專利名稱：一種制備防治大豆根腐病的復(fù)合菌劑的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)科技領(lǐng)域，具體的說是一種制備防治大豆根腐病的復(fù)合菌劑 的方法。
背景技術(shù)：
大豆根腐病是一種分布廣、危害嚴(yán)重、病原菌種類繁多和防治較困難的世界性病 害。大豆根腐病在中國(guó)主要分布于北方春大豆和南方黃淮夏大豆生產(chǎn)區(qū)，其中尤其以黑龍 江東北部地區(qū)發(fā)生嚴(yán)重。大豆根腐病主要危害大豆根系、影響作物對(duì)水分和養(yǎng)分的吸收。此 病的發(fā)生可以使大豆植株的根重、根瘤重、固氮酶活性以及側(cè)根數(shù)均受到不同程度的影響。 據(jù)調(diào)查該病一般減產(chǎn)10-30%，嚴(yán)重時(shí)可達(dá)60% -90%，甚至絕產(chǎn)，而且使大豆含油量明顯 下降。大豆根腐病的病原菌種類繁多，主要為鐮刀菌(Fusarium spp.)、立枯絲核菌 (Rhizoctonia Solani)、腐霄菌(Pythium spp.)禾口疫霄菌(Phytophthora spp.)等，其中 鐮刀菌為優(yōu)勢(shì)菌，病害最為普遍，隨種子發(fā)芽侵染率逐漸提高，危害大豆時(shí)，根部從根尖開 始變色，呈水浸狀，主根下半部顯現(xiàn)出褐色條紋，以后逐漸擴(kuò)大，表皮及皮層變黑腐爛，嚴(yán)重 時(shí)主根下半部爛掉。葉片由下而上逐漸變黃，植株矮化，結(jié)瘤少，嚴(yán)重時(shí)植株死亡，危害非常 嚴(yán)重。當(dāng)?shù)乜旆e水時(shí)，腐霉菌和疫霉菌病害較重。目前，對(duì)該病的防治，除了一些農(nóng)耕措施(如與禾本科作物合理輪作，適時(shí)晚播、 淺播，選用和培育抗病種等)之外，主要是化學(xué)藥劑的防治，如多菌靈、福美雙、多克福、適 時(shí)樂等，藥劑拌種雖然可推遲侵染期，但是一般的大豆藥劑防治根腐病時(shí)間短，藥效差，因 為根腐病一般會(huì)持續(xù)兩個(gè)月左右，而一般的藥劑有效期只有一個(gè)月左右，后期病原菌還會(huì) 侵染大豆，而且長(zhǎng)期使用化學(xué)藥劑，病原菌會(huì)產(chǎn)生抗性變種，使防治難度加大。利用生物制劑來(lái)防治根腐病是目前的研究熱點(diǎn)，因?yàn)樯镏苿┑尼槍?duì)性強(qiáng)，無(wú)污 染，有效期長(zhǎng)。利用對(duì)病原真菌的拮抗作用篩選生防細(xì)菌，是生防菌劑的有效出路，但是生 防菌劑一直存在定植難，活性低，對(duì)根部病原菌針對(duì)性不強(qiáng)等特點(diǎn)，限制了發(fā)展。目前用的 比較好的大豆根腐病生防菌劑，主要是生物制劑埃坶泌(一種放線菌顆粒劑)，防治鐮刀菌 和紫青霉菌；還有淡紫擬青霉菌劑其分泌物對(duì)鐮刀菌有抑制作用，但有效的生防細(xì)菌菌 劑還很少報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于提供一種制備防治大豆根腐病的復(fù)合菌劑的方法。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為取土壤菌懸液，其為田間大豆根際土 壤，分別利用King’ B培養(yǎng)基和80°C水浴IOmin后涂牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的方法特異性篩 選假單胞菌(Pseudomonas spp.)和芽孢桿菌(Bacillus spp.)，待用；另采集大豆根腐病 病株根，利用馬丁培養(yǎng)基分離病原真菌；采用PDA平板牛津杯對(duì)峙的方法，將上述特異性篩 選的假單胞菌和芽孢桿菌中復(fù)篩出具有高效抑制所篩選的病原真菌活性的菌株，分別發(fā)酵處理后復(fù)配即可得到防治大豆根腐病的復(fù)合菌劑。所述King’B培養(yǎng)基組分為示蛋白胨20g，磷酸二氫鉀1. 2g，七水硫酸鎂1. 5g，甘 油10ml，瓊脂15g，蒸餾水1000ml, pH = 7. 4-7. 6，混合后滅菌，滅菌后加入0. 22um濾膜過 濾除菌的氨芐青霉素，氯霉素和放線菌酮。所述氨芐青霉素用無(wú)菌水溶解濃度為40ug/ml ； 氯霉素用95%乙醇溶解濃度為13ug/ml ；放線菌酮用丙酮溶解濃度為lOOug/ml。所述牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基組分為牛肉膏5g，蛋白胨10g，氯化鈉5g，瓊脂15g，蒸 餾水1000ml，pH = 7. 0-7. 2。土壤懸液在80°C水浴鍋中溫浴10分鐘，再稀釋涂平板。土壤 懸液在80°C水浴鍋中溫浴10分鐘，再稀釋涂平板。所述的馬丁培養(yǎng)基的配方為葡萄糖10g，蛋白胨5g，磷酸二氫鉀lg，硫酸鎂0.5g， 0.1 %孟加拉紅溶液3. 3ml，瓊脂20g，蒸餾水IOOOml，pH自然。滅菌后加入80 %的乳酸2ml。所述采用牛津杯平板對(duì)峙的方法中所用的固體PDA培養(yǎng)基配方如下削皮土豆 200g，蔗糖20g，蒸餾水1000ml，pH自然。土豆切成小塊兒，加入蒸餾水煮沸20min，過濾，濾 液加入蔗糖，定容到1000ml，加入20g瓊脂，115°C高壓滅菌30min。PDA平板牛津杯對(duì)峙的方法，在土豆汁固體平板中央接種直徑8mm的病原真菌菌 絲塊，在距菌絲塊3cm的位置放置火焰上灼燒后的牛津杯，或者菌絲塊培養(yǎng)1天后，再放置 牛津杯，牛津杯中加入各待用假單胞菌或芽孢桿菌的培養(yǎng)產(chǎn)物，培養(yǎng)2-3天后，檢測(cè)各菌的 抑菌率。將經(jīng)復(fù)篩出的假單胞菌和芽孢桿菌分別混合發(fā)酵，假單胞菌屬的混合菌株在未 加抗生素的上述King’ B培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)；芽孢桿菌屬的混合菌株在牛肉膏蛋白胨培 養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)基；待兩個(gè)屬的菌體數(shù)量都達(dá)到10億個(gè)/ml以上，分別用質(zhì)量比 2:8-1: 9麥麩和草炭土在40-50°C下吸附風(fēng)干并粉碎，然后以質(zhì)量比3 7-5 5的比 例混合，制成固體菌劑；或分別將兩個(gè)屬的發(fā)酵菌液都濃縮為原體積的1/2，然后按體積比 3:7-5: 5的比例混合，無(wú)菌包裝制成液體菌劑。假單胞菌發(fā)酵罐的條件為；無(wú)菌空氣的通氣量為1 0.8-1，攪拌速度為180-200 轉(zhuǎn)/min，培養(yǎng)溫度為28-30°C，培養(yǎng)時(shí)間為20_30h ；而芽孢桿菌的發(fā)酵條件為無(wú)菌空氣 的通氣量為1 0.8-1，攪拌速度為180-200轉(zhuǎn)/min，培養(yǎng)溫度為28-30°C，培養(yǎng)時(shí)間為 40-60h，有利于形成芽孢。本發(fā)明所具有的優(yōu)點(diǎn)1.本發(fā)明從原位根際篩選以大豆根際為底物的防治大豆根腐病的降解菌，其在大 豆根際的定植能力較強(qiáng)，能有效保護(hù)大豆根際免受病原真菌的侵染。2.本發(fā)明根據(jù)微生物拮抗的原理，利用抗性微生物來(lái)控制根腐病的病原真菌，針 對(duì)性強(qiáng)，抗病周期長(zhǎng)，而且綠色環(huán)保。3.本發(fā)明篩選的方法其利用大豆根際生防混合細(xì)菌，有效提高生物活性和防治范 圍，并且其來(lái)源為健康大豆根際，多為大豆益生菌，而且能夠在大豆根際有效定殖，增強(qiáng)了 菌劑的利用率。5.假單胞菌能夠分泌2，4_ 二乙酰基間苯三酚，吩嗪羧酸，硝吡咯菌素，藤黃綠濃 菌素等抗生素類或其他活性物質(zhì)，在防治土傳真菌病害方面有重要貢獻(xiàn)。芽孢桿菌能夠分 泌雙效菌素等活性物質(zhì)能有效抑制鐮刀菌等病害真菌，所以本發(fā)明篩選這兩類細(xì)菌作為復(fù) 合菌劑的菌種，這樣既能防治大豆根腐病，又能解決定植問題。以期達(dá)到很好的生防根腐病病害的效果。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1采集田間健康大豆根際土壤(黑龍江省佳木斯市撫遠(yuǎn)縣大豆田)，IOg 土加入90ml 蒸餾水稀釋成菌懸液，利用King’B固體培養(yǎng)基，培養(yǎng)基滅菌后加入0. 22um濾膜過濾除菌的 氨芐青霉素(40ug/ml，無(wú)菌水溶解)，氯霉素(13ug/ml 95%乙醇溶解)，放線菌酮(IOOug/ ml丙酮溶解)，特異性篩選假單胞菌(Pseudomonas spp.)；上述土樣稀釋后的菌懸液在80°C水浴鍋內(nèi)溫浴lOmin，然后利用牛肉膏蛋白胨固 體培養(yǎng)基篩選芽孢桿菌(Bacillus spp.)。采集田間大豆根腐病病株根(黑龍江省佳木斯市撫遠(yuǎn)縣大豆田)，實(shí)驗(yàn)室破碎組 織，用馬丁培養(yǎng)基(滅菌后加入2ml乳酸，抑制細(xì)菌和放線菌的生長(zhǎng))分離病原真菌主要為 尖孢鐮刀菌(Fusarium oxysporum)、禾谷鐮刀菌(Fusarium graminearum)禾口立枯絲核菌 (RhizoctoniaSolani)，待用。采用土豆汁(PDA)平板牛津杯對(duì)峙的方法，即將上述篩選的病原真菌分別在PDA 固體培養(yǎng)基上接種培養(yǎng)3天后，用滅菌的打孔器在菌絲邊緣打出直徑8mm的菌絲塊，備用； 在新的PDA固體平板中央分別接種菌絲塊，培養(yǎng)1天后，在距菌絲塊3cm的位置放置牛津杯 (在火焰上灼燒5s左右，再放置)，牛津杯中分別加入各假單胞菌或芽孢桿菌的培養(yǎng)產(chǎn)物， 培養(yǎng)2天后，檢測(cè)各菌的抑菌率。擬陽(yáng)性對(duì)照的抑菌率為100 %，陰性對(duì)照的抑菌率為O，
膨腦的抑菌率、二的菌二 χ蘭篩選出具有高效抑制所篩選的病原真菌活性的36株假單胞菌和21株芽孢桿 菌，假單胞菌和芽孢桿菌分別混合發(fā)酵，假單胞菌發(fā)酵罐的條件為無(wú)菌空氣的通氣量為 1 0.8，攪拌速度為180轉(zhuǎn)/min，培養(yǎng)溫度為28°C，培養(yǎng)時(shí)間為30h;而芽孢桿菌的發(fā)酵條 件為無(wú)菌空氣的通氣量為1 0.8，攪拌速度為180轉(zhuǎn)/min，培養(yǎng)溫度為28°C，培養(yǎng)時(shí)間 為60h，顯微鏡下觀察大部分形成芽孢。發(fā)酵結(jié)束后，兩個(gè)屬的菌體數(shù)量都達(dá)到10億個(gè)/ml 以上，分別用麥麩和草炭土(質(zhì)量比2 8)在45°C下吸附風(fēng)干并粉碎，然后兩個(gè)屬以質(zhì)量 比3 7的比例混合，制成固體菌劑；或分別將兩個(gè)屬的發(fā)酵菌液濃縮為原體積的1/2，然 后按體積比3 7的比例混合，無(wú)菌包裝制成液體菌劑。實(shí)施例2采集田間健康大豆根際土壤(黑龍江省佳木斯市撫遠(yuǎn)縣大豆田)，IOg 土加入90ml 蒸餾水稀釋成菌懸液，利用King’B固體培養(yǎng)基，培養(yǎng)基滅菌后加入0. 22um濾膜過濾除菌的 氨芐青霉素(40ug/ml，無(wú)菌水溶解)，氯霉素(13ug/ml 95%乙醇溶解)，放線菌酮(IOOug/ ml丙酮溶解)，特異性篩選假單胞菌(Pseudomonas spp)；上述土樣稀釋后的菌懸液在80°C水浴 鍋內(nèi)溫浴lOmin，然后利用牛肉膏蛋白胨固 體培養(yǎng)基篩選芽孢桿菌(Bacillus spp.)。采集田間大豆根腐病病株根(黑龍江省佳木斯市撫遠(yuǎn)縣大豆田)，實(shí)驗(yàn)室破碎組織，用馬丁培養(yǎng)基(滅菌后加入2ml乳酸，抑制細(xì)菌和放線菌的生長(zhǎng))分離病原真菌主要為 尖孢鐮刀菌(Fusarium oxysporum)、禾谷鐮刀菌(Fusarium graminearum)禾口立枯絲核菌 (RhizoctoniaSolani)，待用。采用土豆汁(PDA)平板牛津杯對(duì)峙的方法，即將上述篩選的病原真菌分別在PDA 固體培養(yǎng)基上接種培養(yǎng)3天后，用滅菌的打孔器在菌絲邊緣打出直徑8mm的菌絲塊，備用； 在新的PDA固體平板中央分別接種菌絲塊，在距菌絲塊3cm的位置放置牛津杯(在火焰上 灼燒5s左右，再放置)，牛津杯中分別加入各假單胞菌或芽孢桿菌的培養(yǎng)產(chǎn)物，培養(yǎng)3天后， 檢測(cè)各菌的抑菌率。擬陽(yáng)性對(duì)照的抑菌率為100 %，陰性對(duì)照的抑菌率為0，
#得抗性菌的抑菌率=二二二纏篩選出具有高效抑制所篩選的病原真菌活性的36株假單胞菌和21株芽孢桿 菌，假單胞菌和芽孢桿菌分別混合發(fā)酵，假單胞菌發(fā)酵罐的條件為無(wú)菌空氣的通氣量為 1 0.8，攪拌速度為180轉(zhuǎn)/min，培養(yǎng)溫度為28°C，培養(yǎng)時(shí)間為30h;而芽孢桿菌的發(fā)酵條 件為無(wú)菌空氣的通氣量為1 0.8，攪拌速度為180轉(zhuǎn)/min，培養(yǎng)溫度為28°C，培養(yǎng)時(shí)間為 60h，顯微鏡小觀察大部分形成芽孢。發(fā)酵結(jié)束后，兩個(gè)屬的菌體數(shù)量都達(dá)到10億個(gè)/ml以 上，分別用麥麩和草炭土(質(zhì)量比1 9)在50°C下吸附風(fēng)干并粉碎，然后以質(zhì)量比5 5 的比例混合，制成固體菌劑；或分別將兩個(gè)屬的發(fā)酵菌液濃縮為原體積的1/2，然后按體積 比5 5的比例混合，無(wú)菌包裝制成液體菌劑。實(shí)施例3采集田間健康大豆根際土壤(黑龍江省佳木斯市撫遠(yuǎn)縣大豆田)，10g土加入90ml 蒸餾水稀釋成菌懸液，利用King’B固體培養(yǎng)基，培養(yǎng)基滅菌后加入0. 22um濾膜過濾除菌的 氨芐青霉素(40ug/ml，無(wú)菌水溶解)，氯霉素(13ug/ml 95%乙醇溶解)，放線菌酮(lOOug/ ml丙酮溶解)，特異性篩選假單胞菌(Pseudomonas spp.)；上述土樣稀釋后的菌懸液在80°C水浴鍋內(nèi)溫浴lOmin，然后利用牛肉膏蛋白胨固 體培養(yǎng)基篩選芽孢桿菌(Bacillus spp.)。采集田間大豆根腐病病株根(黑龍江省佳木斯市撫遠(yuǎn)縣大豆田)，實(shí)驗(yàn)室破碎組 織，用馬丁培養(yǎng)基(滅菌后加入2ml乳酸，抑制細(xì)菌和放線菌的生長(zhǎng))分離病原真菌主要為 尖孢鐮刀菌(Fusarium oxysporum)、禾谷鐮刀菌(Fusarium graminearum)禾口立枯絲核菌 (RhizoctoniaSolani)，待用。采用土豆汁(PDA)平板牛津杯對(duì)峙的方法，即將上述篩選的病原真菌分別在PDA 固體培養(yǎng)基上接種培養(yǎng)3天后，用滅菌的打孔器在菌絲邊緣打出直徑8mm的菌絲塊，備用； 在新的PDA固體平板中央分別接種菌絲塊，培養(yǎng)1天后，在距菌絲塊3cm的位置放置牛津杯 (在火焰上灼燒5s左右，再放置)，牛津杯中分別加入各假單胞菌或芽孢桿菌的培養(yǎng)產(chǎn)物， 培養(yǎng)2天后，檢測(cè)各菌的抑菌率。 擬陽(yáng)性對(duì)照的抑菌率為100 %，陰性對(duì)照的抑菌率為0，
腿維菌的抑菌率、二二二 ―。篩選出具有高效抑制所篩選的病原真菌活性的36株假單胞菌和21株芽孢桿 菌，假單胞菌和芽孢桿菌分別混合發(fā)酵，假單胞菌發(fā)酵罐的條件為無(wú)菌空氣的通氣量為 1 1，攪拌速度為200轉(zhuǎn)/min，培養(yǎng)溫度為30°C，培養(yǎng)時(shí)間為20h;而芽孢桿菌的發(fā)酵條件 為無(wú)菌空氣的通氣量為1 1，攪拌速度為200轉(zhuǎn)/min，培養(yǎng)溫度為30°C，培養(yǎng)時(shí)間為40h， 顯微鏡小觀察大部分形成芽孢。發(fā)酵結(jié)束后，兩個(gè)屬的菌體數(shù)量達(dá)到10億個(gè)/ml以上，分 別用麥麩和草炭土(質(zhì)量比2 8)在45°C下吸附風(fēng)干并粉碎，然后以質(zhì)量比3 7的比例 混合，制成固體菌劑；或分別將兩個(gè)屬的發(fā)酵菌液分別濃縮為原體積的1/2，然后按體積比 3 7的比例混合，無(wú)菌包裝制成液體菌劑。實(shí)施例4采集田間健康大豆根際土壤(黑龍江省佳木斯市撫遠(yuǎn)縣大豆田)，10g 土加入90ml 蒸餾水稀釋成菌懸液，利用King’B固體培養(yǎng)基，培養(yǎng)基滅菌后加入0. 22um濾膜過濾除菌的 氨芐青霉素(40ug/ml，無(wú)菌水溶解)，氯霉素(13ug/ml 95%乙醇溶解)，放線菌酮(lOOug/ ml丙酮溶解)，特異性篩選假單胞菌(Pseudomonas spp.)；上述土樣稀釋后的菌懸液在80°C水浴鍋內(nèi)溫浴lOmin，然后利用牛肉膏蛋白胨固 體培養(yǎng)基篩選芽孢桿菌(Bacillus spp.)。采集田間大豆根腐病病株根(黑龍江省佳木斯市撫遠(yuǎn)縣大豆田)，實(shí)驗(yàn)室破碎組 織，用馬丁培養(yǎng)基(滅菌后加入2ml乳酸，抑制細(xì)菌和放線菌的生長(zhǎng))分離病原真菌主要為 尖孢鐮刀菌(Fusarium oxysporum)、禾谷鐮刀菌(Fusarium graminearum)禾口立枯絲核菌 (RhizoctoniaSolani)，待用。采用土豆汁(PDA)平板牛津杯對(duì)峙的方法，即將上述篩選的病原真菌分別在PDA 固體培養(yǎng)基上接種培養(yǎng)3天后，用滅菌的打孔器在菌絲邊緣打出直徑8mm的菌絲塊，備用； 在新的PDA固體平板中央分別接種菌絲塊，在距菌絲塊3cm的位置放置牛津杯(在火焰上 灼燒5s左右，再放置)，牛津杯中分別加入各假單胞菌或芽孢桿菌的培養(yǎng)產(chǎn)物，培養(yǎng)3天后， 檢測(cè)各菌的抑菌率。擬陽(yáng)性對(duì)照的抑菌率為100 %，陰性對(duì)照的抑菌率為0，
羅性菌的抑菌率=二二二篩選出具有高效抑制所篩選的病原真菌活性的36株假單胞菌和21株芽孢桿 菌，假單胞菌和芽孢桿菌分別混合發(fā)酵，假單胞菌發(fā)酵罐的條件為無(wú)菌空氣的通氣量為 1 1，攪拌速度為200轉(zhuǎn)/min，培養(yǎng)溫度為30°C，培養(yǎng)時(shí)間為20h;而芽孢桿菌的發(fā)酵條件 為無(wú)菌空氣的通氣量為1 1，攪拌速度為200轉(zhuǎn)/min，培養(yǎng)溫度為30°C，培養(yǎng)時(shí)間為40h， 顯微鏡下觀察大部分形成芽孢。發(fā)酵結(jié)束后，兩個(gè)屬的菌體數(shù)量都達(dá)到10億個(gè)/ml以上， 分別用麥麩和草炭土(質(zhì)量比1 9)在50°C下吸附風(fēng)干并粉碎，然后以質(zhì)量比5 5的 比例混合，制成固體菌劑；或分別將兩個(gè)屬的發(fā)酵菌液濃縮為原體積的1/2，然后按體積比 5 5的比例混合，無(wú)菌包裝制成液體菌劑。
權(quán)利要求
一種制備防治大豆根腐病的復(fù)合菌劑的方法，其特征在于取土壤菌懸液，分別利用King’B培養(yǎng)基和80℃水浴10min后涂牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的方法特異性篩選假單胞菌(Pseudomonas spp.)和芽孢桿菌(Bacillus spp.)，待用；另采集大豆根腐病病株根，利用馬丁培養(yǎng)基分離病原真菌；采用PDA平板牛津杯對(duì)峙的方法，將上述特異性篩選的假單胞菌和芽孢桿菌中復(fù)篩出具有高效抑制所篩選的病原真菌活性的菌株，分別發(fā)酵處理后復(fù)配即可得到防治大豆根腐病的復(fù)合菌劑。
2.按權(quán)利要求1所述的制備防治大豆根腐病的復(fù)合菌劑的方法，其特征在于所述 King’ B培養(yǎng)基組分為示蛋白胨20g，磷酸二氫鉀1. 2g，七水硫酸鎂1. 5g，甘油10ml，瓊脂 15g，蒸餾水1000ml，pH = 7. 4-7. 6，混合后滅菌，滅菌后加入0. 22um濾膜過濾除菌的氨芐 青霉素，氯霉素和放線菌酮。
3.按權(quán)利要求1所述的制備防治大豆根腐病的復(fù)合菌劑的方法，其特征在于所述氨 芐青霉素用無(wú)菌水溶解濃度為40ug/ml ；氯霉素用95%乙醇溶解濃度為13ug/ml ；放線菌酮 用丙酮溶解濃度為100ug/ml。
4.按權(quán)利要求1所述的制備防治大豆根腐病的復(fù)合菌劑的方法，其特征在于所述牛 肉膏蛋白胨培養(yǎng)基組分為牛肉膏5g，蛋白胨10g，氯化鈉5g，瓊脂15g，蒸餾水1000ml，pH =7. 0-7. 2。土壤懸液在80°C水浴鍋中溫浴10分鐘，再稀釋涂平板。
5.按權(quán)利要求1所述的制備防治大豆根腐病的復(fù)合菌劑的方法，其特征在于所述的 馬丁培養(yǎng)基的配方為葡萄糖10g，蛋白胨5g，磷酸二氫鉀lg，硫酸鎂0. 5g，0. 孟加拉紅 溶液3. 3ml，瓊脂20g,蒸餾水IOOOml，pH自然。滅菌后加入80 %的乳酸2ml。
6.按權(quán)利要求1所述的制備防治大豆根腐病的復(fù)合菌劑的方法，其特征在于所述采 用牛津杯平板對(duì)峙的方法中所用的固體PDA培養(yǎng)基配方如下削皮土豆200g，蔗糖20g，蒸 餾水1000ml，pH自然。土豆切成小塊兒，加入蒸餾水煮沸20min，過濾，濾液加入蔗糖，定容 到1000ml，加入20g瓊脂，115°C高壓滅菌30min。
7.按權(quán)利要求1所述的制備防治大豆根腐病的復(fù)合菌劑的方法，其特征在于PDA平板 牛津杯對(duì)峙的方法，在土豆汁固體平板中央接種直徑8mm的病原真菌菌絲塊，在距菌絲塊 3cm的位置放置火焰上灼燒后的牛津杯，或者菌絲塊培養(yǎng)1天后，再放置牛津杯，牛津杯中 加入各待用假單胞菌或芽孢桿菌的培養(yǎng)產(chǎn)物，培養(yǎng)2-3天后，檢測(cè)各菌的抑菌率。
8.按權(quán)利要求1所述的制備防治大豆根腐病的復(fù)合菌劑的方法，其特征在于將經(jīng)復(fù) 篩出的假單胞菌和芽孢桿菌分別混合發(fā)酵，假單胞菌屬的混合菌株在未加抗生素的上述 King’ B培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)；芽孢桿菌屬的混合菌株在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵培 養(yǎng)基；待兩個(gè)屬的菌體數(shù)量都達(dá)到10億個(gè)/ml以上，分別用質(zhì)量比2 8-1 9麥麩和草 炭土在40-50°C下吸附風(fēng)干并粉碎，然后以質(zhì)量比3 7-5 5的比例混合，制成固體菌劑； 或分別將兩個(gè)屬的發(fā)酵菌液都濃縮為原體積的1/2，然后按體積比3 7-5 5的比例混 合，無(wú)菌包裝制成液體菌劑。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備防治大豆根腐病的復(fù)合菌劑的方法，其特征在于假單 胞菌發(fā)酵罐的條件為；無(wú)菌空氣的通氣量為1 0.8-1，攪拌速度為180-200轉(zhuǎn)/min，培 養(yǎng)溫度為28-30°C，培養(yǎng)時(shí)間為20-30h ；而芽孢桿菌的發(fā)酵條件為無(wú)菌空氣的通氣量為 1 0. 8-1，攪拌速度為180-200轉(zhuǎn)/min，培養(yǎng)溫度為28_30°C，培養(yǎng)時(shí)間為40_60h，有利于 形成芽孢。
全文摘要
本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)科技領(lǐng)域，具體地說是一種制備防治大豆根腐病的復(fù)合菌劑的方法。采集田間健康大豆根際土壤，分別利用King’B培養(yǎng)基和80℃水浴10min后涂牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的方法特異性篩選假單胞菌和芽孢桿菌，待用；采集田間大豆根腐病病株根，利用馬丁培養(yǎng)基分離病原真菌；采用PDA平板牛津杯對(duì)峙的方法，從待用的假單胞菌和芽孢桿菌中復(fù)篩出具有高效抑制所篩選的病原真菌活性的菌株，分別發(fā)酵處理后按比例復(fù)配，即可得到防治大豆根腐病的復(fù)合菌劑。本發(fā)明的篩選方法，利用大豆根際生防混合細(xì)菌，能夠有效提高生物活性和防治范圍，并且其來(lái)源為健康大豆根際，多為大豆益生菌，且能夠在大豆根際有效定殖，增強(qiáng)了菌劑的利用率。
文檔編號(hào)A01N63/04GK101843260SQ20091001087
公開日2010年9月29日 申請(qǐng)日期2009年3月25日 優(yōu)先權(quán)日2009年3月25日
發(fā)明者張惠文, 張曉黎, 李新宇, 李旭, 蘇振成, 阮曉東 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院沈陽(yáng)應(yīng)用生態(tài)研究所