專(zhuān)利名稱(chēng)：：活體仔豬心臟缺血再灌注模型及模型的建立方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種活體仔豬心臟缺血再灌注模型及模型的建立方法。
背景技術(shù)：
：z動(dòng)物器官的利用為近半個(gè)世紀(jì)以來(lái)研究的熱點(diǎn)，取得令人振奮的成果。而在動(dòng)物的器官再利用過(guò)程中會(huì)經(jīng)歷缺血再灌注損傷(ischemiareperfusioninjury,IRI)。缺血再灌注損傷是指組織器官缺血后再灌注，不僅不能使組織器官功能恢復(fù)，反而加重組織器官的功能障礙和結(jié)構(gòu)損傷。缺血再灌注損傷在許多重要器官包括心、肝、肺、腎、胃腸道等均可發(fā)生。如果對(duì)動(dòng)物器官進(jìn)行移植，那么移植器官經(jīng)缺血損傷后，隨著血流的開(kāi)放，又會(huì)經(jīng)歷第二次打擊。會(huì)^f吏器官的損傷進(jìn)一步加劇。心臟是一個(gè)耗氧量高而儲(chǔ)備能力很低的器官。心臟在缺血幾秒鐘后就耗盡自身的氧而使有氧代謝轉(zhuǎn)變?yōu)闊o(wú)氧代謝。缺血時(shí)間長(zhǎng)將發(fā)生心肌細(xì)胞的變性和壞死。而缺血心肌迅速恢復(fù)灌注使心肌損傷進(jìn)一步加重。在移植過(guò)程中器官會(huì)經(jīng)受缺血再灌注損傷的影響，這對(duì)手術(shù)的成功與否起著重要的作用。所以如何評(píng)價(jià)在手術(shù)前后器官組織的損傷情況是一個(gè)重要的問(wèn)題。目前在我國(guó)，豬的主要《介值還是體現(xiàn)在肉用價(jià)值上，而對(duì)豬器官的功能性開(kāi)發(fā)的研究，特別是活體仔豬心肌缺血再灌注研究實(shí)驗(yàn)很少報(bào)道。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明是為了克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足之處，提供一種以活體仔豬為對(duì)象，動(dòng)物品種普遍，成本較低廉，操作方便的心臟缺血再灌注模型及模型的建立方法。本發(fā)明通過(guò)下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)一種活體仔豬心臟缺血再灌注模型，其特征在于，將活體仔豬開(kāi)胸手術(shù)，進(jìn)行心臟冠狀動(dòng)脈左旋支結(jié)扎，之后再放開(kāi)結(jié)扎線，得到活體仔豬心臟缺血再灌注模型。一種活體仔豬心臟缺血再灌注模型的建立方法，其特征在于，包括下3述步驟(1)手術(shù)前的祠養(yǎng)管理仔豬采用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)的規(guī)定進(jìn)行飼養(yǎng)。(2)手術(shù)前預(yù)處理選擇體溫正常、精神狀態(tài)良好、無(wú)異常表現(xiàn)的健康活體仔豬作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，仔豬麻醉前禁食12h。(3)麻醉按照每千克體重肌肉注射乙酰丙溱O.5mg、阿托品0.04mg、846麻醉合劑0.03mL進(jìn)行基礎(chǔ)麻醉，10min后按照每千克體重肌肉注射舒泰50麻醉劑2mg進(jìn)行麻醉。肌肉注射可以選擇臀部或背部肌肉。(4)固定待活體仔豬麻醉后，右側(cè)臥位保定在手術(shù)臺(tái)上；將仔豬進(jìn)行氣管插管，接呼吸機(jī)進(jìn)行機(jī)械通氣；使用呼吸機(jī)內(nèi)自動(dòng)吸入氣體內(nèi)濃度為2%的異氟烷穩(wěn)定10min，檢測(cè)心臟和呼吸頻率，測(cè)量肛門(mén)溫度；(5)開(kāi)胸將麻醉后心臟和呼吸正常、肛溫正常的仔豬用碟酒在左胸部皮膚表面進(jìn)行消毒，用刮毛器清除豬毛，用手術(shù)刀在第3、4肋間切開(kāi)皮膚，在心跳搏動(dòng)處分離肋間肌肉，并用撐開(kāi)器打開(kāi)胸腔，暴露心包和肺，縱形切開(kāi)心包；(6)結(jié)扎切開(kāi)心包后找到左心耳，分離左心耳耳下脂肪，分離回旋支動(dòng)脈，用結(jié)扎線結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左旋支；(7)縫合結(jié)扎一定時(shí)間后，打開(kāi)結(jié)扎線，之后縫合心包，逐層縫合肋骨、肌肉，縫合外部皮膚，用紗布對(duì)手術(shù)部位進(jìn)行包扎，得到仔豬心臟缺血再灌注模型。(8)手術(shù)后處理手術(shù)后待仔豬自主呼吸穩(wěn)定后拔出氣管插管，及時(shí)送回實(shí)驗(yàn)動(dòng)物觀察室。仔豬安置在寬敞的動(dòng)物消化代謝籠內(nèi)，室內(nèi)溫度22~25。C，相對(duì)濕度65~68%，清潔衛(wèi)生。分別2次肌肉注射氨千西林納，每次注射藥量為O.5mg，兩次間隔4小時(shí)。按標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)^亍飼養(yǎng)。本發(fā)明具有下述技術(shù)效果豬在解剖、生理、營(yíng)養(yǎng)和新陳代謝等方面與人類(lèi)非常相似，豬的心血管系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、皮膚、營(yíng)養(yǎng)需要、骨骼發(fā)育以及礦物質(zhì)代謝等都與人的情況極其相似。本發(fā)明成功構(gòu)建的活體仔豬心臟缺血再灌注模型，提供了一種新型的可供醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)的動(dòng)物種類(lèi)，即實(shí)驗(yàn)豬模型，成為研究人類(lèi)疾病的重要?jiǎng)游锬Ｐ?，并且是現(xiàn)在所研究的人造器官的主要供體。由于可供實(shí)驗(yàn)選擇的豬品種，其資源廣泛，數(shù)量群體大，動(dòng)物原料成本適宜。建立的仔豬活體開(kāi)胸冠狀動(dòng)脈結(jié)扎心臟缺血手術(shù)方法，為今后大量獲取豬心臟相關(guān)試驗(yàn)數(shù)據(jù)，提供了可行性，而且，操作方便。確定的活體豬心臟手術(shù)相關(guān)的血像影響指標(biāo)，具有臨床醫(yī)學(xué)研究參考價(jià)值。具體實(shí)施例方式以下結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。l.手術(shù)前的仔豬詞養(yǎng)仔豬采用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)的規(guī)定進(jìn)行飼養(yǎng)。選擇保育期長(zhǎng)白和大約克夏品種活體仔豬作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，具體飼養(yǎng)方法:i口下1.1實(shí)驗(yàn)仔豬的飼養(yǎng)環(huán)境仔豬在保育舍內(nèi)進(jìn)行飼養(yǎng)，自由采食，以鴨嘴式飲水器提供充足潔凈飲水。豬舍溫度2225。C，濕度65~68%,每天衛(wèi)生清潔2次，舍內(nèi)通風(fēng)采光良好。采用百毒消、滅毒威進(jìn)行消毒，2~3天/次。1.2實(shí)驗(yàn)仔豬日糧營(yíng)養(yǎng)配比全價(jià)日糧配制參照美國(guó)NRC豬營(yíng)養(yǎng)需要量標(biāo)準(zhǔn)(第10版1998年)瘦肉型豬體重10~20kg，基礎(chǔ)日糧及營(yíng)養(yǎng)成分組成見(jiàn)表l。分別于上午8:00、中午ll:00、下午17:00，每天3次祠喂。1.3仔豬手術(shù)前預(yù)飼期在手術(shù)前7天，將實(shí)驗(yàn)仔豬運(yùn)送至中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)消化代謝實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心血瘺管仔豬舍進(jìn)行飼養(yǎng)，以減少仔豬的環(huán)境應(yīng)激，仔豬采食量及體溫檢測(cè)均正常，并記錄仔豬的健康狀況。該試驗(yàn)動(dòng)物中心實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)SYXK(京2004-0010)。實(shí)驗(yàn)在封閉的豬舍內(nèi)進(jìn)行，每只仔豬放于不同的實(shí)驗(yàn)消化代謝籠內(nèi)分開(kāi)飼養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)豬舍拋光地面，自然采光，自由飲水，豬舍內(nèi)溫度在22-25'C,相對(duì)濕度65~68%。每日飼喂3次(早8:00,11:30，下午17:00)，清理衛(wèi)生3次，保持舍內(nèi)的清潔，隨時(shí)觀察并記錄實(shí)驗(yàn)豬的身體狀況、食欲、精神狀況、糞便等情況。實(shí)驗(yàn)期間，按常規(guī)程序消毒。采食日糧配比與表l相同。表l*原料組成成分(質(zhì)量%)營(yíng)養(yǎng)水平玉米Corn51.40消化能DE(MJ/kg)13.05大豆禾白Soybeanmeal16.00粗蛋白質(zhì)CP(9018.87<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>*(1)其中粗蛋白質(zhì)、鈣、總磷為實(shí)測(cè)值，其余均為計(jì)算值。*(2)1%預(yù)混料為每kg全價(jià)伺料提供Cu200mg，F(xiàn)el30mg,Znl30mg,Mn60mg,SeO.3mg,10.4mg,VA8000IU,VD31800IU,VB30IU，VK33.56mg，VB!1.8mg，VB26mg，VB61.26mg，VB120.02mg,葉酸0.3mg，生物素0.44mg，煙酸32mg，d-泛酸15mg，膽堿500mg,金霉素75mg，洛克沙生40mg。2.建立活體仔豬心臟缺血再灌注模型2.1實(shí)-瞼分組預(yù)飼7天后，選擇體溫正常、精神狀態(tài)良好、無(wú)異常表現(xiàn)的健康仔豬作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，隨機(jī)分為A、B和C三個(gè)處理組，每組重復(fù)數(shù)4頭。A、B和C三個(gè)處理組，體重分別平均為16.99土3.85kg、16.49±3.13kg和16.97±3.71kg。2.2仔豬手術(shù)前預(yù)處理仔豬麻醉前禁食12h，仔豬精神狀況良好，無(wú)異常表現(xiàn)。2.3活體仔豬心臟缺血再灌注制備手術(shù)(1)麻醉按照每千克體重肌肉注射乙酰丙嗪O.5mg、阿托品O.04mg、846麻醉合劑0.03mL進(jìn)行基礎(chǔ)麻醉，10min后按照每千克體重肌肉注射舒泰50麻醉劑2mg進(jìn)行麻醉。(2)固定待仔豬麻醉后，右側(cè)臥位保定在手術(shù)臺(tái)上；將仔豬進(jìn)行氣管插管，接呼吸機(jī)進(jìn)行機(jī)械通氣，測(cè)得潮氣量為10~15mL/kg，吸呼比為2:1，氣道壓力為15cm/kg，呼吸次數(shù)為10次/min。使用呼吸機(jī)內(nèi)自動(dòng)吸入氣體內(nèi)濃度為2n/。異氟烷穩(wěn)定10min，檢測(cè)心臟和呼吸頻率，測(cè)量肛門(mén)溫度。(3)開(kāi)胸將麻醉后心臟和呼吸正常、肛門(mén)溫度為3839。C的仔豬，用碘酒在左胸部皮膚表面進(jìn)行消毒，用刮毛器清除豬毛，用手術(shù)刀在第3、4肋間切開(kāi)皮膚，在心跳搏動(dòng)處分離肋間肌肉，并用撐開(kāi)器打開(kāi)胸腔，暴露心包和肺，縱形切開(kāi)心包。(4)結(jié)扎切開(kāi)心包后找到左心耳，分離左心耳耳下脂肪，分離回旋支動(dòng)脈，動(dòng)脈下留置7號(hào)結(jié)扎線，用結(jié)扎線結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左旋支。(5)縫合處理組A冠狀動(dòng)脈左回旋支結(jié)扎時(shí)間2.5min，處理組B冠狀動(dòng)脈左回旋支結(jié)扎時(shí)間為5min，處理組C冠狀動(dòng)J3^左回旋支結(jié)扎時(shí)間為10min,之后打開(kāi)結(jié)扎線，縫合心包，逐層縫合肋骨、肌肉，縫合外部皮膚，用紗布對(duì)手術(shù)部位進(jìn)行包扎，得到活體仔豬心臟缺血再灌注模型。(6)手術(shù)后處理術(shù)后待仔豬自主呼吸穩(wěn)定后拔出氣管插管，及時(shí)送回實(shí)驗(yàn)動(dòng)物觀察室。仔豬安置在寬敞的動(dòng)物消化代謝籠內(nèi)，室內(nèi)溫度22~25°C，相對(duì)濕度65~68%，清潔衛(wèi)生。分別2次肌肉注射氨千西林納，每次注射藥量為0.5mg，兩次間隔4小時(shí)。按標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行飼養(yǎng)。自由采食、自由飲水。記錄仔豬手術(shù)后反應(yīng)。1.仔豬血清心肌肌鉤蛋白I(cTnl)、磷酸肌酸激酶(CK-MB)、乳酸脫氫酶(LDH)、磷酸肌酸激酶(CK)含量的測(cè)定通過(guò)仔豬手術(shù)前后設(shè)定6個(gè)時(shí)間點(diǎn)，采集外周靜脈血。6個(gè)時(shí)間點(diǎn)分別是仔豬活體手術(shù)前30min、冠狀動(dòng)脈結(jié)扎線打開(kāi)后lh(T2，)、冠狀再灌注動(dòng)物模型，仔豬在手術(shù)后存活時(shí)間達(dá)到8h。實(shí)驗(yàn)后相關(guān)指標(biāo)的測(cè)定動(dòng)脈結(jié)扎線打開(kāi)后2h(T3)、冠狀動(dòng)脈結(jié)扎線打開(kāi)后4h(T4)、冠狀動(dòng)脈結(jié)扎線打開(kāi)后6h(T5)和冠狀動(dòng)脈結(jié)扎線打開(kāi)后8h(T6)。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)采血3mL,靜置10min，2500rpm/min離心15min，分離血清后分裝，-70°(3保存，測(cè)定時(shí)，冷凍血清;故置室溫2h，自然溶解待測(cè)樣品。采用ELISA法測(cè)定血清cTnl和CK-MB含量，嚴(yán)格按照試劑盒要求進(jìn)行檢觀'j。仔豬不同時(shí)間血清心肌肌鉤蛋白I含量測(cè)定結(jié)果如表2所示，仔豬不同時(shí)間血清磷酸肌酸激酶同功酶(CK-MB)含量測(cè)定結(jié)果如表3所示。其中，表中的p值表示實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)通過(guò)數(shù)理統(tǒng)計(jì)，差異顯著性結(jié)果。表2(單位ng/mL)<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>從表2可以看出，手術(shù)前各處理組心肌肌釣蛋白I的含量均在正常范圍之內(nèi)。手術(shù)后3個(gè)處理組血清中cTnl有不同程度的升高。隨著時(shí)間的延長(zhǎng),cTnl的含量不斷上升，組C上升更為明顯。表3(單位U/L)<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>從表3可以看出，手術(shù)前3個(gè)處理組CK-MB均正常，手術(shù)后CK-MB開(kāi)始上升，各處理組之間相比有顯著差異(尸<0.05)用全自動(dòng)生化分析儀分別測(cè)定手術(shù)前、手術(shù)后4h所有組仔豬血清樣本中肌酸磷酸激酶、乳酸脫氫酶的含量，測(cè)定結(jié)果如表4所示。表4(單位U/L)<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>表4可以看出，手術(shù)前和手術(shù)后4h血清中LDH和CK相比，手術(shù)后4h血清中的LDH和CK與手術(shù)前相比均差異顯著CP<0.05)。以上數(shù)據(jù)說(shuō)明在手術(shù)過(guò)程中，隨著冠狀動(dòng)脈左旋支的開(kāi)放，仔豬心臟受到缺血再灌注的損傷，l吏得cTnl、CK-MB、LDH和CK這些心臟損傷標(biāo)志物不斷釋放到血液中，且3個(gè)處理組之間相比較表現(xiàn)差異顯著，心臟損傷的程度與冠狀動(dòng)脈結(jié)扎時(shí)間的長(zhǎng)短有關(guān)。本發(fā)明制成的動(dòng)物模型對(duì)缺血再灌注反應(yīng)明顯，有效。2.梗死心肌范圍的測(cè)定實(shí)驗(yàn)結(jié)束后重新結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左旋支，左心室內(nèi)緩慢推注1%的EvensBlue,以區(qū)分缺血區(qū)心肌和非缺血區(qū)心肌，非缺血區(qū)心肌被染成藍(lán)色，而缺血區(qū)心肌不著色。處死實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，速取心臟，方欠入冰的生理鹽水中洗凈血液，剪去非左心室部分，用濾紙吸干水分后稱(chēng)重，垂直于左心室長(zhǎng)軸連續(xù)切成10mm的薄片，分離缺血區(qū)和非缺血區(qū)心肌，稱(chēng)取缺血區(qū)心肌重量。再將缺血區(qū)心肌放入含有(10g/L)氯化三苯四氮唑(TTC)的PBS(pH=7.4)中，37。C浸浴15min，未梗死區(qū)染成磚紅色，梗死區(qū)呈灰白色，分離梗死區(qū)心肌在電子天平上稱(chēng)重，記錄數(shù)據(jù)。然后置于4%福爾馬林溶液中固定、保存。心肌缺血面積=缺血區(qū)心肌重量/左室重量心肌梗死面積=梗死區(qū)心肌重量/缺血區(qū)重量心臟缺血面積、梗死面積測(cè)定值如表5所示，.表5<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>由表5可以看出，手術(shù)后3個(gè)處理組仔豬左心室發(fā)生了不同程度的缺血和梗死，相比差異顯著。說(shuō)明不同的結(jié)扎時(shí)間造成了仔豬左心室不同程度的缺血缺氧，本發(fā)明閉合冠狀動(dòng)脈有效。綜上所述，本發(fā)明通過(guò)閉合仔豬冠狀動(dòng)脈左旋支，建立心肌再灌注的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停芯炕铙w仔豬缺血再灌注對(duì)心臟損傷，對(duì)缺血再灌注反應(yīng)明顯、有效，為豬器官的開(kāi)發(fā)利用提供了新的途徑。權(quán)利要求1、一種活體仔豬心臟缺血再灌注模型，其特征在于，將活體仔豬開(kāi)胸手術(shù)，進(jìn)行心臟冠狀動(dòng)脈左旋支結(jié)扎，之后再放開(kāi)結(jié)扎線，得到活體仔豬心臟缺血再灌注模型。2、一種權(quán)利要求1所述的活體仔豬心臟缺血再灌注模型的建立方法，其特征在于，包括下述步驟(1)手術(shù)前的飼養(yǎng)管理仔豬采用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)的規(guī)定進(jìn)行飼養(yǎng)；(2)手術(shù)前預(yù)處理選擇體溫正常、精神狀態(tài)良好、無(wú)異常表現(xiàn)的健康活體仔豬作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，仔豬麻醉前禁食12h;(3)麻醉按照每千克體重肌肉注射乙酰丙漆0.5mg、阿托品0.04mg、846麻醉合劑0.03mL進(jìn)行基礎(chǔ)麻醉，10min后按照每千克體重肌肉注射舒泰50麻醉劑2mg進(jìn)行麻醉；(4)固定待活體仔豬麻醉后，右側(cè)臥位保定在手術(shù)臺(tái)上；將仔豬進(jìn)行氣管插管，接呼吸機(jī)進(jìn)行機(jī)械通氣；使用呼吸機(jī)內(nèi)自動(dòng)吸入氣體內(nèi)濃度為2%的異氟烷穩(wěn)定10min,檢測(cè)心臟和呼吸頻率，測(cè)量肛門(mén)溫度；(5)開(kāi)胸將麻醉后心臟和呼吸正常、肛溫正常的仔豬用碘酒在左胸部皮膚表面進(jìn)行消毒，用刮毛器清除豬毛，用手術(shù)刀在第3、4肋間切開(kāi)皮膚，在心跳搏動(dòng)處分離肋間肌肉，并用撐開(kāi)器打開(kāi)胸腔，暴露心包和肺，縱形切開(kāi)心包；(6)結(jié)扎切開(kāi)心包后找到左心耳，分離左心耳耳下脂肪，分離回旋支動(dòng)脈，用結(jié)扎線結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左旋支；(7)縫合結(jié)扎一定時(shí)間后，打開(kāi)結(jié)扎線，之后縫合心包，逐層縫合肋骨、肌肉，縫合外部皮膚，用紗布對(duì)手術(shù)部位進(jìn)行包扎，得到仔豬心臟缺血再灌注模型。3、根據(jù)權(quán)利要求2所述的活體仔豬心臟缺血再灌注模型的建立方法，其特征在于，手術(shù)后待仔豬自主呼吸穩(wěn)定后拔出氣管插管，及時(shí)送回實(shí)驗(yàn)動(dòng)物觀察室；仔豬安置在寬敞的動(dòng)物消化代謝籠內(nèi)，室內(nèi)溫度為18°C，相對(duì)濕度為65%，清潔衛(wèi)生；分別2次肌肉注射氨爺西林納，每次注射藥量為0.5mg，兩次間隔4小時(shí)；按標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行飼養(yǎng)。全文摘要本發(fā)明公開(kāi)了一種活體仔豬心臟缺血再灌注模型及模型的建立方法，旨在提供一種以活體仔豬為對(duì)象，動(dòng)物品種普遍，成本較低廉，操作方便的心臟缺血再灌注模型及模型的建立方法。將活體仔豬開(kāi)胸手術(shù)，進(jìn)行心臟冠狀動(dòng)脈左旋支結(jié)扎，之后再放開(kāi)結(jié)扎線，得到活體仔豬心臟缺血再灌注模型。本發(fā)明構(gòu)建的活體仔豬心臟缺血再灌注模型，提供了一種新型的可供醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)的動(dòng)物種類(lèi)，即實(shí)驗(yàn)豬模型，成為研究人類(lèi)疾病的重要?jiǎng)游锬Ｐ?。由于可供?shí)驗(yàn)選擇的豬品種，其資源廣泛，數(shù)量群體大，動(dòng)物原料成本適宜。建立的仔豬活體開(kāi)胸冠狀動(dòng)脈結(jié)扎心臟缺血手術(shù)方法，為今后大量獲取豬心臟相關(guān)試驗(yàn)數(shù)據(jù)，提供了可行性，而且，操作方便，具有臨床醫(yī)學(xué)研究參考價(jià)值。文檔編號(hào)A01K67/027GK101601374SQ20091006949公開(kāi)日2009年12月16日申請(qǐng)日期2009年6月30日優(yōu)先權(quán)日2009年6月30日發(fā)明者偉趙,亮郭申請(qǐng)人:天津農(nóng)學(xué)院