專利名稱：：一種應用納米技術促進鐵皮石斛快速增殖的組培方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及一種藥用石斛的快速增殖方法，屬于生物
技術領域：
。具體的講，是指一種采用組織培養(yǎng)技術對鐵皮石斛進行快速繁殖的方法。二
背景技術：
：植物組織培養(yǎng)是指用植物的各種器官、組織或細胞，在人工控制的條件下進行無菌培養(yǎng)，通過生長發(fā)育的過程，產生可以用于繁殖的完整植株，并在數量上得到大幅度的增加。該技術取材少，培養(yǎng)植物材料成本低，生長周期短，管理方便。利用植物組織培養(yǎng)這種快速繁殖技術，能在短時間內繁衍出大量植株，并且能較好的保持母本的遺傳性狀。在我國通過組織培養(yǎng)技術快速繁殖的植物已有數千種。鐵皮石斛[DeA7drojb/'wmo所c/Va/eK/'muraefM/'go]是我國的一種傳統名貴中藥和名貴的室內觀賞植物，由于生長條件苛刻，自然條件下生長極為緩慢，常規(guī)繁殖又較難，通過種子播種不能得到大量與親代性狀一致的植株，分株和高位芽扦插繁殖則速度很慢，一般在1年中的繁殖速度為2-3倍。目前大量的采挖已經使野生的鐵皮石斛資源瀕臨滅絕。由于其具有極高的藥用價值，同時鐵皮石斛花色艷麗，花期長，適合于做盆花栽培，目前國際市場市場價格為1300-3600美元/公斤，因此極具開發(fā)利用價值。對石斛的開發(fā)，快速繁殖是第一步。目前有關于石斛屬組培快繁的技術報道比較多，從外植體的選擇、培養(yǎng)基的篩選等方面可以說已經相當成熟了。一般是以成熟或未成熟的種子為材料，在有激素或無激素的培養(yǎng)基上萌發(fā)，形成原球莖，原球莖繼續(xù)擴增或成苗。但上述方法以種子為材料，由于石斛屬植物在自然狀態(tài)下，主要以營養(yǎng)繁殖為主要繁殖方式，雖然開花多，當授粉結實率低，使得種子的獲得具有一定的困難，且接種時間受到嚴格的限制；選擇幼嫩莖尖為材料，不僅接種時間受到限制，材料數量有限，還會明顯的影響栽培植株的正常生長；不利于材料的更新。此外，在煉苗技術上，多數方法要求較高，如要求栽在活苔蘚上，才能獲得較高的成功率等，所以難以大規(guī)模生產。納米化二氧化鈦(Titaniumdioxide,Ti02)是目前最具有應用潛力和開發(fā)前景的一種光半導體材料，其本身無毒、無味、無剌激性，并且具有價格低廉、性能穩(wěn)定、催化性能高、無污染和對人畜無毒副作用等優(yōu)點。研究表明，物質的納米顆粒因為其所具有的巨大表面積會有利于細胞的吞噬吸收，顆粒的納米尺度可能會通過促進細胞的吞噬吸收來影響細胞的生理活動。同時，微量金屬元素對植物的生長有一種類似于激素(生長素和細胞分裂素)的效應，其對高等植物具有促進其生長的功效。三、發(fā)明專利內容本發(fā)明的目的在于針對現有石斛組織培養(yǎng)方法的不足，對其進行改進，提供一種能夠適合鐵皮石斛、采用組織培養(yǎng)技術進行快速繁殖的方法。本發(fā)明的方法是在現有石斛組織培養(yǎng)技術的基礎上，在培養(yǎng)基中加入各種納米化的材料，利用其吸附能力對培養(yǎng)基中各種成分形成的緩釋作用來減少因培養(yǎng)基中的物質消耗而進行的繼代培養(yǎng)次數，以提高繁殖效率；利用其類激素效應促進組織生長，以提高生長效率。本發(fā)明所述的鐵皮石斛快速繁殖組織培養(yǎng)技術方法包括以下步驟-(1)外植體的選擇與滅菌選擇當年萌生的有嫩莖尖，先用無菌水沖洗干凈，去除葉鞘，切成具有1-4個腋芽、長3-5cm段，用0.5g/L的多菌靈溶液浸泡2-3個小時，再用75%乙醇消毒30秒鐘，用0.1%升汞水浸泡20分鐘，無菌水沖洗5-6次，取出材料，切成具有一個腋芽、長度為lcm左右的小段，最后用12%次氯酸鈉殺菌30秒，無菌水沖洗5-6次。(2)腋芽的萌發(fā)誘導培養(yǎng)基為Ne培養(yǎng)基，加入的5mg/ml—20mg/ml濃度的納米顆粒材料，納米Ti02(Titaniumdioxide,Ti02)、納米Sn02、納米CdSe、納米Si02、納米Fe304/Ti02、納米ZnO、納米SnSe2、Ce-Mn-0納米粉體、納米Si02復配粉體、鎳納米材料、0.5mg/L的6-BA、l.Omg/L的NAA和150.0mg/L的椰子汁，在25±1°C、光照1500-2000Lx、光照時間為8-10小時/天的條件下培養(yǎng)，直至形成帶葉的小苗。其中Ne基本培養(yǎng)基是本行業(yè)常用的一種培養(yǎng)基，其組成成分如下表表lN6培養(yǎng)基的組成和配方組成成分數量(mg/L)組成成分數量(mg/L)KN032.3MgS04'7H2。185CaCl2H20166KH2P04400(NH4)2so4463KI0.8H3B。31.6MnS044H204.4ZnSO47H201.5Na2-EDTA37.3FeS047H2027.8蔗糖50pH5.8煙酸0.5鹽酸吡眵醇0.5甘氨酸2.0鹽酸硫銨1.0(3)叢生芽誘導將小苗接種在含有5mg/m1—20mg/ml濃度的納米顆粒如納米Ti02(Titaniumdioxide,Ti02)、納米Sn02、納米CdSe、納米SiQ2、納米4Fe304/Ti02、納米ZnQ、納米SnSe2、Ce-Mn-O納米粉體、納米Si02復配粉體、鎳納米材料、l.Omg/LNAA和150.0mg/L的椰子汁的1/2N6培養(yǎng)基上培養(yǎng)，直至形成叢生芽，培養(yǎng)條件25士rC、光照1500-2000Lx、光照時間為8-10小時/天。(4)成苗培養(yǎng)將分化的小苗接種到含有5mg/m1—20mg/ml濃度的納米顆粒納米Ti。2(Titaniumdioxide，Ti02)、納米Sn02、納米CdSe、納米Si02、納米Fe304/Ti02、納米ZnO、納米SnSe2、Ce-Mn-0納米粉體、納米Si02復配粉體、鎳納米材料、O.lmg/L的6-BA和l.Omg/LNAA的2/3MS成苗培養(yǎng)基上，在25士TC、光照1500-2000Lx、光照時間為8-10小時/天的條件下。培養(yǎng)29-31天生根，形成完整植株。其中MS基本培養(yǎng)基是本行業(yè)常用的一種培養(yǎng)基，其組成成分如下表表2MS培養(yǎng)基的組成和配方<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>(5)煉苗和移栽先將組培苗在室內鍛煉20-25天后，洗凈根上的培養(yǎng)基，用0.1%的多菌靈消毒后，栽培于活苔蘚中，栽后澆足水，以后經常進行人工噴霧，保持環(huán)境濕潤，每隔10-15天灑一次營養(yǎng)液。在上述發(fā)明的描述中，6-BA是6-芐基腺嘌呤，NAA是萘乙酸，1102納米顆粒直徑約為20nm，Lx是光強的單位——勒克斯。本發(fā)明方法具有如下優(yōu)點和效果(1)克服了傳統繁殖方法繁殖速度慢，很難滿足大規(guī)模生產需求的不足。在短時間內能夠繁殖出滿足大規(guī)模生產所需要的種苗；(2)本方法保證了遺傳的穩(wěn)定性；(3)本方法具有成本低廉的特點。權利要求1、一種應用納米技術促進鐵皮石斛快速增殖的組培方法，其特征在于該方法包括下列步驟(1)外植體的選擇與滅菌；(2)腋芽的萌發(fā)；(3)叢生芽誘導；(4)成苗培養(yǎng)；(5)煉苗和移栽。2、如權利1所述的繁殖方法，其特征在于在步驟(1)中，選擇當年萌生的有嫩莖尖，先用無菌水沖洗干凈，去除葉鞘，切成具有l(wèi)-4個腋芽、長3-5cm段，用0.5g/L的多菌靈溶液浸泡2-3個小時，再用75%乙醇消毒30秒鐘，用0.1%升汞水浸泡20分鐘，無菌水沖洗5-6次，取出材料，切成具有一個腋芽、長度為lcm左右的小段，最后用12%次氯酸鈉殺菌30秒，無菌水沖洗5-6次。3、如權利1所述的繁殖方法，其特征在于在步驟(2)中，所采用的培養(yǎng)基為加入5mg/ml—20mg/ml濃度的納米顆粒材料，如納米Ti02(Titaniumdioxide，Ti02)、納米Sn02、納米CdSe、納米Si02、納米Fe304/Ti02、納米ZnO、納米SnSe2、Ce-Mn-O納米粉體、納米Si02復配粉體、鎳納米材料、0.5mg/L的6-BA、l.Omg/L的NAA和150.0mg/L的椰子汁的Ns培養(yǎng)基；培養(yǎng)條件為在25±TC、光照1500-2000Lx、光照時間為8-10小時/天。4、如權利1所述的繁殖方法，其特征在于在步驟(3)中，所采用的培養(yǎng)基為加入5mg/ml—20mg/ml濃度的納米顆粒材料納米Ti02(Titaniumdioxide,Ti02)、納米Sn02、納米CdSe、納米Si02、納米Fe304/Ti02、納米ZnO、納米SnSe2、Ce-Mn-0納米粉體、納米Si02復配粉體、鎳納米材料、l.Omg/LNAA和150.0mg/L的椰子汁的1/2Ne培養(yǎng)基；培養(yǎng)條件為在25±1°C、光照1500-2000Lx、光照時間為8-10小時/天。5、如權利1所述的繁殖方法，其特征在于在步驟(4)中，所采用的培養(yǎng)基為加入5mg/ml—20mg/ml濃度的納米顆粒材料納米Ti02(Titaniumdioxide，Ti02)、納米Sn02、納米CdSe、納米Si02、納米Fe304/Ti02、納米ZnO、納米SnSe2、Ce-Mn-0納米粉體、納米Si02復配粉體、鎳納米材料、O.lmg/L的6-BA和1.0mg/LNAA的2/3MS成苗培養(yǎng)基；培養(yǎng)條件為在25±1°C、光照1500-2000Lx、光照時間為8-10小時/天。全文摘要本發(fā)明屬生物工程
技術領域：
。本發(fā)明提供一種應用納米技術促進鐵皮石斛快速增殖的組培方法，通過將各種納米材料如納米TiO₂(Titaniumdioxide，TiO₂)、納米SnO₂、納米CdSe、納米SiO₂、納米Fe₃O₄/TiO₂、納米ZnO、納米SnSe₂、Ce-Mn-O納米粉體、納米SiO₂復配粉體、鎳納米材料等應用于鐵皮石斛組織培養(yǎng)過程，促進鐵皮石斛組培苗再生芽發(fā)育，從而達到鐵皮石斛快速增殖的目的。培養(yǎng)基中加入的納米材料顆粒的巨大表面積吸附了一部分植物激素，培養(yǎng)基中植物組織可利用的生長調節(jié)物質濃度相對下降，從而促進植物組培苗再生芽的發(fā)育。文檔編號A01H4/00GK101548644SQ20091003812公開日2009年10月7日申請日期2009年3月25日優(yōu)先權日2009年3月25日發(fā)明者劉星華申請人:劉星華;劉宏源