專利名稱：：利用植物鋁誘導(dǎo)表達(dá)基因增加植物抗鋁性的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及植物基因工程領(lǐng)域，具體地說，涉及一種利植物鋁誘導(dǎo)表達(dá)基因增加植物抗鋁性的方法。
背景技術(shù)：
：鋁是自然界含量最多的金屬元素,占地殼總質(zhì)量的7%。其中大部分在土壤中以氧化鋁、硅化鉬的形式存在，對(duì)植物的生長(zhǎng)不夠成傷害。當(dāng)土壤溶液酸化后(p!K5),鋁就會(huì)從氧化物或硅酸鹽中釋放出來，溶解到土壤中，主要以A產(chǎn)形式存在。A產(chǎn)對(duì)植物的脅迫最大，甚至低濃度(pmol/L)鋁離子在酸性條件下就能對(duì)植物產(chǎn)生毒害效應(yīng)[Horstetal.Effectofaluminumonrootgrowth,cell-divisionrateandmineralelementcontentsinrootsofimgw'cw/atofgenotypes.ZPflanzenphysiol,1983，109:95-103;KinraideandParker,Assessingthephytotoxicityofmononuclearhydroxyl-aluminum.PlantcellEnviron,1989,12:479-487]。鋁毒最明顯的特征是抑制根的生長(zhǎng)，造成植物對(duì)水分和營養(yǎng)吸收的困難[KochinaLV，Cellularmechanismsofaluminumtoxicityandresistanceinplants.AnnuRevPlantPhysiol.PlantMolBiol,1995，46:237-260;Clarkson，ClarksonDT.Theeffectofaluminumandsomeothertrivalentmetalcationsoncelldivisionintherootapicesof爿〃/wmcepa.AnnBot,1965,29:309-315]。研究者對(duì)鋁誘導(dǎo)植物抗性基因的表達(dá)做了大量的研究。Richard和S麗den[RichardsKDetal.Wali6andWali7.Plantphysiol1994,105:1455-1456;SnowdenKCandGardnerRC.Fivegenesinducedbyaluminuminwheat(7HZ/c謂ae勸'v應(yīng)L,)roots.PlantPhysiol,1993,103:855-861]從鋁敏感小麥中分離得到了7個(gè)鋁誘導(dǎo)基因，命名wali基因(forwheataluminuminduced)。這些基因編碼的蛋白分別與植物類金屬硫蛋白(walil)、苯丙氨酸解氨酶(wali4)，蛋白酶抑制劑〔wali3,wali5和wali6)及谷氨酰胺合成酶(wali7)具有同源性。另外還有十幾個(gè)鋁誘導(dǎo)的基因已被分離出來，包括小麥、擬南芥和煙草中的各種基因。為了研究植物抗鋁性的機(jī)理，人們利用了轉(zhuǎn)基因技術(shù)。DelaFuente等(1997)將細(xì)菌(Pseudomonasaeniginosa)的梓檬酸合成酶基因(CS)在煙草中過量表達(dá)，結(jié)果轉(zhuǎn)基因煙草的耐鋁能力增強(qiáng)，這是人類首次釆用轉(zhuǎn)基因技術(shù)提高植物耐鋁特性的嘗試[delaFuenteJMetal.Aluminumtoleranceintransgenicplantsbyalterationofcitratesynthesis.Science,1997，276:1566-1568]。Anoop等(2003)將擬南芥的線粒體檸檬酸合酶CS基因?qū)胗筒酥胁⒌玫竭^量表達(dá)，結(jié)果轉(zhuǎn)基因植株中CS活性提高，植株的耐鋁能力增加[AnoopVMetal.Modulationofcitratemetabolismalteraluminumtoleranceinyeastandtransgeniccanolaofoverexpressingamitochondrialcitratesynthase.PlantPhysiol，2003，132:2205-2217]。Delhaize等(2004)將小麥根尖蘋果酸分泌的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因ALMT1在大麥中異源表達(dá)，轉(zhuǎn)ALMT1基因的大麥植株其蘋果酸分泌的能力和耐鋁能力都有顯著提高[DelhaizeEetal.Engineeringhigh-levelaluminumtoleranceinbarleywiththeALMT1gene.PlantBiol,2004，101:15249-15254]。cDNA，稱之為Si69基因，它來自于谷子未成熟種子的cDNA文庫，該cDNA與植物抗鋁性有關(guān)，
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明目的是提供一種利用植物受鋁誘導(dǎo)的基因來提高植物抗鋁性的方法。本發(fā)明從谷子(&to〃'a/to//caBeauv.Var.3661，3662)未成熟種子cDNA文庫中篩選得到一個(gè)cDNA克隆，稱之為Si69基因。該cDNA的序列長(zhǎng)度為1061bp，為雙鏈核酸類型，線性，其核苷酸序列如SEQIDNo.l所示。通過三大數(shù)據(jù)庫的檢索，發(fā)現(xiàn)Si69cDNA編碼蛋白與水稻(NP—001051238AAP12992)、擬南芥(NP—188925NP—199196)、小鹽芥(AAM19711)和小麥(AAC37416.1)同源性分別為84%,58%,50%，50%。它們都具有一共同特點(diǎn)蛋白結(jié)構(gòu)中存在一保守的wali7結(jié)構(gòu)域，但功能未知。Southern印跡研究表明該基因在谷子基因組中以單拷貝存在。Northern印跡分析5V砂基因的表達(dá)模式，表明其在谷子谷子幼苗、根、莖、葉、幼穗及未成熟種子等組織中均可檢測(cè)到其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的存在。RT-PCR和熒光定量PCR研究表明^'"基因的表達(dá)受到鋁的誘導(dǎo)。進(jìn)一步，本發(fā)明構(gòu)建含Si69的表達(dá)載體，并將其轉(zhuǎn)化植物，用以考察轉(zhuǎn)基因植物的抗鋁性。在本發(fā)明實(shí)施方案中，構(gòu)建了含有S/McDNA的擬南芥表達(dá)載體，其表達(dá)盒是由花椰菜花葉病毒35S啟動(dòng)子和來自胭脂堿合成酶(nos)基因的3轉(zhuǎn)錄終止區(qū)域構(gòu)成，選擇標(biāo)記基因?yàn)樾旅顾叵铀徂D(zhuǎn)移酶II(NPTII)。所述的表達(dá)載體優(yōu)選的是重組質(zhì)粒pBI121-Si69，其中S/仰cDNA正向插入并且在35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)下。本發(fā)明將上述含有所述&69cDNA的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化植物，如擬南芥，獲得了抗鋁性提高的轉(zhuǎn)基因植物。在本發(fā)明實(shí)施方案中，將含有所述cDNA的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化擬南芥，獲得的植株抗鋁性提高，根伸長(zhǎng)受鋁抑制減弱。本發(fā)明找到了與植物受鉬誘導(dǎo)的cDNA(稱為^'卯基因)，將所述的基因轉(zhuǎn)化到植物中可使植物抗鋁性增加。利用本發(fā)明方法，可以顯著提高植物的抗鋁性，從而對(duì)植物生物量的增加特別是農(nóng)作物增產(chǎn)有重要意義。圖1顯示的是來自谷子的&69cDNA序列，以及推導(dǎo)的氨基酸序列。圖2顯示的是含有5V砂cDNA的擬南芥表達(dá)載體構(gòu)建過程圖。圖3顯示的是T3代轉(zhuǎn)基因擬南芥Western雜交。圖4顯示的是擬南芥根部蘇木靜染色圖，其中左上圖和右上圖分別為野生型和轉(zhuǎn)基因植株在20^MA1處理下的染色圖，左下圖和右下圖分別是野生型和轉(zhuǎn)基因植株在50|aMAl處理下的染色圖(lOOpm標(biāo)尺)；圖5顯示的是擬南芥根尖掃描電鏡圖(放大倍數(shù)上層xl.00K30pm標(biāo)尺；下層:x2.50K12.0lim標(biāo)尺)圖6顯示的轉(zhuǎn)基因擬南芥和野生型的根尖伸長(zhǎng)及MDA含量情況。具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明的內(nèi)容，但不應(yīng)理解為對(duì)本發(fā)明的限制。在不背離本發(fā)明精神和實(shí)質(zhì)的情況下，對(duì)本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。實(shí)施例l植物受鋁誘導(dǎo)基因S/69的克隆選取谷子授粉后5、7及12天的未成熟種子，材料混合后，提取總RNA,磁珠法富集mRNA(Promega)，釆用Stratagene公司cDNASynthesisKit反轉(zhuǎn)錄合成cDNA,雙鏈cDNA補(bǔ)平后，連接五"RIadapter,將其構(gòu)建至人ZAPII載體上，使用ZAP-cDNAGigapackIIIGoldCloningKit(Stratagene公司)進(jìn)行體外包裝。包裝完畢后，加入SM溶液和氯仿，離心后，上清即為構(gòu)建好的文庫。取lpl文庫上清液進(jìn)行滴度測(cè)定，結(jié)果表明構(gòu)建的文庫容量為2xl07pfo/ml。原始文庫構(gòu)建完成后，擴(kuò)增一次備用。利用酵母雙雜交(Clontech公司)篩選cDNA表達(dá)文庫，技術(shù)為公知技術(shù)，經(jīng)過篩選后，得到陽性克隆。進(jìn)行序列測(cè)序,測(cè)序結(jié)果如SEQIDNo.1所示，稱之為S/65>。實(shí)施例2植物受鋁誘導(dǎo)基因&"的克隆1、植物組織總RNA的提取(1)將4ml苯酸與8mlRNA提取緩沖液混勻后，放在65°C水洛預(yù)熱；(2)取谷子葉片約5g，加入液氮和少量石英砂，研缽中充分研磨成粉末，裝入50ml離心管；(3)將預(yù)熱的提取混合液加入含有植物材料粉末的離心管中，與植物材料充分混勻，室溫抽提10min;再加入4ml氯仿，繼續(xù)抽提10min;(4)室溫條件下12,000rpm離心20min;吸取上清液，加入等體積氯仿再抽提一次；(5)室溫條件下12,000rpm離心20min;吸取上清液，加入1/3體積的8mol/LLiCl，混勻后置于4。C放置16h或冰上放置8-12h，沉淀RNA;(6)在4。C條件下12,000rpm,離心20min,棄去上清液；(7)加入2ml70o/。乙醇洗滌RNA沉淀，室溫條件下12,000rpm離心5min，將RNA沉淀在超凈工作臺(tái)內(nèi)吹干，溶于適量DEPC處理水中，在-20°C(短期)或-70。C(長(zhǎng)期)保存?zhèn)溆谩?、RT-PCR(1)cDNA第一鏈的合成在經(jīng)DEPC處理的離心管中依次加入以下成分試劑用量RNA5嗎oligdT0.2嗎DEPC-H20補(bǔ)足體積至20^混勻后瞬時(shí)離心，在70。C變性5min,冰上冷卻。依次加入以下成分試劑用量5xRTbuffer10|alRNasin0.5^dNTP1niM-MLV1piDEPC-H2017.5piTotal50(xl混勻后瞬時(shí)離心，在42。C反應(yīng)60min。(2)PCR反應(yīng)反應(yīng)體系如下反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物1-2^15'primer(100ng/jjl)1pi3'primer(100ng/|jl)l^ddNTP(lOmmol/Leach)1jallOxTaqBuffer5|alTaq(51%1)1WSDW補(bǔ)足終體積至50pi首先將上述試劑加于200jxl離心管，混勻，瞬時(shí)離心，放于PCR儀上。用于&砂cDNA全長(zhǎng)擴(kuò)增引物PI:5'-GCGAGGAGAGAGGAGGGAAGAGC隱3'P2:5'-CGTCTCAGCGGTTCAGCGGATA-3'。擴(kuò)增條件如下94。C,變性1min;60。C，退火1min;72°C,延伸1min;擴(kuò)增循環(huán)數(shù)35;最后72°C，延伸10min。取適量PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，其余產(chǎn)物放于-2(TC保存。將PCR產(chǎn)物連接到T-vector,進(jìn)行酶切和序列測(cè)序，鑒定正確，命名該質(zhì)粒為pS,'69。實(shí)施例3用于擬南芥中表達(dá)S/69的表達(dá)載體的構(gòu)建和轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌表達(dá)盒是由花椰菜花葉病毒"5*啟動(dòng)子和來自胭脂堿合成酶(nos)基因的3轉(zhuǎn)錄終止區(qū)域(Depickere等人(1982)J.Mol.Appl.Genet.1:561-570)組成，選擇標(biāo)記基因?yàn)樾旅顾亓姿徂D(zhuǎn)移酶II(NPTII)。如圖2所示，以57卯質(zhì)粒(實(shí)施例2的陽性克隆質(zhì)粒)為模板，利用PCR擴(kuò)增，使5，端帶入SamHI酶切位點(diǎn)，3，端帶入flag-tag標(biāo)簽(MDYKDDDDK)和酶切位點(diǎn)，使flag-tag與Si69融合。擴(kuò)增引物PI(5'-CGGGATCCAAGCGAGGAGAGAGG-3')，P2(5'畫GCGAGCTCTCAC7TGTCGTCGTCGTCCTr，GTCC^4CTGGTTGGACCAGT-3'),反應(yīng)體系如下表所列，5769質(zhì)粒5'primer(100ng/|il)1pl3'primer(100ng/(il)inidNTP(10籠ol/Leach)1pl10xTaqBuffer5^1Taq(5U/nl)1(alSDW補(bǔ)足終體積至50nl擴(kuò)增條件為94°C,變性lmin;60°C,退火1min(退火溫度及時(shí)間應(yīng)根據(jù)引物的長(zhǎng)度及Tm值來確定)；72°C，延伸1min;擴(kuò)增循環(huán)數(shù)30-35;最后72°C,延伸10min。取適量PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，其余產(chǎn)物放于-2(TC保存?？寺≈羛MD18-T，測(cè)序正確。將帶有flag-tag標(biāo)簽的Si69用萬"附HI和S"cl雙酶切，回收840bp的片段；將雙元表達(dá)載體pBIUl((購自Clontech公司)用5amHI和&cl雙酶切，除去報(bào)告基因GUS,回收載體大片段，將載體和目的片段連接，轉(zhuǎn)化后，得到構(gòu)建在pBI121載體上，由35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的S柳cDNA.正向插入的重組質(zhì)粒pBI121畫Si69。將pBI121畫Si69采用凍溶法直接轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101，獲得含有重組質(zhì)粒pBI121-Si69的農(nóng)桿菌GV3101(pBI121-Si69)。農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化技術(shù)為公知技術(shù)。實(shí)施例435S啟動(dòng)子AS/69表達(dá)載體轉(zhuǎn)化擬南芥野生型擬南芥植株生長(zhǎng)約4周后，出現(xiàn)初級(jí)花序。初級(jí)花序長(zhǎng)至5-10cm高時(shí)將其剪去，使其次級(jí)花序生長(zhǎng)。6-7天后，植物次級(jí)花序即將開花，或僅有極少的花已開，此時(shí)是轉(zhuǎn)化最佳時(shí)期。農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化擬南芥植株的方法采用花芽浸泡法[CloughSJandBentAFFloraldip:asimplifiedmethodfor^4gro6ac^n'ww-mediatedtransformationof」ra6Wo戸^PlantJ,1998,16:735-743)，將擬南芥植株倒置，使蓮座葉以上的花序浸入稀釋好的菌液約3min，期間輕微晃動(dòng)。將菌液浸泡過的植株橫放至22T:環(huán)境中，暗培養(yǎng)24小時(shí)后，豎直見光培養(yǎng)至收獲種子。收獲的T。代轉(zhuǎn)基因植株的種子用70%酒精處理2min，0.5%次氯酸鈉消毒處理8-10min，再用無菌水洗滌4-6遍。將種子均勻置于含Kan50|ig/mlMS培養(yǎng)基上篩選。置4。C暗培養(yǎng)2-3天進(jìn)行春化，然后光照培養(yǎng)(16h光照，8h黑暗)7-12天，取抗性苗50株(苗深綠色，有真葉，有真正的根)移栽到花盆(花丼營養(yǎng)土蛭石=1:l)培養(yǎng)，獲得Ti代轉(zhuǎn)基因種子，有85%的轉(zhuǎn)基因株系篩選得到3:1比例分離的陽性植株。同時(shí)用上述相同的方法轉(zhuǎn)化不含Si69的空載體，作為陰性對(duì)照。提取陽性植株基因組DNA,擴(kuò)增&'69基因。引物P1:5'-GCCAACCTGAAGCAGCACTA-3'和P2:5'-GCGTAAGGAACGTAGCAGAA-3',反應(yīng)體系如表所列，<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>擴(kuò)增條件為94°C，變性lmin;55°C,退火1min(退火溫度及時(shí)間應(yīng)根據(jù)引物的長(zhǎng)度及Tm值來確定)；72°C，延伸1min;擴(kuò)增循環(huán)數(shù)30-35;最后72°C，延伸10min。取適量PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度619bp。其余產(chǎn)物放于-2(TC保存。結(jié)果表明，被檢10株陽性植株均擴(kuò)增得到&仰基因，而野生植株(2株)和陰性對(duì)照(轉(zhuǎn)化不含5V砂基因的空載體植株)均未檢出。實(shí)施例5轉(zhuǎn)基因擬南芥中蛋白的檢測(cè)提取T3代轉(zhuǎn)基因擬南芥葉片總蛋白，經(jīng)SDS-PAGE電泳分離，恒流冰洛轉(zhuǎn)膜后進(jìn)行Westernblot雜交。其中一抗為anti-flagtag抗體，稀釋比例為1:10,000，二抗為辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG，稀釋比例為1:10,000。Western雜交結(jié)果參見圖3。圖中結(jié)果表明Si69在轉(zhuǎn)基因擬南芥中穩(wěn)定表達(dá)。實(shí)施例6轉(zhuǎn)基因擬南芥中根部蘇木靜染色和掃描電鏡觀察實(shí)驗(yàn)對(duì)象陽性植株10株，每組5株；陰性對(duì)照4株，每組2株；野生型植株4株，每組2株。樣品處理野生型、陰性植株和轉(zhuǎn)基因擬南芥種子用70%酒精處理2min，0.5%次氯酸鈉消毒處理8-10min，再用無菌水洗滌4-6遍。將種子均勻置于含50嗎/mlKan的MS培養(yǎng)基上篩選。置4。C暗培養(yǎng)2-3天進(jìn)行春化，然后22。C光照培養(yǎng)(16h光照，8h黑暗)7天，用含有不同鋁濃度(20iiM和50laMAlCl3)的1/6MS(含10g/L蔗糖)培養(yǎng)液(pH4.0)分別處理植株根24h，根在鋁處理后用200ml蒸餾水浸泡15分鐘，然后用50ml蘇木精水溶液(w^O.P/。蘇木精w=0.01%KIO3O.lmmol/LNaOH)染色20分鐘，最后用去離子水浸洗15分鐘至無浮色。用顯微鏡觀察根尖染色情況并拍照。取擬南芥幼苗，用5%戊二醛溶液固定，抽氣至樣品沉到固定液中，再用鋨酸固定2小時(shí)，經(jīng)乙醇系列脫水，C02臨界點(diǎn)干燥，噴金屬膜后用曰立S-570掃描電鏡觀察。顯微鏡觀察結(jié)果顯示在2(HlMAlCl3處理后轉(zhuǎn)基因擬南芥根尖基本都沒有染上紅色，而野生型擬南芥和陰性對(duì)照根尖呈藍(lán)紫色；50pMAl處理后，轉(zhuǎn)基因擬南芥根尖有淺紫色出現(xiàn)，染色程度要明顯低于野生型(深紅色)(圖4)。掃描電鏡觀察，結(jié)果顯示20|iMAlCl3處理后，轉(zhuǎn)基因擬南芥的根尖結(jié)構(gòu)都沒有變化，和野生型沒有受鋁處理的擬南芥根尖細(xì)胞結(jié)構(gòu)基本相同；50^iMAlCl3處理后，轉(zhuǎn)基因擬南芥根尖伸長(zhǎng)區(qū)細(xì)胞出現(xiàn)部分凹陷，但破壞程度不嚴(yán)重，相比之下，野生型擬南芥和陰性對(duì)照在鋁離子處理下根尖細(xì)胞受到嚴(yán)重破壞，特別是根冠和伸長(zhǎng)區(qū)，細(xì)胞大量凹陷(圖5)。實(shí)施例7轉(zhuǎn)基因擬南芥根伸長(zhǎng)和丙二醛含量測(cè)定實(shí)驗(yàn)對(duì)象陽性植株6株，每組3株；野生型植株2株，每組1株。野生型和轉(zhuǎn)基因擬南芥種子滅菌春化處理后，將生長(zhǎng)7天的幼苗轉(zhuǎn)到分別含有20pM和50pMAlCl3的培養(yǎng)液中生長(zhǎng)72小時(shí)。測(cè)量處理前后的根長(zhǎng)，與正常生長(zhǎng)情況下的根伸長(zhǎng)對(duì)比，20和50iaMAlCl3處理后，野生型擬南芥根相對(duì)伸長(zhǎng)分別減少35%和70%，而轉(zhuǎn)基因擬南芥根相對(duì)伸長(zhǎng)分別減少10-25%和50-55%。稱取AlCl3處理過的擬南芥根部0.5g，加入lml10。/。TCA研磨至勻漿，加入lml0.6。/。TBA溶液，混勻物于95°。反應(yīng)20分鐘，迅速冷卻后10000g離心5分鐘，吸上清，測(cè)定532、600、450nm波長(zhǎng)下的消光度。MDA濃度(nmol/L"6.45(A532-A6。o)-0.56A450MDA含量(iamol/g"MDA濃度(iimol/L)x提取液體積(ml)/植物組織鮮重(g)在2(HiM和50(iMAlCl3處理下，與對(duì)照相比，野生型擬南芥根部MDA含量分別增加3.5倍和5.0倍，而轉(zhuǎn)基因擬南芥根部MDA含量分別是對(duì)照的2.0倍和3.5倍，要明顯低于野生型(圖6)。序列表說明SEQIDNo.l&2是Si69基因及其編碼的氨基酸序列；SEQIDNo.3&4是用于擴(kuò)增S/卯cDNA全長(zhǎng)的引物序列；SEQIDNo.5&6是擴(kuò)增質(zhì)粒并在其兩端引入酶切位點(diǎn)和標(biāo)簽的引物序列；SEQIDNo.7&8是用于檢測(cè)S/69基因的引物。序列表〈110〉中國農(nóng)業(yè)大學(xué)<120>利用植物鋁誘導(dǎo)表達(dá)基因增加植物抗鋁性的方法<130〉KHP09112101.5<160>8<170>Patentlnversion3.5<210>1<211>765〈212>DNA<213〉谷子<220〉〈221〉CDS<222>(1)..(765)〈400〉1atgctggcggtgttcgatcccacggtggccaagtgcccggagggcetc48MetLeuAlaValPheAspProThrValAlaLysCysProGluGlyLeu151015cgcageccgctggtggccggcgcggccgetgccgcggccggcggcgtg96ArgSerProLeuValAlaGlyAlaAlaAlaAlaAlaAlaGlyGlyVal202530ggcgcgetcatgaagggcttctecgccteacacgacggcaccgtcacc144GlyAlaLeuMetLysGlyPheSerAlaSerHisA印GlyThrValThr354045gtcagectggggccctecggcgcgctggcgcacteggcggccaaccag192ValSerLeuGlyProSerGlyAlaLeuAlaHisSerAlaAlaAsnGin505560agecccetcgtccctaggttgtttggtgetgtgaatgacatettttgc240SerProLeuValProArgLeuPheGlyAlaValAsnAspliePheCys65707580ctgttccaagggaacattgagaacattgccaacctgaagcagcactac288LeuPheGinGlyAsnlieGluAsnlieAlaAsnLeuLysGinHisTyr859095ggcctgageaagacegccaacgaggtgactateetcategaggcctac336GlyLeuSerLysThrAlaAsnGluValThrlieLeulieGluAlaTyr100105110agaaccctgagggacaggggtcccgtccca_gccagecaggttgtgaga384ArgThrLeuArgAspArgGlyProValProAlaSerGinValValArg115120125gatcttagtggaaagttcgcattcatettgtatgacaccctgtegaag432AspLeuSerGlyLysPheAlaPhelieLeuTyrAspThrLeuSerLys130135140tecaccttcgttgetgetgacgetgatggcageatecccttcttctgg480SerThrPheValAlaAlaAspAlaAspGlySerlieProPhePheTrp145150155160ggcgtcgacteggaggaccacetcgtgttctctgacgatgetgggeta528GlyValAspSerGluAspHisLeuValPheSerAspAspAlaGlyLeu165170175etcaagaccggctgcggcaactegttcgcgccattccctaaaggttgc576LeuLysThrGlyCysGlyAsnSerPheAlaProPheProLysGlyCys180185190ttctacaccacctecggcgggctgcagagetacgagcacccgctgcac624PheTyrThrThrSerGlyGlyLeuGinSerTyrGluHisProLeuHis195200205gaggtc卿gcggtgccgcgcgtggscagecagggccsg3tgtgcggc672GluValLysAlaValProArgValAspSerGinGlyGinMetCysGly210215220tecaccttcaaggtcgacagegagaccaagaagaagcaggacgccage720<image>imageseeoriginaldocumentpage16</image>PheAlaPhelieLeuTyrAspThrLeuSerLys130135140SerThrPheValAlaAlaAspAlaAspGlySerlieProPhePheTrp145150155160GlyValAspSerGluAspHisLeuValPheSerAspAspAlaGlyLeu165170175LeuLysThrGlyCysGlyAsnSerPheAlaProPheProLysGlyCys180185190PheTyrThrThrSerGlyGlyLeuGinSerTyrGluHisProLeuHis195200205GluValLysAlaValProArgValAspSerGinGlyGinMetCysGly210215220SerThrPheLysValAspSerGluThrLysLysLysGinAspAlaSer225230235240lieProArgValGlySerAlaAlaAspTrpSerAsnGinPhe245250<210〉3<211>23<212〉DNA<213>人工序列<400〉3gcgagg卿gaggagggaagage23<210>4〈211〉22<212>DNA<213〉人工序列<400>4cgtctcagcggttcagcggata22<210>5<211>23〈212>DNA<213>人工序列<400>5cgggatccaagcgaggagagagg23〈210>6<211〉52<212>腿<213>人工序列<400>6gcgagctctcacttgtcgtcgtcgtccttatagtcgaactggttggaccagt52<210>7<211>20〈212〉醒<213>人工序列<400>7gccaacctgaagcagcacta20<210>8<211>20〈212>DNA<213>人工序列<400>8gcgt犯ggaacgtagc卿a2018權(quán)利要求1、Si69基因在增加植物抗鋁性中的應(yīng)用。2、一種利用植物鋁誘導(dǎo)表達(dá)基因增加植物抗鋁性的方法，其特征在于，所述的基因?yàn)?amp;砂。3、如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，該方法使用含有5V砂基因的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化目的植物。4、如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述表達(dá)載體的啟動(dòng)子為組成型啟動(dòng)子。5、如權(quán)利要求24任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述植物為雙子葉植物。6、如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述植物為擬南芥。7、如權(quán)利要求24任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述表達(dá)載體為pBI121-Si69。全文摘要本發(fā)明提供了一種利用植物鋁誘導(dǎo)表達(dá)基因增加植物抗鋁性的方法，該方法利用Si69基因來提高植物的抗鋁性。研究表明，通過將Si69基因轉(zhuǎn)化植株，能夠顯著提高植株的抗鋁性。本發(fā)明方法對(duì)植物生物量的增加特別是農(nóng)作物增產(chǎn)有重要意義。文檔編號(hào)A01H5/00GK101532029SQ20091008034公開日2009年9月16日申請(qǐng)日期2009年3月19日優(yōu)先權(quán)日2009年3月19日發(fā)明者于靜娟,敖光明,倩趙,趙琳娜申請(qǐng)人:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)