專利名稱：改良植物的多核苷酸和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及產(chǎn)生具有增加的生物量的植物的組合物和方法。
背景技術(shù)：
隨著世界人口的增長，農(nóng)業(yè)研究的一個主要目標是改良作物和飼用植物物種的生
物量產(chǎn)量。直到最近，這樣的改良依賴為所期望特性對植物選擇性育種。但是對于很多植物 來說，子代中產(chǎn)生的異源遺傳互補不引起與其親代中一樣的期望性狀，因此限制了選擇性 育種方法的有效性。如今分子生物學(xué)的進展使得可以對植物和動物的種質(zhì)進行遺傳操作。植物的遺傳 工程包括分離并操作遺傳材料以及后續(xù)的將該材料導(dǎo)入植物。這種技術(shù)已經(jīng)引起能夠表達 藥物和其它化學(xué)物的植物的開發(fā)、具有增強的害蟲抗性、增強的壓力耐受的植物的開發(fā)和 表達其它有益性狀的植物的開發(fā)。盡管本領(lǐng)域已知可以應(yīng)用某些生長因子來增加植物大小，但是這些生長因子的應(yīng) 用是高成本且耗時的。因此亟需相對于它們的栽培對應(yīng)物具有增加的生物量的植物。本發(fā)明的目標是提供開發(fā)具有改變的生物量的植物品種的改良的組合物和/或 方法，或至少為公眾提供有用的選擇。發(fā)明概述在第一方面，本發(fā)明提供了產(chǎn)生具有改變的生物量的植物的方法，該方法包括使 用下列多核苷酸來轉(zhuǎn)化植物a)包含編碼具有SEQ ID NO :1的氨基酸序列的多肽或該多肽變體的序列的多核 苷酸；或b)包含a)中的多核苷酸的長度為至少15個核苷酸的片段的多核苷酸，或c)包含a)中的多核苷酸的長度為至少15個核苷酸的互補物的多核苷酸；或d)包含能夠在嚴緊條件下與a)中的多核苷酸雜交的長度為至少15個核苷酸的序 列的多核苷酸。優(yōu)選地，多核苷酸被包含為遺傳構(gòu)建體的部分。在一實施方式中，變體與具有SEQ ID NO 1的氨基酸序列的多肽具有至少70%的 序列同一性。在另一實施方式中，變體包含SEQ ID NO 20的氨基酸序列。在另一實施方式中，變體源自植物物種并且包含SEQ ID NO 20的氨基酸序列。在另一實施方式中，變體源自雙子葉植物物種并且包含SEQ IDN0:21的氨基酸序 列。優(yōu)選地，變體能夠調(diào)節(jié)植物的生物量。在另一實施方式中，a)中的多核苷酸編碼具有SEQ ID NO 1的氨基酸序列的多 肽。
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優(yōu)選地，該多核苷酸在植物中的表達導(dǎo)致植物中能夠調(diào)節(jié)生物量產(chǎn)生的內(nèi)源多核 苷酸/多肽的下調(diào)。優(yōu)選地，減少的表達受反義抑制、正義抑制或RNA干擾的影響。優(yōu)選地，產(chǎn)生的植物相對于合適對照植物具有增加的生物量。在另一方面，本發(fā)明提供了產(chǎn)生具有增加的生物量的植物的方法，該方法包括使 用與編碼具有SEQ ID NO :1的序列的多肽或其變體的內(nèi)源核酸具有足夠序列相似性的多核 苷酸來轉(zhuǎn)化植物，以致該多核苷酸的表達導(dǎo)致所述內(nèi)源核酸表達的抑制。優(yōu)選地，多核苷酸被包含為遺傳構(gòu)建體的部分。在一實施方式中，變體與具有SEQ ID NO 1的氨基酸序列的多肽具有至少70%的 序列同一性。在另一實施方式中，變體包含SEQ ID NO 20的氨基酸序列。在另一實施方式中，變體源自植物物種并且包含SEQ ID NO 20的氨基酸序列。在另一實施方式中，變體源自雙子葉植物物種并且包含SEQ IDN0 21的氨基酸序 列。優(yōu)選地，變體能夠調(diào)節(jié)植物的生物量。在另一實施方式中，多肽具有SEQ ID N0:1的序列。在另一方面，本發(fā)明提供了產(chǎn)生具有改變的生物量的植物的方法，該方法包括轉(zhuǎn) 化植物細胞或植物，所述轉(zhuǎn)化使用a)包含SEQ ID NO 10的核苷酸序列的多核苷酸或其變體；或b)包含a)中的多核苷酸的長度為至少15個核苷酸的片段的多核苷酸；或c)包含a)中的多核苷酸的長度為至少15個核苷酸的互補物的多核苷酸；或d)包含能夠在嚴緊條件下與a)中的多核苷酸雜交的長度為至少15個核苷酸的序 列的多核苷酸。優(yōu)選地，多核苷酸被包含為遺傳構(gòu)建體的部分。優(yōu)選地，變體編碼能夠調(diào)節(jié)植物生物量的多肽。在一實施方式中，a)中的多核苷酸包含SEQ ID NO 10的序列。優(yōu)選地，該多核苷酸在植物中的表達導(dǎo)致植物中能夠調(diào)節(jié)生物量產(chǎn)生的內(nèi)源多核 苷酸/多肽的下調(diào)。優(yōu)選地，下調(diào)受反義抑制、正義抑制或RNA干擾的影響。優(yōu)選地，通過本發(fā)明的方法產(chǎn)生的植物相對于合適對照植物具有增加的生物量。在另一方面，本發(fā)明提供了產(chǎn)生具有增加的生物量的植物的方法，該方法包括使 用與具有SEQ ID NO :10的序列的內(nèi)源核酸或其變體具有足夠序列相似性的多核苷酸來轉(zhuǎn) 化植物，以致該多核苷酸的表達導(dǎo)致所述內(nèi)源核酸表達的抑制。優(yōu)選地，多核苷酸被包含為遺傳構(gòu)建體的部分。在一實施方式中，變體與SEQ ID NO :10的全長編碼序列具有至少70%的序列同一性。在另一實施方式中，變體編碼包含SEQ ID NO 20的氨基酸序列的多肽。在另一實施方式中，變體源自植物物種并且編碼包含SEQ ID NO 20的氨基酸序列 的多肽。
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在另一實施方式中，變體源自雙子葉植物物種并且編碼包含SEQID NO 21的氨基 酸序列的多肽。優(yōu)選地，變體編碼能夠調(diào)節(jié)植物生物量的多肽。在另一實施方式中，內(nèi)源核酸包含SEQ ID NO 10的全長編碼序列。在另一方面，本發(fā)明提供了產(chǎn)生具有改變的生物量的植物細胞或植物的方法，該 方法包括減少包含SEQ ID N0:1的氨基酸序列或其變體的多肽的表達或活性。在一實施方式中，變體與具有SEQ ID NO 1的氨基酸序列的多肽具有至少70%的 序列同一性。在另一實施方式中，變體包含SEQ ID NO 20的氨基酸序列。在另一實施方式中，變體源自植物物種并且包含SEQ ID NO 20的氨基酸序列。在另一實施方式中，變體源自雙子葉植物物種并且包含SEQ IDN0 21的氨基酸序 列。在另一實施方式中，多肽具有SEQ ID N0:1的序列。在另一方面，本發(fā)明提供了產(chǎn)生具有改變的生物量的植物的方法，該方法包括減 少包含SEQ ID NO :20的序列的多肽在植物細胞或植物中的表達或活性的步驟。在一實施方式中，多肽包含SEQ ID NO 21的序列。在另一實施方式中，多肽包含與SEQ ID NO :1的序列具有至少70%同一性的序 列。在另一實施方式中，多肽包含SEQ ID N0:1的序列。在另一實施方式中，將能夠在嚴緊條件下與編碼多肽的內(nèi)源核酸雜交的多核苷酸 導(dǎo)入植物細胞或植物以實現(xiàn)該多肽的減少的表達。在另一實施方式中，內(nèi)源核酸包含與SEQ ID NO :10的全長編碼序列具有至少 70%同一性的序列。在另一實施方式中，內(nèi)源核酸包含SEQ ID NO 10的全長編碼序列。在另一實施方式中，多核苷酸包含與SEQ ID NO: 10的序列具有至少70%同一性 的序列的至少15個相鄰核苷酸。在另一實施方式中，多核苷酸包含SEQ ID NO 10的至少15個相鄰核苷酸。在另一方面，本發(fā)明提供了通過本發(fā)明的方法產(chǎn)生的植物細胞或植物。優(yōu)選地，通過本發(fā)明的方法產(chǎn)生的植物相對于合適對照植物具有增加的生物量產(chǎn)生。優(yōu)選地，通過本發(fā)明的方法產(chǎn)生的植物相對于合適對照植物具有數(shù)量增加的分蘗。在另一方面，本發(fā)明提供了分離的多核苷酸，其與編碼包含SEQID N0 1的氨基酸 序列的多肽的核苷酸序列具有至少71 %的序列同一性。優(yōu)選地，多核苷酸編碼能夠調(diào)節(jié)植物生物量的多肽。在一實施方式中，多肽包含SEQ ID N0:1的氨基酸序列。在另一實施方式中，核苷酸序列包含SEQ ID NO 10的序列。在另一實施方式中，所述核苷酸序列包含SEQ ID NO 10的全長編碼序列。在另一方面，本發(fā)明提供了分離的多核苷酸，其編碼包含SEQ IDN0 1的氨基酸序列的多肽。在一實施方式中，多核苷酸包含SEQ ID NO 10的序列。在另一實施方式中，多核苷酸包含SEQ ID NO 10的全長編碼序列。在另一方面，本發(fā)明提供了包含SEQ ID NO :10的全長編碼序列或其變體的分離的 多核苷酸，其中該變體源自黑麥草或羊茅并且編碼能夠調(diào)節(jié)植物生物量的多肽。在一實施方式中，變體與SEQ ID NO :10的全長編碼序列具有至少70%的序列同 一性。在一實施方式中，分離的多核苷酸包含SEQ ID NO 10的序列。在另一方面，本發(fā)明提供了分離的多肽，其與SEQ ID NO :1的氨基酸序列具有至少 90%的序列同一性，其中該多肽能夠調(diào)節(jié)植物生物量。在一實施方式中，分離的多肽包含SEQ ID N0:1的氨基酸序列。在另一方面，本發(fā)明提供了編碼本發(fā)明多肽的分離的多核苷酸。在另一方面，本發(fā)明提供了分離的多核苷酸，包含a)包含本發(fā)明的多核苷酸的長度為至少15個核苷酸的片段的多核苷酸；或b)包含本發(fā)明的多核苷酸的長度為至少15個核苷酸的互補物的多核苷酸；或c)包含能夠與本發(fā)明的多核苷酸雜交的長度為至少15個核苷酸的序列的多核苷酸。在另一方面，本發(fā)明提供了包含本發(fā)明的多核苷酸的遺傳構(gòu)建體。在一實施方式中，遺傳構(gòu)建體是表達構(gòu)建體。在另一方面，本發(fā)明提供了包含本發(fā)明的表達構(gòu)建體或遺傳構(gòu)建體的載體。在另一方面，本發(fā)明提供了經(jīng)遺傳修飾以表達本發(fā)明的多核苷酸或本發(fā)明的多肽 的宿主細胞。在另一方面，本發(fā)明提供了包含本發(fā)明的表達構(gòu)建體或遺傳構(gòu)建體的宿主細胞。在另一方面，本發(fā)明提供了經(jīng)遺傳修飾以表達本發(fā)明的多核苷酸或本發(fā)明的多肽 的植物細胞。在另一方面，本發(fā)明提供了包含本發(fā)明的表達構(gòu)建體或遺傳構(gòu)建體的植物細胞。優(yōu)選地，表達構(gòu)建體能夠表達多核苷酸，從而導(dǎo)致能夠調(diào)節(jié)植物生物量產(chǎn)生的內(nèi) 源多核苷酸/多肽的表達的抑制。在另一方面，本發(fā)明提供了包含本發(fā)明的植物細胞的植物。在另一方面，本發(fā)明提供了選擇具有改變的生物量的植物的方法，該方法包括測 試植物的本發(fā)明的多核苷酸的改變的表達。在另一方面，本發(fā)明提供了選擇具有改變的生物量的植物的方法，該方法包括測 試植物的本發(fā)明的多肽的改變的表達。在另一方面，本發(fā)明提供了根據(jù)本發(fā)明的方法產(chǎn)生的植物細胞或植物。在另一方面，本發(fā)明提供了根據(jù)本發(fā)明的方法選擇的植物。在另一方面，本發(fā)明提供了針對本發(fā)明的多肽產(chǎn)生的抗體。本發(fā)明的多核苷酸和多核苷酸變體可以源自任何物種和/或可以通過重組或合 成產(chǎn)生。 在一實施方式中，多核苷酸或變體源自植物物種。
在另一實施方式中，多核苷酸或變體源自裸子植物物種。在另一實施方式中，多核苷酸或變體源自被子植物物種。在另一實施方式中，多核苷酸或變體源自雙子葉植物物種。在另一實施方式中，多核苷酸或變體源自單子葉植物物種。本發(fā)明的多肽和多肽變體可以源自任何物種和/或可以通過重組或合成產(chǎn)生。在一實施方式中，多肽或變體源自植物物種。在另一實施方式中，多肽或變體源自裸子植物物種。在另一實施方式中，多肽或變體源自被子植物物種。在另一實施方式中，多肽或變體源自雙子葉植物物種。在另一實施方式中，多肽或變體源自單子葉植物物種。植物細胞或植物可以源自任何植物物種。在另一實施方式中，植物細胞或植物源自裸子植物物種。在另一實施方式中，植物細胞或植物源自被子植物物種。在另一實施方式中，植物細胞或植物源自雙子葉植物物種。在另一實施方式中，植物細胞或植物源自單子葉植物物種。優(yōu)選的雙子葉植物的屬包括桃屬(Amygdalus)、腰果屬(Anacardium)、落花 生屬(Arachis)、蕓苔屬(Brassica)、木豆屬(Cajanus)、大麻屬(Cannabis)、紅花屬 (Carthamus)、山核桃屬(Carya)、木棉屬(Ceiba)、鷹咀豆屬(Cicer)、椰子屬(Cocos)、芫 荽屬(Cor i an drum)、小冠花屬(Coronilla)、棉屬(Cossypium)、野百合屬(Crotalaria)、 扁豆屬(Dolichos)、油棕屬(Elaeis)、大豆屬(lycine)、棉屬(Gossypium)、向日葵 屬(Helianthus)、山黧豆屬(Lathyrus)、兵豆屬(Lens)、胡枝子屬(Lespedeza)、亞麻 屬(Linum)、百脈根屬(Lotus)、羽扇豆屬(Lupinus)、澳洲堅果屬(Macadamia)、苜蓿 屬(Medicago)、草木犀屬(Melilotus)、黎豆屬(Mucuna)、木犀欖屬(Olea)、紅豆草屬 (Onobrychis)、烏足豆屬(Ornithopus)、罌粟屬(Papaver)、菜豆屬(Phaseolus)、刺葵屬 (Phoenix)、黃連木屬(Pistacia)、豌豆屬(Pisum)、櫻桃屬(Prunus)、葛屬(Pueraria)、 茶薦子屬(Ribes)、蓖麻屬(Ricinus)、胡麻屬(Sesamum)、可可屬(Theobroma)、車軸草屬 (Trifolium)、胡蘆巴屬(Trigonella)、蠶豆屬(Vicia)和豇豆屬(Vigna)。優(yōu)選的雙子葉植物的種包括扁桃(Amygdalus communis)、腰果(Anacardium occidentale)、花生(Arachis hypogaea)、花生(Arachishypogea)、甘藍型油菜(Brassica napus Rape)、黑芥(Brassica nigra)、白菜(Brassica campestris)、木 ii (Cajanus cajan)、 EP iS ii (Cajanusindicus)>(Cannabis sativa)、衾工 # (Carthamus tinctorius)、美國山核桃(Carya illinoinensis)、爪哇木棉(Ceiba pentandra)、鷹嘴 豆(Cicer arietinum)、椰子(Cocos nucifera)、芫荽(Cor i an drum sativum)、繡球小冠 tE (Coronilla varia)、豐帛 # (Cossypiumhirsutum) > ^ (Crotalaria juncea)、 (Dolichos lablab)、油掠(Elaeis guineensis)、亞洲棉(Gossypium arboreum)、中國棉 (Gossypium nanking)、海島棉(Gossypium barbadense)、草棉(Gossypium herbaceum)、 陸地棉(Gossypium hirsutum)、大豆(Glycine max)、野大豆(Glycine ussuriensis)、 寬葉蔓豆(Glycine gracilis)、向日葵(Helianthus annus)、狹葉羽扇豆(Lupinus angustifolius)、黃習習扇豆(Lupinus luteus)、雜色習習扇豆(Lupinus mutabilis)、里予雞草
9(Lespedeza sericea)、雞草目艮(Lespedeza striata)、大百脈根(Lotus uliginosus)、山 黧豆(Lathyrus sativus)、兵豆(Lens culinaris)、雞目艮草(Lespedeza stipulacea)、亞 麻(Linum usitatissimum)、百脈根(Lotus corniculatus)、白習習扇豆(Lupinus albus)、 木本苜猜(Medicago arborea)、黃花苜猜(Medicago falcate)、南苜猜(Medicago hispida)、Medicago officinalis、紫花苜蓿(Medicago. sativaAlfalfa)、蒺藜狀苜蓿 (Medicago tribuloides)、澳洲堅果(Macadamia integrifolia)、褐斑苜猜(Medicago arabica)、白；^ H (Melilotus albus)、束 U € Hi (Mucuna pruriens)、 ％ til (Olea europaea)、紅豆草(Onobrychis viciifolia)、鋸齒草(Ornithopus sativus)、 Phaseolus aureus、紫 0十李(Prunus cerasifera) ^ M ^ ^^ (Prunus cerasus)、多 # 胃 豆(Phaseolus coccineus)、歐洲李(Prunus domestica)、棉豆(Phaseolus lunatus)、 黃果酸櫻桃(Prunus. maheleb)、綠豆(Phaseolus mungo)、桃(Prunus. Persica)、櫻桃 (Prunus. pseudocerasus)、菜豆(Phaseolus vulgaris)、§粟(Papaver somniferum)、寬 卩十 H (Phaseolus acutifolius)、 | (Phoenix dactyl if era) ^ MM(Pistacia
vera)、豌豆(Pisum sativum)、扁桃(Prunus amygdalus)、杏(Prunus armeniaca)、野 葛(Pueraria thunbergiana)、漂穗醋栗(Ribes nigrum)、紅醋栗(Ribes rubrum)、歐 洲醋栗(Ribes grossularia)、篦麻(Ricinus communis)、芝麻(Sesamum indicum)、 Trifolium august if olium、分散三葉草(Trifolium diffusum)、雜三葉草(Trifolium hybridum)、絳三葉(Trifolium incarnatum)、球三葉草(Trifolium ingrescens)、紅 三葉(Trifolium pratense)、白三葉(Trifolium repens)、波斯三葉草(Trifolium resupinatum)、地三葉草(Trifolium subterraneum)、可可樹(Theobroma cacao)、亞歷山 大三卩十草(Trifolium alexandrinum)、香豆子(Trigonella foenumgraecum)、窄 Of Sf Wi 豆(Vicia angustifolia)、深紫花野豌豆(Vicia atropurpurea)、Vicia calcarata、野豌 豆(Vicia dasycarpa)、荊豆(Vicia ervilia)、紅莓苔子(Vaccinium oxycoccos)、褐毛野 豌豆(Viciapannonica)、長豆工豆(Vigna sesquipedalis)、豆工豆(Vigna sinensis)、長柔 毛野豌豆(Vicia villosa)、蠶豆(Vicia faba)、大巢菜(Vicia sative)和小豆(Vigna angularis)0優(yōu)選的單子葉植物的屬包括冰草屬(Agropyron)、蔥屬(A11 ium)、看麥娘 屬(Alopecurus)、須芒草屬(Andropogon)、燕麥草屬(Arrhenatherum)、天門冬屬 (Asparagus)、燕麥屬(Avena)、簕竹屬(Bambusa)、孔穎草屬(Bothrichloa)、格蘭馬草 屬(Bouteloua)、雀麥屬(Bromus)、沙茅屬(Calamovilfa)、蒺藜草屬(Cenchrus)、虎尾草 屬(Chloris)、香茅屬(Cymbopogon)、狗牙根屬(Cynodon)、鴨茅屬(Dactylis)、雙花草 屬(Dichanthium)、馬唐屬(Digitaria)、摻屬(Eleusine)、畫眉草屬(Eragrostis)、蕎 麥屬(Fagopyrum)、羊茅屬(Festuca)、向日葵屬(Helianthus)、大麥屬(Hordeum)、毒麥 屬(Lolium)、芒屬(Miscanthis)、奇崗屬(Miscanthus xgiganteus)、禾S屬(Oryza)、黍?qū)?(Panicum)、雀稗屬(Paspalum)、狼尾草屬(Pennisetum)、薦草屬(Phalaris)、梯牧草屬 (Phleum)、早熟禾屬(Poa)、甘蔗屬(Saccharum)、黑麥屬(Secale)、狗尾草屬(Setaria)、印 第安草屬(Sorghastrum)、高粱屬(Sorghum)、小麥屬(Triticum)、香果蘭屬(Vanilla)、小 黑麥屬(X Triticosecale Triticale)和玉蜀黍?qū)?Zea)。優(yōu)選的單子葉植物的種包括扁穗冰草(Agropyron cristatum)、沙生冰草(Agropyron desertorum)、長穗偃麥草(Agropyron elongatum)、中間偃麥草(Agropyron intermedium)、藍蓮冰草(Agropyronsmithii)、叢生小麥草(Agropyron spicatum)、細 蓮冰草(Agropyron trachycaulum)、毛冰草(Agropyron trichophorum)、火蔥(Allium ascalonicum)、洋蔥(Allium cepa)、萬頭(Allium chinense)、韭蔥(Allium porrum)、北 蔥(Allium schoenoprasum)、大蔥(Allium fistulosum)、大蒜(Allium, sativum)、草原 看麥娘(Alopecurus pratensis)、須芒草(Andropogon gerardi)、大須芒草(Andropogon Gerardii)、小須芒草(Andropogon scoparious)、燕麥草(Arrhenatherum elatius)、石習 桕(Asparagus officinalis)、蔽麥(Avena nuda)、燕麥(Avena sativa)、佛肚竹(Bambusa vulgaris)、Bothrichloa barbinodis^ 白(Bothrichloa ischaemum)、Bothrichloa
saccharoides、@|H (Bouteloua curipendula)、MM蘭馬胃(Bouteloua eriopoda)、& 蘭馬草(Bouteloua gracilis)、直立雀麥(Bromus erectus)、無芒雀麥(Bromus inermis)、 草地雀麥(Bromus riparius)、沙拂子茅(Calamovilfa longifilia)、纖毛蒺藜草 (Cenchrus ciliaris)、與一效、|、|虎尾草(Chloris gayana)、亞香茅(Cymbopogon nardus)、狗牙 根(Cynodon dactylon)、甲鳥茅(Dactylis glomerata)、雙花草(Dichanthium annulatum)、 雙(Dichanthium aristatum) ^ Dichanthium sericeum、■ {印馬胃(Digitaria
decumbens)、南非馬唐(Digitaria smutsii)、禾參子(Eleusine coracan)、窄穎賴草(Elymus angustus)、俄羅斯里予麥(Elymus junceus)、彎卩十 iH| 眉草(Eragrostis curvula)、 (Eragrostis tef)、養(yǎng)麥(Fagopyrumesculentum)、軸革旦養(yǎng)麥(Fagopyrum tataricum)、高 羊茅(Festuca arundinacea)、羊茅(Festuca ovina)、草甸羊茅(Festuca pratensis)、 紫羊茅(Festuca rubra)、葵花(Helianthus annuus sunflower)、二 棱大麥(Hordeum distichum)、大麥(Hordeum vulgare)、多花漂麥草(Lolium multiflorum)、漂麥草(Lolium perenn)、芒草(Miscanthis sinensis)、奇崗(Miscanthus x giganteus)、水禾§ (Oryza sativa)、禾術(shù)f (Panicum italicium)、^C (Panicum maximum)、■ (Panicummi 1 iaceum)、胃 黍草(Panicum purpurascens)、柳枝稷(Panicum virgatum)、柳枝稷(Panicum virgatum)、 毛花雀禾卑(Paspalum dilatatum)、百喜草(Paspalum notatum)、狼尾草(Pennisetum clandestinum)、 谷(Pennisetum glaucum)、象草(Pennisetum purpureum)、 谷 (Pennisetum spicatum)、IH (Phalaris arundinacea)、梯年jd (Phieum bertolinii)、 (Phieum pratense)、$肉胃(Poa fendleriana)(Poa pratensis) ^
林地早熟禾(Poa nemoralis)、甘蔴(Saccharum officinarum)、大蓮野生蔴(Saccharum robustum)、竹蔴(Saccharum sinense)、云南割手密(Saccharum spontaneum)、漂麥 (Secale cereale)(Setaria sphacelata)(Sorghastrum nutans) ^
擬高梁(Sorghastrum nutans)、舌甘^"梁(Sorghum dochna) ^(Sorghum halepense) ^
蘇丹草(Sorghum sudanense)、高梁(Sorghum vulgare)、高梁(Sorghum vulgare)、/J、麥 (Triticum aestivum)、二粒小麥(Triticum dicoccum)、硬粒小麥(Triticum durum)、一粒 小麥(Triticum monococcum)、香莢蘭(Vanilla fragrans)、小漂麥(X Triticosecale)禾口 玉米(Zea mays)。 優(yōu)選的植物是飼用植物物種，其來自包括但不限于以下屬的組毒麥屬、羊茅屬、 鴨茅屬、雀麥屬、車軸草屬、苜蓿屬、梯牧草屬、薦草屬、絨毛草屬(Holcus)、百脈根屬、車前 屬(Plantago)禾口菊苣屬(Cichorium)。
特別優(yōu)選的植物來自毒麥屬和車軸草屬。特別優(yōu)選的種是黑麥草和白三葉。特別優(yōu)選的單子葉植物的種是黑麥草和水稻。術(shù)語“植物”旨在包括完整植物、植物的任何部分、繁殖體和植物的子代。術(shù)語“繁殖體”意思是可用于再生或繁殖(無論有性的還是無性的)的任何植物 部分，包括種子和插條(cutting)。發(fā)明詳述多核苷酸和片段本文所用的術(shù)語“多核苷酸”意思是單鏈或雙鏈的任何長度的脫氧核糖核苷酸或 核糖核苷酸的聚合物，但優(yōu)選為至少15個核苷酸，并且包括(作為非限制性例子)基因的 編碼和非編碼序列、正義和反義序列互補物、外顯子、內(nèi)含子、基因組DNA、cDNA、pre-mRNA、 mRNA、rRNA、siRNA、miRNA, tRNA、核糖酶、重組多肽、分離的和純化的天然產(chǎn)生的DNA或RNA 序列、合成的RNA和DNA序列、核酸探針、引物和片段。本文提供的多核苷酸序列的“片段”是能夠與目標靶特異性雜交的連續(xù)核苷酸的 亞序列，例如，長度為至少15個核苷酸的序列。本發(fā)明的片段包含本發(fā)明的多核苷酸的連 續(xù)核苷酸的15個核苷酸，優(yōu)選至少20個核苷酸，更優(yōu)選至少30個核苷酸，更優(yōu)選至少50 個核苷酸，更優(yōu)選至少50個核苷酸，最優(yōu)選至少60個核苷酸。多核苷酸序列的片段可用于 反義、基因沉默、三螺旋或核糖酶技術(shù)，或作為引物、探針被包括在微陣列內(nèi)，或用于本發(fā)明 的基于多核苷酸的選擇方法。術(shù)語“引物”是指短的多核苷酸，通常具有自由的3’ OH基團，其與模板雜交并用于 啟動與靶標互補的多核苷酸的聚合。術(shù)語“探針”是指用于在基于雜交的檢驗中檢測與探針互補的多核苷酸序列的短 的多核苷酸。探針可以由本文定義的多核苷酸的“片段”組成。多肽和片段本文所用的術(shù)語“多肽”包括任意長度的氨基酸鏈，但是優(yōu)選為至少5個氨基酸， 包括全長的蛋白，其中氨基酸殘基通過共價肽鍵連接。本發(fā)明的多肽可以是純化的天然產(chǎn) 物，或者可以部分或全部使用重組或合成技術(shù)產(chǎn)生。該術(shù)語可以指多肽、多肽的聚集體例如 二體或其它多聚體、融合多肽、多肽片段、多肽變體或其衍生物。多肽的“片段”是多肽的亞序列，其實現(xiàn)生物活性所需要的功能和/或提供多肽的 三維結(jié)構(gòu)。該術(shù)語可以指能夠?qū)崿F(xiàn)上述酶學(xué)活性的多肽、多肽的聚集體例如二體或其它多 聚體、融合多肽、多肽片段、多肽變體或其衍生物。對于本文公開的多核苷酸或多肽的序列所用的術(shù)語“分離的”是指脫離其天然細 胞環(huán)境的序列。分離的分子可以通過任何方法或方法的組合獲得，包括生物化學(xué)、重組和合 成技術(shù)。術(shù)語“重組體”是指脫離其天然環(huán)境中環(huán)繞它的序列的多核苷酸序列，和/或與那 些不存在于其天然環(huán)境中的序列進行重組的多核苷酸序列?！爸亟M的”多肽序列通過翻譯“重組的”多核苷酸序列而產(chǎn)生。關(guān)于本發(fā)明的多核苷酸和多肽的術(shù)語“源自”(“源自”特定的屬或種)意思是該 多核苷酸或多肽與那些在該屬或種中天然發(fā)現(xiàn)的多核苷酸或多肽具有相同的序列。因此可 通過合成或重組產(chǎn)生多核苷酸或多肽，所述多核苷酸或多肽源自屬或種。
變體本文所用的術(shù)語“變體”是指與具體指明的序列不同的多核苷酸或多肽的序列，其 中刪除、替換或添加了一個或多個核苷酸或氨基酸殘基。變體可以是天然產(chǎn)生的等位基因 變體，或非天然產(chǎn)生的變體。變體可以來自相同的物種或其它物種，可以包括同源物、旁系 同源物和直系同源物。在某些實施方式中，本發(fā)明的多肽和多核苷酸的變體與本發(fā)明的多 肽或多核苷酸變體具有相同或相似的生物學(xué)活性。提及多肽和多核苷酸時的術(shù)語“變體”包 括本文定義的所有形式的多肽和多核苷酸。多核苷酸變體變體多核苷酸序列相對于指明的多核苷酸序列優(yōu)選顯示出至少50%，更優(yōu)選至少 51%,更優(yōu)選至少52%，更優(yōu)選至少53%，更優(yōu)選至少54%，更優(yōu)選至少55%，更優(yōu)選至少 56 %，更優(yōu)選至少57 %，更優(yōu)選至少58 %，更優(yōu)選至少59 %，更優(yōu)選至少60 %，更優(yōu)選至少 61%,更優(yōu)選至少62%，更優(yōu)選至少63%，更優(yōu)選至少64%，更優(yōu)選至少65%，更優(yōu)選至少 66 %，更優(yōu)選至少67 %，更優(yōu)選至少68 %，更優(yōu)選至少69 %，更優(yōu)選至少70 %，更優(yōu)選至少 71%，更優(yōu)選至少72%，更優(yōu)選至少73%，更優(yōu)選至少74%，更優(yōu)選至少75%，更優(yōu)選至少 76 %，更優(yōu)選至少77 %，更優(yōu)選至少78 %，更優(yōu)選至少79 %，更優(yōu)選至少80 %，更優(yōu)選至少 81%,更優(yōu)選至少82%，更優(yōu)選至少83%，更優(yōu)選至少84%，更優(yōu)選至少85%，更優(yōu)選至少 86 %，更優(yōu)選至少87 %，更優(yōu)選至少88 %，更優(yōu)選至少89 %，更優(yōu)選至少90 %，更優(yōu)選至少 91%,更優(yōu)選至少92%，更優(yōu)選至少93%，更優(yōu)選至少94%，更優(yōu)選至少95%，更優(yōu)選至少 96 %，更優(yōu)選至少97 %，更優(yōu)選至少98 %，最優(yōu)選至少99 %的同一性。在指明的多核苷酸序 列的至少20個核苷酸位置，優(yōu)選至少50個核苷酸位置，更優(yōu)選至少100個核苷酸位置，最 優(yōu)選其全長的比較窗口中找到同一性?？梢愿鶕?jù)以下方式確定多核苷酸的序列同一性。使用bl2seq(Tatiana A. Tatusova, Thomas L. Madden (1999), " Blast 2sequences_anew tool for comparing protein and nucleotide sequences “ ， FEMSMicrobiol Lett. 174 247-250) ψ 白勺 BLASTN(來自程序的 BLAST 套裝軟件(the BLAST suite of programs)，版本 2· 2· 5 [2002 年11月])(其可以公開地從NCBI (ftp://ftp.ncbi.nih. gov/blast/)獲得)將主題多核 苷酸序列與候選多核苷酸序列進行比較。使用bl2seq的缺省參數(shù)，只是需要關(guān)閉低復(fù)雜性 部分的濾除?？梢允褂靡韵碌膇mix命令行參數(shù)測定多核苷酸序列的同一性bl2seq-i nucleotideseq l_j nucleotideseq2_F F_p blastn參數(shù)-F F關(guān)閉低復(fù)雜性部分的濾除。參數(shù)-P為序列對選擇合適的算法。bl2seq 程序在行“同一性=”中以相同核苷酸的數(shù)字和百分率報告序列同一性。也可以使用全域序列比對程序(例如Needleman，S. B.和Wunsch，C. D. (1970) J. Mol. Biol. 48,443-453)在候選和主題多核苷酸序列之間的重疊的全長上計算多核苷酸 的序列同一'性?？梢栽?EMBOSS 程序包(Rice，P. Longden, I.和 Bleasby，A. EMBOSS The European MolecularBiology Open Software Suite,Trends in Genetics June 2000,vol 16，No 6. pp. 276-277 ；其可以從 http://www. hgmp. mrc. ac. uk/Software/EMBOSS/獲得)的 needle程序中找到Needleman-Wunsch全域比對算法的完全應(yīng)用。歐洲生物信息學(xué)研究所 服務(wù)器也提供工具而在http:/WWW. ebi. ac. uk/emboss/align/上在線進行兩個序列之間
13的EMBOSS-needle全域比對。或者可以使用GAP程序，其計算兩個序列的最佳全域比對而無處罰末端空隙。 在以下文章中描述了 GAP Huang, X. (1994) On GlobalSequence Alignment. Computer Applications in the Biosciences 10,227-235。如上所述的BLASTN的使用優(yōu)選地用于確定本發(fā)明的多核苷酸變體的序列同一性。本發(fā)明的多核苷酸變體還包括那些與一個或多個具體指明的序列顯示相似性的 序列，其可能保留那些序列的功能等同性，并且不能合理地被預(yù)計通過隨機的機會產(chǎn)生。這 樣的關(guān)于多肽的序列相似性可以使用從NCBI (ftp://ftp. ncbi. nih. gov/blast/)來自程 序的BLAST套裝軟件(版本2. 2. 5[2002年11月])公開獲得的bl2seq程序來確定。可以使用以下的imix命令行參數(shù)測定多核苷酸序列的相似性bl2seq-i nucleotideseq l_j nucleotideseq2_F F_p tblastx參數(shù)-F F關(guān)閉低復(fù)雜性部分的濾除。參數(shù)-ρ為序列對選擇合適的算法。該程 序在序列間找到相似性區(qū)，對于每個這樣的區(qū)域報告一個“E值”，E值是在含有隨機序列的 固定參考大小的數(shù)據(jù)庫中可以預(yù)期隨機見到這樣的匹配的預(yù)期次數(shù)。該數(shù)據(jù)庫的大小在 bl2seq程序中設(shè)定為缺省值。對于小的E值(遠小于1)，E值大約是這樣的隨機匹配發(fā)生 的概率。當與任何一個具體指明的序列相比時，變體多核苷酸序列優(yōu)選顯示出1X10,以 下，更優(yōu)選1X 10_2°以下，更優(yōu)選1 X 10_3°以下，更優(yōu)選1 X 10_4°以下，更優(yōu)選1 X 10_5°以下， 更優(yōu)選1 X10,以下，更優(yōu)選1 X 10_7°以下，更優(yōu)選1 X 10_8°以下，更優(yōu)選1 X 10,以下，最 優(yōu)選1X10,°以下的E值?；蛘撸景l(fā)明的變體多核苷酸在嚴謹條件下與指明的多核苷酸序列或其互補物雜 、-父。術(shù)語“在嚴謹條件下雜交”及其語法等同物是指在確定的溫度和鹽濃度的條件 下，多核苷酸分子與靶多核苷酸分子(例如固定于DNA或RNA印跡例如Southern印跡或 Northern印跡上的靶多核苷酸分子)雜交的能力?？梢酝ㄟ^最初在低嚴謹條件下雜交然后 將嚴謹度增加至需要的嚴謹度來確定在嚴謹雜交條件下的雜交能力。對于長度為大約100個堿基以上的多核苷酸分子，通常的嚴謹雜交條件為不低于 原態(tài)雙鏈的熔解溫度(Tm)的25°C至30°C (例如，10°C)以下(一般性參見，Sambrook等人， Eds,1987,Molecular Cloning,ALaboratory Manual,2nd Ed. Cold Spring Harbor Press ； Ausubel 等人，1987, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing)。 對于大約100個堿基以上的多核苷酸分子，其Tm值可以根據(jù)公式Tm = 81.5+0.41% (G+C-log(Na+). (Sambrook 等人，Eds, 1987,MolecularCloning,A Laboratory Manual, 2nd Ed. Cold Spring Harbor Press ；Boltonand McCarthy, 1962, PNAS 84:1390)計算。對于 長度為100個堿基以上的多核苷酸，通常的嚴謹條件為下列的雜交條件例如在6XSSC， 0.2% SDS的溶液中預(yù)先洗滌；在65°C，6XSSC，0. 2% SDS中雜交過夜；然后在65 °C， 1XSSC，0. 1% SDS中洗滌兩次，每次30分鐘，然后在65°C，0. 2X SSC, 0. 1% SDS中洗滌兩 次，每次30分鐘。對于長度為100個堿基以下的多核苷酸分子，示例性的嚴謹雜交條件為Tm以下5°C至10°C。平均來講，長度為IOObp以下的多核苷酸分子的Tm大約下降(500/寡核苷酸 長度)°C。對于被稱作肽核酸(PNA)的DNA類似物(Nielsen等人，Science. 1991Dec 6 ； 254 (5037) 1497-500)，其Tm值比DNA-DNA或DNA-RNA雜交體的要高，可以使用根據(jù)Giesen 等人，Nucleic Acids Res. 1998Novl ；26 (21) :5004_6描述的公式計算。具有100個堿基以 下長度的DNA-PNA雜交體的示例性的嚴謹雜交條件為Tm以下5°C至10°C。本發(fā)明的變體多核苷酸還包括這樣的多核苷酸其與本發(fā)明的序列不同，但是由 于遺傳密碼的簡并性的結(jié)果，其編碼與本發(fā)明的多核苷酸編碼的多肽具有相似活性的多 肽。不改變多肽的氨基酸序列的序列改變是“沉默變異”。除了 ATG(蛋氨酸)和TGG(色氨 酸)之外，可以通過本領(lǐng)域承認的技術(shù)改變同一個氨基酸的其它密碼子，例如為了在特定 宿主生物中使密碼子的表達最優(yōu)化。本發(fā)明還包括在編碼的多肽序列中引起一個或幾個氨基酸的保守性替換而不顯 著改變其生物學(xué)活性的多核苷酸序列的改變。本領(lǐng)域技術(shù)人員將知道進行表型沉默氨基酸 替換的方法(參見，例如Bowie等人，1990，Science 247，1306)?？梢允褂脧腘CBI (ftp://ftp. ncbi. nih. gov/blast/)公開獲得的來自程序的 BLAST套裝軟件(版本2. 2. 5 [2002年11月])的bl2seq程序通過如上所述的tblastx算 法來確定由于編碼的多肽序列中的沉默變異和保守性替換而產(chǎn)生的變體多核苷酸。多肽變體提及多肽時的術(shù)語“變體”包括天然產(chǎn)生的、重組的和合成產(chǎn)生的多肽。變體多肽 序列相對于本發(fā)明的序列優(yōu)選顯示出至少50%，更優(yōu)選至少51%，更優(yōu)選至少52%，更優(yōu) 選至少53 %，更優(yōu)選至少54 %，更優(yōu)選至少55 %，更優(yōu)選至少56 %，更優(yōu)選至少57 %，更優(yōu) 選至少58 %，更優(yōu)選至少59 %，更優(yōu)選至少60 %，更優(yōu)選至少61 %，更優(yōu)選至少62 %，更優(yōu) 選至少63 %，更優(yōu)選至少64 %，更優(yōu)選至少65 %，更優(yōu)選至少66 %，更優(yōu)選至少67 %，更優(yōu) 選至少68 %，更優(yōu)選至少69 %，更優(yōu)選至少70 %，更優(yōu)選至少71 %，更優(yōu)選至少72 %，更優(yōu) 選至少73 %，更優(yōu)選至少74 %，更優(yōu)選至少75 %，更優(yōu)選至少76 %，更優(yōu)選至少％，更優(yōu)選 至少77 %，更優(yōu)選至少78 %，更優(yōu)選至少79 %，更優(yōu)選至少80 %，更優(yōu)選至少81 %，更優(yōu)選 至少82 %，更優(yōu)選至少83 %，更優(yōu)選至少84 %，更優(yōu)選至少85 %，更優(yōu)選至少86 %，更優(yōu)選 至少87 %，更優(yōu)選至少88 %，更優(yōu)選至少89 %，更優(yōu)選至少90 %，更優(yōu)選至少91 %，更優(yōu)選 至少92 %，更優(yōu)選至少93 %，更優(yōu)選至少94 %，更優(yōu)選至少95 %，更優(yōu)選至少96 %，更優(yōu)選 至少97%，更優(yōu)選至少98%，最優(yōu)選至少99%的同一性。在本發(fā)明的多肽的至少20個氨基 酸位置，優(yōu)選至少50個氨基酸位置，更優(yōu)選至少100個氨基酸位置，最優(yōu)選其全長的比較窗 口中找到同一性?？梢愿鶕?jù)以下方式確定多肽的序列同一性。使用bl2seq中的BLASTP(來自程序 的BLAST套裝軟件，版本2. 2. 5[2002年11月])(其可以公開地從NCBI (ftp://ftp. ncbi. nih. gov/blast/)獲得)將主題多肽序列與候選多肽序列進行比較。使用bl2seq的缺省參 數(shù)，只是需要關(guān)閉低復(fù)雜性區(qū)的濾除。也可以使用全域序列比對程序在候選和主題多核苷酸序列之間的重疊的全長上 計算多肽的序列同一性。如上文討論的EMB0SS_needle(可以從http:/www. ebi. ac. uk/ emboss/align/獲得)禾口 GAP(Huang，X. (1994)On Global Sequence Alignment. ComputerApplications in theBiosciences 10，227-235)也是合適的用于計算多肽的序列同一性 的全域序列比對程序。上面描述的BLASTP用途優(yōu)選用于確定根據(jù)本發(fā)明的多肽變體。本發(fā)明的多肽變體還包括那些與一個或多個具體指明的序列顯示相似性的序列， 其可能保留那些序列的功能等同性，并且不能合理地被預(yù)計通過隨機的機會產(chǎn)生。這樣的 關(guān)于多肽的序列相似性可以使用從NCBI (ftp://ftp. ncbi. nih. gov/blast/)公開獲得的 來自程序的BLAST套裝軟件(版本2. 2. 5[2002年11月])的bl2seq程序來確定。可以使 用以下的imix命令行參數(shù)測定多肽序列的相似性bl2seq-i peptideseq l_j peptideseq2_F F_p blastp當與任何一個具體指明的序列相比時，變體多肽序列優(yōu)選顯示出1X10,以下，更 優(yōu)選1 X 10_2°以下，更優(yōu)選1 X 10_3°以下，更優(yōu)選1 X 10_4°以下，更優(yōu)選1 X 10_5°以下，更優(yōu) 選1 X 10_6°以下，更優(yōu)選1 X 10_7°以下，更優(yōu)選1 X 10_8°以下，更優(yōu)選1 X 10_9°以下，以及最 優(yōu)選1X10,°以下的E值。參數(shù)-F F關(guān)閉低復(fù)雜性部分的濾除。參數(shù)-P為序列對選擇合適的算法。該程序 在序列間找到相似性區(qū)，對于每個這樣的區(qū)域報告一個“E值”，E值是在含有隨機序列的固 定參考大小的數(shù)據(jù)庫中可以預(yù)期隨機見到這樣的匹配的預(yù)期次數(shù)。對于小的E值(遠小于 1)，E值大約是這樣的隨機匹配發(fā)生的概率。本發(fā)明還包括所描述的多肽序列的一個或幾個氨基酸的保守性替換(而不顯著 改變其生物學(xué)活性)。本領(lǐng)域技術(shù)人員將知道進行表型沉默氨基酸替換的方法(參見，例如 Bowie等人，1990，Science 247，1306)。構(gòu)建體、載體及其成分術(shù)語“遺傳構(gòu)建體”是指這樣的多核苷酸分子，其通常為雙鏈DNA，其中可以插入另 一個多核苷酸分子(插入的多核苷酸分子)例如但不限于，cDNA分子。遺傳構(gòu)建體可以含 有允許插入的多核苷酸分子轉(zhuǎn)錄的，以及可選的將轉(zhuǎn)錄本翻譯成多肽的必需元件。插入的 多核苷酸分子可以源自宿主細胞，或者可以源自不同的細胞或生物和/或可以是重組的多 核苷酸。一旦進入宿主細胞，遺傳構(gòu)建體可以整合進入宿主的染色體DNA。遺傳構(gòu)建體可以 與載體相連。術(shù)語“載體”是指這樣的多核苷酸分子，其通常為雙鏈DNA，用于將遺傳構(gòu)建體運送 至宿主細胞。載體能夠在至少一個另外的宿主系統(tǒng)例如大腸桿菌(E.coli)中復(fù)制。術(shù)語“表達構(gòu)建體”是指包括允許插入的多核苷酸分子轉(zhuǎn)錄的，以及可選的將轉(zhuǎn)錄 本翻譯成多肽的必需元件的遺傳構(gòu)建體。表達構(gòu)建體通常以5’至3’方向包含a)在構(gòu)建體轉(zhuǎn)化進入的宿主細胞中有功能的啟動子；b)要表達的多核苷酸；和c)在構(gòu)建體轉(zhuǎn)化進入的宿主細胞中有功能的終止子。術(shù)語“編碼區(qū)域”或“開放讀碼框”(ORF)是指基因組DNA序列或cDNA序列的正義 鏈，其能夠在合適的調(diào)控序列的控制下產(chǎn)生轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物和/或多肽。編碼序列由5’翻譯起始 密碼子和3’翻譯終止密碼子的存在而鑒別。當插入遺傳構(gòu)建體中時，當“編碼序列”與啟 動子和終止子序列可操作地連接時，“編碼序列”能夠表達。“可操作地連接”意思是要表達的序列置于調(diào)控元件(包括啟動子、組織特異性調(diào) 控元件、時間調(diào)控元件、增強子、抑制子和終止子)的控制之下。
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術(shù)語“非編碼區(qū)域”是指在翻譯起始位點上游和翻譯終止位點下游的非翻譯序列。 這些序列也被分別稱為5’UTR和3’UTR。這些區(qū)域包括轉(zhuǎn)錄起始和終止以及調(diào)節(jié)翻譯效率 所需的元件。終止子是終止轉(zhuǎn)錄的序列，存在于基因的3’非翻譯末端，被翻譯的序列的下游。終 止子是mRNA穩(wěn)定性的重要決定者，在一些情況下，發(fā)現(xiàn)終止子具有空間調(diào)控功能。術(shù)語“啟動子”是指調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄的位于編碼區(qū)域上游的非轉(zhuǎn)錄順式調(diào)控元件。啟 動子包含順式起始元件(其指明轉(zhuǎn)錄的起始位點)和保守性的盒例如TATA盒，以及被轉(zhuǎn)錄 因子結(jié)合的基序?！稗D(zhuǎn)基因”是從一個生物中取出并通過轉(zhuǎn)化被導(dǎo)入一個不同生物的多核苷酸。轉(zhuǎn)基 因可以源自相同的物種或來自與轉(zhuǎn)基因所導(dǎo)入的生物的物種不同的物種。“反向重復(fù)”是重復(fù)序列，其中重復(fù)的后一半在互補鏈中，例如(5，) GATCTA.......TAGATC (3，)(3，) CTAGAT.......ATCTAG (5，)通讀轉(zhuǎn)錄將產(chǎn)生這樣的轉(zhuǎn)錄本，其進行互補性堿基配對以形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，只要在 重復(fù)區(qū)域之間有3-5pb的間隔子?！稗D(zhuǎn)基因植物”是指由于遺傳操作或轉(zhuǎn)化的結(jié)果而含有新的遺傳材料的植物。新的 遺傳材料可以源自于得到的轉(zhuǎn)基因植物相同的物種或來自不同物種。術(shù)語“改變本發(fā)明的多核苷酸或多肽的表達”和“本發(fā)明的多核苷酸或多肽的改變 的表達”包括這樣的情況對應(yīng)于本發(fā)明的多核苷酸的基因組DNA被修飾，因而引起本發(fā)明 的多核苷酸或多肽的改變的表達?？梢酝ㄟ^遺傳轉(zhuǎn)化或本領(lǐng)域已知的用于誘導(dǎo)突變的其它 方法進行基因組DNA的修飾?！案淖兊谋磉_”可以與信使RNA和/或產(chǎn)生的多肽的量的增加 或減少相關(guān)，也可以由于產(chǎn)生的多核苷酸和多肽的序列改變而引起多肽的活性改變。術(shù)語“生物量”是指處于特定年齡或發(fā)育階段的植物的營養(yǎng)器官的大小和/或質(zhì) 量和/或數(shù)目。因此，相對于相同年齡或等同發(fā)育階段的合適對照植物來說，具有增加的生 物量的植物具有增加的營養(yǎng)器官的大小和/或質(zhì)量和/或數(shù)目。相反地，具有減少的生物 量的植物與合適對照相比，具有減少的營養(yǎng)器官的大小和/或質(zhì)量和/或數(shù)目。改變的生 物量還可以包括相對于合適對照，在植物生命周期的某些或全部時期中營養(yǎng)器官的生長速 率和/或營養(yǎng)器官的形成速率的改變。因此，改變的生物量可以導(dǎo)致這類植物到達某發(fā)育 階段所耗時間的提前或延緩。合適對照植物可以包括相同物種和品種的非轉(zhuǎn)化植物，或以對照構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的相 同的物種和品種的植物。本發(fā)明提供了產(chǎn)生和/或選擇相對于合適對照植物來說具有改變的生物量的植 物的方法，包括具有增加的和減少的生物量的植物以及通過這樣的方法產(chǎn)生的植物。本發(fā)明提供了編碼調(diào)節(jié)植物中生物量的多肽(SEQ ID NO 1)的多核苷酸(SEQ ID NO 10)。本發(fā)明提供了編碼 SEQ ID NO 1 的多肽變體(SEQ ID NOs 2~9)的 SEQ ID NO 10 的多核苷酸變體(SEQ ID NO 11-18)0本申請人還鑒定了如SEQ ID N0:20所示的、存在于 SEQ IDNO :1和SEQ ID NO 1的全部多肽變體中的共有多肽序列基序，以及存在于SEQ ID N0:1(0RF54)及其源自雙子葉植物的全部多肽變體中的另一共有基序(SEQ ID NO :21)。分離多核苷酸的方法
可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的各種技術(shù)分離本發(fā)明的多核苷酸分子。舉例來 說，可以通過使用Mullis等人，Eds. 1994The Polymerase Chain Reaction，Birkhauser(通 過引用并入本文)中描述的聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)分離這樣的多肽?？梢允褂帽疚亩x的 源自本發(fā)明的多核苷酸序列的引物擴增本發(fā)明的多肽。分離本發(fā)明的多核苷酸或可用于本發(fā)明的方法的多核苷酸的其它方法包括使用 全部或部分的本文列出的作為雜交探針的多核苷酸。將標記的多核苷酸探針與固定于固 體支持物(例如硝酸纖維素膜或尼龍膜)上的多核苷酸雜交的技術(shù)可用于篩選基因組 或cDNA庫。示例性的雜交和洗滌條件為于65°C在5.0XSSC，0. 5%十二烷基硫酸鈉， IXDenhardt' s溶液中雜交20小時；在1.0XSSC，1% (w/v)十二烷基硫酸鈉中洗滌(三 次，每次在55°C洗滌20分鐘)，可選地在60°C，0. 5 X SSC, 1 % (w/v)十二烷基硫酸鈉中洗滌 1次(20分鐘)。可選地，可以在60°C，0. 1XSSC,1% (w/v)十二烷基硫酸鈉的條件下再洗 滌一次(20分鐘)。可以通過本領(lǐng)域熟知的技術(shù)產(chǎn)生本發(fā)明的多核苷酸片段，例如限制性內(nèi)切酶消化 和寡核苷酸合成。多核苷酸序列的一部分可用于本領(lǐng)域熟知的方法以鑒定相應(yīng)的全長多核苷酸序 列。這樣的方法包括基于 PCR 的方法，5，RACE (FrohmanMA, 1993，Methods Enzymol. 218 340-56)和基于雜交的方法，基于計算機/數(shù)據(jù)庫的方法。另外，舉例來說，反向PCR允許獲 得從基于已知區(qū)域的引物開始，本文公開的多核苷酸序列側(cè)翼的未知序列(Triglia等人， 1998,Nucleic Acids Res 16，8186，通過引用并入本文)。該方法使用幾個限制性酶以在基 因的已知區(qū)域產(chǎn)生合適的片段。然后該片段通過分子內(nèi)的連接而環(huán)化并用作PCR的模板。 從已知的區(qū)域設(shè)計分散引物(divergent primer)。為了物理組合全長克隆，可以使用標準 分子生物學(xué)方法(Sambrook 等人，Molecular Cloning :A Laboratory Manual, 2ndEd. Cold Spring Harbor Press,1987)。當從特定物種產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物時，以序列或源自該物種的序列轉(zhuǎn)化這樣的植物可 能是有益的。該益處可以緩解公眾對于跨物種轉(zhuǎn)化而產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因生物的擔心。另外，當某 基因的下調(diào)是想要的結(jié)果時，可能需要使用與植物(希望其中的表達降低)中的序列相同 (或至少高度相似)的序列。由于這些原因(除了其它的之外)，所以需要能夠鑒定并分離 幾個不同植物物種中特定基因的直系同源物?？梢酝ㄟ^所描述的方法鑒定變體(包括直系 同源物)。鑒定變體的方法物理方法可以使用基于PCR的方法鑒定變體多核苷酸(Mullis等人，Eds. 1994The Polymerase Chain Reaction，Birkhauser)。通常，用于通過PCR擴增變體多核苷酸分子的 引物的多核苷酸序列可以基于編碼相應(yīng)氨基酸序列的保守性區(qū)域的序列?；蛘撸梢允褂帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員會知道的庫篩選方法(Sambrook等人，Molecular Cloning :A Laboratory Manual, 2nd Ed. Cold SpringHarbor Press，1987)。當鑒定探針序 列的變體時，雜交和/或洗滌的嚴緊條件通常比尋找完整序列匹配時要低?？梢酝ㄟ^物理方法鑒定本發(fā)明的多肽變體，例如通過使用針對本發(fā)明多肽產(chǎn)生 的抗體來蹄選表達庫(Sambrook 等人，Molecular Cloning :A Laboratory Manual, 2nd
18Ed. Cold Spring Harbor Press, 1987)或通過這樣的抗體的幫助從天然來源鑒定多肽?；谟嬎銠C的方法還可以使用公共的結(jié)構(gòu)域序列比對算法和序列相似性搜索工具(以搜索序列數(shù) 據(jù)庫)(公共的結(jié)構(gòu)域數(shù)據(jù)庫包括Genbank，EMBL, Swiss-Prot, PIR和其它)通過本領(lǐng)域技 術(shù)人員熟知的基于計算機的方法來鑒定包含多核苷酸和多肽變體的本發(fā)明的變體序列。參 見例如Nucleic Acids Res. 29 =I-IOand 11-16，2001，例如在線來源。相似性搜索檢索并 比對靶序列以與待分析的序列(即待查詢序列)進行比較。序列對比算法使用得分陣距以 分配給每個比對一個總體分值。用于在序列數(shù)據(jù)庫中鑒定變體的示例性的程序家族為程序的BLAST套裝軟件 (版本 2. 2. 5[2002 年 11 月])包括 BLASTN，BLASTP，BLASTX, tBLASTN 和 tBLASTX,可 以從(ftp://ftp.ncbi.nih.gov/blast/)或從 National Center for Biotechnology Information (NCBI), NationalLibrary of Medicine, Building 38A, Room 8N805, Bethesda, MD 20894USA公開地獲得。NCBI服務(wù)器還提供使用程序篩選一些可公開獲得的 序列數(shù)據(jù)庫的工具。BLASTN比較待查詢核苷酸序列和數(shù)據(jù)庫核苷酸序列。BLASTP比較待 查詢氨基酸序列和數(shù)據(jù)庫蛋白序列。BLASTX比較以所有讀碼框翻譯的待查詢核苷酸序列和 數(shù)據(jù)庫蛋白序列。tBLASTN比較待查詢蛋白序列和以所有讀碼框動態(tài)翻譯的數(shù)據(jù)庫核苷酸 序列。tBLASTX比較待查詢核苷酸序列的六框翻譯和數(shù)據(jù)庫核苷酸序列的六框翻譯。可以 以缺省參數(shù)使用BLAST程序或者按照需要改變參數(shù)以改善篩選。BLAST家族算法(包括BLASTN，BLASTP和BLASTX)的使用在Altschul等人的論 文 Nucleic Acids Res. 25 :3389_3402，1997 中有描述。BLASTN, BLASTP, BLASTX, tBLASTN, tBLASTX或相似算法產(chǎn)生的待查詢序列對于一 個或多個數(shù)據(jù)庫序列的“命中”比對并鑒定序列的相似部分。命中按照相似度的順序和序 列重疊的長度而排列。對數(shù)據(jù)庫序列的命中一般代表只有待查詢序列的序列長度的一部分
上重疊。BLASTN, BLASTP, BLASTX, tBLASTN 和 tBLASTX 算法還產(chǎn)生比對的“預(yù)計”值。預(yù)計 值(E)表示當搜索含有隨機連續(xù)序列的相同大小的數(shù)據(jù)庫時能夠“預(yù)計”隨機見到的命中 的數(shù)目。預(yù)計值用作顯著性臨界值以確定對數(shù)據(jù)庫的命中是否表示真實的相似性。例如， 分配給多核苷酸命中的E值為0. 1被解讀為意思是在所篩選的數(shù)據(jù)庫大小的數(shù)據(jù)庫中，可 以在具有相似得分的序列比對的部分上能夠簡單地通過隨機預(yù)計見到0. 1個匹配。對于在 比對和匹配部分上具有0. 01或更低的E值的序列，使用BLASTN，BLASTP, BLASTX, tBLASTN 或tBLASTX算法在該數(shù)據(jù)庫中隨機發(fā)現(xiàn)匹配的概率是或更低。可以使用CLUSTALW(Thompson，J. D.，Higgins, D. G.禾Π Gibson, Τ. J. (1994) CLUSTALff improving the sensitivity of progressivemultipIe sequence alignment through sequence weighting, positions-specific gap penalties and weight matrix choice. Nucleic Acids Research,22 :4673_4680, http://www-igbmc.u_strasbg.fr/ Biolnfo/Clustalff/Top. html)或 T-C0FFEE(Cedric Notredame, Desmond G. Higgins, Jaap Heringa, T-Coffee :A novel method for fast and accuratemultiple sequence alignment，J. Mol. Biol. (2000)302 205-217))或 PILEUP (其使用累進的成對比對)(Feng 和Doolittle，1987，J. Mol. Evo 1. 25，351)進行一組相關(guān)序列的多重序列比對。
可以獲得模式識別軟件應(yīng)用以尋找基序或標志序列。例如，MEME(Multiple Em for Motif Elicitation)在一組序列中尋找基序和標志序列，MAST (Motif Alignment and Search Tool)使用這些基序在待查詢序列中鑒定相似或相同的基序。MAST的結(jié)果作為一 系列的具有合適的統(tǒng)計學(xué)數(shù)據(jù)的比對和所發(fā)現(xiàn)的基序的可視概況而提供。MEME和MAST由 University of California, San Diego 開發(fā)。PROSITE (Bairoch 禾口 Bucher，1994，Nucleic Acids Res. 22，3583 ;Hofmann 等人， 1999,Nucleic Acids Res. 27,215)是鑒定從基因組或cDNA序列翻譯而來的未鑒定的蛋白 的功能的方法。PROSITE數(shù)據(jù)庫(www.expasy.org/prosite)含有生物學(xué)顯著模式和概述， 其被設(shè)計為可以使用合適的計算機工具將新的序列分配給已知的蛋白家族或確定在序列 中存在何種已知的結(jié)構(gòu)域(Falquet 等人，2002，Nucleic Acids Res. 30,235) Prosearch 是一種可以按照給定序列模式或標志搜索SWISS-PR0T和EMBL數(shù)據(jù)庫的工具。分離多肽的方法可以使用本領(lǐng)域熟知的肽合成方法(例如使用固相技術(shù)(例如Stewart等人， 1969,in Solid-Phase Peptide Synthesis, WH Freeman Co,San Francisco California) 直接合成肽或自動化合成(例如使用AppliedBiosystems 431A肽合成儀(Foster City, California)))來制備本發(fā)明的多肽，包括變體多肽。也可以在這樣的合成中產(chǎn)生突變形式 的多肽。還可以使用本領(lǐng)域已知的各種技術(shù)(例如Deutscher，1990，Ed，Methods in Enzymology，Vol. 182，Guide to Protein Purification)從天然來源純化本發(fā)明的多Jj太和
變體多肽。或者可以在合適的宿主細胞中重組表達本發(fā)明的多肽和變體多肽并按照以下討 論從細胞中分離本發(fā)明的多肽和變體多肽。產(chǎn)生構(gòu)建體和載體的方法本發(fā)明的遺傳構(gòu)建體包含一個或多個本發(fā)明的多核苷酸序列和/或編碼本發(fā)明 的多肽的多核苷酸，可用于轉(zhuǎn)化例如細菌、真菌、昆蟲、哺乳動物或植物生物。本發(fā)明的遺傳 構(gòu)建體包括本文定義的表達構(gòu)建體。用于產(chǎn)生和使用遺傳構(gòu)建體和載體的方法是本領(lǐng)域熟知的，在Sambrook等人， Molecular Cloning :A Laboratory Manual,2nd Ed. ColdSpring Harbor Press,1987 ； Ausubel 等人，Current Protocols in MolecularBiology, Greene Publishing, 1987)中有 一般性描述。產(chǎn)生包含構(gòu)建體和載體的宿主細胞的方法本發(fā)明提供了包含本發(fā)明的遺傳構(gòu)建體或載體的宿主細胞。宿主細胞可以源自例 如細菌、真菌、昆蟲、哺乳動物或植物生物。包含本發(fā)明的遺傳構(gòu)建體(例如表達構(gòu)建體)的宿主細胞可用于本領(lǐng)域熟知的方 法(例如 Sambrook 等人，Molecular Cloning :A LaboratoryManual, 2nd Ed. Cold Spring Harbor Press, 1987 ;Ausubel 等人，CurrentProtocols in Molecular Biology, Greene Publishing, 1987)以重組產(chǎn)生本發(fā)明的多肽。這樣的方法可以包括在合適的培養(yǎng)基中 在適合于或有益于表達本發(fā)明多肽的條件下培養(yǎng)宿主細胞。然后可以通過本領(lǐng)域熟知的 方法(例如 Deutscher，Ed，1990，Methods in Enzymology, Vol 182， Guide to Protein
20Purification)將所表達的重組多肽(其可選地可以被分泌到培養(yǎng)物中)從培養(yǎng)基、宿主細 胞或培養(yǎng)基中分離出來。本發(fā)明的宿主細胞還可用于生產(chǎn)由所表達的本發(fā)明多肽產(chǎn)生的酶產(chǎn)物的方法。這 樣的方法可以包括可選地當存在用于所表達的本發(fā)明多肽的另外的酶底物時，在適合表達 本發(fā)明的重組多肽的培養(yǎng)基中培養(yǎng)本發(fā)明的宿主細胞。然后可以通過各種本領(lǐng)域標準方法 將產(chǎn)生的酶產(chǎn)物從宿主細胞或培養(yǎng)基中分離出來。產(chǎn)生包含構(gòu)建體和載體的植物細胞和植物的方法本發(fā)明還提供了包含本發(fā)明的遺傳構(gòu)建體的植物細胞和為了改變本發(fā)明的多核 苷酸或多肽的表達而修飾的植物細胞。包含這樣的細胞的植物也構(gòu)成本發(fā)明的一個方面?？梢酝ㄟ^本發(fā)明的方法產(chǎn)生具有改變的生物量的植物。這樣的方法可以包括以本 發(fā)明的構(gòu)建體(其被設(shè)計為改變能夠調(diào)節(jié)這樣的植物細胞和植物中生物量產(chǎn)生的多核苷 酸或多肽的表達)轉(zhuǎn)化植物細胞和植物。這樣的方法還包括以本發(fā)明的構(gòu)建體與一種或多 種其它構(gòu)建體(其被設(shè)計為改變能夠調(diào)節(jié)這樣的植物細胞和植物中生物量產(chǎn)生的一種或 多種多核苷酸或多肽的表達)的組合來轉(zhuǎn)化植物細胞和植物。在 Draper 等人’1988, Plant Genetic Transformation and GeneExpression. A Laboratory Manual. Blackwell Sci. Pub. Oxford, p. 365 ；Potrykus 禾口 Spangenburg, 1995, Gene Transfer to Plants. Springer-Verlag, Berlin.；禾口 Gelvin 等人，1993, Plant Molecular Biol. Manual. Kluwer Acad. Pub. Dordrecht 中描述了以多核苷酸轉(zhuǎn)化植物細 胞、植物及其部分的方法。在Galun和Breiman，1997，Transgenic Plants. ImperialCollege Press，London中提供關(guān)于轉(zhuǎn)基因植物(包括轉(zhuǎn)化技術(shù))的綜述。遺傳操作植物的方法一些遺傳操作植物的策略是可以獲得的(例如Birch，1997，AnnRev Plant Phys Plant Mol Biol，48，297)。例如，策略可被設(shè)計為在正常表達多核苷酸/多肽的植物細胞、 器官和/或特定發(fā)育階段中增加多核苷酸/多肽的表達，或者在不正常表達多核苷酸/多 肽的細胞、組織、器官和/或特定發(fā)育階段中異位表達多核苷酸/多肽。所表達的多核苷酸 /多肽可以源自待轉(zhuǎn)化的植物物種或者可以源自不同的植物物種?？梢詫⑥D(zhuǎn)化策略設(shè)計為在正常表達多核苷酸/多肽的植物細胞、組織、器官或特 定發(fā)育階段中減少多核苷酸/多肽的表達。這樣的策略被稱為基因沉默策略。轉(zhuǎn)基因植物中用于基因表達的遺傳構(gòu)建體通常包括用于驅(qū)動一個或多個克隆的 多核苷酸表達的啟動子、終止子和檢測在轉(zhuǎn)化植物中存在遺傳構(gòu)建體的選擇性標記序列。適合用于本發(fā)明的構(gòu)建體中的啟動子在單子葉植物或雙子葉植物的細胞、組織或 器官中是功能性的，包括細胞、組織和器官特異性的啟動子，細胞周期特異性啟動子，時間 啟動子，可誘導(dǎo)啟動子，在多數(shù)植物組織中有活性的組成性啟動子和重組啟動子。啟動子的 選擇將取決于所需要的克隆的多核苷酸的時間和空間的表達。啟動子可以是那些通常與目 標轉(zhuǎn)基因相連的啟動子或源自其它植物、病毒和植物病原性細菌和真菌的基因的啟動子。 本領(lǐng)域技術(shù)人員無需經(jīng)過過量實驗即能夠選擇適合用于使用包含本發(fā)明的多核苷酸序列 的遺傳構(gòu)建體而改變和調(diào)節(jié)植物特性的啟動子。組成性植物啟動子的例子包括CaMV35S啟 動子，胭脂堿合成酶啟動子和章魚堿合成酶啟動子，以及來自玉米的Ubi 1啟動子。在科技 文獻中描述了在特異性組織中有活性的，對內(nèi)部發(fā)育信號或外部非生物或生物的壓力有反應(yīng)的植物啟動子。在例如WO 02/00894 (通過引用并入本文)中描述了示例性的啟動子。通常用于植物轉(zhuǎn)化遺傳構(gòu)建體的示例性的終止子包括例如花椰菜花葉病毒 (CaMV) 35S終止子、根癌土壤桿菌(Agrobacterium tumefaciens)胭脂堿合成酶或章魚堿 合成酶終止子、玉米(Zea mays)玉米蛋白(zein)基因終止子、水稻(Oryza sativa)ADP_葡 萄糖焦磷酸化酶終止子和馬鈴薯(Solanum tuberosum)PI-II終止子。通常用于植物轉(zhuǎn)化的選擇性標記包括新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶II基因(NPT II)，其賦 予卡那霉素抗性；aadA基因，其賦予奇霉素和鏈霉素抗性；草丁膦乙酰轉(zhuǎn)移酶(bar基因)， 其賦予Ignite (AgrEvo)和Basta (Hoechst)抗性；以及潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因(hpt)，其賦 予潮霉素抗性。還考慮到可用于分析植物和植物組織中的啟動子表達的包含報告基因(其編碼 表達對于宿主來說為外源的活性(通常為酶活性和/或可見信號(例如熒光素酶、GUS、 GFP))的序列)的遺傳構(gòu)建體的使用。關(guān)于報告基因的文獻見綜述=Herrera-Estrella等 人，1993，Nature 303，209 禾口 Schrott，1995，In :Gene Transfer to Plants(Potrykus,Τ., Spangenberg. Eds)Springer Verlag. Berline, pp.325—336?；虺聊呗钥删奂诨虮旧砘蛴绊懢幋a多肽的表達的調(diào)控元件。“調(diào)控元件” 在本文中以最可能寬的意義使用且包括其它的與目標基因相互作用的基因。設(shè)計為減少本發(fā)明的多核苷酸/多肽的表達或使其沉默的遺傳構(gòu)建體可以包括 本發(fā)明的多核苷酸的反義拷貝。在這樣的構(gòu)建體中，多核苷酸被置于相對于啟動子和終止 子的反義方向。通過將多核苷酸或多核苷酸的部分倒置而獲得“反義”多核苷酸，從而所產(chǎn)生的轉(zhuǎn) 錄本將與基因的mRNA轉(zhuǎn)錄本互補，例如5，GATCTA 3，(編碼鏈)3，CTAGAT 5，(反義鏈)3，CUAGAU 5，mRNA 5，GAUCUCG 3，反義 RNA設(shè)計用于基因沉默的遺傳構(gòu)建體還可以包括反向重復(fù)?！胺聪蛑貜?fù)”是重復(fù)序列， 其中重復(fù)的后一半在互補鏈中，例如5，GATCTA.......TAGATC-3，3’ CTAGAT.......ATCTAG-5’形成的轉(zhuǎn)錄本可以進行互補性堿基配對以形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)。發(fā)夾結(jié)構(gòu)的形成通常需 要在重復(fù)區(qū)域之間有3_5pb的間隔子。另一個沉默方法包括使用靶向等同于miRNA的轉(zhuǎn)錄本的小的反義RNA(Llave等 人，2002，Science 297,2053).也明確考慮到這樣的對應(yīng)于本發(fā)明的多核苷酸的小的反義 RNA的使用。本文所用的術(shù)語遺傳構(gòu)建體還包括小的反義RNA和其它這樣的用于影響基因沉 默的多核苷酸。以本文定義的表達構(gòu)建體進行轉(zhuǎn)化還可能通過被稱為正義抑制的過程引起基因 沉默(例如 Napoli 等人，1990，Plant Cell 2,279 ；deCarvalho Niebel 等人，1995，Plant Cell，7，347)。在一些情況下，正義抑制可以包括全部或部分編碼序列的過表達，但還可以 包括基因的非編碼區(qū)域例如內(nèi)含子或5’或3’非翻譯區(qū)域(UTR)的表達?？梢允褂们逗系牟?分正義構(gòu)建體協(xié)調(diào)地使多個基因沉默(Abbott等人，2002，PlantPhysiol. 128(3) :844_53 ；
22Jones等人，1998，Planta 204:499-505)。使用這樣的正義抑制策略以使本發(fā)明的多核苷 酸的表達沉默也考慮在內(nèi)。設(shè)計用于基因沉默的遺傳構(gòu)建體中的多核苷酸插入物可以對應(yīng)于編碼序列和/ 或非編碼序列，例如啟動子和/或內(nèi)含子和/或5’或3’ UTR序列，或相應(yīng)的基因。其它的基因沉默策略包括顯性負性方法和使用核糖酶構(gòu)建體(Mclntyre，1996， Transgenic Res，5，257)0可以通過基因本身的突變或其調(diào)控元件的突變引起轉(zhuǎn)錄前沉默。這樣的突變可以 包括點突變、移框、插入、刪除和取代。以下的代表性文獻公開了可以用于遺傳轉(zhuǎn)化下列植物物種的遺傳轉(zhuǎn)化規(guī)程 水稻(Alam等人，1999，Plant Cell R印.18，572)；玉米(美國專利系列號5，177，010 和 5，981，840)；小麥(Ortiz 等人，1996，Plant CellRep. 15，1996，877)；番茄(美國 專利系列號5，159，135)；馬鈴薯(Kumar等人，1996Plant J. 9，821)；木薯(Li等人， 1996Nat. Biotechnology 14，736)；萵苣(Michelmore 等人，1987，Plant Cell Rep. 6, 439)；煙草(Horsch 等人，1985，Science 227，1229)；棉花(美國專利系列號 5，846，797 和 5，004，863)；草(美國專利號 5，187，073,6. 020，539)；薄荷(Niu 等人，1998，Plant Cell Rep. 17，165)；柑橘屬植物(Pena 等人，1995，Plant Sci. 104，183)；香菜(Krens 等 人，1997，Plant Cell Rep, 17, 39)；香蕉(美國專利系列號5，792，935)；大豆(美國專 利號 5，416，011 ；5，569，834 ；5，824，877 ；5，563，04455 和 5，968，830)；菠蘿(美國專利 系列號5，952，543)；白楊(美國專利號4，795，855)； —般性單子葉植物(美國專利號 5，591，616 和 6，037，522)；蕓苔(美國專利號 5，188，958 ；5，463，174 和 5，750，871)；苜蓿 (Weeks et al., (2008)Transgenic Research 17 :587_597 ；Samac et al. ,(2006)Methods Mol Biol, Vol 343, AgrobacteriumProtocols. 2nd edition. Totowa, NJ :Humana Press, ρ 301-311.)；和谷類(美國專利號6，074，877)。其它的物種也考慮在內(nèi)，本領(lǐng)域技術(shù)人員使 用的合適的方法和規(guī)程可以在科學(xué)文獻中獲得。本領(lǐng)域已知的幾個其它方法可以用于改變本發(fā)明的核苷酸的表達和/或改 變本發(fā)明的多肽的表達或活性，或者用于本發(fā)明的方法中。這樣的方法包括但不限于 Tilling(Till 等人，2003，Methods Mol Biol，2%，205)，所謂的“Deletagene” 技術(shù)(Li 等 人，2001，Plant Journal 27 (3)，235)以及使用人工轉(zhuǎn)錄因子，例如合成的鋅指轉(zhuǎn)錄因子 (例如Jouvenot等人，2003，Gene Therapy 10，513)。還可以在植物中表達另外的靶向特定 多肽的抗體或其片段(Jobling等人，2003，Nat. Biotechnol.，21(1)，35)。還可以使用轉(zhuǎn)座 子標簽方法?？梢酝ㄟ^一些技術(shù)例如噬菌體展示(Dyax Corporation)來鑒定與本發(fā)明的 多肽相互作用的其它多肽。這樣的相互作用的肽可以在植物中表達或者應(yīng)用到植物中以影 響本發(fā)明的多肽的活性。植物抗體(Stoger et al. ,Current Opinion in Biotechnology Volumel3, Issue 2，2002 年 4 月 1 日，Pages 161-166 ；Sudarshana et al. , MethodsMol Biol. 2007；354183-95.)也可以用于調(diào)節(jié)植物中多肽的表達或活性。被特別考慮在內(nèi)的 是，將以上方法(包括所討論的沉默方法)中的每一個用于改變本發(fā)明的核苷酸的表達和 /或本發(fā)明的多肽的表達或活性。選擇植物的方法還提供了選擇具有改變的生物量的植物的方法。這樣的方法包括測試植物中的本發(fā)明的多核苷酸或多肽的表達的改變。這樣的方法可用于年幼的年齡或早期發(fā)育階段(當 改變的生物量不是必須可見時)以加速朝向改善的生物量的育種程序。多核苷酸例如信使RNA的表達經(jīng)常被用作相應(yīng)的多肽表達的指示。示例性的測定 多核苷酸表達的方法包括但不限于Northern分析、RT-PCR和點雜交分析(Sambrook等人， Molecular Cloning :ALaboratory Manual,2nd Ed. Cold Spring Harbor Press,1987)。因 此本發(fā)明的多核苷酸或多核苷酸的部分可用作如本文定義的用于鑒定具有改變的生物量 的植物的方法的探針或引物。本發(fā)明的多肽可用作雜交實驗中的探針，或基于PCR的實驗 中的引物，其被設(shè)計為鑒定這樣的植物。或者可以產(chǎn)生針對本發(fā)明的多肽的抗體。產(chǎn)生和使用抗體的方法在本領(lǐng)域中是標 準的(參見例如Antibodies, A Laboratory Manual, Harlow A Lane, Eds, Cold Spring Harbour Laboratory, 1998) 0這樣的抗體可用于檢測調(diào)節(jié)植物中生物量的多肽的表達的 改變的方法。這樣的方法可以包括ELISA (Kemeny，1991，A Practical Guide to ELISA, NYPergamon Press)禾口 Western 分析(Towbin禾口Gordon, 1994, J ImmunoIMethods, 72, 313)。這些分析多核苷酸或多肽表達并選擇具有改變的表達的植物的方法在被設(shè)計為 產(chǎn)生具有改變的生物量的品種的常規(guī)育種程序中是有用的。植物可以種植本發(fā)明的植物并且自交或與不同植物株進行雜交，可以鑒定所產(chǎn)生的具 有需要的表型特征的雜交體?？梢苑N植兩代或兩代以上以確保主題表型特征被穩(wěn)定地保持 和遺傳。從這樣的標準育種方法產(chǎn)生的植物也構(gòu)成本發(fā)明的一個方面。期望的可以是增加或減少特定植物物種中的生物量。增加的生物量會對例如人食 物、飼用和林業(yè)作物以及裝飾植物是有利的。減少的生物量對于上述情況中的某些也可能 是期望的，例如在裝飾植物的小型化中?？梢酝ㄟ^本發(fā)明的方法改變植物中的生物量。這樣的方法可以包括以本發(fā)明的構(gòu) 建體(其被設(shè)計為改變調(diào)節(jié)這樣的植物細胞和植物中的生物量的多核苷酸或多肽的表達) 轉(zhuǎn)化植物細胞和植物。這樣的方法還包括以本發(fā)明的構(gòu)建體和一個或多個其它構(gòu)建體(其 被設(shè)計為改變調(diào)節(jié)植物中生物量的一個或多個多核苷酸或多肽的表達)的組合轉(zhuǎn)化植物 細胞和植物。在Boyes DC 等人，2001，Plant Cell. 13(7) 1499-510 ；Lancashire P.D 等人， 1991，Ann. Appl. Biol. 119 560-601和下面的實施例1中提供了用于評價本發(fā)明的植物中 生長速率和生物量的示例性方法。附圖簡述將通過參考附圖會更好地理解本發(fā)明，其中


圖1顯示了以0RF54多肽(SEQ ID NO 1)作為種子序列，對NR-植物數(shù)據(jù)庫(公 開日期2005年1月1日)進行BLAST-P搜索的輸出總結(jié)。圖2顯示了多肽(SEQ ID NO :1至9)(包括0RF54及其變體)的PrettyPlot比 對。圖3顯示了在多肽序列(SEQ ID NO :1至9)中發(fā)現(xiàn)的、稱為RCC重復(fù)的7個重復(fù) 元件的“T-C0FFEE”比對，該比對由本申請人用于鑒定存在于全部序列的每個重復(fù)中的共有 區(qū)域(SEQ ID NO 10)。
圖4顯示了用于植物轉(zhuǎn)化的載體的圖，該載體包含以相對于CaMV35S啟動子的反 義方向克隆的0RF54。載體的序列示于SEQ ID NO 20中。圖5顯示了來自0RF54T0轉(zhuǎn)基因植物的基因組DNA的DNA凝膠印跡分析，其以 HindIII消化并以0RF54編碼序列的片段探測(probe)，從而確定基因拷貝數(shù)并鑒定獨立轉(zhuǎn) 化事件。圖5a_5e顯示了在兩個單獨試驗中觀察到的相對于表現(xiàn)最好的野生型對照(日本 晴(Nipponbare))的這些0RF54T1植物系的生長參數(shù)。其中，圖5a是在實驗1中測量的植 株高度；圖5b是在實驗1中測量的植物分蘗數(shù)目；圖5c是超過表現(xiàn)最好的野生型對照(日 本晴)分蘗能力的0RF54系中的分蘗數(shù)目；圖5d是在實驗2中測量的植株高度；圖5e是來 自實驗2的分蘗數(shù)目。圖6a顯示了 0RF54植物與野生型對照(日本晴)之間的莖生物量分析。學(xué)生t_檢 驗*1樣品與日本晴之間的平均差異是高度顯著的(p-0.01)。*2樣品與日本晴之間的平 均差異是非常高度顯著的(P = 0. 001)。圖6b顯示了超過表現(xiàn)最好的野生型對照(日本晴)的干物質(zhì)產(chǎn)能的0RF54系的
干物質(zhì)產(chǎn)量。圖7顯示了 0RF54多肽及其來自單子葉物種的變體的比對。高亮表示在全部序列 中完全保守的共有序列基序(SEQ ID NO 20)的位置。圖8顯示了 0RF54多肽及其來自雙子葉物種的變體的比對。高亮表示在全部序列 中完全保守的共有序列基序(SEQ ID N0:21)的位置。圖 9 顯示轉(zhuǎn)基因黑麥草系(1V20、1V5、1V1、1V8、1V11、1V3、2V9、2V8、2V5、2V7、2V2、 3V5、3V12、3V11、3V10和3V7)相對于非轉(zhuǎn)基因?qū)φ障?T40、T41和T101)改變的生物量(以 克表示的干重)。柱上的條代表標準偏差。
實施例現(xiàn)在將通過參考以下非限制性實施例來解釋本發(fā)明。實施例1.通過在轉(zhuǎn)基因植物中下調(diào)本發(fā)明的多核苷酸來增加生物量0RF54^t ViaLactia Biosciences Ltd Ijf W W H ^ ^ (LoIium perenne) GeneThresher (Orion Genomics)基因組文庫中鑒定了編碼SEQ ID NO :1的多肽的多核苷 酸序列，將其稱為0RF54(SEQ ID NO: 10)。0RF54 變體使用0RF54多肽序列(SEQ ID NO 1)作為種子序列以進行對NR-植物數(shù)據(jù)庫(公 開日期2005年1月1日)的BLASTP搜索，從而鑒定0RF54的變體?；诒旧暾埲藢?數(shù)據(jù)庫中相關(guān)分數(shù)值和注解的評價，將小于或等于le-140的截止(cut-off)值鑒定為區(qū)分 0RF54變體。BLASTP輸出總結(jié)示于
圖1中。利用EMBOSS工具EMMA (Thompson et al 1994)，對所選擇的變體序列進行比對，該 EMMA是流行的多重比對程序ClustalW的接口。如圖2所示，利用稱為prettyplot的另一 種EMBOSS工具使比對的序列可視化。0RF54變體的多肽序列如序列表中SEQ ID NO :2至9所列。對應(yīng)的多核苷酸序列 分別如SEQ ID NO 11至18所列。
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多肽序列的分析揭示了每個多肽序列存在7個重復(fù)，該重復(fù)序列稱為RCC重復(fù)。利 用T-COFFEE比對程序(版本1. 37) (Notredame et. al2000，Higgins)對上文的來自全部多 肽(SEQ ID NO 1-9)的重復(fù)序列進行比對，結(jié)果示于圖3中。鑒定了基于并存在于來自0RF54和每個0RF54變體的全部RCC重復(fù)的多肽基序， 并示于圖3中。包含0RF54的載體將0RF54多核苷酸序列(SEQ ID NO 10)以反義方向克隆至雙35S啟動子上游，以 下調(diào)水稻中0RF54同源物的表達。通過標準分子生物學(xué)技術(shù)產(chǎn)生包含0RF54的載體。雙元 載體圖示于圖4中。載體的序列示于SEQ ID NO :19ο植物轉(zhuǎn)化_水稻通過電穿孔(denDulk-Ras A and Hooykaas PJ.)，將純化的雙元載體(SEQ ID NO 19)導(dǎo)入土壤桿菌(Agrobacterium)菌株EHA105，并將懸浮液在26 °C下孵育30分 鐘。將一小等份平板接種于含有100mg/L卡那霉素的AB最小培養(yǎng)基(minimal medium) (Schmidt-Eisenlohr等人1999)。在26°C將平板孵育3天，使用構(gòu)建體特異性引物測試單 克隆中質(zhì)粒的存在，并確認轉(zhuǎn)化。使土壤桿菌培養(yǎng)物在26°C下生長于含有100mg/L卡那霉素的AG最小培養(yǎng)基中， 200rpm振搖。在5，OOOrpm沉淀土壤桿菌懸浮液5分鐘，在含有1 %葡萄糖和3%蔗糖的基 礎(chǔ)MS培養(yǎng)基(pH為5. 2)中洗滌一次，并重懸于含有200 μ M乙酰丁香酮的相同培養(yǎng)基中至 0D6000. 6-0. 8。使用含有雙元載體0RF54的根癌土壤桿菌(A. tumefaciens)共培養(yǎng)至少1，000 個未成熟水稻(水稻(Oryza sativa))栽培種日本晴胚。在無菌水中洗滌來自水稻的未 成熟種子，然后以含有1.25%活性氯的次氯化鈉和lOyLTween 20進行表面滅菌20分 鐘。滅菌后，以無菌水將種子洗滌幾次，并在無菌濾紙(3M)上吸干。使用一對無菌鉗將種 子人工去殼，以無菌刀剖開胚。將分離的胚浸沒于IOmL培養(yǎng)管中的土壤桿菌懸浮液中，在 IOOrpm持續(xù)振搖30分鐘。排掉多余液體，將胚在無菌濾紙上吸干，然后將其置于含MS培 養(yǎng)基(Murashige 和 Skoog, 1964)(添加了 3%蔗糖、1 %葡萄糖、2mg/L 2，4_D、0. lmg/L ΒΑ、 400μΜ乙酰丁香酮)的共培養(yǎng)培養(yǎng)基(ρΗ*5.2)中，暗下培養(yǎng)4天。共培養(yǎng)后，將形成愈 傷組織的胚每兩周一次在選擇性培養(yǎng)基上傳代培養(yǎng)，直至達到至少30個顯示指示健康出 芽的綠色斑點的健康愈傷組織，所述選擇培養(yǎng)基由添加了 3%蔗糖、葡萄糖、2mg/L 2， 4-D(2，4- 二氯苯氧基乙酸)、0. lmg/L BA(芐基腺嘌呤)的MS培養(yǎng)基組成，并含有50mg/L 潮霉素和300mg/L特美汀TM (替卡西林+克拉維酸)。將含有綠色斑點的愈傷組織轉(zhuǎn)移至 不含2，4-D的選擇性培養(yǎng)基以再生最少10個轉(zhuǎn)化植株。使再生的植物生根，然后移植到6 英寸含有土壤的罐子中，使植物在溫室中生長。通過用HindIII消化來自轉(zhuǎn)基因植物的基 因組DNA，并用0RF54編碼序列的片段進行探測，來進行DNA凝膠印跡分析(圖5)，以確定 基因拷貝數(shù)并鑒定5個獨立轉(zhuǎn)化事件。從轉(zhuǎn)化的植物(TO)中收獲Tl種子。Tl植物表型分型將來自Southern陽性TO植物的30粒種子種植于單個的含有椰糠的杯子中，將其 中的20個健康植物移植到溫室。利用CRD以來自隨機數(shù)字表的隨機數(shù)字排列這些植物。在兩個單獨的實驗中進行Tl植物表型分型。第一個實驗包括來自TO事件1129503和123602及日本晴(野生型對照)的子代系，第二個實驗包括來自TO事件1164906、 1164914和1164922及日本晴(野生型對照)的子代系。Tl系的表型分析移植后每周測量一次植株高度和分蘗數(shù)目，直至達到結(jié)籽。圖5a、圖5b、圖5c、圖 5d和圖5e描述了在兩個單獨的實驗中觀察到的這些植物的生長參數(shù)。轉(zhuǎn)基因0RF54植物 (Tl)的植株高度沒有表現(xiàn)出與野生型對照(日本晴)太大的差異(圖5a和圖5d)。然而， 0RF54植物(Tl)的分蘗能力顯得比野生型對照(日本晴)更高(圖5b和圖5e)。更仔細 的分析揭示，12. 5%的0RF54T1植物勝過分蘗最好的野生型對照植物(圖5c)，并且分蘗數(shù) 目超過兩倍。因此，由0RF54植物(Tl)的干物質(zhì)產(chǎn)生所測量的生物量也增加了(圖6a)。 與野生型對照(日本晴)相比，生物量平均增加約66%。再次觀察到12. 5%的0RF54T1植 物群體產(chǎn)生比干物質(zhì)產(chǎn)量最高的野生型對照(日本晴)更多的干物質(zhì)(圖6b)?？傊?，通過 反義或類似技術(shù)的植物中0RF54基因表達或0RF54變體的基因表達的下調(diào)導(dǎo)致增加的植物 生物量。植物轉(zhuǎn)化_黑麥草基本上如Bajaj 等人(Plant Cell R印orts，2006，25 :651_659)所述，對多年生黑 麥草(黑麥草栽培種英派克(Lolium perenne L. cv. Impact))進行轉(zhuǎn)化。將源自所選黑麥 草系分蘗的分生組織區(qū)的胚胎形成愈傷組織和攜帶修飾的雙元載體(0RF54，圖4)的根癌 土壤桿菌菌株EHAlOl用于轉(zhuǎn)化實驗。將胚胎形成愈傷組織浸沒在過夜生長的土壤桿菌培 養(yǎng)物中30分鐘，并持續(xù)振搖。將它們在共培養(yǎng)培養(yǎng)基上傳代培養(yǎng)4周后，選擇對潮霉素具 有抗性的愈傷組織。選擇后，將抗性愈傷組織每兩周在再生培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)，直至植物再 生。兩輪或三輪選擇后繼續(xù)生長的再生物(regenerant)被證明為穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化體。然后，將 每個再生的植株在維持培養(yǎng)基(maintenance medium)中倍增，以產(chǎn)生克隆小植株(clonal plantlet)，隨后使其在不含激素的MS培養(yǎng)基中生根。將來自每個克隆的生根植物轉(zhuǎn)移至 受控溫室(contained glasshouse)條件下，而保留組織培養(yǎng)中的克隆對應(yīng)物作為備份。在 氣候控制環(huán)境實驗室中分析了 18個獨立的轉(zhuǎn)基因系(1V1、1V3、1V5、1V8、1V10、1V11、1V20、 2V2、2V4、2V5、2V7、2V8、2V9、3V5、3V7、3V10、3V11、3V12)和它們的非轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩参?分別 是T40、T41和T101)，其中在全水條件(fully water condition)下評價它們的生物量產(chǎn) 生。在生長室中篩選增加的生物量利用長度為500mm、直徑為90mm的塑料雨水管來建立植物生長系統(tǒng)。將管置于移 動托架上，并通過繩索和金屬框架在側(cè)面進行支持。將管在底部用石棉塞住，并用洗過的灰 泥用砂逐漸填充，其用水實現(xiàn)均勻包裝。在每個管的開口端的中心種植一叢多年生黑麥草 (5分蘗)。將來自每個事件的植物在三個管中重復(fù)種植。將植物隨機排列，三重復(fù)中每一 取一個，并使其在70%的相對濕度、16/8小時的晝/夜循環(huán)和650 μ mol. m_2. s—1的光照強度 下生長。每天早晨向植物一次澆灌50mL荷格倫特溶液(Hoagland’s solution) (Hoagland and Arnon, 1938)，并在下午再澆灌50mL淡水。開始使植物適應(yīng)20天，然后將植物修剪回 15cm的高度。允許所有的植物在接下來的14天從修剪恢復(fù)。分別從計時日起的7天和14 天后，記錄植物分蘗數(shù)目。14天后，將植物修剪回15cm的高度。將收獲的樣品在60°C下干 燥3天，然后記錄干重。允許植物在全水條件下再生長14天。再次將植物修剪回15cm的
27高度，然后在將樣品在60°C干燥3天后，記錄修剪的樣品的干重。允許植物再生長13天，并 通過收獲高于15cm的植物并將樣品在60°C干燥3天來記錄生物量產(chǎn)生(干物質(zhì))的最終 數(shù)據(jù)。在每個收獲中，大于四分之一的測試的轉(zhuǎn)基因事件產(chǎn)生了比野生型植物更多的生 物量。當在3次收獲的時間段內(nèi)確定累積生長時，轉(zhuǎn)基因系之一的3V7產(chǎn)生大于470%的生 物量；而在4個其它系2V2、2V7和3V10中，生物量增加的范圍從大于35%至95% (參見圖 9)。上文的實施例示例了本發(fā)明的實施。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當理解，可以進行眾多變 化和修飾而不偏離本發(fā)明的精神和范圍。參考文獻Adams et al. 1991，Science 252 :1651_1656.Chen H, Nelson RS, Sherwood JL. (1994)Biotechniques ； 16 (4) 664-8,670.Chen et al. 2002，Nucleic Acids Res. 31 :101_105den Dulk-Ras A, Hooykaas PJ. (1995)Methods Mol Biol. ；55 63-72.Lee et al. 2003，PNAS 99:12257-12262Lee and Lee,2003Plant Physiol. 132 :517_529Murashige T，Skoog F (1962)Physiol Plant 15 473-497Notredame C. , Higgins, D. and Heringa, J. (2000) J. Mol. Biol.，302，205—217.Richmond and Somerville 2000, Current Opinion in Plant Biology.3 108-116Ruan et al. 2004, Trends in Biotechnology 22:23—30.Schmidt-Eisenlohr H, Domke N, Angerer C, Wanner G, ZambryskiPC, Baron C. (1999) J. Bacteriol. ； 181 (24) :7485_92·Sun et al. 2004，BMC Genomics 5 :1. 1-1. 4Thompson, J. D.，Higgins, D. G. and Gibson, T. J. (1994) CAB I OS, 10，19-29.Velculescu et al. 1995，Science 270 484-487上文的實施例示例了本發(fā)明的實施。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當理解，可以進行眾多變 化和修飾而不偏離本發(fā)明的精神和范圍。序列小結(jié)
權(quán)利要求
產(chǎn)生具有改變的生物量的植物的方法，所述方法包括使用下列多核苷酸來轉(zhuǎn)化植物細胞或植物a)多核苷酸，其包含編碼具有SEQ ID NO1的氨基酸序列的多肽或所述多肽的變體的序列；或b)多核苷酸，其包含a)中的多核苷酸的長度為至少15個核苷酸的片段，或c)多核苷酸，其包含a)中的多核苷酸的長度為至少15個核苷酸的互補物；或d)多核苷酸，其包含能夠在嚴緊條件下與a)中的多核苷酸雜交的長度為至少15個核苷酸的序列。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述變體與具有SEQID NO :1的氨基酸序列的多肽 具有至少70%的序列同一性。
3.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其中所述變體包含SEQID NO 20的氨基酸序列。
4.如權(quán)利要求1至3中任一權(quán)利要求所述的方法，其中所述變體包含SEQID NO :21的氨基酸序列。
5.如權(quán)利要求1至4中任一權(quán)利要求所述的方法，其中所述多核苷酸包含編碼具有SEQ ID NO 1的氨基酸序列的多肽的序列。
6.如權(quán)利要求1至5中任一權(quán)利要求所述的方法，其中所述多核苷酸在所述植物中的 表達導(dǎo)致所述植物中能夠調(diào)節(jié)生物量產(chǎn)生的內(nèi)源多核苷酸或多肽的下調(diào)。
7.如權(quán)利要求1至6中任一權(quán)利要求所述的方法，其中所產(chǎn)生的植物相對于合適對照 植物具有增加的生物量。
8.產(chǎn)生具有增加的生物量的植物的方法，所述方法包括使用與編碼具有SEQID NO 1 的序列的多肽或其變體的內(nèi)源核酸具有足夠序列相似性的多核苷酸來轉(zhuǎn)化植物，以致所述 多核苷酸的表達導(dǎo)致所述內(nèi)源核酸表達的抑制。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，其中所述變體與具有SEQID N0:1的氨基酸序列的多肽 具有至少70%的序列同一性。
10.如權(quán)利要求8或9所述的方法，其中所述變體包含SEQID NO 20的氨基酸序列。
11.如權(quán)利要求8至10中任一權(quán)利要求所述的方法，其中所述變體包含SEQID NO 21 的氨基酸序列。
12.如權(quán)利要求8至10中任一權(quán)利要求所述的方法，其中所述核酸編碼具有SEQID NO 1的序列的多肽。
13.產(chǎn)生具有改變的生物量的植物的方法，所述方法包括轉(zhuǎn)化植物細胞或植物，所述轉(zhuǎn) 化使用a)包含SEQID NO :10的核苷酸序列的多核苷酸或其變體，其中所述變體編碼能夠調(diào) 節(jié)植物生物量的多肽；或b)多核苷酸，其包含a)中的多核苷酸的長度為至少15個核苷酸的片段；或c)多核苷酸，其包含a)中的多核苷酸的長度為至少15個核苷酸的互補物；或d)多核苷酸，其包含能夠在嚴緊條件下與a)中的多核苷酸雜交的長度為至少15個核 苷酸的序列。
14.如權(quán)利要求13所述的方法，其中所述a)中的多核苷酸包含SEQID N0:10的序列。
15.如權(quán)利要求13或14所述的方法，其中所述多核苷酸在所述植物中的表達導(dǎo)致所述植物中能夠調(diào)節(jié)生物量產(chǎn)生的內(nèi)源多核苷酸或多肽的下調(diào)。
16.如權(quán)利要求13至15中任一權(quán)利要求所述的方法，其中通過所述方法產(chǎn)生的植物相 對于合適對照植物具有增加的生物量。
17.產(chǎn)生具有增加的生物量的植物的方法，所述方法包括使用與具有SEQID N0:10的 序列的內(nèi)源核酸或其變體具有足夠序列相似性的多核苷酸來轉(zhuǎn)化植物細胞或植物，以致所 述多核苷酸的表達導(dǎo)致所述內(nèi)源核酸表達的抑制。
18.如權(quán)利要求17所述的方法，其中所述變體與SEQID NO :10的序列具有至少70% 的序列同一性。
19.如權(quán)利要求17或18所述的方法，其中所述變體編碼包含SEQIDNO :20的氨基酸 序列的多肽。
20.如權(quán)利要求17或18所述的方法，其中所述變體編碼包含SEQIDNO 21的氨基酸 序列的多肽。
21.如權(quán)利要求17至20中任一權(quán)利要求所述的方法，其中所述內(nèi)源核酸包含SEQID NO 10的序列。
22.產(chǎn)生具有改變的生物量的植物的方法，所述方法包括減少植物細胞或植物中包含 SEQ ID NO :20的序列的多肽的表達或活性的步驟。
23.如權(quán)利要求22所述的方法，其中所述多肽包含SEQID N0:21的序列。
24.如權(quán)利要求22或23所述的方法，其中所述多肽包含與SEQIDNO 1的序列具有至 少70%同一性的序列。
25.如權(quán)利要求22或23所述的方法，其中所述多肽包含SEQIDNO 1的序列。
26.如權(quán)利要求22至25中任一權(quán)利要求所述的方法，其中將能夠在嚴緊條件下與編碼 所述多肽的內(nèi)源核酸雜交的多核苷酸導(dǎo)入所述植物細胞或植物以實現(xiàn)所述多肽的減少的 表達。
27.如權(quán)利要求26所述的方法，其中所述內(nèi)源核酸包含與SEQIDNO 10的全長編碼序 列具有至少70%同一性的序列。
28.如權(quán)利要求26所述的方法，其中所述內(nèi)源核酸包含SEQIDN0:10的全長編碼序列。
29.如權(quán)利要求26所述的方法，其中所述多核苷酸包含與SEQIDN0:10的序列具有至 少70%同一性的序列的至少15個相鄰核苷酸。
30.如權(quán)利要求26所述的方法，其中所述多核苷酸包含SEQIDNO 10的至少15個相 鄰核苷酸。
31.植物，其通過權(quán)利要求1至30中任一權(quán)利要求所述的方法產(chǎn)生。
32.如權(quán)利要求31所述的植物，其中通過所述方法產(chǎn)生的植物相對于合適對照植物具 有增加的生物量產(chǎn)生。
33.如權(quán)利要求31或32所述的植物，其中通過所述方法產(chǎn)生的植物相對于合適對照植 物具有增加數(shù)目的分蘗。
34.分離的多核苷酸，其與編碼包含SEQID NO :1的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列 具有至少71 %的序列同一性，其中所述多核苷酸編碼能夠調(diào)節(jié)植物生物量的多肽。
35.如權(quán)利要求34所述的分離的多核苷酸，其中所述核苷酸序列編碼包含SEQID NO 1的氨基酸序列的多肽。
36.如權(quán)利要求34或35所述的分離的多核苷酸，其中所述核苷酸序列包含SEQID NO 10的序列。
37.如權(quán)利要求34至35中任一權(quán)利要求所述的分離的多核苷酸，其中所述核苷酸序列 包含SEQ ID NO 10的全長編碼序列。
38.包含SEQID NO :10的序列或其變體的分離的多核苷酸，其中所述變體源自黑麥草 或羊茅，并且編碼能夠調(diào)節(jié)植物生物量的多肽。
39.如權(quán)利要求38所述的分離的多核苷酸，其中所述變體與SEQIDN0:10的序列具有 至少70%的序列同一性。
40.如權(quán)利要求38所述的分離的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含SEQID NO :10的 全長編碼序列。
41.分離的多肽，其與SEQID NO :1的氨基酸序列具有至少90%的序列同一性，其中所 述多肽能夠調(diào)節(jié)植物生物量。
42.如權(quán)利要求41所述的分離的多肽，其包含SEQID NO=I的氨基酸序列。
43.分離的多核苷酸，其編碼權(quán)利要求41或42所述的多肽。
44.分離的多核苷酸，其包含a)多核苷酸，其包含權(quán)利要求34至40中任一權(quán)利要求所述的多核苷酸的長度為至少 15個核苷酸的片段；或b)多核苷酸，其包含權(quán)利要求34至40中任一權(quán)利要求所述的多核苷酸的長度為至少 15個核苷酸的互補物；或c)多核苷酸，其包含能夠與權(quán)利要求34至40中任一權(quán)利要求所述的多核苷酸雜交的 長度為至少15個核苷酸的序列。
45.遺傳構(gòu)建體，其包含權(quán)利要求34至40、43和44中任一權(quán)利要求所述的多核苷酸。
46.如權(quán)利要求43所述的遺傳構(gòu)建體，其中所述遺傳構(gòu)建體是表達構(gòu)建體。
47.宿主細胞，其經(jīng)遺傳修飾以表達權(quán)利要求34至40、43和44中任一權(quán)利要求所述的 多核苷酸或者權(quán)利要求41或42所述的多肽。
48.宿主細胞，其包含權(quán)利要求45或46所述的遺傳構(gòu)建體。
49.植物細胞，其經(jīng)遺傳修飾以表達權(quán)利要求34至40、43或44中任一權(quán)利要求所述的 多核苷酸或者權(quán)利要求41或42所述的多肽。
50.植物細胞，其包含權(quán)利要求45或46所述的遺傳構(gòu)建體。
51.植物，其包含權(quán)利要求49或50所述的植物細胞。
52.選擇具有改變的生物量的植物的方法，所述方法包括測試植物的權(quán)利要求34至 40、43或44中任一權(quán)利要求所述的多核苷酸或者權(quán)利要求41或42所述的多肽的改變的表達。
53.植物組或植物群體，其通過權(quán)利要求52所述的方法選擇。
54.抗體，其針對權(quán)利要求41或42所述的多肽而產(chǎn)生。
全文摘要
本發(fā)明提供了產(chǎn)生具有改變的生物量的植物的方法和組合物，該方法包括改變植物細胞或植物中包含SEQ ID NO1的序列的多肽或其變體的表達和/或活性的步驟。本發(fā)明還提供了包含SEQ ID NO1的序列的多肽及該序列變體片段。本發(fā)明還提供了編碼這類多肽序列的多核苷酸。本發(fā)明還提供了包含這類多核苷酸的構(gòu)建體、細胞和植物。
文檔編號A01H5/00GK101938897SQ200880125634
公開日2011年1月5日 申請日期2008年11月26日 優(yōu)先權(quán)日2007年11月27日
發(fā)明者喬納森·羅伯特·菲利普斯, 克勞蒂亞·珍妮特·斯密斯-埃斯皮諾薩, 凱瑟琳·簡·布賴恩特, 希爾蘭·邁克爾·埃爾博拉夫, 瑪格麗特·比斯瓦斯, 薩特希施·普特希格 申請人:方塔拉合作集團有限公司