專利名稱：：鑒別可溶性酸性轉(zhuǎn)化酶基因等位變異的甜高粱材料的分子標(biāo)記的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及農(nóng)業(yè)生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，特別是涉及一種鑒別可溶性酸性轉(zhuǎn)化酶基因等位變異的甜高粱材料的分子標(biāo)記
背景技術(shù)：
：世界許多國(guó)家都積極推廣生物燃料，目前，世界上推廣的燃料乙醇主要是利用玉米、甘蔗或小麥原料生產(chǎn)的第一代生物燃料，隨著燃料乙醇生產(chǎn)規(guī)模的迅速擴(kuò)大，對(duì)全球糧食價(jià)格的影響引起廣泛關(guān)注。跟據(jù)世界貨幣基金組織的資料，由于美國(guó)大量的玉米用于生產(chǎn)燃料乙醇，2006年世界糧食價(jià)格上漲10%，2006年白糖價(jià)格也創(chuàng)近十年新高；面對(duì)現(xiàn)在能源緊缺的事實(shí)，利用生物質(zhì)生產(chǎn)能源己經(jīng)成為一個(gè)不可逆轉(zhuǎn)的趨勢(shì)，但是如何選擇良好的能源作物，不與糧食掙地是現(xiàn)在的一個(gè)主要問題，而甜高梁作為能源作物有其自身的優(yōu)勢(shì)，但是，由于我國(guó)人多地少，科研水平相對(duì)落后等問題，甜高粱育種長(zhǎng)期以來以提高產(chǎn)量和改良抗病性為主，直到最近，甜高粱品質(zhì)改良才開始受到重視，但是莖稈中的糖分含量的改良基礎(chǔ)性、系統(tǒng)性的研究還很缺乏。我國(guó)現(xiàn)有的甜高粱品種莖稈中的糖分含量差異很大，現(xiàn)有的大多數(shù)品種的莖稈含糖量還很低而且不穩(wěn)定，還不能滿足燃料乙醇生產(chǎn)的要求(曹文伯.應(yīng)對(duì)甜高粱生產(chǎn)發(fā)展的新形勢(shì).中國(guó)種業(yè)，2005，(11):17-18)。在燃料乙醇產(chǎn)業(yè)化發(fā)展中，糖分含量是一個(gè)非常重要的因素，加工工廠都渴望得到多的糖分，這樣才能保證生產(chǎn)乙醇的長(zhǎng)期運(yùn)轉(zhuǎn)和獲得良好的利潤(rùn)，改良其莖稈中的糖分含量己經(jīng)成為我國(guó)甜高粱品質(zhì)育種的重要目標(biāo)。李振武等(1992)對(duì)甜高粱21種性狀的遺傳變異系數(shù)、遺傳力、遺傳相關(guān)、遺傳進(jìn)度等進(jìn)行了綜合研究。結(jié)果表明，甜高粱的生物產(chǎn)量、子粒產(chǎn)量和莖稈錘度均有較高的遺傳變異潛力，主莖稈鮮重與主要因素的遺傳相關(guān)性很高，并具有較高的遺傳力一些研究也指出，雖然環(huán)境因素對(duì)莖桿含糖量有一定影響，但主要受遺傳因素影響，莖桿遺傳率為0.75(馬鴻圖，徐希德.高粱莖稈含糖量遺傳研究.遼寧農(nóng)業(yè)科學(xué)，1989，(4):15-20)或者更高0.877-0.927(李勝國(guó)，馬宏圖.高粱莖桿含糖量遺傳研究.作物雜志，1993，(5):18-21)。2007年本課題組對(duì)206份甜高粱品種進(jìn)行了研究，也發(fā)現(xiàn)品種(系)間莖桿含糖量存在很大差異，錘度(BX)變化范圍為1.6~19.1%，相差約12倍，選擇潛力很大(趙香娜，李桂英，劉洋等.國(guó)內(nèi)外甜高粱種植資源主要性狀遺傳多樣性及相關(guān)性分析.植物遺傳資源學(xué)報(bào)，2008，9(3):302-307);根據(jù)國(guó)內(nèi)外甜高粱品種莖稈汁液錘度的實(shí)際情況，我國(guó)確定甜高粱品種選育莖稈汁液含糖量最少也要在16%以上，錘度則要求更高(盧慶善.甜高粱.北京中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)出版社，2008)。甜高粱種質(zhì)資源豐富，在眾多的甜高梁品種中選擇具有高含糖量潛力的甜高粱品種作為育種的親本材料是解決甜高粱育種的關(guān)鍵，也很難，甜高粱與普通高梁之間在性狀上有明顯的差異，比較易于區(qū)分，但甜高粱品種之間的差異主要體現(xiàn)在含糖量這種非外觀性狀上；上述馬鴻圖，李勝國(guó)等人的研究報(bào)道甜高粱莖桿含糖量這一性狀的遺傳力高達(dá)0.7500.927說明決定甜高粱莖桿含糖量的主要因素取決于遺傳因素，尋找到準(zhǔn)確的分子標(biāo)記來鑒別高含糖量潛力的甜高梁品種對(duì)于育種工作將起到四兩撥千斤的作用，而目前沒有見到相關(guān)報(bào)道。前人對(duì)甜高粱糖分含量的研究中發(fā)現(xiàn)，在甜高粱莖稈中，SAI(Solubleacidinvertase)的活性與節(jié)間的長(zhǎng)度有很高的正相關(guān)性(LingleS.E.,DunlapJ.R.Sucrosemetabolisminnettedmuskmelonfruitduringdevelopment.PlantPhysiol,1987,84:386-389)，而李興軍等(李興軍，汪國(guó)云.楊梅花芽孕育期間葉片酸性轉(zhuǎn)化酶活性性及糖類含量的變化.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2000，18(2):164-166)報(bào)道在楊梅花芽孕育期間，蔗糖含量與Inv酶活成顯著的負(fù)相關(guān)性3Iiw—蔗糖轉(zhuǎn)化酶(Iiwertase)，在高等植物蔗糖代謝中起著關(guān)鍵的作用。研究表明，蔗糖轉(zhuǎn)化酶參與植物的生長(zhǎng)、器官建成、糖分運(yùn)輸、韌皮部卸載及調(diào)節(jié)庫組織糖分構(gòu)成及水平，Inv可以不可逆的催化庶糖水解成葡萄糖和果糖，是蔗糖分解中的重要調(diào)控酶，Inv是一類家族蛋白(HaouazineT.N.，TymovvskaL.Z.,TakvorianA.,etal.Characterizationoftwomembersofthe^ra》油/w/jgenefamily,Atbfruct3andAtbfruct4，codingforvacuolarinvertases，Gene,1997,197:239-251;)，根據(jù)不同的分類方法，可將其分為不同的家族，根據(jù)其水溶性可分為可溶性和不可溶性Inv，根據(jù)其最適pH不同又可分成酸性Inv和中性/堿性Inv兩類(SturmA.,ChrispeelsM.cDNAcloningofcarrotextracellularP-fructosidaseanditsexpressioninresponsetowoundingandbacterialinfection.PlantCell,1990,2:1107-1119)，它們的主要功能都是降解蔗糖，只是存在的部位不同；可溶性酸性Inv簡(jiǎn)稱SAI,是主要存在于液泡中，催化蔗糖水解成己糖，起著調(diào)節(jié)植物組織中糖的積累和液泡中蔗糖利用的作用，其結(jié)構(gòu)與中性轉(zhuǎn)化酶存在很大的不同，但是有關(guān)其蛋白結(jié)構(gòu)和特性的研究還比較少，有人用GA處理通過誘導(dǎo)提高SAI活性而降低蔗糖水平，引起新梢旺長(zhǎng)而消耗還原糖；可溶性酸性Inv即SAI在成熟庫器官液泡的蔗糖積累中起關(guān)鍵作用(ZhuY丄，KomorE.,MooreP.H.Sucroseaccumulationinthesugarcanestemisregulatedbythedifferencebetweentheactivitiesofsolubleacidinvertaseandsucrosephosphatesynthase,PlantPhysiol.,1997,115:609-616)，液泡中SAI的活性對(duì)蔗糖的含量有很大的影響。Schaffer等(SchafferA.A.,AloniB.,FogelmanE.Sucrosemetabolismandaccumulationindevelopingfruitofcwc鵬&,Phytochemistiy，1987,26(7):1883-1887)比較甜與不甜的葫蘆科果實(shí)蔗糖積累特點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)果實(shí)中的蔗糖大多數(shù)都在液泡中，而液泡可溶性SA1可以將蔗糖分解成己糖，己糖可能又參與其他一些合成途徑。許多研究都表明，蔗糖在合成過程中并沒有顯著的變化，其含量的差異主要是在庫器官中被分解導(dǎo)致的。前人的研究報(bào)道SAI的缺乏是蔗糖開始累積的先決條件，其它含糖量高的植物如甜菜、柑桔、蘿卜、甘蔗等，都具有SAI活性的特點(diǎn)。本發(fā)明的發(fā)明人的研究數(shù)據(jù)也表明甜高粱的總糖含量與SAI酶活性具有顯著的負(fù)相關(guān)性(r=-0.52,PO.Ol)，如圖5:目前已經(jīng)成功的從番茄、擬南芥、胡蘿卜、馬鈴薯、甘蔗、水稻等作物中克隆出了Inv基因DNA序列或cDNA序列(劉慧英，朱祝軍.轉(zhuǎn)化酶在高等植物蔗糖代謝中的作用研究進(jìn).植物學(xué)通報(bào)，2002,19(6):666-674)，但未見有關(guān)編碼中性Inv基因克隆和甜高粱Inv基因克隆的報(bào)道。錘度是指用Brix比重錘度計(jì)測(cè)得的純蔗糖溶液中蔗糖重量百分率(克溶質(zhì)/100克溶液)，對(duì)于不純的蔗糖溶液，其表示的為干固物的重量百分率。其數(shù)值要略高于蔗糖含量?？梢杂缅N度來近似表示含糖量(王季槐，陳莊，何春林.不同甘蔗材料錘度與糖分的關(guān)系.湛江海洋大學(xué)學(xué)報(bào)，2003,23(4):62-66)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明針對(duì)甜高粱育種選擇優(yōu)良種質(zhì)資源的需要，本發(fā)明提供一種用于輔助選擇具有高含糖量潛力的甜高梁材料的分子標(biāo)記，該標(biāo)記選自SAI基因的等位變異基因，有助于育種工作者從眾多甜高粱品種中尋找優(yōu)良的親本材料，不用通過繁復(fù)的栽培試驗(yàn)及測(cè)定來進(jìn)行鑒別。一種鑒別可溶性酸性轉(zhuǎn)換酶基因等位變異的甜高粱材料的分子標(biāo)記，其特征在于用如下引物擴(kuò)增而來正向弓I物5-TTGTCTGCTTGTATATCACC-3，反向弓I物5-CTTGTACTCTTGTCGATCGAGC-3。所述分子標(biāo)記，具有如SeqIDNO1所示的126bp的核苷酸序列。所述分子標(biāo)記，具有如SeqIDNO2所示的131bp的核苷酸序列。所述分子標(biāo)記，具有如SeqIDNO3所示的136bp的核苷酸序列。所述分子標(biāo)記在輔助選擇高含糖量潛力的甜高粱品種中的應(yīng)用。本發(fā)明以與高梁同源關(guān)系非常近的作物甘蔗的可溶性酸性轉(zhuǎn)化酶基因(幼z'"W，NCBI登錄號(hào)為AY302083)cDNA序列為探針，在NCBI網(wǎng)站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)上的高粱EST庫中進(jìn)行檢索分析，找出與甘蔗幼/rn^相似性很高的4條高粱EST序列，根據(jù)這些EST序列及甘蔗(AY302083)SAI基因cDNA序列設(shè)計(jì)SAIl、SAE、SAI3禾QSAI4,如表1所示。以甜高粱品種考利(Cowley)的全DNA為模板，分別對(duì)這4段序列進(jìn)行克隆，引物設(shè)計(jì)保證每段序列之間都含有200bP左右的重疊序列。利用DNAMAN、DNAstar等軟件對(duì)獲得的4段序列進(jìn)行拼接獲得長(zhǎng)3409bp,如SeqIDNo.4所示，SW-/通過GRAMENE網(wǎng)站與高粱基因組DNA序列進(jìn)行比對(duì)，如圖15，確定toW所在的位置和拷貝數(shù)，結(jié)果顯示SAI基因在甜高粱基因組第四條染色體上，只有一個(gè)拷貝，有終止了，但沒有起始密碼了，其外顯子序列與甘蔗幼Z"vJ(AY302083)序列相似性很高，相似性為95%-96%;在編碼區(qū)內(nèi)，&W與水稻INV3基因結(jié)構(gòu)相似，但是序列大小和相似性存在較大不同，其第二外顯子比水稻INV3基因多34bp，第三外顯子則多45bp，第二內(nèi)含子比水稻INV3基因多465bp，第三內(nèi)含子則少114bp,外顯子相似性為82%-85%。據(jù)此推測(cè)獲得的為甜高粱的可溶性酸性轉(zhuǎn)換酶基因的準(zhǔn)全長(zhǎng)基因。高粱5b/-/游c"A^片段長(zhǎng)為1683bp如SeqIDNo.5所示，與甘蔗ShinvA序列相似性很高，相似性為95%。雖然沒有獲得起始密碼子密碼信息，但是根據(jù)其終止密碼子的位置對(duì)此序列進(jìn)行蛋白預(yù)測(cè)分析，分析結(jié)果顯示其包含一個(gè)558個(gè)氨基酸的多肽，如如SeqIDNo.6所示，分子量大小為61.9KDa;對(duì)此蛋白進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域分析，結(jié)果表明此蛋白含有一個(gè)完整的糖基水解酶(Glycosylhydrolasesfamily32)結(jié)構(gòu)域(14-504)，期望值(E)為E-128,由一個(gè)N端335個(gè)氨基酸(14-348)和一個(gè)C端82個(gè)氨基酸(423-504)組成，如圖3，此結(jié)構(gòu)域具有水解蔗糖的功能，進(jìn)一步證明本發(fā)明獲得的為可溶性酸性轉(zhuǎn)換酶基因。本發(fā)明用擴(kuò)增<SVW的4對(duì)引物擴(kuò)增24個(gè)錘度差異明顯的甜高粱品種，擴(kuò)增測(cè)序，拼接后分別得到24個(gè)材料的SAI基因的準(zhǔn)全長(zhǎng)基因，利用DNAMAN軟件中的多重序列比對(duì)程序進(jìn)行序列比，利用dnaSP4.9軟件進(jìn)行DNA多態(tài)性分析和單體型分析，獲得三種單體型(functionalhaplotypes)，分別記為&'-/仏&'-/6和6^-",然后再根據(jù)這幾種單體型的多態(tài)性設(shè)計(jì)得到一個(gè)分子標(biāo)記SBXl,如圖8所示，該標(biāo)記所處的位置為Sai-1的第二內(nèi)含子區(qū)域，內(nèi)含子會(huì)通過選擇性剪接來影響基因的轉(zhuǎn)錄；而在一些基因中，內(nèi)含子的插入/缺失會(huì)造成酶活性性的變化從而影響其表型性狀(HeX.Y.,ZhangY丄.,HeZ.H.,etal.Characterizationofphytoenesynthase1gene(尸iy/)locatedoncommonwheatchromosome7Aanddevelopmentofafunctionalmarker.7Teor^p/GewW,2008，116:213—2219)。對(duì)于SAI基因來說，有過功能標(biāo)記研究的報(bào)道。(YauY.Y.，SimonP.W.A2.5kbinserteliminatesacidsolubleinvertaseisozymeIItranscriptincarrot(Ztocitfc/aL.)roots,causinghighsucroseaccumulation.PlantMolecularBiology,2003,53:151-162)指出，在胡蘿卜SAI轉(zhuǎn)錄本中插入一個(gè)2.5kb的片段后能導(dǎo)致蔗糖含量的顯著增加，Hadas等(HadasR.,SchafferA.，MironD.,etal.PCR-generatedmolecularmarkersfortheinvertasegeneandsucroseaccumulationintomato.TheorApplGenet,1995，90:1142-1148)也報(bào)道，在高蔗糖含量和低蔗糖含量的番茄中，SAI基因存在很大的差異，并根據(jù)這些差異開發(fā)了與蔗糖含量相關(guān)的分子標(biāo)記。結(jié)合這些報(bào)道，推測(cè)本發(fā)明獲得的標(biāo)記可用于鑒別試驗(yàn)材料的等位變異類型，根據(jù)該標(biāo)記設(shè)計(jì)得到擴(kuò)增該標(biāo)記SBX1的引物正向引物5-TTGTCTGCTTGTATATCACC-3，反向引物5-CTTGTACTCTTGTCGATCGAGC-3。利用這對(duì)引物再擴(kuò)增24個(gè)甜高粱材料，得到具有SeqIDNO1所示核苷酸序列的甜高粱品種為單體型SmW"，依次單體型5te'-"具有SeqIDNO2所示核苷酸序列，單體型具有S叫IDNO3所示核5苷酸序列，如圖10所示。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，如表7所示，型品種的錘度范圍低于Sai-7b型品種，型品種的錘度值最高。經(jīng)過對(duì)164個(gè)甜高粱品種進(jìn)行等位變異類型分類與錘度測(cè)定驗(yàn)證，測(cè)定分析結(jié)果如表8及表9所示，證實(shí)136bp條帶類型的錘度顯著高于131bp條帶類型的錘度，而136bp條帶類型的錘度顯著高于126bp條帶類型的錘度，證明此標(biāo)記與含糖量關(guān)系密切，推測(cè)這一規(guī)律與等位變異造成SAI的活性變化有關(guān)，因?yàn)榘被嵬蛔冇锌赡茉斐擅傅鞍谆钚缘淖兓１景l(fā)明的驗(yàn)證數(shù)據(jù)說明，本發(fā)明獲得的分子標(biāo)記可用于輔助選擇高含糖量潛力的甜高粱品種。圖l利用甘蔗ShinvA(AY302083)cDNA序列檢索出的高粱EST序列和相對(duì)同源位置。圖2甜高粱SAI基因組PCR產(chǎn)物1%瓊脂糖凝膠電泳A、B、C和D分別代表引物SAIl、SAI2、SAI3和SAI4的擴(kuò)增結(jié)果，M:DL2000，Ml:Marker5。圖3編碼多肽及保守結(jié)構(gòu)域。圖4可溶性酸性轉(zhuǎn)化酶活性與蔗糖含量相關(guān)性。橫坐標(biāo)表示可溶性酸性轉(zhuǎn)化酶，縱坐標(biāo)表示蔗糖含量。圖5可溶性酸性轉(zhuǎn)化酶活性與總糖含量相關(guān)性。橫坐標(biāo)表示可溶性酸性轉(zhuǎn)化酶，縱坐標(biāo)表示總糖含量。圖6高粱SA1基因DNA多態(tài)性分析。圖7高粱SAI基因進(jìn)化分析。圖8&7/-/a、5^'-/6和&'-^序列局部比對(duì)。方框內(nèi)為分子標(biāo)記SBX1的引物序列圖9標(biāo)記S&W對(duì)24個(gè)甜高粱材料擴(kuò)增產(chǎn)物的變形聚丙烯酰胺凝膠電泳圖。泳道編號(hào)代表的材料名稱見表6圖10用S&W檢測(cè)164份甜高梁材料的per產(chǎn)物4%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果。圖11型甜高粱材料莖稈錘度頻率分布。圖型甜高粱材料莖稈錘度頻率分布。圖13&H'-/c型甜高粱材料莖稈錘度頻率分布。圖14.164份甜高粱等位變異類型和綞度的綜合統(tǒng)計(jì)分析。圖15甜高粱基因所在染色體位置和拷貝數(shù)。具體實(shí)施方式實(shí)施例l.克隆SAI基因提取DNA方法和試劑參照Sambrook等(SambrookJ,FritschE.F.，ManiatisT.Molecularcloning:alaboratorymanual,Edition,ColdSpringHabourLaboratoryPress,NewYork,1989)。PCR所用試劑無特別要求，普通常用試劑即可。以甘蔗ShinvA基因cDNA序列AY302083為探針，在GenBank高梁EST數(shù)據(jù)庫中檢索，得到4條高粱EST片段登錄號(hào)依次BE125476、BE361549、BE361676為，AW922406。這四條EST雖然不能覆蓋整個(gè)AY302083，但這4條EST與AY302083同源性很高(84%~94%)如圖1。利用上述的四條EST和AY302083設(shè)計(jì)4對(duì)引物，SAIl，SAI2,SAI3，SAI4，如表1所示，PCR程序94。C預(yù)變性3min，94。C變性30s，6rC復(fù)性30s，72。C延伸90s。共30個(gè)循環(huán)，72'C延伸10min，4'C保存。凝膠電泳取5u1于1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，用Bio-Rad公司的凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行分析。PCR產(chǎn)物回收PCR產(chǎn)物回收參照天根生化DNA回收試劑盒說明書?；厥债a(chǎn)物的連接、轉(zhuǎn)化和克隆驗(yàn)證參考Progema公司的pGEM-TEasyVectorSystem說明書。測(cè)序陽性克隆送中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院重大科學(xué)工程進(jìn)行測(cè)序。每個(gè)PCR產(chǎn)物測(cè)序都要重復(fù)2-4次，以保證獲得正確的核苷酸序列。TaqDNA聚合酶采用TaKaRa公司的EXTacj，克隆試劑盒采用Pro肥ga公司的pGEM-TEasyVectorSystem,瓊脂糖購自Genetech公司，DNA回收試劑盒、dNTP和DNAMarker購自天根生化科技公司表1<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>以甜高粱品種考利(Cowley)基因組DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析，每對(duì)引物所得PCR產(chǎn)物均出現(xiàn)單一條帶，獲得的片段大約分別為lOOObp、500bp、1500bp和500bP左右，與推測(cè)的大小基本一致，如圖2所示。將SAIl、SAI2、SAI3和SAI4PCR產(chǎn)物回收后克隆測(cè)序，得到4條帶有200bp左右的DNA重疊的序列，將這4條序列進(jìn)行拼接，得到一個(gè)甜高粱SAI的基因組DNA片段，命名為Sai-l。Sai-1長(zhǎng)為3409bp,如SeqIDNo.4所示，推測(cè)其含有2個(gè)內(nèi)含子，如圖2,Sai-1外顯子序列與甘蔗ShinvA序列相似性很高，相似性為95%-96%，在編碼區(qū)內(nèi)，Sai-1與水稻INV3基因結(jié)構(gòu)相似，但是序列大小和相似性存在較大不同，其第二外顯子比水稻INV3基閎多34bp，第二外顯子則多45bp，第二內(nèi)含子比水稻INV3基因多465bp，第三內(nèi)含子則少114bp,外顯子相似性為82%-85%。高粱Sai-lcDNA片段長(zhǎng)為1683bp，如SeqIDNo.5所示，與甘蔗ShinvA序列相似性很高，相似性為95%。雖然沒有獲得起始密碼子密碼信息，但是根據(jù)其終止密碼子的位置對(duì)此序列進(jìn)行蛋白預(yù)測(cè)分析，分析結(jié)果顯示其包含一個(gè)558個(gè)氨基酸的多肽，如SeqlDNo.6所示，分于量大小為61.9KDa;對(duì)此蛋白進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域分析，結(jié)果表明此蛋白含有一個(gè)完整的糖基水解酶(Glycosylhydrolasesfamily32)結(jié)構(gòu)域(14-504)，期望值(E)為E-128,由一個(gè)N端335個(gè)氨基酸04-348)和一個(gè)C端82個(gè)氨基酸(423-504)組成，如圖3，此結(jié)構(gòu)域具有水解蔗糖的功能。實(shí)施例2甜高粱莖稈糖分與SAI酶活性的關(guān)系步驟l測(cè)定SAI酶活性U實(shí)驗(yàn)材料實(shí)驗(yàn)選用10個(gè)甜高粱材料，即TX20、MN-2794、MN-2747、Sm他-l、BJK236、Ramada、Honey、Cowley、Theis和M-81E，均為本中國(guó)農(nóng)科院作物科學(xué)研究所保存。2007年5月在中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所昌平實(shí)驗(yàn)站播種，3次重復(fù)，3行區(qū)，行長(zhǎng)3m，行距0.7m,株距0.2m，小區(qū)面積6.3m2。成熟期(丌花后40天)從中間一行連續(xù)收獲3株莖稈，收獲時(shí)應(yīng)避免高溫和陽光照射，將收獲材料的穗和葉片除去，將節(jié)間按照從頂部到底部的順序編號(hào)(1N)。由于不同材料節(jié)間數(shù)量不同，為保證每個(gè)材料都能進(jìn)行測(cè)定，取l、3、5、7、9和11節(jié)間，將其外皮去掉并用剪刀剪成10~15cm的小段，放入液氮中，取回后放入-8(TC冰箱保存。用于酶活性的測(cè)定。1.2方法酶的提取酶的提取參照Zhu等(ZhuY.J.,KomorE.,MooreP.H.Sucroseaccumulationinthesugarcanestemisregulatedbythedifferencebetweentheactivitiesofsolubleacidinvertaseandsucrosephosphatesynthase,PlantPhysiol.,1997,115:609-616)的方法。稱取0.10.2g樣品，在液氮中研磨成粉末。將研磨好的樣品放入2ml離心管中，加入lml提取緩沖液(50mMHepes(pH7.5),5mMMgCl2,1mMEDTA，2.5mMDTT,0.05%(V/V)TritonX-100,0.5mg/mlBSA)。充分混勻后用兩層紗布過濾，將過濾液在13000g，4。C下離心10min,上清液逐漸加入過飽和的硫酸銨溶液至80%飽和度，放置2h后12000g,4'C下離心30min，用lml提取緩沖液溶解沉淀，用于酶活性的測(cè)定。三次重復(fù)，每個(gè)重復(fù)保證為一個(gè)獨(dú)立的樣品。酶活性的測(cè)定SAI活性測(cè)定參考Lowell等(LowellCA，TomlinsonPT,KochKE.Sucrosemetabolizingenzymesintransporttissueandadjacentsinkstructuresindevelopingcitrusfruit./Van//V^s/o/,1989，90:1394-1402)的方法，并做了改進(jìn)。在4卯ML反應(yīng)體系中含醋酸-磷酸鉀緩沖液80mmol/L(pH4.5),蔗糖100mmo1/L，210酶液。37。C反應(yīng)30min，加入4卯pLDNS試劑終止反應(yīng)，沸水浴5min，冷卻后測(cè)定A520值。結(jié)果如表2所示表210個(gè)甜高粱材料不同節(jié)間SAI酶活性材料名稱SAI酶活性Sucrosephosphatesynthaseactivities([imol.h-l.g-lfw)Cultivars節(jié)間1節(jié)間3節(jié)間5節(jié)間7節(jié)間9節(jié)間11平均No.lNo.3No.5No.7No.9No.11MsanCowley6.182.852.612.441.601.522.87Sm池-l6.625.033.554.373.261.70楊TX206.063.983.812.562.591.863.48BJK2367.615.212.753.593.053.244.24Ramada11.607.644.602.962.782.495.35Theis10.455.925.224.943.713.105.56顧-27949.424.644.333.384.564.765.18Honey8.503,774.403.633.713.964.66M-81E10.506.596.175.785.404.986.57顧-27476.604.565.044.884.663.034,80步驟22.1實(shí)驗(yàn)材料實(shí)驗(yàn)材料同步驟1糖分提取參照陳俊偉等(陳俊偉，張上隆，張良誠(chéng)等.柑桔果實(shí)遮光處理對(duì)光合產(chǎn)物分配、糖代謝與積累的影響.植物生理學(xué)報(bào)，2001，28(2):112-118〗的方法。在液氮中研磨樣品，取0.1-0.2g樣品，加入2mL80。/。乙醇混勻，80。C下浸提2h，12000r/min離心10min，取上清lmL濃縮干燥，沉淀用1mL超純水溶解，過濾后供色譜上機(jī)用。2.2糖分測(cè)定蔗糖、葡萄糖和果糖含量均采用高效液相色譜法(HPLC)測(cè)定。采用日本島津液相色譜儀，色譜柱為島津CLC-NH2柱，工作條件柱溫40°C,流速1.0ml/min，檢測(cè)器為RID-10A示差折光檢測(cè)器，流動(dòng)相為乙腈水=70:30，每次進(jìn)樣體積為10u1，Class-vp數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)。根據(jù)樣品峰高和各種糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各種糖的含量。三次重復(fù)，每個(gè)重復(fù)保證為一個(gè)獨(dú)立的樣品。整株莖稈的含糖量以6個(gè)節(jié)間的平均值計(jì)算，己糖含量以果糖與葡萄糖含量之和計(jì)算，總糖含量以果糖、葡萄糖和蔗糖含量之和計(jì)算。結(jié)果如表3、4、5所示所有圖表中的fw表示鮮重(freshweight)。表3早熟甜高梁材料不同節(jié)間可溶性糖的含量糖分材料名稱可溶性糖含量Solublesugarcontent(mg/gfw)SugarCultivars節(jié)間1節(jié)間3節(jié)間5節(jié)間7節(jié)間9節(jié)間11平均No.lNo.3No.5No.7No,9No.11Mean果糖TX204.223.711.852.182.712.032.78aFructoseMN-27949.8410.487.808.125.736.188.03bMN-27474.873.963.922.833.323.293.70a葡萄糖TX207.804.041.452.243.072.913.59aGlucoseMN-27948.7911.579.658.056.776.318.52b畫-27474.672.773.232.232.342.943.03a蔗糖TX2077.5678.5971.2576.9486.5696.0981.17aSucrose應(yīng)-279453.4550.1549.1056.6352.0653.1452.42b麗-274718.8931.1341.9234.4341.7847.4035.93c總糖TX2089.5886.3574.5681.3692.35101.0387.54aTotalSugar應(yīng)-279472.0872.2066.5672.8064.5665.6368.97b畫-274728.4237.8649.0739.4947.4453.6242.65c表4中熟甜高粱材料不同節(jié)間可溶性糖的含量糖分材料名稱可溶性糖含量Solublesugarcontent(mg/gfW)SugarCultivars節(jié)間1節(jié)間3節(jié)間5節(jié)間7節(jié)間9節(jié)間11平均No.lNo.3No.5No.7No.9No.11Msan果糖Sm他-l3.481.561.461.22UI1.791.77aFructoseBJK2362.231.442.412.322.634.292.55aRamada5.802.992.534.294.925.534.34bHoney6.665.485.325.717.188.596.49c葡萄糖Smith-13.171.111.230.840.801.501.44aGlucoseBJK2362.411.242.122.684.486.663.27bRamada3.672.912.104.865.166.154.14bHoney6.II5.235.946.118.469.166.84c蔗糖Smith-175.5988.1698.5779.2581.2480.3283.86a<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>步驟3數(shù)據(jù)分析糖含量與酶活性相關(guān)性分析利用將IO個(gè)材料不同節(jié)間的蔗糖含量與SAI酶活性進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果表明蔗糖含量與與SAI酶活性具有顯著的負(fù)相關(guān)性產(chǎn)-0.54，PO.Ol，如圖4所示?？偺呛颗cSAI酶活性具有顯著的負(fù)相關(guān)性，圖5，r=-0.52，戶O.Ol。實(shí)施例3通過等位變異分析開發(fā)甜高粱SAI基因的分子標(biāo)記試劑與材料試驗(yàn)材料如表6所示的164個(gè)甜高粱品種。1)所用藥品(1)0.5MEDTA(pH8.0):186.1gNa2EDTA-2H20溶于800ml水中，用固體NaOH調(diào)pH值至8.0,定容至1000ml，高溫滅菌，室溫保存。(2)10xTBEbuffer:Tris216g,Boricacid(硼酸)110g，0.5MEDTA(pH8.0)74.5ml，攪拌溶化，定容至2000ml,室溫保存。(3)6%Aciylamide膠儲(chǔ)存液:UREA420.42g，Aciylamide60g,Bis-acrylamide3.16g，10xTBE50ml，攪拌溶解后，用超純水配成1000ml,過濾后置于4。C冰箱或室溫備用。(4)LoadingBuffer:98%Formamide(甲酰胺，10mMEDTA(pH8.0),0.25%BrphBlue(溴酚藍(lán))，0.25%XCynol(二甲苯青)(5)2%R叩elSilane:4卯ml氯仿，加入10mlRepelSilane,混合后室溫保存；(6)0,5%BindingSilane的配制(現(xiàn)用現(xiàn)配)5pl的BindingSilane和5jil的冰乙酸加入到的9卯nl無水乙醇中；(7)10%過硫酸銨(AmmoniumPersulphate):超純過硫酸銨2g，超純水18ml，溶解后，用EP管分裝250^tl，-20°。保存；(8)引物的稀釋新合成的引物，根據(jù)合成單位提供的數(shù)據(jù)，用TE將引物稀釋成200(iM，放在-2(TC冰箱長(zhǎng)期保存。然后取適量的200pM將引物稀釋成2nM放在4"冰箱備用。2)電泳檢測(cè)前的準(zhǔn)備(l)玻璃板的清洗用熱水沾上洗滌靈把玻璃板反復(fù)擦洗干凈，用酒精擦干、干燥。其中一塊玻璃板上涂2。/。RepelSilane后，再擦洗、干燥。另一塊玻璃板上涂0.5%BindingSilane。操作過程中，防止兩塊玻璃板互相污染，徹底干燥后再進(jìn)行玻璃板組裝、灌膠。(2)垂直電泳平板的組裝，水平儀檢測(cè)。(3)聚丙烯酰胺變性膠的配制6%PA膠，10%過硫酸銨，TEMED。(4灘膠搖勻膠后把膠沿灌膠口邊輕輕灌進(jìn)，邊輕輕敲打，防止出現(xiàn)氣泡。待膠流動(dòng)到底部，在灌膠口輕輕插入梳子，平口朝下。讓其充分聚合；如果讓膠過夜，應(yīng)在膠的兩端鋪上濕濾紙或保鮮膜以防膠干燥)。(5)擴(kuò)增產(chǎn)物的變性在擴(kuò)增產(chǎn)物中加入5-8mlLoadingBuffer,95'C變性5-10分鐘后立即置于冰水混合物中待用。3)擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳IxTBE的配制取200mllx0TBE加入800ml去離子水，混勻。其中800ml加入正極槽中，1200ml預(yù)熱至60。C，加入負(fù)極槽；加入樣品梳子，清除氣泡；預(yù)電泳100W恒定功率電泳30分鐘。預(yù)電泳結(jié)束后，清除膠面沉積的尿素和氣泡，插入樣品梳子；加變性的擴(kuò)增樣品DNA6nl,電泳1小時(shí)；4)擴(kuò)增產(chǎn)物的銀染顯色脫色與固定電泳結(jié)朿后，小心分開兩塊玻璃板，膠會(huì)緊緊貼在涂有BindingSilane的玻璃板上；將其放入1L固定液(895ml蒸餾水+100ml無水乙醇+5ml冰醋酸)中，于搖床上振蕩至指示劑無色，約沖洗用去離子水漂洗膠板3-5分鐘；染色加入l升染色液(含1.5gAgN03)，輕輕搖動(dòng)染色10分鐘；沖洗用去離子水漂洗膠板不超過10秒鐘；顯影將膠板放入1升冷的顯影液(10001111離子水+15gNaOH+3.5ml甲醛)中并輕輕搖動(dòng)，直至帶紋清晰出現(xiàn)；停顯/定影將膠板轉(zhuǎn)移至10%的固定液中停顯淀影3-5分鐘；沖洗用去離子水漂洗膠板3-5分鐘；干燥將膠板置于室溫下自然干燥；實(shí)驗(yàn)結(jié)果記錄分析膠板可永久保存，或進(jìn)行拍照。表6驗(yàn)證桐t斗的捶度與等位變異類型(本所指中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所)<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>A036LEOTl-4美國(guó)15.66bA037麗-3455美國(guó)13.34bA038EARLYSUMAC美國(guó)12.60bA039BATHURSTSUMAC美國(guó)11.83aA040畫-3867美國(guó)15.43A041REDAMBER-1美國(guó)11.68bA042ROMA美國(guó)17.95bA043SA183-1美國(guó)13.11bA044麗-4561美國(guó)19.01aA045AMESAMBER美國(guó)15.81aA046甜選6本所16.33bA0478161遼寧農(nóng)科院17.45bA048LEOTI-2美國(guó)16.73bA050COLMAN(M)美國(guó)14.82bA052MN-4394美國(guó)12.15aA053甜選65本所16.84bA054COLLIER-7美國(guó)14.83bA055蘇馬克澳大利亞16.94bA056EARLYFOLGER美國(guó)12.99bA057MN-4008美國(guó)12.27bA058MN-3046美國(guó)13.00A059COLLIER-2美國(guó)12.92bA060MN-3466美國(guó)17.27A0618142本所14.03bA062COWPER美國(guó)14.11bA063DAYMILO美國(guó)12.80bA064MN-4329美國(guó)13.07aA065甜選3本所20.28cA066甜選9本所20.83cA068SUGARDrip日本13.72bA069廳-3535美國(guó)15.83cA070甜選62本所17.21bA0718147遼寧農(nóng)科院11.35cA072BATHURSTSUMAC美國(guó)13.06aA073甜選13本所19.72cA074甜選189本所17.88cA075麵-3457美國(guó)17.71b13<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>A114糖高粱(懷仁)山西，懷仁11.48bA115甜選126本所17.63bA116甜選155本所16.10bA117能飼一號(hào)河北農(nóng)林科學(xué)院谷子所14.86bA118布勞利美國(guó)16.57bA119甜選137本所14.23bA121甜選80本所16.30bA122甜選ni本所17.00bA123甜選181本所16.70bA124甜選32本所15.77bA125甜選卯本所16,53bA126意大利澳大利亞16.43bA127甜選83本所16.47bA128甜選121本所17.65bA129甜選129本所17.17bABO甜選162本所17.14bA131甜選165木所16.23bA133甜選98本所15.87bA134甜選113本所17.14bA1358169遼寧農(nóng)科院12.47bA136甜選99本所15.47bA137甜選136本所15.64bA138甜選193本所16.00bA139BJK153中科院植物所17.35bA140BJK156中科院植物所16.12bA141甜選105本所15.94bA142甜選20本所18.92cA143甜高粱4本課題保存17.14bA144甜選174本所17.65bA145甜選186本所15.37bA146拉馬達(dá)美國(guó)18.39bA147凱勒美國(guó)16.71bA148Mer72-2美國(guó)18.72A149Mer72-3美國(guó)16.97bA150非洲白澳大利亞13.78bA151戴爾美國(guó)14.00A152泰斯美國(guó)14.39315<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>步驟1測(cè)定錘度錘度是指用Brix比重錘度計(jì)測(cè)得的純蔗糖溶液中蔗糖重量百分率(克溶質(zhì)/100克溶液)，對(duì)于不純的蔗糖溶液，其表示的為千固物的重量百分率。以成熟期(開花后40天)從小區(qū)中間一行連續(xù)取5株，取第10節(jié)間(從頂部數(shù))進(jìn)行錘度的測(cè)定，整株的錘度用5個(gè)值的平均數(shù)表示，用手持型數(shù)字錘度計(jì)進(jìn)行測(cè)定，錘度計(jì)為日本ATAGO公司生產(chǎn)，測(cè)定結(jié)果見表6。步驟2:開發(fā)分子標(biāo)記選擇步驟1中測(cè)得的錘度差異較大的24個(gè)材料作為標(biāo)記篩選的供試材料，如表7所示，利用實(shí)施例1中的表1中的引物擴(kuò)增這24個(gè)材料出苗兩周后幼嫩的葉片的DNA,擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行測(cè)序，拼接后分別得到24個(gè)材料的SAI基因的準(zhǔn)全長(zhǎng)基因。DNA提取，PCR程序，測(cè)序，序列比對(duì)等方法同實(shí)施例1。利用DNAMAN軟件中的多重序列比對(duì)程序進(jìn)行序列比，利用dnaSP4.9軟件進(jìn)行DNA多態(tài)性分析和單體型分析，24種材料分為三種單體型，分別記為SazWa、和5*a/-/c,利用dnaSP4.9軟件對(duì)準(zhǔn)全長(zhǎng)的SAI基因進(jìn)行等位變異分析，結(jié)果表明準(zhǔn)全長(zhǎng)的SAI基因在前1000bp變異幅度較大，尤其是在700800bp左右，Pi值到達(dá)了0.03以上，而1000~1500bp左右變異幅度較小，Pi值都為0.005左右，在2000bp以后Pi值又有四次波動(dòng)，在0.01左右，如圖6。單體型分析表明，這三種基因?qū)儆谌N單體型。利用Clustelx軟件對(duì)其做同源進(jìn)化樹分析，表明^/-76和&/-/￡關(guān)系很近，而與5^-fl和5te'-W關(guān)系較遠(yuǎn)，如圖7?；蛑邪l(fā)現(xiàn)的SNP既存在與內(nèi)含子中也存在于外顯子中，而所有的In/Del都在內(nèi)含子內(nèi)。外顯子中的SNP共造成了3個(gè)氨基酸的突變位點(diǎn)，其中，和5VhWc完全一致，而與<Ste'-7a和相比，只有1個(gè)SNP造成了第351個(gè)氨基酸由丙氨酸(&A",&ri-7c)變成了纈氨酸(&hW。)。根據(jù)等位變異&Wa、Sb/-"和的序列差異開發(fā)了一個(gè)共顯性的標(biāo)記5BJO如圖9。根據(jù)該標(biāo)記設(shè)計(jì)的引物，正向弓|物5-TTGTCTGCTTGTATATCACC-3,反向弓l物5-CTTGTACTCTTGTCGATCGAGC-3。此對(duì)引物擴(kuò)增本實(shí)施例中的24份甜高粱材料的DNA,擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，結(jié)果表現(xiàn)出了擴(kuò)增產(chǎn)物的多態(tài)性，如圖10，既在SwW"的材料中可以擴(kuò)增出126bp的片段，在&":乃的材料中可以擴(kuò)增出131bp，而在&!Wc的材料中能擴(kuò)增出136bp的片段，證明此標(biāo)記鑒別甜高粱材料的SAI基丙的等位變異類型。步驟3數(shù)據(jù)分析通過步驟2的實(shí)驗(yàn)，依據(jù)SA1基因等位變異類型將24份材料分成了三種單倍型。數(shù)據(jù)如表7表7.24份甜高粱材料<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>如表7所示，等位變異類型為S"zWa壟^游材料其錘度平均值低于星6型的錘度最高。步驟4標(biāo)記的驗(yàn)證以標(biāo)記檢測(cè)164份甜高梁材料，有42份材料能擴(kuò)增出126bp的條帶(Saz'-k)，有104個(gè)材料能擴(kuò)增出131bp的條帶(&!W6)，有18份材料能擴(kuò)增出136bp的條帶(&/-/c)。在&，'-h中，絕大多數(shù)材料錘度都集中在12~16%之間，占到總數(shù)的72%(圖ll);而在^/-/6中，絕火多數(shù)材料錘度都集中在14~21%之間，占到總數(shù)的69%(圖12);在&Wc中,絕大多數(shù)材料錘度都集中在14~18%之間，占到總數(shù)的94%(圖L3);對(duì)164份材料的錘度與分類綜合分析結(jié)果見圖14,越趨于高錘度區(qū)域，特別是錘度在16-18以后，&/-/6型和5^士型較&'-/"型明顯占的比例要多。而平均值統(tǒng)計(jì)分析也表明，擴(kuò)增出136bp條帶的材料錘度的平均值極顯著高于擴(kuò)增出131bp條帶的材料，而擴(kuò)增出131bp條帶的材料錘度的平均值極顯著高于擴(kuò)增出和126bp條帶的材料，見表8。如果按照Clustak軟件對(duì)其做同源進(jìn)化樹分析的結(jié)果，如圖7將&i-/6和&/-化歸為一類，那么SflW6和&W-化的錘度也極顯著大于^SW-h類型的錘度，見表9。該標(biāo)記的擴(kuò)增片段與錘度顯著相關(guān)。表8164份甜高粱等位變異類型和錘度的統(tǒng)計(jì)分析<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>平均值后面的不同字母表示兩組間的均值差異極顯著(/><0.01)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā)明獲得的分子標(biāo)記能夠通過鑒別可溶性酸性轉(zhuǎn)化酶基因等位變異來選擇具有高含糖量潛力的甜高粱品種。附錄序列表SeqIDNo1SBXl-Sai-lattgtctgcttgtatatcaccattgaattgaattgaattgaataatggagcagtataatgctgccaacctagctatggatgaatcaatgaacgatatactcctatgctcgatcgacaagagtacaagS叫IDNo2SBXI-Sai-lbttgtctgcttgtatatcaccattgaattgaattgaattgaattgaataatggagcagtataatgctgccaacctagctatggatgaatcaatgaacgatatactcctatgctcgatcgacaagagtacasgSeqIDNo3SBXI陽Sai-lcttgtctgcttgtatatcaccattgaattgaattgaattgaattgaattgaataatggagcagtataatgctgccaacctagctatggatgaatcaatgaacgatatactcctatgctcgatcgacaagagtacaagSeqIDNo4Sai-1DNA601201266012013160120136TCACGGACATCTGATGCTGSeqlDNo5Sai-lcDNAATGGTCACGGACATCTGATGCTGSeqIDNo6Sai-lproteinVYPTEAIYANAGVFLF麗ATAARVTAKKLWHEMDSSYNHDYMVTDI權(quán)利要求1.鑒別可溶性酸性轉(zhuǎn)化酶基因等位變異的甜高粱材料的分子標(biāo)記，其特征在于用如下引物擴(kuò)增而來正向引物5-TTGTCTGCTTGTATATCACC-3，反向引物5-CTTGTACTCTTGTCGATCGAGC-3。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述分子標(biāo)記，具有如SeqIDNO1所示的126bp的核苷酸序列。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述分子標(biāo)記，具有如SeqIDNO2所示的131bp的核苷酸序列。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述分子標(biāo)記，具有如SeqIDNO3所示的136bp的核苷酸序列。5.權(quán)利要求1至4所述的任一分子標(biāo)記在輔助選擇高含糖量潛力的甜高粱品種中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明涉及一種鑒別可溶性酸性轉(zhuǎn)化酶基因等位變異的甜高粱材料的分子標(biāo)記，屬于生物
技術(shù)領(lǐng)域：
。該分子標(biāo)記用如下引物擴(kuò)增而來正向引物5-TTGTCTGCTTGTATATCACC-3，反向引物5-CTTGTACTCTTGTCGATCGAGC-3，該引物能將鑒別出甜高粱品種中的可溶性酸性轉(zhuǎn)化酶基因的等位變異類型Sai-1a、Sai-1b、Sai-1c，通過發(fā)明人的研究發(fā)現(xiàn)，各種等位變異類型與品種的蔗糖含糖量顯著相關(guān)，通過驗(yàn)證證明，Sai-1a類型與低含糖量相關(guān)，Sai-1b和Sai-1c與高含糖量有關(guān)；本發(fā)明獲得的分子標(biāo)記在選擇高含糖量潛力的甜高粱品種中的應(yīng)用將有助于加快育種選擇周期。文檔編號(hào)A01H1/04GK101580878SQ20091008755公開日2009年11月18日申請(qǐng)日期2009年6月29日優(yōu)先權(quán)日2009年6月29日發(fā)明者洋劉,李桂英,明路,頓寶慶申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所