包含的負責(zé)重量高產(chǎn)的基因區(qū)域。畢竟，數(shù)量和重量之間成 反比是作物育種固有的。下面的圖2給出了一個實施例，其描述了供體系PI 169383生產(chǎn) 出很多成捆的小黃瓜，而基因滲入系(IL)生產(chǎn)出少量成捆的大黃瓜。另一個熟知的實施例 包含等產(chǎn)量重量的櫻桃與牛肉西紅柿的對比，盡管在果實大小上有本質(zhì)上的差異。因此，不 能預(yù)期所有高產(chǎn)量重量基因滲入系均來自報道稱具有高產(chǎn)量數(shù)量的PI 169383。在黃瓜育種中，產(chǎn)量數(shù)量和產(chǎn)量重量是單獨考慮的特征。每顆果實的重量是由市 場需求決定的固定值，重量的高產(chǎn)量比數(shù)量的高產(chǎn)量(小黃瓜)更重要。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)在黃瓜登錄號為PI 169383中，與增加產(chǎn)量相關(guān)的基因或調(diào)控序 列存在于連鎖群4中。根據(jù)Horejsi等(2000)，Cucumissativus L的連鎖群4還包含抵 抗霜霉病(downy mildew, dm)抗性基因。LG 4進一步具有如下熟知的標(biāo)記物之一或其結(jié) 合的特征1)CSC443/H3(RFLP marker ；Bradeen, et al. ,2001, Genome 44:111-119) ；2) BC551. 550(RAPD marker ；Park et al.,2000, Genome 43:1003-1010) ；3)PER(isozyme ； Bradeen et al. supra)。還沒有指定增加產(chǎn)量的QTL所在的黃瓜染色體的明確的染色體數(shù)量。然而，可以 通過參考這些和其他基因組區(qū)域所在的連鎖群(LG4)來指定染色體。本文使用的術(shù)語連鎖 群是指物理基因組單元，具備產(chǎn)量提高的等位基因位于其上，與染色體具有相同的分層等級。第一個方法包括將用于增加產(chǎn)量的QTL從黃瓜登錄號為PI169383的作物基因滲 入到相關(guān)黃瓜系的作物中。這將得到QTL存在于相關(guān)黃瓜系的遺傳背景中的結(jié)果。通過使 用QTL特異性標(biāo)記物可以監(jiān)測子代作物中適當(dāng)基因滲入的建立。重組是在減數(shù)分裂期間交換兩個同源染色體之間的信息。在重組作物中，最開始 存在于染色體特殊位置的DNA與來自另一作物的DNA互換(即母本成為父本或反之亦然)。 為了只互換所需的材料，并在染色體上盡可能最多地保留有價值的原始信息，通常將需要 兩次交換事件。找到這種重組體的正常途徑是篩選F2代作物的種群。該種群必需有足夠 的規(guī)模以便檢測稀少的(低頻率的)二倍重組體。重組體的頻率可以按如下方式計算。例 如，IOcM面積中的重組體為10%的頻率(測交法中1厘摩被定義為重組體后代)。本發(fā)明現(xiàn)在提供標(biāo)記輔助選擇(MAS)的較好的方式。因此本發(fā)明涉及作物育種的 方法和選擇作物的方法，尤其是黃瓜作物，特別是將栽培的黃瓜作物作為育種作物用于育 種程序或者栽培的黃瓜作物用于要求具有基因型的或潛在的表型性質(zhì)，尤其是涉及生產(chǎn)有 價值的黃瓜果實，還涉及農(nóng)藝上令人滿意的作物。此處，栽培的作物被定義為目的性選擇的 作物或來自在農(nóng)藝上或園藝實踐中具有目的性選擇的作物，以具有預(yù)期的基因型或潛在的 表型性質(zhì)，尤其是通過近親繁殖得到的作物。因為產(chǎn)量-提高的QTL是附加的性狀(雜種表達為兩親本之間的表型)，可以通過 測量作物的產(chǎn)量在Fl或BCl中進行監(jiān)測。然而，由于這將需要在受控的條件下栽培很多星 期，所以在子代作物中建立適當(dāng)?shù)幕驖B入具有獨特的優(yōu)勢，可采用本文提供的QTL-特異 性標(biāo)記物對其進行監(jiān)控，如下面的示例所述，順式或反式偶合均可。因此，本領(lǐng)域的技術(shù)人 員可采用MAS或MAB法篩選作物。因此，本發(fā)明還提供篩選表現(xiàn)出增加的產(chǎn)量的物種Cucumissativus作物的方法， 包括檢測所述作物中在連鎖群(染色體)4上是否存在本文定義的產(chǎn)量-提高的QTL。本發(fā) 明檢測所述作物的優(yōu)選方法包括a)從黃瓜作物中提供基因組DNA樣本；b)在所述基因組DNA樣本中檢測至少一種與產(chǎn)量_提高的QTL連接的分子標(biāo)記 物。從黃瓜作物中提供基因組DNA樣本的步驟可以采用本領(lǐng)域已知的標(biāo)準DNA分離方 法操作。在一個優(yōu)選的實施方案中，檢測分子標(biāo)記物(步驟b)的步驟可以包括使用AFLP 法中所用的一對雙向引物，以產(chǎn)生擴增產(chǎn)物表示QTL標(biāo)記物。此處所述的一對引物是指定 義AFLP標(biāo)記物的引物或標(biāo)記物-特異性引物。雙向的意思是在核酸擴增反應(yīng)中引物的方 向為一個函數(shù)是正向的、一個函數(shù)是反向的引物?？蛇x地，在另一個優(yōu)選的實施方案中，檢測分子標(biāo)記物(步驟b)的步驟可以包括 使用具有堿基序列的核酸探針，其實質(zhì)上是補充定義所述分子標(biāo)記物的核酸序列，該核酸 探針能在嚴格的條件下與定義所述分子標(biāo)記物的核酸序列特異地雜交。一個合適的核酸探 針可以例如是與標(biāo)記物相應(yīng)的擴增產(chǎn)物單鏈。檢測分子標(biāo)記物(步驟b)的步驟還可以包括在所述基因組DNA上進行核酸擴增 反應(yīng)以檢測所述QTL。這也適于通過采用一對標(biāo)記物_特異性引物執(zhí)行PCR反應(yīng)來完成。在一個優(yōu)選實施方案中，所述步驟b)包括使用至少一組定義AFLP標(biāo)記物的引物用于所述 QTL,或者在嚴格的條件下特異性地與AFLP標(biāo)記物的核酸序列雜交的一組引物用于QTL。步驟d)檢測具有預(yù)期長度或預(yù)期核酸序列的擴增的DNA片段的步驟優(yōu)選地這樣 制作擴增的DNA片段具有與預(yù)期長度相應(yīng)的(加或減幾個堿基，例如一個、兩個或三個堿 基左右的長度)長度，因為基于與相同引物進行的相似反應(yīng)，該引物具有來自作物的DNA， 所述標(biāo)記物首先從該作物中被檢出，或者擴增的DNA片段具有與預(yù)期序列相應(yīng)的(具有大 于80 %的同源性，優(yōu)選地大于90 %，更優(yōu)選地大于95 %，甚至更優(yōu)選地大于97 %，更優(yōu)選地 大于99% )核酸序列，因為基于與作物中QTL相關(guān)的標(biāo)記物的序列，所述標(biāo)記物首先從該作 物中被檢出。本領(lǐng)域的技術(shù)人員知曉在具有本文定義的基因滲入的作物(供體作物)中不 存在、而在接受基因滲入的作物(受體作物)中存在的標(biāo)記物(所謂的反式_標(biāo)記物)，也 可以用于分析檢測子代作物中的基因滲入，盡管通過測試不存在的標(biāo)記物來檢測特異性基 因滲入的存在不是最佳方案?？刹捎脴?biāo)準凝膠電泳技術(shù)或自動DNA測序儀來檢測具有預(yù)期長度或預(yù)期核酸序 列的擴增的DNA片段。該技術(shù)已為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知，因此本文無需對其進行描述。應(yīng) 當(dāng)指出的是，基于其引物序列與擴增產(chǎn)物的長度結(jié)合和連鎖圖譜上相對于其他標(biāo)記物的該 標(biāo)記物的位置來定義該標(biāo)記物。分子標(biāo)記物和QTLs分子標(biāo)記物用于可視化核酸序列的差異。該可視化可通過被限制性內(nèi)切酶(RFLP) 消化后的DNA-DNA雜交技術(shù)和/或通過采用聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)(例如STS、微衛(wèi)星、AFLP) 來實現(xiàn)。兩親本基因型之間的所有差異都可基于這些親本基因型的雜交而在圖譜種群(例 如BC1U中分離開?？梢詫Ρ炔煌瑯?biāo)記物的分離，并計算重組頻率。分子標(biāo)記物在不同染 色體上的重組頻率一般為50%。位于相同染色體的各分子標(biāo)記物之間，重組頻率取決于標(biāo)記物之間的距離。低重 組頻率對應(yīng)于染色體上標(biāo)記物之間較短的遺傳距離。比較所有重組頻率將得到染色體上分 子標(biāo)記物最合乎邏輯的順序。最合乎邏輯的順序描述于連鎖圖譜中。連鎖圖譜上與增加的 產(chǎn)量有關(guān)的相鄰的或連續(xù)的組，能精確定位與增加的產(chǎn)量相關(guān)的QTL。本文確定的標(biāo)記物可用于本發(fā)明的多個方面，現(xiàn)對其予以闡明。本發(fā)明的各方面 不限于使用本文確定的標(biāo)記物。應(yīng)當(dāng)強調(diào)，各方面也可利用本文沒有明確公開的標(biāo)記物，或 者甚至還沒有被確定的。除了遺傳單元“基因”外，表型的表達還取決于大量無法預(yù)測的因 素，遺傳單元“QTL”表示基因組區(qū)域，與表型的可以計量的性狀直接相關(guān)。因此，雖然基因 本身承擔(dān)很少或根本沒有涉及作物育種，但QTL可直接適用于作物育種。本文確定的QTL位于連鎖群4，其位置的最佳特征在于大量的其他任意標(biāo)記物。本 研究中使用擴增片段長度多態(tài)性(AFLP)標(biāo)記物、單核苷酸多態(tài)性(SNPs)和插入突變標(biāo)記 物，盡管也可以使用限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)標(biāo)記物、微衛(wèi)星標(biāo)記物(例如SSRs)，序 列-特征擴增區(qū)(SCARs)標(biāo)記物、酶切擴增多態(tài)性序列(CAPS)標(biāo)記物或同工酶標(biāo)記物或各 標(biāo)記物的結(jié)合。一般來說，一個QTL可能跨越了幾百萬個堿基區(qū)域。因此，提供QTL的完整 序列信息實際上并不可行，而且也沒有必要，因為QTL首次被檢出的方式-通過一串連續(xù)的 基因組標(biāo)記物的存在和特定表型性狀的存在之間的相關(guān)性觀察_允許在子代作物種群之 間跟蹤，那些作物具有能表現(xiàn)出特定表型性狀的遺傳潛力。通過提供一個非限制性的標(biāo)記物列表，本發(fā)明從而提供了 QTLs在育種方案中的有效用途。標(biāo)記物特異于特定的育種系。因此，特異的性狀與特定的標(biāo)記物有關(guān)。本發(fā)明所 指出的標(biāo)記物不僅指QTL的位置，它們還與作物中特異性表型性狀的存在相關(guān)。重要的是 注意表明QTL在基因組位置的連續(xù)的基因組標(biāo)記物原則上是任意的或非限定的。一般來 講，QTL的位置由連續(xù)的一串能顯示與表型性狀的統(tǒng)計相關(guān)性的標(biāo)記物來表示。一旦發(fā)現(xiàn) 標(biāo)記物在那一串之外(即LOD值低于某一閾值的標(biāo)記物，表明該標(biāo)記物是如此遙遠，以至于 該標(biāo)記物與QTL在區(qū)域內(nèi)頻繁發(fā)生重組，使得該標(biāo)記物的存在與表型的存在統(tǒng)計學(xué)上顯著 不相關(guān))，則設(shè)置QTL的邊界。因此，也可以通過在該特定區(qū)域內(nèi)的其他標(biāo)記物來指示QTL 的位置。更加重要的是注意連續(xù)的基因組標(biāo)記物也可以用于指示個體作物中存在的 QTL(及表型)，即它們可用于標(biāo)記輔助選擇(MAS)程序。原則上，潛在有用標(biāo)記物的數(shù)量 是有限的，但是可以很多，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以很容易鑒別本發(fā)明中提到的那些其他標(biāo) 記物。與QTL連接的任何標(biāo)記物，例如落入設(shè)立的LOD值高于某一閾值的標(biāo)記物跨越的基 因組區(qū)域的物理邊界內(nèi)，因此表明標(biāo)記物和QTL之間在雜交中沒有或很少發(fā)生重組；以及 對QTL連鎖不平衡的任何標(biāo)記物；以及代表QTL中的實際因果突變的標(biāo)記物，均可用于在 MAS程序。這意味著本發(fā)明確定的標(biāo)記物與QTLs相關(guān)，如AFLP標(biāo)記物E12/M24-F-063-P2 ； E11/M62-F-200-P1 ；E12/M24-F-177-P2 ；E12/M24-F-176-P1 ；E25/M13-F-128-P2 ；E21/ M16-F-080-P2，用于產(chǎn)量-提高的QTL，都是適用于MAS程序的僅為示例性的標(biāo)記物。也可 以使用標(biāo)記物E22M12-F-278-P1和E22/M12-F-092-P2，因為如圖1所示它們顯示出與性狀 連鎖。這些標(biāo)記物可以適當(dāng)?shù)貫椤绊樖綐?biāo)記物”，表明它們的存在與QTL的存在同時發(fā)生。 此外，當(dāng)QTL或賦予特定性狀的部分，被基因滲入到另一個遺傳背景(即滲入到另一個作物 系的基因組)，然后一些標(biāo)記物可能不再出現(xiàn)在子代中，雖然性狀還存在其中，這表明這些 標(biāo)記物在基因組區(qū)域以外，表明QTL的特定性狀-賦予部分僅在原始親本系，新遺傳背景有 不同的基因組組織。這些標(biāo)記物的缺失表明子代中成功引入了遺傳元素，稱為“反式標(biāo)記 物”，在本發(fā)明中同樣適用于MAS程序。與標(biāo)記物相關(guān)的本發(fā)明產(chǎn)量QTL的單體型為E12/M24-F063-P2順式(存在 標(biāo)記物)；E11/M62-F-200-P1反式(缺少標(biāo)記物)；E12/M24-F-177-P2順式(存在標(biāo)記 物)；E12/M24-F-176-P1反式(缺少標(biāo)記物)；E25/M13-F-128-P2順式(存在標(biāo)記物)； E22M12-F-278-P1反式(缺少標(biāo)記物)；E22/M12-F-092-P2順式(存在標(biāo)記物)；E21/ M16-F-080-P2順式(存在標(biāo)記物)。Pl或P2表示標(biāo)記物的親本標(biāo)簽(遺傳背景)，其中Pl 是輪回親本，P2是供體親本。當(dāng)鑒別QTL時，QTL的效應(yīng)(提高產(chǎn)量)，例如可以通過評估分離用于QTLs研究的 BC2S1后代的產(chǎn)量來確定。優(yōu)選地，用至少一種本文定義的QTL標(biāo)記物檢測本發(fā)明QTL的存 在。因此，本發(fā)明還涉及一種用于檢測QTL存在的方法，通過使用所述標(biāo)記物來提高黃瓜產(chǎn)量。本發(fā)明的QTL的核苷酸序列可通過確定與所述QTL相關(guān)的一或多個標(biāo)記物的核苷 酸序列和為所述標(biāo)記物序列設(shè)計內(nèi)部引物來解決，然后所述標(biāo)記物序列可以用于進一步確 定在所述標(biāo)記物序列之外的QTL序列。例如可通過從電泳凝膠上(用于確定所述標(biāo)記物在 目標(biāo)作物的基因組中的存在)分離所述標(biāo)記物，和通過例如本領(lǐng)域熟知的雙脫氧測序法確定所述標(biāo)記物的核苷酸序列，獲得AFLP標(biāo)記物的核苷酸序列。在測定QTL在黃瓜作物中存在的方法的實施方案中，該方法還可以包括提供寡核 苷酸或多核苷酸的步驟，所述寡核苷酸或多核苷酸能在嚴格的雜交條件下與連接所述QTL 的標(biāo)記物的核酸序列雜交，用黃瓜作物的消化的基因組核酸與所述寡核苷酸或多核苷酸接 觸，確定所述寡核苷酸或多核苷酸與所述消化的基因組核酸之間的特異性雜交。優(yōu)選地，對從所述黃瓜作物獲得的所述核酸樣本實施所述方法，盡管也可以使用 原位雜交法。任選地，在更優(yōu)選的實施方案中，一旦確定了 QTL的核苷酸序列，本領(lǐng)域的技 術(shù)人員就可以設(shè)計特異的雜交探針或寡核苷酸，所述探針或寡核苷酸能夠在嚴格雜交條件 下與所述QTL的核酸序列雜交，技術(shù)人員可以在方法中用這種雜交探針檢測黃瓜作物中本 發(fā)明的QTL的存在。原則上，本文使用的個體AFLP標(biāo)記物有指定的標(biāo)記物代碼。該代碼定義兩個引 物，可選地與數(shù)字結(jié)合，在明確的登錄品種中表明引物的擴增產(chǎn)物的長度(見上文表1的描 述)。因此AFLP標(biāo)記物定義一個或兩個-雙鏈DNA片段，該片段通過對黃瓜基因組DNA進行 擴增反應(yīng)獲得，在指明登錄品種的情況下得到指明長度的片段。此外，該標(biāo)記物在5' -3' 方向上包括一個由第一引物序列、黃瓜-特異性DNA序列和第二引物序列及其補體組成的 序列。因此，黃瓜-特異性DNA序列兩側(cè)與兩個引物連接。術(shù)語“黃瓜-特異性DNA序列” 表示核苷酸序列區(qū)域兩側(cè)由各自的引物連接，并代表從黃瓜登錄號為PI 169383擴增的序 列，或具有序列同源性為至少90%、優(yōu)選地至少95%、更優(yōu)選地至少98%的序列。轉(zhuǎn)基因法牛產(chǎn)增加了產(chǎn)量的黃瓜作物在本發(fā)明的另一個方面，含有QTL的核酸(優(yōu)選DNA)序列可以用于生產(chǎn)增加了 產(chǎn)量的黃瓜作物。在這方面，本發(fā)明提供了本文定義的QTLs的應(yīng)用或其產(chǎn)量提高部分，提 供了生產(chǎn)提高產(chǎn)量的黃瓜作物，該應(yīng)用涉及將包括QTL的核酸序列引入到適當(dāng)?shù)氖荏w作物 中。如前所述，所述核酸序列可以從適當(dāng)?shù)墓w作物中得到。本發(fā)明產(chǎn)量-提高的QTL的 適當(dāng)來源是黃瓜地方品種PI 169383，來源于土耳其。這種作物例如可通過T. C. Wehner獲 得，葫蘆遺傳基因合作組織(CGC)的黃瓜基因館長，園藝科學(xué)部，北卡羅來納州大學(xué)，羅利， NC，27695-7609U. S. Α.或者通過馬里蘭州貝茨維爾USDA的國家種質(zhì)資源實驗室主辦的種 質(zhì)資源信息網(wǎng)(GRIN)獲得。 含有用于提高產(chǎn)量的QTL的、或者含有其產(chǎn)量_提高部位的核酸序列，可以通過任 何可行的方法轉(zhuǎn)移到適當(dāng)?shù)氖荏w作物中。例如，所述核酸序列可以通過將系PI 169383的 作物與選擇性育種系雜交而轉(zhuǎn)移使產(chǎn)量得到提高、(即通過基因滲入)、通過轉(zhuǎn)化、通過原 生質(zhì)體融合、通過雙單倍體技術(shù)或通過胚胎拯救或通過任何其他核酸轉(zhuǎn)移系統(tǒng)，可選地隨 后進行含有QTL和表現(xiàn)為產(chǎn)量增加的子代作物篩選。對于轉(zhuǎn)移核酸序列的轉(zhuǎn)基因方法，含 有用于增加產(chǎn)量的QTL的核酸序列通過采用本領(lǐng)域已知的方法可從所述供體作物中分離， 因此，分離的核酸序列可以通過轉(zhuǎn)基因的方法轉(zhuǎn)移到受體中，例如借助載體、在配子中、或 在任何其他適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)移元素中，諸如用所述核酸序列包裹的彈道微粒。作物轉(zhuǎn)移一般包括構(gòu)建在作物細胞中起作用的表達載體。本發(fā)明中，這種載體包 括含有用于增加產(chǎn)量的QTL的核酸序列，該載體可以包含用于產(chǎn)量提高的基因，該基因在 調(diào)控因子諸如啟動子的控制下或可操作地連接到調(diào)控因子上。表達載體可含有一或多個 這樣的可操作連接基因/調(diào)控因子組合，提供至少一種組合中含有的基因編碼用于提高產(chǎn)量。載體可以是質(zhì)粒的形式，可單獨或與其他質(zhì)粒聯(lián)合應(yīng)用，采用本領(lǐng)域已知的轉(zhuǎn)移法，諸 如農(nóng)桿菌屬(Agrobacterium)轉(zhuǎn)移系統(tǒng)，以提供表現(xiàn)為提高產(chǎn)量的轉(zhuǎn)基因作物。表達載體包括至少一個標(biāo)記物基因，開放式連接到調(diào)控因子(如啟動子)，允許轉(zhuǎn) 移含有標(biāo)記物的細胞通過陰性選擇(通過抑制不含有可選標(biāo)記物基因的細胞生長)或通過 陽性選擇(通過篩選標(biāo)記物基因編碼的產(chǎn)品)恢復(fù)。本領(lǐng)域已知許多常用的用于作物轉(zhuǎn)移 的選擇性標(biāo)記物基因，包括例如，編碼酶的基因，代謝性地對選擇性化學(xué)試劑(可能是一種 抗生素或除草劑)解毒，或者編碼對抑制劑不敏感的改變靶標(biāo)的基因。本領(lǐng)域已知幾種正 向篩選方法，諸如甘露糖篩選。另外，可使用無標(biāo)記物轉(zhuǎn)移來獲得不含所述標(biāo)記物基因的作 物，該技術(shù)是本領(lǐng)域已知的。一種將表達載體引入作物的方法基于農(nóng)桿菌屬(Agrobacterium)的天然轉(zhuǎn)移系 統(tǒng)(見Horsch等，1985)。農(nóng)桿菌(A. tumefaciens)和發(fā)根農(nóng)桿菌(A. rhizogenes)是作物 致病土壤菌，遺傳轉(zhuǎn)化作物細胞。分屬于農(nóng)桿菌和發(fā)根農(nóng)桿菌的Ti和Ri載有負責(zé)作物遺傳 轉(zhuǎn)移的基因。將表達載體引入作物組織的方法包括直接感染或與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)作物細胞。 美國專利No. 5，591，616提供了農(nóng)桿菌屬載體系統(tǒng)的說明和農(nóng)桿菌屬_介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移方 法。作物表達載體、受體基因、轉(zhuǎn)移方法的一般描述和農(nóng)桿菌屬載體系統(tǒng)的一般描述及農(nóng)桿 菌屬-介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移方法可見于Gruber和Crosby, 1993。Miki等，1993和Phillips等， 1988提供了培養(yǎng)作物組織的一般方法。分子克隆技術(shù)和適當(dāng)表達載體的合適的參考手冊為 Sambrook 禾口 Russell,2001。將表達載體引入作物的另一種方法基于微粒-介導(dǎo)的轉(zhuǎn)移，其中DNA載于微粒的 表面。用基因槍設(shè)備將表達載體弓I入作物組織，使微粒加速到300-600m/s，足以穿透作物細 胞壁和細胞膜。另一種將DNA引入作物的方法是通過超聲處理靶細胞。另外，利用脂質(zhì)體 或原生質(zhì)球融合將表達載體引入作物。也有報道利用CaCl2沉降、聚乙烯乙醇或聚-L-鳥 氨酸直接將DNA帶入原生質(zhì)體。還描述了原生質(zhì)體、完整細胞和組織的電穿孔。其他熟知的技術(shù)如使用BACs，其中部分黃瓜基因組被引入細菌人工染色體 (BACs)，即在大腸桿菌細胞中用于克隆DNA片段(100-300kb插入大??；平均150kb)的載 體，基于大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)的天然存在的F-因子質(zhì)粒，可以利用其與BIBAC系統(tǒng)結(jié)合來產(chǎn)生 轉(zhuǎn)基因作物。黃瓜靶組織轉(zhuǎn)移后，采用本領(lǐng)域熟知的再生和篩選方法，上面描述的選擇標(biāo)記物 基因的表達允許優(yōu)先選擇轉(zhuǎn)移的細胞、組織和/或作物。
具有通過非轉(zhuǎn)基因方法而提高產(chǎn)量的黃瓜作物的生產(chǎn)在另外的實施例中，為生產(chǎn)具有提高產(chǎn)量的黃瓜作物，能夠?qū)⒃|(zhì)融合用于核 酸從供體作物向受體作物的轉(zhuǎn)移。原生質(zhì)融合是誘導(dǎo)的或自發(fā)的聯(lián)合，諸如體細胞雜交，在 兩個或多個原生質(zhì)間(該細胞的細胞壁通過酶處理去除)以產(chǎn)生單個雙-或多-核細胞。 該融合細胞甚至可以用不能在自然界中異種交配的植物種來獲得，將該融合細胞進行組織 培養(yǎng)至表現(xiàn)所需特性組合的雜種作物。更具體地，能夠從PI169383的黃瓜作物獲得第一原 生質(zhì)體。能夠從第二或其他作物品種獲得第二原生質(zhì)體，優(yōu)選地黃瓜系包括市售有價值的 特性，諸如，但不限于抗病性、防蛀性、有價值作物特性等等。隨后使用傳統(tǒng)的原生質(zhì)融合程 序?qū)⒃撛|(zhì)融合，這在本領(lǐng)域中是公知的。另外，胚胎拯救可以被應(yīng)用到包括本文所描述的QTL的核酸的從供體作物向受體作物的轉(zhuǎn)移中。胚胎拯救能夠用于將胚胎從作物不產(chǎn)生可育種子的雜交中分離的過程。在 該過程中，將作物的受精子房或未成熟種子進行組織培養(yǎng)以制造出新作物。本發(fā)明也涉及用于提高黃瓜育種系的作物的產(chǎn)量的方法，所述方法包括以下步 驟a)將黃瓜育種系的作物與黃瓜系PI 169383的作物雜交；b)選擇來自所述雜交的來自黃瓜登錄號為PI 169383的具有在與提高產(chǎn)量相關(guān) 的連鎖群4上的基因滲入的后代黃瓜作物；c)將選自步驟(b)的使用所述黃瓜育種系作為輪回親本的所述后代黃瓜作物自 交和/或回交；d)選擇由在步驟(c)中得到的來自黃瓜登錄品種PI 169383的具有在與提高產(chǎn)量 相關(guān)的連鎖群4上的基因滲入的后代黃瓜作物；e)重復(fù)所述的自交和/或回交步驟以及選擇步驟(C)和(d)以提供對于所述基因 滲入基本上純合的黃瓜育種系的作物；其中在步驟(b)或(d)中所進行的至少一種選擇由標(biāo)記輔助的選擇來完成。在這種方法的一個優(yōu)選的實施方式中，所述黃瓜育種系是優(yōu)良系。在上述方法的另一個優(yōu)選的實施方式中，所述標(biāo)記輔助的選擇過程包括用于如 下 AFLP 標(biāo)記的選擇E12/M24-F-063-P2、E11/M62-F-200-P1、E12/M24-F-177-P2、E12/ M24-F-176-PUE25/M13-F-128-P2 和 / 或 E21/M16-F-080-P2。在一個優(yōu)選的實施方式中，通過將所述作物雜交，本方法包括通過將來自PI 169383作為供體黃瓜作物的所述核酸序列基因滲入轉(zhuǎn)移至受體黃瓜作物。因此，可以通過 使用傳統(tǒng)的育種技術(shù)來適當(dāng)?shù)赝瓿珊斜景l(fā)明的QTL的核酸序列的基因滲入。通過使用標(biāo) 記輔助選擇(MAS)或標(biāo)記輔助育種(MAB)來優(yōu)選地將QTL進行基因滲入至市售黃瓜品種 中。MAS和MAB包括使用一種多種分子標(biāo)記用于那些含有一種或多種編碼所需特性的基因 的后代作物的識別和選擇。在本發(fā)明中，這種識別和選擇是基于本發(fā)明的QTL或與此關(guān)聯(lián) 的標(biāo)記的選擇。也能夠使用MAS來開發(fā)具有相關(guān)的QTL的近同源系(NIL)，允許各個QTL效 應(yīng)的更具體的研究并且對于回交自交系(BIL)種群的開發(fā)也是有效的方法。本實施例研發(fā) 的黃瓜作物能夠有利地從受體作物獲得其大多數(shù)特性，以及從供體作物獲得提高的產(chǎn)量。如上文簡要所述，能夠?qū)鹘y(tǒng)的育種技術(shù)用于將編碼提高產(chǎn)量的核酸序列的基因 滲入至需要提高產(chǎn)量的受體黃瓜作物。在一種涉及譜系育種的方法中，如本文所定義的表 現(xiàn)提高產(chǎn)量并包括編碼與提高產(chǎn)量相關(guān)的QTL的核酸序列的供體黃瓜作物與受體黃瓜作 物(優(yōu)選地為優(yōu)良系的作物)雜交，該受體黃瓜作物表現(xiàn)出在農(nóng)學(xué)上所需的特性，諸如但不 限于抗病性、防蛀性、有價值的果實特性等等。所得到的作物種群(代表Fl雜種)隨后自 授粉并結(jié)籽(F2種子)。隨后將生長自F2種子的F2作物針對提高產(chǎn)量而篩選。以多種不 同的方法來篩選該種群。第一，能夠使用傳統(tǒng)的產(chǎn)量分析來篩選該種群。這樣的分析在本領(lǐng)域中是公知的。 第二，能夠使用一種或多種上文所描述的分子標(biāo)記來進行標(biāo)記輔助的選擇以識別那些包含 編碼本文所述提高產(chǎn)量核酸序列的后代?？梢允褂蒙衔乃岬降挠糜跈z測QTL存在的其他 方法。也能夠使用標(biāo)記輔助的選擇來確認產(chǎn)量分析所得的結(jié)果，因此，也可以使用不同方法 的組合。
能夠使用輪回選擇和回交、自交和/或雙單倍體的技術(shù)或其他用于制備親本系的 技術(shù)來開發(fā)具有提高產(chǎn)量的自交黃瓜作物系。在輪回選擇和回交的方法中，本文所描述的 有關(guān)提高產(chǎn)量的遺傳因子能夠通過將輪回親本與第一供體作物雜交而被基因滲入至目標(biāo) 受體作物(所述輪回親本)，該供體作物不同于所述輪回親本并且在本文中被稱為“非輪回 親本”。輪回親本的作物的產(chǎn)量提高并具有農(nóng)學(xué)上所需的特性，諸如但不限于，抗病性、防蛀 性、有價值的作物特性等等。非輪回親本是系PI 169383的作物，并且包括編碼提高產(chǎn)量的 核酸序列。另外，非輪回親本能夠是任何作物品種或與所述輪回親本雜交生育的自交系，非 輪回親本已經(jīng)獲得用于在與作物系PI 169383的早期雜交中提高產(chǎn)量的QTL。來源于輪回 親本和非輪回親本的雜交后代被回交至輪回親本。所得到的作物種群隨后用于篩選所需特 性，該篩選可以以多種方法進行。例如，能夠使用在本領(lǐng)域中公知的表型篩選來篩選所述種 群。另外，不使用表型篩選的話，能夠使用一種或多種上文所描述的分子標(biāo)記、雜交探針或 多核苷酸來進行標(biāo)記輔助的選擇(MAS)以識別那些包括編碼提高產(chǎn)量的核酸序列的后代。在篩選后，表現(xiàn)出改善產(chǎn)量表型(或更優(yōu)選地為基因型)的Fl雜種作物因此包括 必要的編碼提高產(chǎn)量的核酸序列，隨后被針對多個世代而選擇并回交至輪回親本以便允許 黃瓜作物成為增多的自交。將該過程進行兩代至五代或更多代。一般來講，來源于輪回親 本與非輪回親本的雜交過程的后代對于一種或多種編碼提高產(chǎn)量的基因是雜合的。一般來講，將所需特征引入雜種黃瓜品種的方法包括以下步驟(a)將自交黃瓜親本與另一包括一種或多種所需特性的黃瓜作物雜交以產(chǎn)生Fl 后代作物，其中所需特性是通過來自PI 169383的QTL的產(chǎn)量提高而達到的提高的產(chǎn)量；(b)選擇具有所述特性的所述Fl后代作物來生產(chǎn)所選的Fl后代作物，優(yōu)選地使用 本文所定義的分子標(biāo)記；(c)將所選的后代作物與所述后代黃瓜親本作物回交以生產(chǎn)回交后代作物；(d)選擇具有所述后代黃瓜親本作物的所需特性和形態(tài)學(xué)和生理學(xué)特性的回交后 代作物，其中所述選自包括基因組DNA的分離和檢測所述DNA，對于至少一種針對上述的 QTL的分子標(biāo)記的存在；(e)連續(xù)兩次或多次重復(fù)步驟(c)和(d)以生產(chǎn)所選的第三或更高的回交后代作 物；(f)任選地自交所選的回交后代以便識別純合作物；(g)將至少一種所述回交后代或自交作物與另一自交黃瓜親本作物雜交以產(chǎn)生雜 種黃瓜品種，當(dāng)在同樣的環(huán)境中生長時，其具有所述特性以及雜種黃瓜品種的全部形態(tài)學(xué) 和生理學(xué)特性。如上文所述，可以將最后回交世代自交以提供具有提高產(chǎn)量的純合的純的育種 (自交)后代。因此，輪回選擇、回交和自交的結(jié)果是產(chǎn)生系，該系是對于與提高產(chǎn)量相關(guān)的 基因以及其他與市售特性相關(guān)的基因是遺傳同源的。應(yīng)當(dāng)指出的是，雜合作物也表現(xiàn)出提高的產(chǎn)量，這種作物也因此是本發(fā)明的一方黃瓜作物和種子作物育種的目的是將各種令人滿意的性狀結(jié)合到單一的品種或雜種中。對于商業(yè) 農(nóng)作物，這些性狀可以包括抗病和蟲害、耐熱和干旱、縮短作物成熟時間、增加產(chǎn)量和更優(yōu)的農(nóng)藝學(xué)品質(zhì)。作物特征的一致性，如發(fā)芽和起身期、生長速度、成熟和作物高度都很重要。通過利用作物授粉方法的技術(shù)對商業(yè)農(nóng)作物進行育種。如果來自一朵花的花粉轉(zhuǎn) 移到同一作物的相同或另一花朵上，則該作物是自花授粉。當(dāng)用同一科或系的個體進行授 粉時，該作物是同胞授粉。如果花粉來自不同科或系的不同作物的花，則該作物是異花授 粉。自花授粉和被選為許多代的類型的作物在幾乎所有基因位點都變成純合型，產(chǎn)生 真正一致的育種后代種群。兩種不同的純合系雜交產(chǎn)生一致種群的雜種作物，該雜種作物 在許多基因位點都可能是雜合型的。多個基因位點都是雜合型的兩株作物雜交，會產(chǎn)生遺 傳方面不同的異質(zhì)作物種群，也會不一致。雜種黃瓜品種在黃瓜作物育種程序中的發(fā)育包括三個步驟(1)從不同的種質(zhì)池 中選擇作物用于初始育種雜交；(2)從育種雜交中選定作物自交幾代，以產(chǎn)生一系列自交 系，其中，個體的育種真實且具有高度的一致性；和(3)將選定的自交系與不相關(guān)的自交系 雜交，產(chǎn)生雜交后代(Fl)。經(jīng)過連續(xù)足量的近親繁殖，最終的后代將只會有助于增加已發(fā)育 的自交系種子。優(yōu)選地，自交系在其約95%或以上的位點應(yīng)包括純合性等位基因。自交系純合性和同質(zhì)性的重要結(jié)論是通過一對明確的自交系雜交而創(chuàng)建的雜種 始終是相同的。一旦創(chuàng)建更優(yōu)良雜種的自交系被確定，利用這些自交親本可產(chǎn)生連續(xù)供應(yīng) 的雜種種子，然后從供應(yīng)的雜種種子可傳代雜種黃瓜作物。采用上面描述的方法，技術(shù)人員將能生產(chǎn)出所需的自交系，通過雜交所述自交系 生產(chǎn)商業(yè)(Fl)雜種。
實施例產(chǎn)量提高的基因滲入IL種群的開發(fā)將外來的供體PI69383與市售親本系雜交，該親本系為市售黃瓜雜種品種的母本 系。使用AFLP標(biāo)記開發(fā)基因滲入以選擇基因組覆蓋和在BC1、BC2間的重疊片段以及后續(xù) 的自交世代(取決于所述IL、進行1或2自交)。使用所述BCl世代以獲得對于黃瓜的基 因圖譜。沒有發(fā)現(xiàn)帶有其他圖譜的普通標(biāo)記，因此未比對染色體數(shù)。本文所涉及的連鎖群 指隨機連鎖群數(shù)目。對于基因組覆蓋的選擇導(dǎo)致了 30個基因滲入系(IL)的選擇。將IL與輪回親本(F1 IL)雜交導(dǎo)致對于供體片段雜合的系，但對于其余基因組是 純合的。也將IL與所述品種(父本系)的其他市售親本雜交，導(dǎo)致對于所述供體片段以及 對于其他基因組是雜合的雜種(HY IL)。在本實驗設(shè)置中，所謂的雜種IL(即親本系1具有用原始種群Accolade的親本系 2雜交的基因滲入)操作良好(參見表1)。種群的表型在溫室中種植30IL，該溫室?guī)в袃蓚€復(fù)制塊，每塊5. 75m2，含有8個板，導(dǎo)致每平 方米1. 39株作物的種植密度。在ILs中檢測QTL，并且僅在早春實驗而不在夏季中檢測。為了以kg/m2確定產(chǎn)量，對于長黃瓜的果實重量和收獲早熟，在至少2個月的期間 里每周采收2或3次ILs的果實，其中作物在采收階段生產(chǎn)果實(果實中央直徑至少為4cm， 即使果實直徑未到4cm，也采收停止生長3天的果實)，并且以采收的總重量和果實的數(shù)目確定各個采收的產(chǎn)量。所提供的結(jié)構(gòu)參見表1，其中的值表示每塊的平均值。按照生產(chǎn)(P) 的產(chǎn)量以產(chǎn)量/m2來表示并按照如下計算 果實重量=總重量(kg)/果實總數(shù)通過距果實Icm距離處切割果柄來采收果實。在采收后2小時內(nèi)用天平稱重來計 算產(chǎn)量。早熟采收是在播種后數(shù)日的第一個采收日。表1基因滲入系的產(chǎn)量。首行表示對照值，比對照值高的值用(+)表示，比對照 值低的值用(_)表示。對照BC =系Pyr42 ；對照* = Accolade市售雜種的專有親本；對照 ** = PI69383 ；親本系=市售雜種Accolade。IL編號產(chǎn)量kg產(chǎn)量數(shù)目IL:數(shù)巨產(chǎn)量kg產(chǎn)量數(shù)
果實/塊果實/塊果實/塊果實,
對照BC(Pl)41 3155 8親本系50. 8177, 5
對照*(P2)42 3151 5HYIL1.-145. 9155, 0
對照**供體19. 5(-)107. 8(-)HYIL,2!-145. 3171 5
LIL1-141.7141.0HYIL2--255. 5187.5
SIL1-139.1141.5HYIL3--155. 4206.(K+)
Fl [L 1-143.7146.5HYIL4--160. 5 (+)207.5⑴
LIL2-138.9150.0HYIL4--252. 3184.5
LIL2-227.0㈠104.5㈠HYIL5--145. 9163.0
SIL2-139.0154.0HYIL6--147. 7170.0
SIL2-234.4㈠130.5㈠HYIL6--347. 9166.5
Fl [L 2-138.9155.5HYIL7--151. 1174.5
Fl [L 2-238.2141.5HYIL8--145. 9156.0
LIL3-143.9182.0(+)
SIL3-137.2135.5
SIL3-248.2⑴187.0(+)
SIL3-339.7160.5
SIL3-446.6190.0(+)
SIL3-548.6⑴217.5⑴
SIL3-643.4172.0
Fl [L 3-141.2162.0
LIL4-154.4⑴229.0(+)
LIL4-251.6⑴214.5(+/"
SIL4-138.7154.5
SIL4-256.2⑴229.5⑴
SIL4-353.9⑴232.0(+)
SIL4-446.9197.5(+)
ACAAAAAGAGACAAATATAGAGAGTTCAAGTGTGTGTGTATGTGTGCATAAAGCACTAGATAGGGTTGAGGTTTAGGGCACATCAAACCAATATATATACAACCACTCCTGAATATTCGGTGCAAGTCCACGTACTTTACTTTTTTTTACTTTT GAG TTACTCAGGACTCATCE14/M60-F-185-P1GACTGCGTACCAATTC 巡 TACACGACATGTAGATCTAATTGCTGAACAAAAAAAAAAAAAAAAAAGCAATTCTGCAAGAACTCCAGAAACAAAATTAGGGGTAGGCTTTTTTGTCTATAGAAAAGTAGTTGGTGTGACAGAACCATTGTTTGCAATAGGCTG GAG TTACTCAGGACTCATCE11/M62-F-200-P1GNCTGCGGACCAATTC Ml CTGTAAACTAGGAAACTCTAATGATCTAGTTTTAGTTGATATTGAACAATATCAACGTCTCGTGGGTAAATTGATTTACTTATCCCATACTTGTCCTGATATTTCCTTTGCTGTGAGTGTTGTCACCCAGTTTATGCAGGCTCCTTATGAGAAACACATGG AAG TTACTCAGGACTCATCE18/M15-F-221-P2GACGTACCAATTC d GCAGATAGATTATGCCGCTTAGAATGTCATGAGTGACCGAGATGGTAGATTCATTGGCACATTTTGGACTAAACTATTCACTTT
CTCAGGAACAAGTCTGAATGTGTCCTCAAGTTACCATCCTCAAATAGACGGTCAGATCGAACGATTCAAATGTATGCTCGAATAATATTTGCGCCATTTIQi TTACTCAGGACTCATCE13/M17-F-226-P2GACTGCGTACCAATTCAG AGACGTGGTTTTATAAAAAAGAGAAAAAAAGCTATTAGGGACATAGCTGGCAAATATAAGATGATCAGTCATATTGCTCATACTCATAGAGTCATAGCAAGTCTAAGGATTACTTTGAGATTGCTTTATTTACAAAATGTTGGTTAGAGAGACATCAATTTTTTTAGGAAGCCAATCTCTAGAACTA CG TTACTCAGGACTCATCE21/M16-F-080-P2GACTGCGTACCAATTC GG TGGTTAGATTGTATTTCTACAATCTCTTTGTCGTTGGGTT GG TTACTCAGGACTCATC遺傳研究為確定遺傳形式，將IL的表型與雜合IL和雜種IL的表型做比較。結(jié)果在表2中 示出。表2遺傳研究的結(jié)果。(IL，原始(純合)文庫的基因滲入系；FlIL是用輪回親本 雜交的IL ；HY IL是用市售品種(父本系)的親本系雜交的IL)。 供體登錄品種的典型的附加特征為大量的雄性花，短果實以及高果實敗育無 商業(yè)價值。純合、雜合以及雜種作物不再具有這些不利特征并具有相當(dāng)高產(chǎn)量，其遠超過了 市售雜種的產(chǎn)量。該果實的末端具有不同的星形黃色，其被認為是連鎖累贅的結(jié)果。通過 常規(guī)育種方法(回交)已經(jīng)去除了該供體系的上述不利特征。
權(quán)利要求
一種具有來自黃瓜登錄號為PI 169383的基因滲入的黃瓜育種系的作物，其代表性樣本的種子已經(jīng)保藏于蘇格蘭阿伯丁的NCIMB，登錄號為NCIMB 41532，保藏參考號為PI169383，其中所述基因滲入是在與所述作物的提高產(chǎn)量相關(guān)的連鎖群3和/或4上的基因滲入，并且其中所述作物相對于缺少所述基因滲入的所述黃瓜育種系的作物表現(xiàn)出提高產(chǎn)量，優(yōu)選地所述提高產(chǎn)量指每株作物總果實重量更高。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的作物，其中所述作物是基本上純合的純優(yōu)良育種系的作物。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的作物，其中所述作物基本上不具有來自黃瓜登錄號為PI 169383的任何其他基因滲入。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項所述的作物，其中所述在連鎖群3和/或4上的基因滲入 包括i)與AFLP 標(biāo)記 E12/M24-F-063-P2、E11/M62-F-200-P1 相關(guān)的片段；ii)與AFLP 標(biāo)記 E12/M24-F-177-P2、E12/M24-F-176-P1、E25/M13-F-128-P2 相關(guān)的片段；iii)與AFLP標(biāo)記E21/M16-F-080-P2相關(guān)的片段；和/或連鎖群3的染色體替換。
5.通過將權(quán)利要求1-4任一項所述的黃瓜作物進行雜交或自交所生產(chǎn)的黃瓜種子。
6.通過種植權(quán)利要求5所述的種子所生產(chǎn)的黃瓜作物。
7.權(quán)利要求6所述作物的作物部位。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的作物部位，其中所述作物部位是黃瓜果實或種子。
9. 一種用于生產(chǎn)雜種黃瓜種子的方法，包括將根據(jù)權(quán)利要求1-4或6任一項所述的作 物與另一株黃瓜作物雜交以及采收所得到的雜種黃瓜種子。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中所述另一株黃瓜作物是黃瓜的育種系，更優(yōu)選地 是根據(jù)權(quán)利要求2所述的不同優(yōu)良系的作物。
11.通過權(quán)利要求9或10所述的方法生產(chǎn)的雜交黃瓜種子。
12.通過種植權(quán)利要求11所述的雜交黃瓜種子所生產(chǎn)的雜種黃瓜作物。
13.權(quán)利要求12所述的雜交黃瓜作物的作物部位。
14.一種用于提高黃瓜育種系的作物產(chǎn)量的方法，所述方法包括以下步驟a)將黃瓜育種系的作物與黃瓜系PI169383的作物雜交；b)選擇由所述雜交得到的來自黃瓜登錄號為PI169383的具有在與提高產(chǎn)量相關(guān)的 連鎖群4上的基因滲入的后代黃瓜作物；c)將選自步驟(b)的使用所述黃瓜育種系作為輪回親本的所述后代黃瓜作物自交和/ 或回交；d)選擇由在步驟(c)中自交或回交得到的來自黃瓜登錄號為PI169383的具有在與提 高產(chǎn)量相關(guān)的連鎖群4上的基因滲入的后代黃瓜作物；e)重復(fù)所述的自交和/或回交步驟以及選擇步驟(c)和(d)以提供對于所述基因滲入 基本上純合的黃瓜育種系的作物；其中在步驟(b)或(d)中所進行的至少一種選擇由標(biāo)記輔助選擇來完成。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中所述黃瓜育種系是優(yōu)良系。
16. 一種用于提高黃瓜雜交Fl的產(chǎn)量的方法，所述方法包括以下步驟a)將至少一個所述黃瓜雜交Fl代的第一親本系與黃瓜系PI169383的作物雜交；b)選擇由所述雜交得到的來自黃瓜登錄號為PI169383的具有在與提高產(chǎn)量相關(guān)的 連鎖群4上的基因滲入的后代黃瓜作物；c)將選自步驟(b)的使用所述黃瓜雜交Fl代的親本系作為輪回親本的所述后代黃瓜 作物自交和/或回交；d)選擇由在步驟(c)中得到的來自黃瓜登錄號為PI169383的具有在與提高產(chǎn)量相關(guān) 的連鎖群4上的基因滲入的后代黃瓜作物；e)重復(fù)所述的自交和/或回交步驟以及選擇步驟(c)和(d)以提供對于所述基因滲入 基本上純合的所述黃瓜雜交Fl代的親本系；f)使用在步驟(e)中得到的作為親本系的用于具有提高產(chǎn)量的Fl雜種的生產(chǎn)的所述 親本系；其中在步驟(b)或(d)中所進行的至少一種選擇由標(biāo)記輔助的選擇來完成。
17.根據(jù)權(quán)利要求14-16任一項所述的方法，其中所述標(biāo)記輔助選擇過程包括用于 如下 AFLP 標(biāo)記的選擇E12/M24-F-063-P2、E11/M62-F-200-P1、E12/M24-F-177-P2、E12/ M24-F-176-P1、E25/M13-F-128-P2 和 E21/M16-F-080-P2。
18.通過根據(jù)權(quán)利要求14-17任一項的方法所獲得的黃瓜育種系或黃瓜雜交Fl代。
19.一種包含與提高黃瓜產(chǎn)量相關(guān)的QTL的分離出的核酸序列，其中所述QTL定義如下i)與AFLP 標(biāo)記 E12/M24-F-063-P2、E11/M62-F-200-P1 相關(guān)的連鎖群 4 上的片段；ii)與AFLP 標(biāo)記 E12/M24-F-177-P2、E12/M24-F-176-P1、E25/M13-F-128-P2 相關(guān)的連 鎖群4上的片段；iii)與AFLP標(biāo)記E21/M16-F-080-P2相關(guān)的連鎖群4上的片段。
20.基因標(biāo)記的使用，該基因標(biāo)記選自如下AFLP標(biāo)記E12/M24-F-063-P2、Ell/ M62-F-200-P1、E12/M24-F-177-P2、E12/M24-F-176-P1、E25/M13-F-128-P2 禾口 E21/ M16-F-080-P2，用于檢測與提高黃瓜作物產(chǎn)量相關(guān)的QTL。
21.一種用于選擇黃瓜作物或其部位包括種子的方法，該方法包括以下步驟(a)提供通過將黃瓜育種系的作物與黃瓜系PI169383的作物雜交得到的后代黃瓜作 物或其部位；(b)針對來自黃瓜登錄號為PI169383的基因滲入片段檢測所述后代黃瓜作物或其部 位，其中所述基因滲入是與所述作物的產(chǎn)量提高相關(guān)的連鎖群4上的基因滲入；(c)選擇基于來源于所述檢測信息的所述后代黃瓜作物或其部位；以及(d)任選地使用所述信息用于進一步的育種考慮。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種具有來自黃瓜登錄號為PI 169383的基因滲入的黃瓜育種系的作物，其代表性樣本的種子已經(jīng)保藏于蘇格蘭阿伯丁的NCIMB，登錄號為NCIMB 41532，保藏參考號為PI169383，其中所述基因滲入是在與所述作物的提高產(chǎn)量相關(guān)的連鎖群4上的基因滲入，并且其中所述作物相對于缺少所述基因滲入的所述黃瓜育種系的作物表現(xiàn)出提高產(chǎn)量，所述提高產(chǎn)量指每株作物總果實重量更高。
文檔編號A01H1/04GK101902905SQ200880121889
公開日2010年12月1日 申請日期2008年12月19日 優(yōu)先權(quán)日2007年12月20日
發(fā)明者布拉姆·羅澤, 杰羅恩·塞巴斯蒂安·德·弗里斯, 阿尼塔·埃弗科·德·哈安, 馬丁努斯·奎里努斯·瑪麗亞·凡·派森 申請人:孟山都投資股份有限公司