專利名稱：一種建立蘭州百合高效基因槍轉(zhuǎn)化體系的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，具體涉及蘭州百合基因槍高頻轉(zhuǎn)化方法。
技術(shù)背景蘭州百合(Lilium davidii var. unicolor)是百合科百合屬川百合的一個變種， 是一種多年生鱗莖類草本植物。蘭州百合的栽種始于清代同治年間，距今約130多年，由于 獨特的土壤條件和多年積累的栽培技術(shù)，其鱗莖碩大，顏色潔白，鱗片豐滿白嫩，質(zhì)地細(xì)膩， 營養(yǎng)豐富，口味甜美而幽香；其花單生，大而美麗，香味濃郁，有很高的食用、藥用、保健和觀 賞價值，它不僅是中國百合中的上品，而且是中國唯一的甜百合。我國著名的植物分類學(xué)家 孔憲武教授曾評價"蘭州百合味極甜美，纖維很少，又毫無苦味，不但聞名全國，亦可稱世 界第一。" 近年來對蘭州百合的研究主要集中在種植栽培、貯存保鮮、化學(xué)成分、細(xì)胞學(xué)、分 子學(xué)、保健食品開發(fā)、雜交育種、組織培養(yǎng)、離體快繁等方面。百合已被國家衛(wèi)生部確定為 "既是食品又是藥品"的植物之一，蘭州百合的營養(yǎng)成分豐富，包括各種蛋白質(zhì)、脂肪和維生 素等。不僅在營養(yǎng)方面具有重要的價值，而且蘭州百合還具有重要藥用價值和觀賞價值。
我國是百合屬植物的故鄉(xiāng)，觀賞、食用或藥用百合的栽培歷史十分悠久，具備良好 的種質(zhì)資源基礎(chǔ)。但目前我國的百合育種工作十分落后，現(xiàn)有的百合種質(zhì)資源不僅沒有得 到充分利用，而且破壞、流失現(xiàn)象十分嚴(yán)重。百合通常采用分球、鱗莖等繁殖，易造成種性退 化，品質(zhì)下降，甚至凝聚病毒。

發(fā)明內(nèi)容
針對上述現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題與缺陷，本發(fā)明的目的在于提供蘭州百合高效率 基因槍轉(zhuǎn)化方法，該轉(zhuǎn)化方法具有高效表達(dá)、原核基因無需修飾改造、便于遺傳操作，易保 持純系，后代不分離，大大提高了蘭州百合的轉(zhuǎn)化效率。 實現(xiàn)上述發(fā)明目的技術(shù)方案是一種建立蘭州百合高效基因槍轉(zhuǎn)化體系的方法， 具體包括下列步驟 選擇蘭州百合組培苗的鱗片作為受體材料，用基因槍法將外源DNA導(dǎo)入該受體材 料，在該基因槍中，采用氯化鈣和亞精胺包被質(zhì)粒DNA，濃度為0. 4-1. 2mg/L，使用lum金粉 作為DNA質(zhì)粒的載體，轟擊高度為3-9cm，轟擊次數(shù)為1-3次。 本發(fā)明的方法中，轉(zhuǎn)化的外源基因是GLDH，轉(zhuǎn)化表達(dá)載體為pCAMBIA1303。 本發(fā)明還有一個目的是提供一種制備轉(zhuǎn)基因蘭州百合的方法，該方法包括以下步
驟 1)將蘭州百合組培苗的鱗片在含有O. 2-0. 6M山梨醇和0. 2-0. 6M甘露醇高滲培養(yǎng) 基上預(yù)培養(yǎng)4h; 2)以預(yù)培養(yǎng)后的鱗片作為轉(zhuǎn)化受體進(jìn)行基因槍轉(zhuǎn)化，采用氯化鈣和亞精胺包被質(zhì) 粒DNA，濃度為0. 4-1. 2mg/L，直徑為lum的金粉作為DNA質(zhì)粒的載體，轟擊高度為3-9cm，轟擊次數(shù)為1-3次； 3)將轟擊后鱗片在高滲培養(yǎng)基上培養(yǎng)16h，而后在分化培養(yǎng)基上恢復(fù)培養(yǎng)7d ;
4)經(jīng)恢復(fù)培養(yǎng)后的鱗片，在篩選壓力為2mg/L潮霉素分化培養(yǎng)基上篩選培養(yǎng)30d， 后轉(zhuǎn)入5mg/的再生培養(yǎng)基上繼續(xù)進(jìn)行篩選培養(yǎng)直至再生成植株；所述的高滲培養(yǎng)基由MS+2. Omg/LBA+0. 2mg/LNAA+30g/L蔗糖+6g/L瓊脂組成；
所述的分化培養(yǎng)基由MS+2. Omg/LBA+0. 2mg/LNAA+30g/L蔗糖+6g/L瓊脂組成；
所述的潮霉素分化培養(yǎng)基由MS+2. Omg/LBA+0. 2mg/LNAA+30g/L蔗糖+6g/L瓊脂 +2mg/L hyg組成;所述的再生培養(yǎng)基由MS+1. Omg/LBA+0. 2mg/LNAA+30g/L蔗糖+6g/L瓊脂組成。在上述方法中轉(zhuǎn)化的外源基因是GLDH，轉(zhuǎn)化表達(dá)載體為pCAMBIA1303。 本發(fā)明的方法成功地將GLDH基因?qū)氲教m州百合基因組中，從而獲得了移栽成
活的潮霉素抗性株系。 與現(xiàn)有技術(shù)相比較，本發(fā)明的方法具有以下優(yōu)點 1)通過本發(fā)明的方法獲得轉(zhuǎn)基因植株蘭州百合可以明顯提高Vc含量2-5倍，從而 增加蘭州百合的實用價值。 2)本發(fā)明的方法轉(zhuǎn)化效率高達(dá)15%，并且育種時間僅需半年，與傳統(tǒng)育種相比大 大縮短了蘭州百合的育種時間。


圖1是獲得的抗性芽在潮霉素濃度為5mg/L的培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選培養(yǎng)。 圖2為轉(zhuǎn)基因植株的GUS染色。 圖3PCR檢測的電泳圖。 圖4轉(zhuǎn)基因植株的Southern雜交圖片。 圖5是轉(zhuǎn)基因蘭州百合在生根培養(yǎng)基上的生長情況。
具體實施例方式
下面結(jié)合發(fā)明人給的具體實施例和試驗列對本發(fā)明的方法和使用效果做進(jìn)一步 闡明。 實施例l蘭州百合組培苗鱗片的獲得方法 洗去百合鱗莖表面泥土，剝?nèi)ネ鈱佑胁“呋驒C械損傷的鱗片，取中外層無病斑健 壯的鱗片，浸泡清洗，然后在自來水下沖洗8 12h，再用蒸餾水清洗3次，在超凈臺上用 70%乙醇消毒408，投入0. 1%升汞溶液中消毒15min，無菌水沖洗5次。滅菌后的鱗片切成 1. 0-2. OcmX 1. 0-2. Ocm方塊，倒置接種于分化培養(yǎng)基1/2MS+2. Omg/LBA+0. 2mg/LNAA+30g/ L蔗糖+6g/L瓊脂上。l-2月后取組培苗鱗片作為受體待侵染。
實施例2建立蘭州百合高效基因槍轉(zhuǎn)化體系的方法 選擇蘭州百合組培苗的鱗片作為受體材料，用基因槍法將外源DNA導(dǎo)入該受體材 料，在該基因槍中，采用氯化鈣和亞精胺包被質(zhì)粒DNA，濃度為0. 4mg/L，使用lum金粉作為 DNA質(zhì)粒的載體，轟擊高度為3cm，轟擊次數(shù)為3次。該方法中轉(zhuǎn)化的外源基因是GLDH，轉(zhuǎn)化 表達(dá)載體為pCAMBIA1303。
實施例3建立蘭州百合高效基因槍轉(zhuǎn)化體系的方法 選擇蘭州百合組培苗的鱗片作為受體材料，用基因槍法將外源DNA導(dǎo)入該受體材 料，在該基因槍中，采用氯化鈣和亞精胺包被質(zhì)粒DNA，濃度為0. 8mg/L，使用lum金粉作為 DNA質(zhì)粒的載體，轟擊高度為6cm，轟擊次數(shù)為2次。該方法中轉(zhuǎn)化的外源基因是GLDH，轉(zhuǎn)化 表達(dá)載體為pCAMBIA1303。 實施例4建立蘭州百合高效基因槍轉(zhuǎn)化體系的方法 選擇蘭州百合組培苗的鱗片作為受體材料，用基因槍法將外源DNA導(dǎo)入該受體材 料，在該基因槍中，采用氯化鈣和亞精胺包被質(zhì)粒DNA，濃度為1.2mg/L，使用lum金粉作為 DNA質(zhì)粒的載體，轟擊高度為9cm，轟擊次數(shù)為2次。該方法中轉(zhuǎn)化的外源基因是GLDH，轉(zhuǎn)化 表達(dá)載體為pCAMBIA1303。 實施例5制備轉(zhuǎn)基因蘭州百合的方法 1)將蘭州百合組培苗的鱗片在含有0. 2-M山梨醇和0. 6M甘露醇高滲培養(yǎng)基上預(yù) 培養(yǎng)4h ; 2)以預(yù)培養(yǎng)后的鱗片作為轉(zhuǎn)化受體進(jìn)行基因槍轉(zhuǎn)化，采用氯化鈣和亞精胺包被質(zhì) 粒DNA，濃度為0. 4mg/L，直徑為lum的金粉作為DNA質(zhì)粒的載體，轟擊高度為3cm，轟擊次數(shù) 為3次； 3)將轟擊后鱗片在高滲培養(yǎng)基上培養(yǎng)16h，而后在分化培養(yǎng)基上恢復(fù)培養(yǎng)7d ;
4)經(jīng)恢復(fù)培養(yǎng)后的鱗片，在篩選壓力為2mg/L潮霉素分化培養(yǎng)基上篩選培養(yǎng)30d， 后轉(zhuǎn)入5mg/L的再生培養(yǎng)基上繼續(xù)進(jìn)行篩選培養(yǎng)直至再生成植株；
所述的高滲培養(yǎng)基由MS+2. Omg/LBA+0. 2mg/LNAA+30g/L蔗糖+6g/L瓊脂組成；
所述的分化培養(yǎng)基由MS+2. Omg/LBA+0. 2mg/LNAA+30g/L蔗糖+6g/L瓊脂組成；
所述的潮霉素分化培養(yǎng)基由MS+2. Omg/LBA+0. 2mg/LNAA+30g/L蔗糖+6g/L瓊脂 +2mg/L hyg組成;所述的再生培養(yǎng)基由MS+1. Omg/LBA+0. 2mg/LNAA+30g/L蔗糖+6g/L瓊脂組成。
在上述方法中轉(zhuǎn)化的外源基因是GLDH，轉(zhuǎn)化表達(dá)載體為pCAMBIA1303。
以下實施例6-8中，所用的培養(yǎng)基、轉(zhuǎn)化的外源基因及轉(zhuǎn)化表達(dá)載體均相同。
實施例6制備轉(zhuǎn)基因蘭州百合的方法 1)將蘭州百合組培苗的鱗片在含有O. 4M山梨醇和0. 6M甘露醇高滲培養(yǎng)基上預(yù)培 養(yǎng)4h ; 2)以預(yù)培養(yǎng)后的鱗片作為轉(zhuǎn)化受體進(jìn)行基因槍轉(zhuǎn)化，采用氯化鈣和亞精胺包被質(zhì) 粒DNA，濃度為0. 6mg/L，直徑為lum的金粉作為DNA質(zhì)粒的載體，轟擊高度為5cm，轟擊次數(shù) 為l次； 3)將轟擊后鱗片在高滲培養(yǎng)基上培養(yǎng)16h，而后在分化培養(yǎng)基上恢復(fù)培養(yǎng)7d ;
4)經(jīng)恢復(fù)培養(yǎng)后的鱗片，在篩選壓力為2mg/L潮霉素分化培養(yǎng)基上篩選培養(yǎng)30d， 后轉(zhuǎn)入5mg/L的再生培養(yǎng)基上繼續(xù)進(jìn)行篩選培養(yǎng)直至再生成植株。
實施例7制備轉(zhuǎn)基因蘭州百合的方法 1)將蘭州百合組培苗的鱗片在含有O. 6M山梨醇和0. 2M甘露醇高滲培養(yǎng)基上預(yù)培 養(yǎng)4h ; 2)以預(yù)培養(yǎng)后的鱗片作為轉(zhuǎn)化受體進(jìn)行基因槍轉(zhuǎn)化，采用氯化鈣和亞精胺包被質(zhì)粒DNA，濃度為1. 2mg/L，直徑為lum的金粉作為DNA質(zhì)粒的載體，轟擊高度為9cm，轟擊次數(shù) 為l次； 3)將轟擊后鱗片在高滲培養(yǎng)基上培養(yǎng)16h，而后在分化培養(yǎng)基上恢復(fù)培養(yǎng)7d ;
4)經(jīng)恢復(fù)培養(yǎng)后的鱗片，在篩選壓力為2mg/L潮霉素分化培養(yǎng)基上篩選培養(yǎng)30d， 后轉(zhuǎn)入5mg/L的再生培養(yǎng)基上繼續(xù)進(jìn)行篩選培養(yǎng)直至再生成植株。
實施例8制備轉(zhuǎn)基因蘭州百合的方法 1)將蘭州百合組培苗的鱗片在含有O. 4M山梨醇和0. 4M甘露醇高滲培養(yǎng)基上預(yù)培 養(yǎng)4h ; 2)以預(yù)培養(yǎng)后的鱗片作為轉(zhuǎn)化受體進(jìn)行基因槍轉(zhuǎn)化，采用氯化鈣和亞精胺包被質(zhì) 粒DNA，濃度為1. Omg/L，直徑為lum的金粉作為DNA質(zhì)粒的載體，轟擊高度為7cm，轟擊次數(shù) 為3次； 3)將轟擊后鱗片在高滲培養(yǎng)基上培養(yǎng)16h，而后在分化培養(yǎng)基上恢復(fù)培養(yǎng)7d ;
4)經(jīng)恢復(fù)培養(yǎng)后的鱗片，在篩選壓力為2mg/L潮霉素分化培養(yǎng)基上篩選培養(yǎng)30d， 后轉(zhuǎn)入5mg/L的再生培養(yǎng)基上繼續(xù)進(jìn)行篩選培養(yǎng)直至再生成植株。
試驗例1轉(zhuǎn)基因植株蘭州百合的抗性篩選 獲得再生芽后，轉(zhuǎn)移至含有hyg的分化培養(yǎng)基上，若是轉(zhuǎn)基因植株在抗生素培養(yǎng) 基上生長良好，若為非轉(zhuǎn)基因植株，在抗生素培養(yǎng)基上死亡，如圖1所示。
試驗例2轉(zhuǎn)基因植株的GUS染色將材料浸泡于GUS染色液(50mmol/L磷酸緩沖液pH 7. 0， lmmol/LEDTA， 0. 05 % Triton-100，lmmol/L鐵氰化鉀，lmmol/L亞鐵氰化鉀，甲醇20%，0. 5mg/ml X-Gluc)，37。C 染色12-24h后，用70-95%乙醇脫色。每個樣本重復(fù)3次，用Olympus optics顯微鏡觀察， 結(jié)果如圖2所示，圖中左為非轉(zhuǎn)基因植株，右為轉(zhuǎn)基因植株。
試驗例3轉(zhuǎn)基因植株GLDH基因的PCR檢測 用于蘭州百合遺傳轉(zhuǎn)化的基因含有GLDH基因，采用CTAB法提取葉片的DNA進(jìn)行 檢測，擴(kuò)增片斷長度為850bp。如圖3所示，圖中l(wèi)為Mark，2為陽性對照，3為陰性對照，4-8 為轉(zhuǎn)基因植株。 25ii L的反應(yīng)體系包括2. 5ii L 10XPCR Bufer，1.5iiL 25mmol/L MgCl2，2iiL 2.5mmol/L dN TPs, 1 ii L10mmol/L DHARs弓|物，1 ii L 10mmol/LDHARa引物，0. 25 ii L5U/ii L 的Taq DNA聚合酶，2 ii L模板DNA，用滅菌雙蒸水補齊至25 ii L。PCR的反應(yīng)條件為l)94t:預(yù)變性5分鐘后，2)94。C變性45秒，3)6(TC退火45秒， 4)72t:延伸1分，步驟2至4循環(huán)38次。5)最后72。C延伸10分鐘。
GLDH檢測引物上游引物5' -AAAACGAACCATCCGCACAGAA-3'
下游引物5' -AATAAAGAACTAACCAACAGCA-3'
試驗例4轉(zhuǎn)基因植株的Southern雜交 用改良CTAB法提取蘭州百合的DNA，用EcoRI進(jìn)行單酶切，而后進(jìn)行Southern雜 交，雜交結(jié)果如圖4所示，圖中1-5為轉(zhuǎn)基因植株，6為非轉(zhuǎn)基因植株，7為陽性對照，8為 Mark。 試驗例5轉(zhuǎn)基因植株生根 本蘭州百合的生根所用基本培養(yǎng)基為1/2MS培養(yǎng)基，各培養(yǎng)基附加30g/L蔗糖，
66g/L瓊脂，ph5. 8， IBA濃度為0. 5-1. 5mg/L，生根結(jié)果如圖5所示'
權(quán)利要求
一種建立蘭州百合高效基因槍轉(zhuǎn)化體系的方法，其特征在于，包括下步步驟選擇蘭州百合組培苗的鱗片作為轉(zhuǎn)化受體進(jìn)行基因槍轉(zhuǎn)化，采用氯化鈣和亞精胺包被質(zhì)粒DNA，濃度為0.4-1.2mg/L，使用1um金粉作為DNA質(zhì)粒的載體，轟擊高度為3-9cm，轟擊次數(shù)為1-3次。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，轉(zhuǎn)化的外源基因是GLDH，轉(zhuǎn)化表達(dá)載體為 pCAMBIA1303。
3. —種制備轉(zhuǎn)基因蘭州百合的方法，其特征在于，該方法包括以下步驟1) 將蘭州百合組培苗的鱗片在含有O. 2-0. 6M山梨醇和0. 2-0. 6M甘露醇高滲培養(yǎng)基上 預(yù)培養(yǎng)4h ;2) 以預(yù)培養(yǎng)后的鱗片作為轉(zhuǎn)化受體進(jìn)行基因槍轉(zhuǎn)化，采用氯化鈣和亞精胺包被質(zhì)粒 DNA，濃度為0. 4-1. 2mg/L，直徑為lum的金粉作為DNA質(zhì)粒的載體，轟擊高度為3-9cm，轟擊 次數(shù)為1-3次；3) 將轟擊后鱗片在高滲培養(yǎng)基上培養(yǎng)16h，而后在分化培養(yǎng)基上恢復(fù)培養(yǎng)7d ;4) 經(jīng)恢復(fù)培養(yǎng)后的鱗片，在篩選壓力為2mg/L潮霉素分化培養(yǎng)基上篩選培養(yǎng)30d，后轉(zhuǎn) 入5mg/L的再生培養(yǎng)基上繼續(xù)進(jìn)行篩選培養(yǎng)直至再生成植株；所述的高滲培養(yǎng)基由MS+2. Omg/LBA+0. 2mg/LNAA+30g/L蔗糖+6g/L瓊脂組成； 所述的分化培養(yǎng)基由MS+2. Omg/LBA+0. 2mg/LNAA+30g/L蔗糖+6g/L瓊脂組成； 所述的潮霉素分化培養(yǎng)基由MS+2. Omg/LBA+0. 2mg/LNAA+30g/L蔗糖+6g/L瓊脂+2mg/ L hyg組成；所述的再生培養(yǎng)基由MS+1. Omg/LBA+0. 2mg/LNAA+30g/L蔗糖+6g/L瓊脂組成。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，轉(zhuǎn)化的外源基因是GLDH，轉(zhuǎn)化表達(dá)載體為 pCAMBIA1303。
全文摘要
本發(fā)明是公開了一種建立蘭州百合高效基因槍轉(zhuǎn)化體系的方法，選擇蘭州百合組培苗的鱗片作為轉(zhuǎn)化受體進(jìn)行基因槍轉(zhuǎn)化，采用氯化鈣和亞精胺包被質(zhì)粒DNA，濃度為0.4-1.2mg/L，使用金粉作為DNA質(zhì)粒的載體，轟擊高度為3-9cm，轟擊次數(shù)為1-3次，獲得了抗性株系，對抗性株系進(jìn)行了PCR檢測和southern檢測，都檢測到目的基因，證實獲得了轉(zhuǎn)基因蘭州百合。
文檔編號A01H4/00GK101748147SQ20091002336
公開日2010年6月23日 申請日期2009年7月17日 優(yōu)先權(quán)日2009年7月17日
發(fā)明者師守國, 李善菊, 梁東, 王平平, 王順才, 馬鋒旺 申請人:西北農(nóng)林科技大學(xué)