專利名稱：一種海馬抗菌肽畢赤酵母工程菌及其在養(yǎng)殖中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體地說(shuō)是一種抗菌肽基因轉(zhuǎn)化畢赤酵母工程菌及其 制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
海馬(Hippocampus)是一種奇特的海洋生物，屬脊椎動(dòng)物亞門(mén)、魚(yú)綱、海龍目、海 龍科(Syngnathidae)。目前，全球已鑒定的的海馬有35種。在我國(guó)，海馬主要棲息在東 南部海域，常見(jiàn)的共有5種(張朝暉等，1998年)，分別是線紋海馬(H.kelloggi)、刺海馬 (H. histris)、大海馬(H. kuda)、斑海馬(H. trimaculatus)以及日本海馬(H. japonicus)?？咕臑閯?dòng)物體內(nèi)免疫防御系統(tǒng)的重要組成部分，是一種氨基酸短鏈肽，被稱為 無(wú)污染的天然抗生素，具有廣譜抗菌、無(wú)耐藥性、熱穩(wěn)定、水溶性好、無(wú)毒無(wú)殘留等優(yōu)點(diǎn)，符 合現(xiàn)代環(huán)保的觀念。目前全球?yàn)E用抗生素的情況嚴(yán)重，有學(xué)者曾憂心地提出——由于人類(lèi) 在與細(xì)菌的“軍備競(jìng)賽”中總是處于被動(dòng)和落后的態(tài)勢(shì)，當(dāng)有朝一日人類(lèi)研制的最強(qiáng)效的抗 生素都因?yàn)槌?jí)細(xì)菌的存在而失效時(shí)，這個(gè)世界將會(huì)變成什么樣子呢？據(jù)統(tǒng)計(jì)，目前我國(guó) 尚有多達(dá)20種人畜共用或畜禽專用的抗生素作飼料添加劑，隨著我國(guó)加入WT0，抗生素作 飼料添加劑必將嚴(yán)重影響我們的家畜產(chǎn)品在國(guó)際市場(chǎng)的競(jìng)爭(zhēng)力。將抗菌肽產(chǎn)品開(kāi)發(fā)成新的 代替?zhèn)鹘y(tǒng)抗生素添加劑的綠色飼料添加劑，將給我國(guó)的飼料添加劑行業(yè)注入一針強(qiáng)心劑， 將整體提升飼料行業(yè)的層次，使我國(guó)的飼料產(chǎn)品在世界市場(chǎng)更具競(jìng)爭(zhēng)力，推動(dòng)我國(guó)飼料行 業(yè)不斷向前發(fā)展。我們前期的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明從海馬中克隆得到的兩個(gè)抗菌肽基因hkplp和hkabf都 具有很好的抗菌活性。以HKABF為例，重組HKABF對(duì)G+菌比較敏感，尤其是對(duì)金黃色葡萄球 菌，在0.5ug/ml的蛋白濃度即可抑制稀釋為約5X 106CFU/mL濃度的金黃色葡萄球菌。測(cè) 試的微生物菌中，其次敏感的為白色葡萄球菌，MIC為2. 5ug/mL，再次為華納葡萄球菌(MIC 為5ug/mL)和廣州疾控中心分離出的金黃色葡萄球菌HI (MIC為5ug/mL)，中山大學(xué)附屬二 院分離鑒定出的金黃色葡萄球菌II (MIC為15ug/mL)，對(duì)于摩根氏菌(MIC為30ug/mL)和 創(chuàng)傷弧菌(MIC為120ug/mL)這兩種G_菌在較低肽濃度下也能抑制其生長(zhǎng)。對(duì)于其它G+和 G—菌甚至真菌(白色念珠菌、酵母、熱帶念珠菌)在比較高的蛋白濃度下有的也能顯示出不 同的抑菌效果。將兩個(gè)抗菌肽基因hkplp和hkabf同時(shí)經(jīng)畢赤酵母KM71重組表達(dá)，檢測(cè)其 抗菌活性表明HKPLP的抗菌活性要明顯優(yōu)于HKABF，因此我們選擇了抗菌肽基因hkplp作為 抗菌肽飼料添加劑的開(kāi)發(fā)對(duì)象。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種新的抗菌肽HKPLP和編碼該蛋白的基因hkplp。本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供該抗菌肽制品的生產(chǎn)方法。本發(fā)明的進(jìn)一步目的在于提供該抗菌肽在飼料添加劑中的應(yīng)用。 海洋抗菌肽對(duì)細(xì)菌、真菌有廣譜抗菌能力，對(duì)病毒、原蟲(chóng)及癌細(xì)胞也有作用。一般來(lái)講，海洋抗菌肽具有以下抗菌特性(1)殺菌活力很高，致死濃度均在umol/L級(jí)；(2)作 用迅速，往往在幾秒或幾分鐘內(nèi)可將99%以上的菌殺滅；(3)對(duì)真核生物細(xì)胞無(wú)毒性；(4) 活性穩(wěn)定，比較耐熱，IOCTC下處理30min不喪失其抗菌活性；(5)在高鹽環(huán)境下，許多海洋 抗菌肽同樣具有抗菌活性?？咕挠捎谧陨淼膬?yōu)良特性顯示出在食品儲(chǔ)存、飼料安全和醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)中廣泛的應(yīng) 用前景?？咕囊话悴缓邢∮邪被岷屯庠椿瘜W(xué)成分，是一種健康安全產(chǎn)品。在動(dòng)物消 化道中具有良好穩(wěn)定性，同時(shí)具有免疫原性小、水溶性好、廣譜殺菌甚至能夠殺真菌、原蟲(chóng) 且不產(chǎn)生耐藥性菌株等優(yōu)點(diǎn)，能耐受胃腸道中蛋白酶及肽酶的降解。此外，抗菌肽還具有良好的熱穩(wěn)定性，特別是在酸性條件下，加熱甚至是高溫高壓 處理對(duì)其抗菌活性沒(méi)有影響，因此不僅能夠耐受飼料加工過(guò)程中高溫高壓的劇烈條件，并 且可以在飼料保存過(guò)程中持續(xù)發(fā)揮其功能，保持飼料品質(zhì)，延長(zhǎng)貯存期限?？咕淖鰹樾乱?代的綠色飼料添加劑，是很好的傳統(tǒng)抗生素替代品，能有效得解決人和動(dòng)物藥殘和病原菌 耐藥性的問(wèn)題。


圖1是合成抗菌肽基因hkplp流程圖。圖2是質(zhì)粒載體pPIC3. 5K的物理圖譜。圖3是pPIC3. 5K-PLP重組質(zhì)粒載體的PCR鑒定，圖中M為DNA Marker DL2000 ；1為以空載體PPIC3.5K質(zhì)粒為模板的擴(kuò)增產(chǎn)物，其大小為220bp ；2、3、4、5為 PPIC3. 5K-PLP轉(zhuǎn)化子的擴(kuò)增產(chǎn)物，其大小為289bp。圖4是重組酵母轉(zhuǎn)化子的PCR鑒定，M為DNA Marker DL2000 ；1為陰性對(duì)照；2、3、 4、5、6、7為酵母重組菌株的菌落PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，其大小為289bp。圖5是抗菌肽基因酵母重組菌株構(gòu)建的流程圖。圖6是抗菌肽HKPLP對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌K12D31、大腸桿菌DH5 α、沙門(mén)氏 菌、動(dòng)物致病 大腸桿菌和醫(yī)院臨床病例分離的大腸埃希菌、尿腸球菌、溶血葡萄球菌的抗菌 實(shí)驗(yàn)結(jié)果，圖中1表示氨芐青霉素的抗菌活性；2為陰性對(duì)照ddH20;3、4、5、6、7為畢赤酵母 工程菌表達(dá)抗菌肽的抗菌活性。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1重組酵母表達(dá)抗菌肽HKPLP產(chǎn)品的生產(chǎn)方法(1)抗菌肽基因hkplp的合成根據(jù)酵母偏愛(ài)密碼子對(duì)抗菌肽基因hkplp進(jìn)行優(yōu)化設(shè)計(jì)，分別合成PLPl及PLP2 兩段引物，兩段引物之間有15bp的互補(bǔ)配對(duì)序列，互為模板做PCR擴(kuò)增。合成抗菌肽抗菌 肽基因hkplp流程圖如圖1所示。PLPl 5 ’ -CGGGATCCACCATGTTTTTGGGACTTATTTTTCACGGTCTGGTTCACGCCGGAAAGCTG-3’PLP2 5’ -CGGAATTCTCATTAACCACGATTTCTGTGGATCAAACCGTGGATCAGCTTTCCGGCGTG-3’反應(yīng)條件
10XPCR reaction buffer2μ LdNTPs (2. 5mmol/L)2 μ LPLPl1 μ LPLP21 μ Lpfu Taq (2U/ μ L)0. 5 μ LddH2013. 5μ L_Total Volume 20 μ L反應(yīng)程序?yàn)?MVX 5min — (94°C X Imin — 55°C X 30s — 72°C X lmin) X 30cycles —72°C XlOmin — 4°C X ①。第一次PCR產(chǎn)物作為模板，再次以PLPl和PLP2為引物進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)條件同上， PCR產(chǎn)物經(jīng)PCR產(chǎn)物純化試劑盒純化得到hkplp基因，_20°C保存?zhèn)溆谩?2)抗菌肽基因hkplp重組載體的構(gòu)建將抗菌肽基因hkplp和載體pPIC3. 5K經(jīng)EcoR I和BamH I雙酶切后，用T4 DNA 連接酶將抗菌肽基因hkplp和載體pPIC3. 5K進(jìn)行連接，構(gòu)建pPIC3. 5K-PLP重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化 大腸桿菌DH5a。質(zhì)粒pPIC3. 5K購(gòu)自invitrogen公司，其物理圖譜如圖2所示。在含氨芐 青霉素的LB固體平板上挑選轉(zhuǎn)化子，提取轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒DNA進(jìn)行5’ AOXl引物/3’ AOXl引物 PCR擴(kuò)增，如圖3所示。進(jìn)一步經(jīng)ABI 7300 DNA自動(dòng)測(cè)序儀測(cè)定抗菌肽基因hkplp與設(shè)計(jì) 序列完全一致且閱讀框正確。(3)抗菌肽基因hkplp重組載體的酶切線性化將測(cè)序正確的重組載體pPIC3. 5K-PLP轉(zhuǎn)化子大量提取質(zhì)粒，經(jīng)Sac I酶切線性化 后，用酚/氯仿/異戊醇(25 24 1)抽提反應(yīng)液一次，取水相加入2倍體積的無(wú)水乙醇 混勻后室溫放置1小時(shí)，12，OOOrpm離心10分鐘，將上清液棄除，用75%乙醇漂洗沉淀，室 溫干燥后用IOuL無(wú)菌雙蒸水溶解沉淀，立即使用或放于_20°C保存。(4)轉(zhuǎn)化畢赤酵母KM71將SOuL新鮮制備的酵母感受態(tài)細(xì)胞和5-10ug線性化的DNA混勻后電擊轉(zhuǎn)化，然 后取適量的菌液涂布于MD平板，于30°C倒置培養(yǎng)，待長(zhǎng)出單菌落后挑取單菌落點(diǎn)板于含有 0. 5mg/mL的G418的YPD固體平板上，培養(yǎng)4天后選取大的單菌落轉(zhuǎn)至2. 0mg/mLG418抗性 平板上以篩選高拷貝重組子。選取單菌落進(jìn)行5’ AOXl弓丨物/3’ AOXl引物菌落PCR擴(kuò)增， 結(jié)果如圖4所示，重組載體已經(jīng)轉(zhuǎn)入畢赤酵母工程菌。(5)抗菌肽HKPLP抗菌譜的測(cè)定從YPD平板上挑取PCR鑒定為陽(yáng)性的單菌落接種于IOOmLBMGY培養(yǎng)基，30°C振蕩 培養(yǎng)至0D_2 6，去上清，加入20mLBMMY培養(yǎng)基重懸菌體，30°C振蕩培養(yǎng)96小時(shí)，每隔24 小時(shí)取ImL樣品于Eppendorff管中，取上清用于抗菌活性檢測(cè)。將瓊脂培養(yǎng)基在水浴中加熱熔化，冷卻至50°C左右，用無(wú) 菌操作法吸取60μ L的 生測(cè)菌(0D600 = 0. 3)，加入20mL瓊脂培養(yǎng)基中，迅速混勻，傾倒入直徑為9cm的無(wú)菌平面 皿內(nèi)，水平放置待凝固。在瓊脂上打直徑為2. 7mm的圓孔，分別在孔中加入發(fā)酵液上清、無(wú) 菌水和lOOmg/mL Amplicin0將平皿倒置于37°C培養(yǎng)過(guò)夜，次日觀察結(jié)果。胞內(nèi)表達(dá)的抗菌肽HKPLP對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌K12D31、大腸桿菌DH5 α、沙門(mén)氏菌、動(dòng)物致病大腸桿菌和醫(yī)院臨床病例分離的大腸埃希菌、尿腸球菌、溶血葡萄球菌的 抗菌實(shí)驗(yàn)如圖6所示，該抗菌肽對(duì)以上各菌均有良好的抗菌活性。(6)畢赤酵母高密度發(fā)酵表達(dá)海馬抗菌肽HKPLP從YPD平板上挑取單菌落接種于5mLYPD培養(yǎng)基，30°C振蕩培養(yǎng)20小時(shí)；以 1 100的比例將菌液接種至300mL YPD培養(yǎng)基，30°C振蕩培養(yǎng)過(guò)夜至OD6tltl達(dá)2 6，作為 接種發(fā)酵罐的種子菌。國(guó)產(chǎn)30L發(fā)酵罐，加入IOL發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基，121 V滅菌20分鐘，調(diào)節(jié)溫度至 30 °C，用氨水調(diào)節(jié)pH至5. 0-5. 5，加入PTMl 13mL(4. 35mL/L)和ImL消泡劑，接入種子 菌(1 10)。發(fā)酵過(guò)程中溫度控制在30°C以下，通氣量維持在2vvm以上，轉(zhuǎn)速控制在 300-800rpm之間，維持溶氧在20 %以上。發(fā)酵分為三個(gè)階段生長(zhǎng)期，從加入種子菌，培養(yǎng)約16-24小時(shí)，直到將培養(yǎng)基中 的甘油耗盡，表現(xiàn)為溶氧長(zhǎng)時(shí)間在低水平濃度，突然上升到80%或以上。之后進(jìn)入甘油促 生長(zhǎng)期，通過(guò)提高發(fā)酵罐內(nèi)菌密度來(lái)增加目的蛋白的表達(dá)量補(bǔ)加50%甘油(含有PTM1， 12mL/L) 300mL,補(bǔ)料速度為lSmLL—l·1，持續(xù)4_6小時(shí)。最后進(jìn)入誘導(dǎo)期，用氨水或磷酸調(diào)節(jié) PH至所需值，流加100%甲醇(含有PTMl，12mL/L)并同時(shí)加入其它碳源(如甘油或山梨 醇)為菌體生長(zhǎng)和表達(dá)提供能量，100%甲醇的流加速度從ImL L-1IT1經(jīng)10小時(shí)線性上升至 3mL L^h-1,持續(xù)96小時(shí)，期間如果溶氧低于20%就通過(guò)增加通氣量和轉(zhuǎn)速來(lái)提高罐內(nèi)培養(yǎng) 基的溶氧濃度或者暫停補(bǔ)料來(lái)維持溶氧在20%以上的水平。由于畢赤酵母生長(zhǎng)會(huì)產(chǎn)酸性代謝物，在發(fā)酵過(guò)程中，用發(fā)酵罐系統(tǒng)泵自動(dòng)補(bǔ)入 37%氨水，調(diào)節(jié)罐內(nèi)pH值，及時(shí)補(bǔ)充消泡劑。并每隔24小時(shí)取樣測(cè)定0D_及菌體濕重，同 時(shí)將發(fā)酵上清進(jìn)行抗菌活性檢測(cè)。放料，發(fā)酵液經(jīng)噴霧干燥，得到抗菌肽HKPLP的畢赤酵母 制品。(7)重組抗菌肽HKPLP最小抑菌濃度(MIC)的測(cè)定MIC 將測(cè)試菌株培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的菌液稀釋為約5X 106CFU/mL，加入96孔培 養(yǎng)板中，測(cè)試孔每孔加入菌液90uL，然后加入倍比稀釋的不同濃度的抗菌肽溶液，IOuL/ 孔。陽(yáng)性對(duì)照為IOOuL/孔的菌液，陰性對(duì)照為相應(yīng)的IOOuL培養(yǎng)基。然后于37°C慢搖培養(yǎng) 約16h，用酶標(biāo)儀測(cè)0D·。抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的最低濃度即為MIC，結(jié)果見(jiàn)表1。
表1重組抗菌肽HKPLP的MIC
權(quán)利要求
一種抗菌肽基因轉(zhuǎn)化畢赤酵母工程菌，其特征是一種抗菌肽基因hkplp轉(zhuǎn)化KM71、GS115和X33等畢赤酵母菌株而制得的工程菌。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗菌肽基因轉(zhuǎn)化畢赤酵母工程菌，其特征在于所述的載體是 pPIC3. 5K、pPIC9K、pPICZ α A、pGAPZ α A 等畢赤酵母表達(dá)載體。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗菌肽基因轉(zhuǎn)化畢赤酵母工程菌，其特征在于所述的基因是 抗菌肽基因 hkplp，其核苷酸序列如下TTT TTG GGA CTC ATT TTT CAC GGC CTG GTT CAC GCC GGA AAG CTGATC CAC GGG TTG ATC CAC AGG AAT CGC GGC0
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的抗菌肽基因，其特征在于，經(jīng)酵母偏愛(ài)密碼子優(yōu)化的DNA序列 為:TTT TTGGGA CTT ATT TTT CAC GGT CTG GTT CAC GCC GGA AAG CTG ATC CAC GGT TTG ATC CAC AGAAAT CGT GGT0
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述基因編碼蛋白HKPLP，其特征在于，其氨基酸序列為 FLGLIFHGLVHAGKLIHGLIHRNRG。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗菌肽HKPLP制品，其特征在于，制備方法包括如下步驟(1)將抗菌肽基因hkplp經(jīng)酵母偏愛(ài)密碼子優(yōu)化后設(shè)計(jì)引物合成基因序列；(2)將抗菌肽基因hkplp克隆到表達(dá)載體pPIC3.5K，得到重組表達(dá)載體 pPIC3. 5K-PLP ；(3)將重組表達(dá)載體pPIC3.5K-PLP電擊轉(zhuǎn)化畢赤酵母KM71 ；(4)在pH6.0的培養(yǎng)基，以濃度為的甲醇，對(duì)上述重組酵母基因工程菌誘導(dǎo)表達(dá)5天；(5)放料，發(fā)酵液經(jīng)80°C以上高溫處理后，噴霧干燥得到轉(zhuǎn)抗菌肽HKPLP的制品。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的抗菌肽HKPLP制品，其特征在于所敘述的抗菌肽在養(yǎng)殖中的應(yīng)用。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的抗菌肽HKPLP制品，其特征在于，所述及的應(yīng)用是在制備飼料 添加劑，促進(jìn)家禽家畜的生長(zhǎng)。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種來(lái)源于大海馬的天然抗菌肽HKPLP和編碼該蛋白的基因hkplp，其DNA序列如序列表中1所示，該基因編碼的蛋白(HKPLP)的氨基酸序列如序列列表中2所示。本發(fā)明根據(jù)酵母偏愛(ài)密碼子重新設(shè)計(jì)新的hkplp抗菌肽基因，合成其DNA序列轉(zhuǎn)化于畢赤酵母KM71中表達(dá)，形成抗菌肽基因的畢赤酵母工程菌。同時(shí)優(yōu)化該菌發(fā)酵條件，達(dá)到高密度發(fā)酵和高效表達(dá)的效果。該工程菌發(fā)酵液對(duì)Gram+菌、Gram-菌及真菌等均有明顯的抑制作用。將發(fā)酵液經(jīng)處理的產(chǎn)品添加到對(duì)蝦、雞等的飼料中，均達(dá)到較好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。該抗菌肽制品能夠代替抗生素，能夠預(yù)防消化道疾病、促進(jìn)生長(zhǎng)、增加體重，可以作為畜禽和水產(chǎn)飼料添加劑。
文檔編號(hào)A23K1/17GK101988038SQ200910041558
公開(kāi)日2011年3月23日 申請(qǐng)日期2009年7月31日 優(yōu)先權(quán)日2009年7月31日
發(fā)明者吳松青, 徐安龍, 徐梁洪, 李本濤, 梁東, 王瑞, 荊琛峰, 黃海林, 黃賽鴛 申請(qǐng)人:廣東中大南海海洋生物技術(shù)工程中心有限公司