專利名稱：綠針假單胞桔黃亞種Pa40及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種微生物新菌株及其應(yīng)用，具體涉及一種綠針假單 胞桔黃亞種菌株及其在病害生物防治中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
小麥紋枯病(i /^zoctom'a cerea/k )又稱立枯病、尖眼斑病，是分 布范圍甚廣的世界性病害之一。主要發(fā)生在世界各溫帶小麥區(qū)。早在 1934年國(guó)外即有報(bào)道。此病在我國(guó)雖早有發(fā)生，但危害較輕。自70 年代中后期開(kāi)始，隨著小麥品種的更換及豐產(chǎn)栽培措施的推廣應(yīng)用 (如早播、灌溉、高肥等)，該病在我國(guó)各冬麥區(qū)普遍發(fā)生，并有逐年 加重的趨勢(shì)。病區(qū)由南向北擴(kuò)展，對(duì)小麥的高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)構(gòu)成較大的威脅。 尤以江蘇、浙江、安徽、山東、河南、陜西、貴州、湖北及四川等省 麥區(qū)發(fā)生普遍且危害嚴(yán)重。 一般病田病株率為10%-20%,重病田塊 病株率可達(dá)60%-80%以上，特別嚴(yán)重的田塊枯白穗率可高達(dá)20%以 上。小麥紋枯病發(fā)病越早，造成的產(chǎn)量損失越重，輕的減產(chǎn)5%-10%， 重的可減產(chǎn)20%-40%，甚至造成枯孕穗、枯白穗，更為嚴(yán)重的可導(dǎo) 致顆粒無(wú)收。
目前防治小麥紋枯病主要釆取的還是"一拌一噴"的化學(xué)防治技 術(shù)。藥劑拌種以三唑類藥劑為主。藥劑拌種的防病效果因田間病情的 輕重而有高低，在輕病田和一般病田，防病效果可持續(xù)到小麥生長(zhǎng)后 期，但在發(fā)病較重的麥田只持續(xù)到3月中下旬或4月上旬，此后病情 會(huì)激增。目前防治小麥紋枯病藥劑主要為井岡霉素和三唑類藥劑?；?學(xué)藥劑能有效防治病害，但對(duì)小麥產(chǎn)量有不同程度的影響。
目前國(guó)內(nèi)已發(fā)現(xiàn)對(duì)小麥紋枯病菌具有較強(qiáng)抑制作用的生防菌株 有放線菌S024、蠟樣芽孢桿菌2011 、2012、2013和枯草芽孢桿菌2014等，這些菌株處理種植或植株后均能在植株內(nèi)定殖，且能促進(jìn)小麥生 長(zhǎng)，提高品質(zhì)及抗逆性。南京農(nóng)業(yè)大學(xué)植保系王金生等人經(jīng)多年研究， 篩選出對(duì)小麥紋枯病有明顯抑制作用的B3菌株(商品名為麥豐寧)，
在自然條件下，B3菌粉拌種防效可達(dá)60%以上，可促進(jìn)小麥種子發(fā) 芽，提高發(fā)芽率和出苗率，并增產(chǎn)13.7%。陳延熙等用拮抗真菌和細(xì) 菌防治小麥紋枯病，田間防效為20%。史建榮等人從小麥植株上分 離篩選出Rb2、 Rb26等芽孢桿菌，室內(nèi)抑苗測(cè)定及苗期盆栽實(shí)驗(yàn)表 明它們對(duì)小麥紋枯病有一定抑制作用；陳厚德等人通過(guò)盆栽和田間試 驗(yàn)表明，接種 一種滑刃線蟲(chóng)能明顯降低小麥紋枯病的發(fā)病程度； Innocenti等在溫室條件下須!)定了 7Hc/ ocie，a WravzW<ie、 Z/^尸z/a"w附、 77o"g7.6nafc/zz'a/M附、C7owostac/z;^ rose"和5ac/〃ws sw6"/z、 X寸/J、麥紋才古 病的拮抗效果，發(fā)現(xiàn)與對(duì)照相比，用7Hc/;Wwm"屬菌株處理種子后 長(zhǎng)出的麥苗紋枯病的發(fā)生明顯減少了 ， Bacz7/w^Z^'to對(duì)小麥紋枯病 也有較好的拮抗作用，但拮抗性稍微弱于7Hc/^m^屬菌株。但將 綠針假單胞桔黃亞種用于小麥紋枯病的防治中國(guó)內(nèi)外均未見(jiàn)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一株綠針假單胞桔黃亞種新菌株及其在 植物病害生物防治以及促生中的應(yīng)用。
本發(fā)明菌株是從山東省桓臺(tái)縣小麥實(shí)驗(yàn)田中分離得到的綠針假 單胞桔黃亞種(尸化"<^0腳""& subsp.血ra"daca)新菌抹
Pa40。該菌株已于2008年11月26日在中國(guó)微生物菌種保藏管理委 員會(huì)普通微生物中心(地址北京巿朝陽(yáng)區(qū)木屯路甲3號(hào)，中國(guó)科學(xué) 院微生物研究所，郵編100101)保藏，分類命名為綠針假單胞桔黃 亞種(i^eMtfo歸wos. c/z/orara/ to subsp.爿wra"toca)，保藏號(hào)為CGMCC No. 2764。
Pa40具體通過(guò)如下方法分離得到從小麥實(shí)驗(yàn)田中釆集土樣， 取5g的土溶解到在45ml無(wú)菌生理鹽水的三角瓶中，28°C， 120rpm
4搖床震蕩10 min后靜止10 min,取100 的上清液加入到裝有900 |il 生理鹽水的Eppendorf管中，進(jìn)行連續(xù)梯度稀釋。分別取以上土壤懸 浮液和l(T2， 1(T3, 1(^倍土壤懸浮液稀釋液100pl在NA培養(yǎng)基(牛 肉膏5g/1,蛋白胨10g/l，NaC15g/l，瓊脂15g/l)平板上均勻涂板， 超凈工作臺(tái)內(nèi)吹干，每個(gè)濃度重復(fù)3次，，28i:.溫箱內(nèi)培養(yǎng)36 h,用 無(wú)菌牙簽挑取細(xì)菌單菌落劃線純化后，以小麥紋枯病菌為靶標(biāo)菌，利 用平板對(duì)峙法進(jìn)行拮抗菌的初步篩選；對(duì)獲得的拮抗菌進(jìn)行平板、溫 室和田間防治小麥紋枯病實(shí)驗(yàn)，最終篩選出性狀優(yōu)良的生防菌株綠針 假單胞桔黃亞種(尸sewfito卿"os. c/z/orara/ to subsp. Pa40 CGMCCNo.2764。
綜合假單胞菌的形態(tài)學(xué)特征、生理生化特性、16SrDNA序列、 "^D基因序列、wcA基因序列和c"rA基因序列和BIOLOG碳源代 謝譜結(jié)果，將其鑒定為綠針假單胞桔黃亞種尸^M^附omw. cWorarapto subsp. awraw"aca;。
生防相關(guān)性狀檢測(cè)表明，Pa40能夠產(chǎn)生蛋白酶、HCN以及嗜鐵 素。抑菌實(shí)驗(yàn)表明，Pa40對(duì)部分病原真菌具有抑制作用，例如對(duì)串 珠鐮刀病菌、小長(zhǎng)喙霉病菌、百合根腐病菌、桃褐病菌、番漆早疫病 菌、稻瘟病菌、辣椒灰霉病菌、番癡灰霉病菌、棉花枯萎病菌、芽菜 斑枯病菌、番茄葉霉病菌等均有平板抑制作用。對(duì)部分病原細(xì)菌亦具 有抑制作用，例如對(duì)葡萄根癌病菌、土壤根癌病菌、棉花角斑病菌、 茄青枯病菌、丁香假單胞菌、褶皺假單胞菌等均有平板抑制作用。
在平板、溫室和田間，以小麥為指示作物檢測(cè)了生防菌株P(guān)a40 對(duì)小麥紋枯病菌的防治效果，結(jié)果表明Pa40對(duì)平板、溫室和田間小 麥紋枯病的防治效果分別為53.97%、 68.10%和72.46%,其中溫室 和田間對(duì)小麥紋枯病的防治效果均高于井岡霉素。
本領(lǐng)域技術(shù)人員很容易想到將本發(fā)明菌株發(fā)酵液或菌懸液作為 農(nóng)藥的有效成分用于植物病害的生物防治。b本發(fā)明還提供Pa40發(fā)酵培養(yǎng)方法，包括菌種活化、種子液培養(yǎng)、 發(fā)酵罐發(fā)酵等步驟，具體包括如下步驟
1、 菌種活化
使用KB培養(yǎng)基，培養(yǎng)基配方為蛋白胨20g/l,甘油10ml/l, MgSCV7H20 1.5g/l, K2HP04 1.5g/l，瓊脂15g/l。將綠針假單胞桔黃 亞種接種Pa40接種于KB培養(yǎng)基斜面上，28"C培養(yǎng)48h。
2、 種子液的培養(yǎng)
種子培養(yǎng)用NY培養(yǎng)基，NY培養(yǎng)基的組成葡萄糖5-8g/l，酵 母膏5-8g/l, NaC12誦4g/1， KH2P04 0.5-0.8 g, MgS04.7H20 1-1.2 g/1 ， pH值為7.0-7.2。將活化好的將綠針假單胞桔黃亞種Pa40用生理鹽水 配制成108cfo/ml的菌懸液，以0.P/。的接種量接種于NY液體培養(yǎng)基 中，28。C搖床震蕩培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為180-200rpm，培養(yǎng)時(shí)間為40-48h。
3、 發(fā)酵罐發(fā)酵
發(fā)酵培養(yǎng)基組成為蔗糖10-12g/l,黃豆粉5-8g/l， (NH4)2S04 8-10 g/1, KH2P04 1-1.2 g, MgS04.7H20 1-1.2 g/1, CaC031-1.5 g/1 ， pH 值為7.0-7.5。把培養(yǎng)好的綠針假單胞桔黃亞種Pa40種子液以2%的 接種量接入發(fā)酵罐中，28°C,攪拌速度為180rpm,通氣量為1: 0.6-0.8(發(fā)酵液體積每分鐘通氣量體積)、罐壓1.5-2.0F/cm2。發(fā)酵 48h菌量達(dá)到8-10xl0Scfo/ml,獲得綠針假單胞桔黃亞種Pa40發(fā)酵液。
本發(fā)明綠針假單胞桔黃亞種Pa40除對(duì)小麥紋枯病有防治效果 外，對(duì)串珠鐮刀病、甘薯黑斑病、百合根腐病、桃褐病、番茄早疫病、 稻瘟病、辣椒灰霉病、番茄灰霉病、棉花枯萎病、芽菜斑枯病、番東 葉霉病等由病原真菌引起的病害和對(duì)葡萄根癌病、土壤根癌病、棉花 角斑病等由病原細(xì)菌引起的病害均有潛在的防治效果，具有很高的研 究和應(yīng)用價(jià)值。


圖1顯示的是Pa40的16S rDNA、 carA、 recA和WpD基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的凝膠電泳圖片，圖中1、 Marker, 2、空白對(duì)照；3、以Pa40 基因組為模板擴(kuò)增的16S rDNA (a)、 c^A ( b )、 W; D (c)和recA (d)基因。
圖2顯示的是Pa40對(duì)小麥紋枯病溫室防治效果，其中，左邊植 株為無(wú)菌水陰性對(duì)照，中間為20%井岡霉素可濕性粉劑陽(yáng)性對(duì)照，右 為Pa40菌懸液處理。
圖3顯示的是用脫脂牛奶平板對(duì)Pa40產(chǎn)蛋白酶的檢測(cè)。
圖4顯示的是對(duì)Pa40產(chǎn)HCN酸的檢測(cè)，圖中，左為陰性對(duì)照， 右為PA40菌株。
圖5顯示的是對(duì)Pa40嗜鐵素產(chǎn)生的檢測(cè)。
具體實(shí)施例方式
以下實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明的內(nèi)容，但不應(yīng)理解為對(duì)本發(fā)明的 限制。在不背離本發(fā)明精神和實(shí)質(zhì)的情況下，對(duì)本發(fā)明方法、步驟或 條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍。
若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟 知的常規(guī)手段。
實(shí)施例l Pa40的鑒定
綜合假單胞菌的形態(tài)學(xué)特征、生理生化特性、16SrDNA序列、 ^pD基因序列、wcA基因序列和carA基因序列和BIOLOG碳源代 謝譜結(jié)果，將其鑒定為綠針假單胞桔黃亞種尸M^fowo"w. c/j/orara/ to subsp. awra加Vzca。 具體鑒定結(jié)果如下
1、 菌體形態(tài)特征
革蘭氏染色陰性，電子顯微鏡觀察，菌體長(zhǎng)橢圓形。
2、 生理生化特性
綠針假單胞桔黃亞種 i^e油,"as. A/orar—& subsp. 爿wra油'aca Pa40 CGMCCNo.2764生理生化特性如表1所示革蘭氏陰性菌，嚴(yán)格好氧，硝酸鹽還原、淀粉水解、七葉靈利用、OC半乳糖 酶反應(yīng)陰性，氧化酶、精氨酸雙水解、明膠水解、卵磷脂酶、脂肪酶、 葡萄糖氧化產(chǎn)酸產(chǎn)氣、過(guò)氧化氫酶、脲酶、H2S產(chǎn)生、過(guò)敏性壞死反
應(yīng)陽(yáng)性；可以利用海藻糖、N-乙?；?D-葡萄糖胺、L-阿拉伯糖等作 為唯一碳源，不能利用5-酮基葡糖酸、山梨醇、L-巖藻糖等作為唯一碳源。
表1、綠針假單胞桔黃亞種PA40生理生化特性特性結(jié)果特性結(jié)果
革蘭氏反應(yīng)—碳源利用
果聚糖產(chǎn)生+5-酮基葡糖酸a—
氧化酶+山梨醇a—
精氨酸雙水解+L-巖藻糖a—
淀粉水解—木糖醇a—
明膠水解+N-乙酰基-D-葡萄糖胺 a+
七葉靈利用一海藻糖a+
a半乳糖酶—棉子糖a一
硝酸鹽還原-D-阿糖醇a—
卵磷脂酶+L-阿拉伯糖a+
脂肪酶+纖維二糖a—
葡萄糖氧化產(chǎn)酸產(chǎn)氣+麥芽糖a—
厭氧生長(zhǎng)-松二糖3—
過(guò)氧化氫酶+D-葡糖酸a+
脲酶+丙二酸a+
H2S產(chǎn)生+胸苷a—
耐鹽性7%D-甘露醇a+
過(guò)敏性壞死反應(yīng)+龍膽二糖a—
CC-環(huán)糊精a—
檸檬酸a+
溴代丁二酸a+
+,陽(yáng)性反應(yīng)；-,陰性反應(yīng)；a, BIOLOG測(cè)試結(jié)果
3、 16SrDNA序列分析
方法是提取綠針假單胞桔黃亞種/^eMdomowos c/z/orarap/^ subsp.做ra油'acaPa40 CGMCCNo.2764的基因組，用16S擴(kuò)增通用引物8F: 5、CGGGATCCAGAGTTTGATCCTGGCTCAGAACGAACG CT3、和1506R:5、CGGGATCCTACGGCTACCTTGTTACGACTTCACC CC3、.在如下PCR體系中擴(kuò)增50 pl擴(kuò)增體系，10 pmol引物，0.2 mM dNTP， 1.5 mM MgCl2， 2.5 U Taq DNA聚合酶(TaKaRa)， lxPCR buffer (TaKaRa), 25 ng基因組DNA作模板。PCR反應(yīng)條件為94 °C 5min預(yù)變性，94"變性30 s， 55。C退火30 s, 72。C延伸1 min， 30 個(gè)循環(huán)后72'C充分延伸5min。 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電 泳分析，用OMEGA公司的純化試劑盒Gel Extraction Kit純化回收 后連接TaKaRa公司的T載體pMD18-T。在Invitrogen公司用ABI 3730 DNA測(cè)序儀進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果如SEQ ID No.l所示。用BLAST 程序在GenBank (http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov)相應(yīng)序列比對(duì)的結(jié)果表 明綠針假單胞桔黃亞種i^ewdomowos c/z/orarap/zzi subsp. Pa40的16S rDNA序列與目前發(fā)表的綠針假單胞桔黃亞種 i^eMdcwo"as c/z/orara/ /^ rafe/ .爿wra" /ac(2其他菌才朱相比相似性達(dá)至!j 98.39%。
4.a^D基因序列、^cA基因序列和cwA基因序列測(cè)定。提取菌 株P(guān)a40基因組，a/pD基因選用引物為atpD-f 5、 CTGGGCCGSATCATGGACG3 、和atpD-d5 、 GTCCATGCCCAGGATSG CG3' PCR反應(yīng)體系同16SrDNA中反應(yīng)體系，PCR反應(yīng)條件為94 °C 5 min預(yù)變性，94。C變性30 s, 63°C~55°C touchdown每度2 個(gè)循環(huán)，時(shí)間30s; 94°C 30S, 53°C 30S, 72°C lmin, 72。C延伸1 min, 8個(gè)循環(huán)后72。C充分延伸5 min。 recA基因和carA基因選用引 物分別為carA-f 5、 TTCAACACCGCCATGACCGG 3、和carA-d 5、 TGATGRCCSAGGCAGATRCC 3、；腦A-f 5、TCSGGYAARACCA CSCTGAC3、和^cA-d 5、RTACCAGGCRCCGGACTTCT3、； PCR反 應(yīng)體系同16SrDNA中反應(yīng)體系，反應(yīng)條件為94°C 5 min預(yù)變性，94 。C變性30 s, 55。C退火20 s, 72°。延伸1 min, 25個(gè)循環(huán)后72°C充分延伸5min。 W/ D基因、 cA基因和carA基因PCR純化、連接 T載體、轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，以及測(cè)序比對(duì)均與16S rDNA序列測(cè) 定方法相同。Pa40的a^D基因、carA基因和 cA基因序列分別如 SEQ ID No.2~4所示。"/pD基因、carA基因和wcA基因序列在NCBI 用BLAST程序比對(duì)結(jié)果顯示，菌株P(guān)a40的a^ D、 carA和^cA三 個(gè)基因序列與綠針假單胞桔黃亞種尸^M(iomo"as c/2/orara/7/^ subsp. ^ra油'aca對(duì)應(yīng)的a^D、 carA和三個(gè)基因序列分別有98.97%、 99.2%和98.83%的相似性。
綜合菌體形態(tài)、生理生化特性、Biolog碳源代謝譜和16SrDNA、 fl》D、 c"rA和^cA基因序列，將生防菌株P(guān)a40鑒定為綠針假單 胞桔黃亞種尸化"(iomo"ay c/z/orara/7/^ subsp. "wra"http://aca 。
實(shí)施例2抑菌譜分析
對(duì)病原真菌的平板抑制檢測(cè)方法。用打空器打取5 mm直徑的靶 標(biāo)病原真菌接種于PDA平板中央，假單胞與靶標(biāo)菌成180。接種于靶 標(biāo)病原真菌兩測(cè)2.5 cm處，25。C培養(yǎng)4到6天后測(cè)量病原真菌菌落 直徑。以接種靶標(biāo)真菌而不接種假單胞的平板為對(duì)照。抑制生長(zhǎng)率按 照如下公式計(jì)算
抑制生長(zhǎng)率-(C-7)/Cx 100%
C:對(duì)照真菌生長(zhǎng)直徑
T:接種假單胞后真菌生長(zhǎng)直徑
對(duì)病原細(xì)菌平板抑制檢測(cè)方法。用雙層培養(yǎng)法檢測(cè)假單胞對(duì)病原 細(xì)菌的抑制情況。用King、B (蛋白胨20g,甘油10ml， K2HP04 1.5g， MgS04.7H20 1.5g,瓊脂18g，蒸餾水1000ml， pH 7.2.)培養(yǎng)基活化 假單胞后用生理鹽水配成1()Scfii/ml的菌懸液，用移液槍吸取5 pl接 種于King'B平板中央，培養(yǎng)48 h后用3 ml的氯仿以其蒸汽殺死菌體。 將活化好的靶標(biāo)細(xì)菌配成108cfii/ml的菌懸液，吸取50 |il菌懸液加入 到加入3ml融化后冷卻到5(TC的水瓊脂(0.7%瓊脂，pH7.0 )中，迅
10速混勻，立即倒入三氯甲烷殺死Pa40菌體的培養(yǎng)基上，鋪成均勻的 薄層，28t:培養(yǎng)36小時(shí)，觀察抑菌圈的情況。
綠針，叉單胞桔黃亞種 尸^M(io附o"as1 c/z/orarap/^ subsp. aMra"Waca Pa40對(duì)部分病原真菌抑制結(jié)果如表2所示，其對(duì)串珠鐮刀 病菌、小長(zhǎng)喙霉病菌、百合根腐病菌、桃褐病菌、番東早疫病菌、稻 瘟病菌、辣椒灰霉病菌、番茄灰霉病菌、棉花枯萎病菌、芹菜斑枯病 菌、番茄葉霉病菌等均有平板抑制作用。
表2.綠針假單胞桔黃亞種Pa40對(duì)病原真菌平板抑制
植物病原真菌 生長(zhǎng)抑制率(%)
52.6±0.02a
77.3±0.02
43.5±0.01
C/ac/ospo廠/um ft///um50.6±0.01
48.8±0.01
50.2士0.02
55.0±0.01
尸/^啤/7,Aora Leonian56.2±0.02
38.1土0.02
Fusa廠/"m a^jwr謂f.sp.Lili46.1±0.02
Rysa廠/"/n oxyspomm f.sp./as/"fecf"m61.3±0.00
Fusa廠/um. ox，po廠謂f. sp. "/ve謂b
;標(biāo)準(zhǔn)差b-，沒(méi)有抑制作用
綠針假單胞桔黃亞種 i^ewcfo,"as1 c/z/orara; to subsp. 做raw^caPa40對(duì)部分病原細(xì)菌抑制結(jié)果如表3所示，其對(duì)葡萄根癌 病菌、土壤根癌病菌、棉花角斑病菌、茄青枯病菌、丁香假單胞菌、 褶皺假單胞菌等均有平板抑制作用。
表3.綠針假單胞桔黃亞種Pa40對(duì)病原細(xì)菌平板抑制
病原細(xì)菌抑菌圈直徑(mm)
18.4±6.84a
24.7±4.03
26.7±0.45々ra6ac/er/, r/z/zogewes K276.9±0.95
爿gra6or"m'騰v船K30820.7±0.40
i^etw/omcwas1 com/gato ICMP581935.4±0.32
5Kr狄oWeWa cepac/a ICMP 5796O.O土O.OO
々ra6a"en', /w附咖c,'em1 C58O.O士O.OO
a標(biāo)準(zhǔn)差
實(shí)施例3生防相關(guān)性狀檢測(cè)
蛋白酶檢測(cè)用脫脂牛奶平板(胰蛋白胨5g，酵母抽提物2.5g，
葡萄糖lg,7%的脫脂牛奶250ml,瓊脂15g,用水補(bǔ)足1000ml)檢 測(cè)蛋白酶。把Pa40接種到平板中央，28。C培養(yǎng)72h,菌落周圍有透 明圈，如圖3所示，綠針假單胞桔黃亞種i^eMfibmowos c/z/orarap/^ subsp. awra^/aca Pa40 CGMCCNo.2764產(chǎn)生蛋白酶。
HCN檢測(cè)HCN檢測(cè)試紙準(zhǔn)備，10mg乙酰乙酸銅(copper(II) ethyl acetoacetate )和 10mg 4，4'-甲基雙(二甲苯胺)[4, 4，-methylenebis-(N，N-dimethylaniline)]溶于4ml的氯仿中，剪切 Whatman濾紙條，浸泡于配制好的溶液中，氯仿?lián)]發(fā)完全后就制備成 了 HCN檢測(cè)試紙。在含有l(wèi)mlPDA培養(yǎng)基的離心管中穿刺接種假單 胞，HCN檢測(cè)試紙懸于離心管中，28。C培養(yǎng)36h,如圖4所示，HCN 檢測(cè)試紙顯示藍(lán)色，表明綠針假單胞桔黃亞種P化Mc/omo"w c/z/orarapto subsp. m/ra"toa Pa40 CGMCCNo.2764產(chǎn)生HCN。
嗜鐵素的檢測(cè)(CAS培養(yǎng)基(嗜鐵素檢測(cè)用培養(yǎng)基)(Schwyn and Neilands， 1987):由4種溶液組成(溶液1 ~3及casamimo acid) ，4 種溶液混合前單獨(dú)滅菌。 溶液1. CAS/HDTMA溶液
1) CAS溶液60.5mg CAS(鉻天青)溶解在50ml水中
2) 鐵溶液lmMFeCl3 . 6&0溶解于10mMHCl中，pH為2.0
3) HDTMA溶液72.9mg溴化十六碳烷基三甲氨溶解于40ml
水中
12把溶液l)與10ml溶液2)混合后加入溶液3)中并攪拌均勻，把得到的 藍(lán)黑色液體滅菌，該液體即CAS/HDTMA溶液。 溶液2. Salts/Buffer溶液
1) Salts (750ml): K2PO40.3g, NaCl 0.5 g, NH4C11.0g,
2) Pipes: 30.24 g,溶解于Salts中，以50% (W/V)KOH調(diào)節(jié)pH 至6.8，加入15.0 g瓊脂定容至800 ml ,高壓滅菌冷卻至50。C。 溶液3 (750ml):
葡萄糖2g，甘露醇2g， MgS04 7H20 493mg， CaCl2 11 mg, H3B03 1.4 mg， ZnS04 . 7H20 1.2mg, MnS04 . 2H20 1.17mg， Na2Mo04 2H20 lmg, CuSO440 Pg;高壓滅菌。
溶液3冷卻至5(TC后加入溶液2與30ml過(guò)濾除菌的10%(W/V) casamino acid (酸水解酪素)混合，再加入溶液1,緩慢攪拌(避免 產(chǎn)生泡沬)，鋪平板。將活化好的Pa40穿刺接種于平板上。28'C培養(yǎng) 24、 48、 60、 72h觀察菌落周圍是否產(chǎn)生黃色暈圈，如有黃色暈圈表 示產(chǎn)生嗜鐵素。如圖5所示，綠針假單胞桔黃亞種尸^M^moww c/z/orarap/^ subsp. Pa40 CGMCCNo.2764能夠產(chǎn)生嗜鐵素。
實(shí)施例四生防菌Pa40溫室和田間防治小麥紋枯病效果檢測(cè)
溫室和田間檢測(cè)生防菌株P(guān)a40對(duì)小麥紋枯病的防治效果，具體 方法如下用NA培養(yǎng)基將生防菌株P(guān)a40活化24小時(shí)后，用滅菌牙 簽將已活化的菌株接到制備好的PDA液體培養(yǎng)基中，28°C, 160rpm， 搖床搖培72小時(shí)，將培養(yǎng)好的Pa40生防菌菌懸液用無(wú)菌生理鹽水稀 釋到108cfii/ml(OD600 = 0.8)備用。將小麥種子用兩層紗布包好放入大 培養(yǎng)皿中，清水浸濕。28'C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔天用清水浸濕一次。培 養(yǎng)48小時(shí)左右種子露白，挑選大小均句飽滿且露白一直的小麥種子 備用。將小麥紋枯病菌接入玉米砂培養(yǎng)基中，置室溫培養(yǎng)，前兩天要 稍加搖動(dòng)，使菌絲生長(zhǎng)均勻。菌絲長(zhǎng)滿(10天左右)后取出。將一
1定量的玉米砂繁殖的病菌與無(wú)菌土(草碳、蛭石、砂土、腐殖酸土以
體積比l: 1: 1: 1混合)按1: 30的體積比混合均勻，制成菌土。用 制備好的菌懸液、20%井岡霉素、無(wú)菌生理鹽水浸泡催芽好的小麥種 子3h后播種于制備好的病土中。溫室實(shí)驗(yàn)控制條件為溫度20 ~ 25 °C , 12h光照12h黑暗交替，小麥出苗20天后調(diào)查病情指數(shù)和發(fā)病率并 計(jì)算防效。田間實(shí)驗(yàn)播種時(shí)間為IO月15曰，出苗40天后調(diào)查病情 指數(shù)和發(fā)病率并計(jì)算防效。圖2顯示了 Pa40對(duì)小麥紋枯病溫室防治 效果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明綠針假單胞桔黃亞種尸化t^omo"os c/z/orarap/z/s subsp. m/ra"^7ca Pa40 CGMCCNo.2764在溫室和田間對(duì)小麥紋枯病 的防治效果分別為68.1%和72.6%,均高于井岡霉素的防治效果。
以上實(shí)驗(yàn)表明，綠針假單胞桔黃亞種尸^Mcfomowos c/z/orara; /^ subsp.Pa40 CGMCCNo.2764除對(duì)小麥紋枯病有防治效果， 對(duì)串珠鐮刀病、甘薯黑斑病、百合根腐病、桃褐病、番東早疫病、稻 瘟病、辣椒灰霉病、番茄灰霉病、棉花枯萎病、芽菜斑枯病、番茶葉 霉病等由病原真菌引起的病害和對(duì)葡萄根癌病、土壤根癌病、棉花角 斑病等由病原細(xì)菌引起的病害有潛在的防治效果，有很高的研究和應(yīng)
序列表說(shuō)明
SEQ ID No.l~4分別是Pa40的16S rDNA、 cwA、 wcA和W/ D基因的核苷 酸序列；SEQIDNo.5&6、 7&8、 9&10以及11&12分別是用于擴(kuò)增Pa40的16S rDNA、 carA、 wcA和加/ D基因的引物對(duì)。在引物對(duì)中涉及到的R、 S和Y是 根據(jù)保守的序列進(jìn)行設(shè)計(jì)的間并引物，R表示嘌呤(A或G), Y表示嗜嚏(T 或C), S表示強(qiáng)健(C或G)。序列表
<110> 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)
<120>綠針假單胞桔黃亞種Pa40及其應(yīng)用
<130> KHP08113411.9
<160> 12
<170> Patentln version 3.5
<210> 1
<211> 1516
<212> DNA
<213> 尸sei/flfcv77(m3s c/L/o_rorapA_z's subsp.爿i/ra/j"aca Pa40
<400> 1
cgggatcctacggctaccttgttacgacttcaccccagtcatgaatcacaccgtggtaac60
cgtcctcccgaaggttagactagctacttctggtgcaacccactcccatggtgtgacggg120
cggtgtgtac3鄉(xiāng)CCCgggaacgtattcaccgcgacattctgattcgcgattactagcg180
attccgacttcacgcagtcgagttgcagactgcgatccggactacgatcggttttatggg240
attagctccacctcgcggcttggcaaccctctgtaccgaccattgtagcacgtgtgtagc300
ccaggccgtaagggccatgatgacttgacgtcatccccaccttcctccggtttgtcaccg360
gcagtctccttagagtgcccgLCcataacgtgctggt肌ct肌ggac肌gggttgcgctcg420
ttacgggacttaacccaacatctcacgacacgagctgacgacagccatgcsgcacctgtc480
tcaatgctcccgaaggcaccaatccatctctggaaagttc3ttgg3tgtCa鄉(xiāng)cctggt540
^ggttcttcgcgttgcttcgaatt肌accacatgctccaccgcttgtgcgggcccccgt600
caattcatttgagttttaaccttgcggccgtactccccaagcggtc犯cttaatgcgtta660
gctgcgccacaggctcccaacggctagttgacatcgtttacggcgtggac720
taccagggtatctaatcctgtttgctccccacgctttcgcacctcagtgtcagtatcagt780
ccaggtggtcgccttcgccactggtgttccttcctatatctacgcatttcaccgctacac840
aggaaattccaccaccctctaccatactctagctcgcca_ggtttggatgcagttcccagg900
ttgagcccggggatttcacatccacttaacgaaccacctacgcgcgcttteicgcccagta960
attccgattaacgcttgcaccctctgtattaccgcggctgctggcacagagttagccggt1020
gctteittctgtcggtaacgtcaaaatactcacgtattaggtaagtacccttcctcccaac1080
ttaaagtgctttacaatccgaagaccttcttcacacacgcggcatggctggatcaggctt1140
tcgcccattgtccaatattccccactgctgcctcccgtaggagtctggaccgtgtctcag1200
ttccagtgtgactgatcatcctctcagaccagttacggatcgtcgccttggtgagccatt1260
ctagctaatccgacctaggctcatctgatagcgraaggcccg犯ggtccc1320
ctgctttctcccgt3ggacgtetgcggtatt鄧cgtccgtttccggacgttatcccccac1380
taccaggcagattcctaggcattactcacccgtccgccgctctc肌gagsagc犯gcttc1440
tctctaccgctcgacttgcatgtgtt郷cctgccgccagcgttcgttctg兆ccaggat1500caaactctgg atcccg 1516<210> 2<211> 725<212> DNA〈213> 尸sei/ob/ffo"as c/^ororapA/s subsp.」z/ra/7tiaca PA40<400> 2ttcaacaccgccatgaccggctatcaggaaatccttaccgatccttcctacgcccaacag60atcgttaccctgacttacccacatatcggcaataccggcaccacgccggaagacgccgag120tccgatcgtgtctggtcggccggtctggtgattcgcgacctgccactggttgcgagcaac180tggcgtaacaccttgtccctgtccgactacctgaaagccagcaatgttgtggcgatcgcc240ggtatcgacacccgtcgtctgacgcgcatcctgcgcg站a卿gcgcgcag犯cggctgc300atcatggccggcgacaatatctccgacgaagcggcgattgccgctgcgcgcggcttcccg360ggcctga卿gcatggatctggcga鄉(xiāng)tcgtcagcaccacgagtggcgc420tccagcgtctggagcctgaagaccgacagttcgaggcttc.cgagctgcct480taccacgtggttgcctacgactscggcgtcaagctgaacatcctgcgcatgctggtcgag540cgcggttgccgcgtgaccgtggtacctgcgC犯gLCCCCg3ccagcgacgtcctggcgctc600aagcctgacggtgtgUcctgtccaacggtcctggcgaccccgagccttgcgattacgcc660atcc3ggcg3tcaaggacgtgCtgg犯3CCg卿ttccggtcttcggcatctgcctcggt720725<210> 3〈211〉 891<212> DNA<213> 尸sewcfo/z/o朋s c/L/oror邵/ ys subsp. y4c/2"a/2"aca Pa40<400> 3ctgggccggatcatggacgtaCtgggC￡L￡LCccgatcgacgaagctggcccgatcggcgaa60g卿agcgttggggcattcaccgtcctgcgccgaccttcgctgaacaagctggcggc咖120gacctgctggaaaccggcatcaaggttatcgscctggtttgcccgttcgcc肌gggcggt180aaagtcggtctgttcggtggtgccggtgtgggca肌accgtaaacatgatggaactgatc240cgtaacatcgccatcgagcacsgcggttetttccgtgttcgccggtgtgggtgagcgtact300cgtgagggtaacgacttctaccacggigatgaaggattccaacgttctgg8c犯agtggca360ctggtatacggcc8tga<tgaacgagccgccgggagtaccgtctgcgcgtagctctgaccggc420ctgaccatggccg恥犯gttccgtgacgaaggt,gacgttctgctgttcgtcgacaac480atctatcgttacaccctggccggtaccgaagtatccgcactgctgggccgtatgccttcg540gcagtaggttaccagccgaccctggctgaag卿tgggcgttctgcaagaacgtatcact600tcgaccaagcaaggctcgatcacctcgatccaagcggtatacgtgcctgcggacgacttg660accgacccgtcgccagcgaccaccttcgcccacttggacgccaccgtcgttctgtcccgt720ctacccagcg gtagacccac tggactcgac ttcccgtcag 780 ctggacccga acgtgatcgg caacgagcac tacgaaaccg ctcgcggcgt tcagtacgtg 840 ctgcagcgct acaaagagct gaaggacatc atcgcgatcc tgggcatgga c 891<210> 4<211> 666<212〉 DNA<213> 尸sewafe/ffoa3s c力7ororap力is subsp. 力yra/ tj'3ca Pa40<400〉 4tccggcaagaccacgctgaccctgtcggtg attgcccaggcacagaagatgggcgcc60tgcgccttcgtcgacgccgetgcacgcactg gacccggaatacgccggcaaactgggggtc120犯Cgttg3Cgacctgctggtttcccagccg gacaccggcgaacsggcgctggaetatcacc180gacatgctggtgcgctccaatgccatcgac gtgatcgtgatcgactccgtggcggcactg240gtgccc肌ggccggLgatcgeiaggcg卿tg ggcgacatgcacgtgggcctgcaggcccgc300ctgatgtccc郷cgctgcgcaagatcacc ggtaacatcactgcctggtg360a/tcttcatcaaccagatccgtatgaaaatc ggcgtgatgttcggcagcccggaaaccacc420accggtggtaacgcgctg犯gttctacgct tcggttcgtctgg3C8tCCgtcgtactggc480gcg'gtg卿gagtcgtcggt agtgaaacccgagtc犯gatcgtcaagaac540犯ggtggctccaccgttccgtcaggctgaa ttccagatcctgtacggcaagggtatctac600ctg獄ggcgagatcatcgatctgggcgtg ctgcacggtttcctcgeigaagtccggtgcc660tggtat666<210> 5 <211> 38 〈212> DNA <213>人工序列 <400> 5cgggatccag agtttga/tcctggctcagaa cgaacgct 38<210〉 6 <211> 36 <212> DNA <213>人工序列 <400> 6cgggatccta cggctaccttgttacgactt cacccc 36<210> 7<211> 1917<212> 腿 <213〉人工序列 <400> 7ctgggccgsa tca/tggacg<210> 8 <211> 19 〈212〉 DNA <213>人工序列 <400> 8gtccatgccc aggatsgcg<210> 9 〈211> 20 <212〉 ■ <213〉人工序列 <400> 9ttcaacaccg ccatgaccgg<210〉 10 <211> 20 <212> DNA 〈213〉人工序列 <400> 10tgatgrccsa ggcagatrcc<210> 11 〈211> 20 <212> DNA <213>人工序列 〈400> 11txsggyaara ccacsctgac<210> 12 <211> 19 〈212〉 腿 <213〉人工序列 <400> 12rtaccaggcr ccggacttct<formula>formula see original document page 18</formula>
權(quán)利要求
1、綠針假單胞桔黃亞種(Pseudomonas.chlororaphis subsp.Aurantiaca)Pa40，保藏號(hào)為CGMCC No.2764。
2、 權(quán)利要求l所述菌株在制備生物農(nóng)藥中的應(yīng)用。
3、 含有權(quán)利要求l所述菌株或其發(fā)酵菌液的生物農(nóng)藥。
4、 含有權(quán)利要求1所述菌株的菌劑。
5、 權(quán)利要求l所述菌株、權(quán)利要求3所述的生物農(nóng)藥或權(quán)利要 求4所述的菌劑在植物病害生物防治中的應(yīng)用。
6、 如權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其中所述植物病害為串珠鐮刀病、 甘薯黑斑病、百合根腐病、桃褐病、番茄早疫病、稻瘟病、辣椒灰霉 病、番茄灰霉病、棉花枯萎病、芹菜斑枯病、番茄葉霉病、葡萄根癌 病、土壤根癌病、棉花角斑病或小麥紋枯病。
全文摘要
本發(fā)明提供了綠針假單胞桔黃亞種菌株(Pseudomonas.chlororaphis subsp.Aurantiaca)Pa40，菌種保藏編號(hào)為CGMCCNo.2764。該菌株產(chǎn)生與抗菌相關(guān)的HCN、蛋白酶和嗜鐵素。對(duì)測(cè)定的大部分植物病原真菌和部分植物病原細(xì)菌有平板抑制作用。在平板、溫室和田間，以小麥為指示作物檢測(cè)了生防菌株P(guān)a40對(duì)小麥紋枯病菌的防治效果，結(jié)果表明Pa40對(duì)平板、溫室和田間小麥紋枯病的防治效果分別為53.97％、68.10％和72.46％，其中溫室和田間對(duì)小麥紋枯病的防治效果均高于井岡霉素。
文檔編號(hào)A01N63/02GK101514331SQ20091007620
公開(kāi)日2009年8月26日 申請(qǐng)日期2009年1月5日 優(yōu)先權(quán)日2009年1月5日
發(fā)明者吳文良, 孟凡喬, 趙桂慎, 娜 鄔, 郭巖彬 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)